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本发明涉及一种水杨酸脱羧酶降解银杏酸的应用，所述酶的基因序列如序列1所述，该酶为水杨酸脱羧酶(Sdc)，含有Sdc的pET21a(+)-sdc/E.coli BL21(DE3)的细胞破碎液可明显降低银杏酸的含量，本发明的酶可以在较广的温度和pH范围内发挥对银杏酸的降解作用，为银杏中取出银杏酸提供更加快捷便利的方法，为银杏的广泛利用提供更多可能性。

1.  一种水杨酸脱羧酶降解银杏酸的应用。

2.  根据权利要求1所述的水杨酸脱羧酶降解银杏酸的应用，其特征在于：所 述水杨酸脱羧酶的基因序列如序列1所述。

3.  根据权利要求1所述的水杨酸脱羧酶降解银杏酸的应用，其特征在于：所 述水杨酸脱羧酶讲解银杏酸的温度为5～80℃，pH为3.0～11.0。

4.  根据权利要求1所述的水杨酸脱羧酶降解银杏酸的应用，其特征在于：所 述银杏酸为包括银杏酸R＝C13:0、银杏酸R＝C15:0、银杏酸R＝C15:1、银杏酸 R＝C17:1、银杏酸R＝C17:2。

5.  一种降解银杏酸的基因工程菌，其特征在于：含有序列如序列1所述的水 杨酸脱羧酶。

6.  根据权利要求1所述的降解银杏酸的基因工程菌，其特征在于：所述质粒 载体为pET21a(+)。

7.  根据权利要求1所述的降解银杏酸的基因工程菌，其特征在于：所述宿主 菌为E.coli BL21(DE3)。

一种水杨酸脱羧酶降解银杏酸的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种水杨酸脱羧酶(Salicylic acid decarboxylase，Sdc)对银杏酸的降解的应用。
背景技术
银杏在我国分布很广且历史悠久，其叶、种子等部位都有很高的应用价值。但在这些部位普遍存在一种毒性成分——银杏酸。
银杏酸是一类邻羟基苯甲酸类化合物,包括C13:1、C15:1、C17:2、C15:0、C17:1等，对人体有很大的危害。
物理去除方法和化学去除方法是降解银杏酸的常用方法，国外的文献报道的较少，国内曾使用微波和超临界萃取等方法脱除银杏酸，这些方法均需要利用有机溶剂对银杏酸进行溶解，工艺复杂。在生物降解方面，李银亮等人在人工发酵银杏叶中银杏酸含量的研究中曾报道通过人工接种冠突散囊菌发酵银杏叶制作发酵茶可以降低其中银杏酸的含量，但耗时较长，步骤较繁琐。
通过检索，发现一篇与本专利申请相关公开专利文献：一种银杏酚酸的生物降解方法(CN103053876)，该方法是在向含有一定浓度银杏酚酸的降解系统中加入0.004U/ml-0.006U/ml的漆酶LacC的同时(降解体系的PH4.0-6.0，降解温度为45℃-60℃，降解处理时间为10-24h)，加入介体物质，特别是加入ABTS，降解率最高可达100％。
通过对比，上述公开的文献与本专利申请在技术方案方面有较大不同，获得的技术效果不同。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酶降解银杏酸的应用，提供另一种银杏酸的降解途径。
本发明实现目的的技术方案是：
一种水杨酸脱羧酶降解银杏酸的应用。所述水杨酸脱羧酶的基因序列如序列1所述。
所述水杨酸脱羧酶讲解银杏酸的温度为5～80℃，pH为3.0～11.0。
所述银杏酸为包括银杏酸R＝C13:0、银杏酸R＝C15:0、银杏酸R＝C15:1、银杏酸R＝C17:1、银杏酸R＝C17:2。
一种降解银杏酸的基因工程菌，含有序列如序列1所述的水杨酸脱羧酶。
所述质粒载体为pET21a(+)。
所述宿主菌为E.coli BL21(DE3)。
本发明的优点和有益效果为：
1、本发明提供了一种可以降解银杏酸的酶，该酶为水杨酸脱羧酶Sdc，含有Sdc的pET21a(+)-sdc/E.coli BL21(DE3)的细胞破碎液可明显降低银杏酸的含量。1mL其细胞破碎液在40℃、pH＝5.5、5h内使银杏酸C15:1的含量降低了39.017±0.131％。
2、本发明提供的水杨酸脱羧酶可以在较广的温度和pH范围内发挥对银杏酸的降解作用，为银杏中取出银杏酸提供更加快捷便利的方法，为银杏的广泛利用提供更多可能性。
附图说明
图1为重组质粒pET21a(+)-sdc的构建；
图2为pET21a(+)-sdc重组质粒的鉴定；M：maker(10kb)，1：pET21a(+)-sdc的单酶切结果，2：pET21a(+)-sdc的双酶切结果；
图3为对照组pET21a(+)重组质粒的鉴定。M：maker(10kb)，1：pET21a(+)的单酶切结果；
具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明根据Kirimura等报道的基因序列，人工合成了sdc基因，并构建该基因的重组质粒，再将其转入宿主细胞中，将重组菌接种到培养基中培养一定时间，从中取一定量的发酵液进行细胞破碎。称取一定量的银杏酸标准品，配置成溶液。将细胞破碎液和标准品溶液混合后，反应一段时间，用LC-MS测定其中的银杏酸含量。
其中，银杏酸是指一类2-羟基-6-烷基苯甲酸类化合物，包括银杏酸 (R＝C13:0)、银杏酸(R＝C15:0)、银杏酸(R＝C15:1)银杏酸(R＝C17:1)银杏酸(R＝C17:2)等。

具体操作方式及步骤如下：
⑴根据Kirimura等报道的基因序列，人工合成了sdc基因，并构建该基因的重组质粒pET21a(+)-sdc，再将其转入E.coli BL21(DE3)中。
分别用HindIII/Nde I对sdc基因和质粒pET21a(+)进行双酶切，取酶切片段进行连接反应，再转入E.coli BL21(DE3)来完成质粒的构建(如图1)。用培养液涂布Amp抗性平板，重组质粒pET21a(+)-sdc含有Amp的抗性基因，因此使得转入该重组质粒的BL21也带有Amp抗性，本文根据是否带有Amp抗性来筛选重组子，在Amp抗性平板上可以生长的就是构建成功的重组子。从LB固体平板上挑取单菌落，接种到液体LB培养基中过夜培养之后，提取质粒，通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。结果如图2。
双酶切重组质粒出现两条带，分别为5443bp和1053bp，与质粒pET21a(+)和sdc基因的大小一致，而单酶切重组质粒出现一条带，为6496bp。将经过验证的正确的重组质粒进行测序，得到的序列与原序列完全相同，说明载体pET21a(+)-sdc确定构建成功。
由于pET21a(+)含有Amp的抗性基因，所以可用同样的方法进行重组子的筛选，图3为对照组单酶切的鉴定结果，图中出现一条带，为5443bp，说明pET21a(+)已成功转入E.coli BL21(DE3)。
⑵将重组的pET21a(+)-sdc/E.coli BL21(DE3)接种到Amp和IPTG浓度均为100μg/mg的LB培养基中，37℃温度下，130rpm培养12h，将培养液按1％接种量接种于IPTG和Amp浓度均为100μg·mL^-1的LB培养基中，30℃，120rpm培养18h。
⑶取步骤⑵的培养液4mL，在冰浴中超声破碎，功率40％，工作3s，间歇5s，时间10min，3000rpm离心30s，弃上清，再加入2mL PBS缓冲液，混匀后即可得到细胞破碎液。
⑷将细胞破碎液和银杏酸C15:1标准品溶液的稀释液1mL于10mL的离心管A中混匀，取PBS缓冲液和银杏酸C15:1标准品溶液的稀释液各1mL于10mL 的离心管B中混匀作为对照。向两管中通入O₂约5min，于40℃、pH＝5.5反应5h，将反应后的各组溶液真空冷冻干燥至恒重(连续两次称量结果相差不超过0.002g)，再向其中分别加入2mL异丙醇，充分溶解，用0.22μm有机滤膜过滤，并用LC-MS测定各组反应后溶液中的银杏酸C15:1浓度，每组试验重复3次。可计算出与细胞破碎液反应后的溶液中的银杏酸含量为0.003±0.045mg/mL，而对照组溶液中的银杏酸含量为0.006±0.042mg/mL。
根据实施例的结果可知含有Sdc的pET21a(+)-sdc/E.coli BL21(DE3)的细胞破碎液可明显降低银杏酸的含量。1mL其细胞破碎液在40℃、pH＝5.5、5h内使银杏酸C15:1的含量降低了39.017±0.131％。
所述sdc基因的序列为：