一种新型酶制超低分子肝素.pdf

本发明公开了一种新型超低分子肝素，使用从Sphingobacterium daejeonense细菌中得到的肝素酶SDhepⅡ，降解肝素、超滤分离、乙醇沉淀等步骤最终得到。这种超低分子肝素在抗凝血方面具有特异性，有望成为临床抗凝血药物的活性组分。

1.  一种新型超低分子肝素，其特征在于该新型超低分子肝素由肝素酶SDhepⅡ降解肝素得到。

2.  如权利要求1所述的超低分子肝素，其特征在于分子量分布在600Da-3800Da区间范围内。

3.  如权利要求1所述的超低分子肝素，其特征在于抗FXa效价大于150 IU/mg。

4.  如权利要求1所述的超低分子肝素，其特征在于抗FⅡa效价小于3 IU/mg。

5.  如权利要求1所述的超低分子肝素，其制备方法包括以下步骤：
(1) 将肝素配成质量百分比为2-10%的水溶液，加入氯化钙1-100mM，溶解；
(2) 向步骤(1) 所述的肝素溶液中按1-10 IU/g比例加入肝素酶SDhepⅡ，降解反应12-48小时；
(3) 向步骤(2)所述得到的降解液加入质量百分比为1-5%氯化钠，溶解后用截留分子量1-5万的超滤膜过滤；
(4) 向步骤(3)得到的溶液中加入1-1.8倍重的乙醇，沉淀静置6-18小时，倾去上清液；
(5) 将步骤(4)得到的沉淀于60-75℃烘干。

6.  一种新型超低分子肝素，具有独特抗凝血特性，可作为活性成分用于抗凝血药物的制造。

一种新型酶制超低分子肝素
技术领域
本发明涉及一种新型超低分子肝素，具体而言是涉及使用来源于Sphingobacterium daejeonense细菌的新型肝素酶SDhepⅡ降解肝素获得的超低分子肝素产物，以及其制备和应用。
背景技术
肝素于1916年被发现，后来被广泛用于临床抗凝血。过程中标准肝素为第一代产品，低分子肝素为第二代产品，当前低分子肝素已取代大部分标准肝素市场。而创新药物研发正向第三代产品--超低分子肝素发展。
肝素能与血浆白蛋白、血小板、巨噬细胞、内皮细胞等结合，引起患者血小板减少、骨质疏松、出血等一系列副作用。这些副作用大多是因为糖链过长引起（Critical Reviews in Oncology/Hematology 2013; 88:1-18），故可考虑将肝素分子量减小。
肝素抗凝血有两条路径：一方面通过活性中心的核心戊糖序列与抗凝血酶（AT）结合，促进AT与凝血因子Xa结合从而抗凝血；另一方面，当肝素糖链≥18个糖单元，即分子量大于5400Da时，能促进AT与IIa结合，发挥抗凝血活性（Thrombosis Clinic 2008;2:8-21）。
因此，在活性中心保留完整而分子量足够小的情况下，肝素抗凝血过程中出现副作用的风险小。此时一般抗FXa效价高而抗FIIa效价低。
基于此，低分子肝素被发明，临床应用证明低分子肝素具强抗凝血作用且副作用减少，低分子肝素迅速占领市场。目前有依诺肝素、达肝素、亭扎肝素、舍托肝素、那曲肝素等（Critical Reviews in Oncology/Hematology 2013; 88:1-18），平均分子量4500-6000Da，抗FXa/抗FIIa效价在2-5。分子量减小使得抗FIIa效价大幅度降低，而抗FXa效价有所降低，则是由于制备过程中活性中心受到破坏导致。
超低分子肝素是新一代产品，指平均分子量<4000Da，拥有更高的抗FXa/抗FIIa效价比的低分子肝素。抗凝血优于低分子肝素，而出血和血小板减少症等副作用更小。
目前已报道的超低分子肝素主要有三种（Thrombosis Research 2011;127:292-298），分别是由ROVI公司研发的RO-14和Bemiparin、由赛诺菲-安万特研发的Semuloparin，其具体特性如下表所示：

贝米肝素在欧洲已经应用于临床10年(Vascular Pharmacology 2014;62:32-37)，在欧盟6个国家批准上市,其高抗FXa效价和低FIIa效价使得它在用于预防血栓栓塞性疾病方面有突出的效果，Balibrea等人的临床统计研究表明，当贝米肝素用于外科手术患者抗凝血及血栓栓塞性疾病预防时，每位患者的给药量3500IU/天，患者的出血率较低，完成治疗人均消费为€909，在住院6周的观察期内，使用贝米肝素的患者比使用依诺肝素的患者平均节省€144.48，且治疗效果更好(Int J Surg 2007;5:114-119)。
Semuloparin为赛诺菲-安万特研发的一种超低分子肝素，用以降低癌症化疗患者血栓风险，但临床试验数据显示无显著效果，其抗血栓治疗的临床收益尚无定论，赛诺菲-安万特尚未获得该药的上市审批。然而基于该化合物在抗FXa效价和FIIa效价方面与目前已上市的其它低分子肝素相比有显著的优越性，很可能在其它群体会取得显著的疗效，是具有较好成药前景的超低分子肝素。
RO-14是以非水相为介质，采用β-消除法降解肝素得到的，其临床研究表明，不会引起出血副反应，且抗凝血效果非常好。
然而，当前主要采用化学手段对肝素进行降解，超低分子肝素活性收率很低导致生产成本过高。另外，化学降解具有较大的环保压力。
寻找收率高的降解模式，或采用酶解等比较环保的方式制造超低分子肝素，是具有光明前景的研究领域。
本发明采用从自然界筛选到的新型肝素酶SDhepⅡ对肝素做降解，可得到性能优越的超低分子肝素，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明给出了一种新型超低分子肝素，使用从细菌Sphingobacterium daejeonense中纯化出的新型肝素酶SDhepⅡ降解肝素而来，得到的超低分子肝素分子量很低，具有很高的抗FXa活性，而抗FIIa活性很低，有望作为抗凝血药物活性成分使用。
本发明包括以下内容：
1.       肝素酶的制备
（1） Sphingobacterium daejeonense菌株的发酵及粗酶液制备：
将菌体从平板或斜面上刮取两环接种到种子培养基中，培养1-2天后，按5-20%接种量接入二级液体种子培养基中，培养1-2天，再按5-20%接种量接入2L发酵培养基中，培养1-5天。收集菌液10000rpm，4℃离心15-30分钟，收集沉淀，悬浮在Tris-HCl缓冲液中，用高压均质机4℃，800bar，破碎1-5个循环，离心30min，收取上清，冰浴条件下做硫酸铵沉淀，收取硫酸铵饱和度35%-85%的沉淀。将沉淀溶解于100ml的Tris-HCl缓冲液中，于相同的缓冲液中透析过夜。
（2）Q柱粗酶的粗分离：
将步骤（1）中的酶液上样于一根Tris-HCl缓冲液平衡过的Q柱，以同样缓冲液平衡，然后以同样缓冲液中氯化钠0-0.5M线形梯度洗脱，用试管收集上样流出液和平衡液，检测各管肝素酶活性，收集合并有活性的部分，为不与Q柱结合的肝素酶。同样收集洗脱液中有肝素酶活性的各管，合并透析，为与Q柱结合的肝素酶。
（3）SDhepⅡ酶的纯化：
将步骤（2）中得到的与Q柱结合的肝素酶上样于一根用Tris-HCl缓冲液平衡过的CS柱，以同样缓冲液平衡，然后以同样缓冲液中氯化钠0.1-0.6M线形梯度洗脱，检测洗脱液中具有肝素酶活性的组分，收集合并，透析。酶液上一根用Tris-HCl缓冲液平衡过的Q柱，以含0.08M氯化钠的同样缓冲液洗脱，检测并收集有活性组分。上样于一根用Tris-HCl缓冲液平衡过的CS柱，再以同样缓冲液平衡，然后以同样缓冲液中0-1M氯化钠线形梯度洗脱，收集活性组分，合并，浓缩。
2. 超低分子肝素的制备
(1) 将肝素配成质量百分比为2-10%的水溶液，加入氯化钙1-100mM，溶解。
(2) 向步骤(1) 所述的肝素溶液中按1-10IU/g比例加入肝素酶SDhepⅡ，降解反应12-48小时。
(3) 向步骤(2)所述得到的降解液加入质量百分比为1-5%的氯化钠，溶解后用截留分子量1-5万的超滤膜过滤。
(4) 向步骤(3)得到的溶液中加入1-1.8倍重的乙醇，静置沉淀6-18小时，倾去上清液。
(5) 将步骤(4)得到的沉淀于60-75℃烘干。
步骤(1) 所述的肝素溶液，其肝素浓度优选为2-5%，溶液中氯化钙浓度优选50-100mM。
步骤(2)中肝素酶SDhepⅡ的加入比例优选1-2 IU/g，所用酶可自细菌Sphingobacterium daejeonense中提取纯化，也可为该酶经基因工程技术表达的重组酶；可以为游离存在的酶，也可以为固定化形式的酶。
步骤（3）中氯化钠的加入浓度优选为2-3%。
步骤（4）中乙醇的假如量优选为溶液重量的1.2-1.5倍。
步骤（5）中烘干温度优选为65-70℃。
3. 制备的超低分子肝素的性质
（1）本发明所涉及的超低分子肝素，经测定其抗FXa大于150 IU/mg。采用欧洲药典方法（Ph.Eur.8th 5.3.Statistical Analysis of Results of Biological Assays and Tests）。
（2）本发明所涉及的超低分子肝素，经测定其抗FIIa小于3 IU/mg。采用欧洲药典方法（Ph.Eur.8th 5.3.Statistical Analysis of Results of Biological Assays and Tests）。
（3）本发明所涉及的超低分子肝素，经测定其分子量分布在600-3800Da。采用欧洲药典方法（Ph.Eur.8th 专论部分 Heparin low-molecular-mass）。
本发明提供了一种超低分子肝素，使用来源于Sphingobacterium daejeonense的肝素酶
SDhepⅡ，通过肝素溶液降解、超滤、乙醇沉淀等步骤而来。所述超低分子肝素，其分子量
低至600-3800Da、抗FXa大于170 IU/mg、抗FIIa小于3 IU/mg，为一种性能优越的低分子肝素产品，有望作为活性成分用为抗凝血药物。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1：
取10g肝素，加入90g纯化水，配成10%的水溶液，加入氯化钙使浓度为1mM，搅拌溶解。加入肝素酶SDhepⅡ 10 IU，室温降解反应48小时。加入氯化钠2g，搅拌溶解，用截留分子量3万的超滤膜过滤。滤液中加入130g的95%乙醇，静置沉淀6小时，倾去上清液。将得到的沉淀于70℃烘干。得超低分子肝素5.23g，经测定，其抗FXa为171 IU/mg，抗FIIa为1.72 IU/mg，分子量分布在600-3800Da。
实施例2：
取10g肝素，加入90g纯化水，配成10%的水溶液，加入氯化钙使浓度为1mM，搅拌溶解。加入肝素酶SDhepⅡ 15 IU，室温降解反应48小时。加入氯化钠2.5g，搅拌溶解，用截留分子量3万的超滤膜过滤。滤液中加入150g的95%乙醇，静置沉淀6小时，倾去上清液。将得到的沉淀于70℃烘干。得超低分子肝素4.35g，经测定，其抗FXa为179 IU/mg，抗FIIa为1.17 IU/mg，分子量分布在600-3800Da。
实施例3：
取10g肝素，加入90g纯化水，配成10%的水溶液，加入氯化钙使浓度为1mM，搅拌溶解。加入肝素酶SDhepⅡ 30 IU，室温降解反应24小时。加入氯化钠2.5g，搅拌溶解，用截留分子量3万的超滤膜过滤。滤液中加入150g的95%乙醇，静置沉淀12小时，倾去上清液。将得到的沉淀于70℃烘干。得超低分子肝素3.91g，经测定，其抗FXa为191 IU/mg，抗FIIa为2.43 IU/mg，分子量分布在600-3800Da。
实施例4：
取10g肝素，加入90g纯化水，配成10%的水溶液，加入氯化钙使浓度为10mM，搅拌溶解。加入肝素酶SDhepⅡ 10 IU，室温降解反应24小时。加入氯化钠2.0g，搅拌溶解，用截留分子量3万的超滤膜过滤。滤液中加入130g的95%乙醇，静置沉淀12小时，倾去上清液。将得到的沉淀于70℃烘干。得超低分子肝素4.06g，经测定，其抗FXa为181 IU/mg，抗FIIa为1.16 IU/mg，分子量分布在600-3800Da。
实施例5：
取10g肝素，加入90g纯化水，配成10%的水溶液，加入氯化钙使浓度为100mM，搅拌溶解。加入肝素酶SDhepⅡ 10 IU，室温降解反应12小时。加入氯化钠2.0g，搅拌溶解，用截留分子量3万的超滤膜过滤。滤液中加入150g的95%乙醇，静置沉淀6小时，倾去上清液。将得到的沉淀于70℃烘干。得超低分子肝素4.06g，经测定，其抗FXa为166 IU/mg，抗FIIa为2.11 IU/mg，分子量分布在600-3800Da。
实施例6：
取10g肝素，加入190g纯化水，配成5%的水溶液，加入氯化钙使浓度为100mM，搅拌溶解。加入肝素酶SDhepⅡ 10 IU，室温降解反应12小时。加入氯化钠2.0g，搅拌溶解，用截留分子量3万的超滤膜过滤。滤液中加入150g的95%乙醇，静置沉淀6小时，倾去上清液。将得到的沉淀于70℃烘干。得超低分子肝素4.06g，经测定，其抗FXa为151 IU/mg，抗FIIa为2.49 IU/mg，分子量分布在600-3800Da。