一株枯草芽孢杆菌DCU及其用途.pdf

本发明提供了一株枯草芽孢杆菌DCU，其保藏编号为CCTCC NO.2014118，该枯草芽孢杆菌不仅具有良好的抗病原活性，能够很好地抑制致病菌生长繁殖，而且还能够提高机体的免疫力，其应用前景广泛，可以将其应用于益生菌制剂，也可以将其制成菌粉，作为饲料添加剂添加到饲料中，用来抑制动物体内致病菌生长，降低动物死亡率。

1.  一株枯草芽孢杆菌DCU，保藏于中国典型培养物保藏中心， 其保藏编号为CCTCC NO.2014118。

2.  根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的培养方法，其特征在 于，所述培养方法为将所述枯草芽孢杆菌接种到成分为酵母提取物 1g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 34g/L，Fe₃PO₄ 0.1g/L，自然PH的培养基 中，在转速为180rpm，温度为28℃的条件下培养12h。

3.  根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的培养方法，其特征在 于，所述培养方法为将所述枯草芽孢杆菌接种到成分为蛋白胨10g/L， 牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，pH自然的培养基中，在转速为180rpm， 温度为28℃的条件下培养12h。

4.  权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在抑制副溶血弧菌生长中的 用途。

5.  权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备益生菌制剂中的用途。

6.  一种益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌制剂含有如权利 要求1所述的枯草芽孢杆菌。

7.  一种菌粉，其特征在于，所述菌粉是采用如权利要求1所述 的枯草芽孢杆菌制备的。

8.  权利要求7所述的菌粉作为饲料添加剂的用途。

9.  一种饲料，其特征在于，所述饲料含有如权利要求1所述的 枯草芽孢杆菌。

一株枯草芽孢杆菌DCU及其用途
技术领域
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌，具体涉及一株具有抑制副溶血弧菌生长能力的枯草芽孢杆菌DCU及其用途。
背景技术
拟穴青蟹(Scylla paramamosain)，简称青蟹，属广盐广温性的海水经济甲壳动物,主要分布于我国东南沿海地区,是粤东特别是汕头主要的海水养殖品种，具有生长快、个体大、适应性和抗病能力强、耐干露、易运输、肉味鲜美独特、营养丰富等特点,颇受国内外生产者和消费者的青睐。近年来青蟹病害特别是病毒性病(如青蟹杆状病毒病，呼肠孤样病毒病)、细菌性病和寄生虫病等给我省乃至全国青蟹养殖业造成了严重的经济损失。如自2004年秋冬以来，广东青蟹养殖发生了前所未有的突发性病害，尤其是育肥过程中，膏蟹的死亡率在70％以上。2005～2006年广东南水青蟹育肥死亡率在90％以上。2006、2007年的病害仍然严重，发病情况和发病时间与前2年基本相同。4年来，仅汕头牛田洋围垦区群众青蟹养殖就减产了60％，估计每年经济损失达5000万元以上。汕头市青蟹养殖面积10万余亩；其中牛田洋围垦区3万多亩。青蟹病害发病迅速、范围广，主要爆发于每年的9-11月份。
一般认为，青蟹属甲壳类无脊椎动物，不具备特异性免疫系统，其免疫以非特异性免疫为主，故运用疫苗防治青蟹病害的可靠性和广泛性目前尚存在争论。迄今为止，国内外许多学者从青蟹病原、青蟹免疫防御机制和养殖环境等多方面进行了大量的研究和探索，在青蟹病害治疗方面取得了许多进展，但是这些研究很难从根本上解决青蟹的病害问题。因此，寻找“以防为主”的生态学防治方法，被认为是解决目前青蟹养殖疾病，提高青蟹品质的一条有效途径。
使用益生菌进行青蟹的生态健康养殖,是提高青蟹免疫力，预防青蟹病 害特别是细菌性病害的有效途径之一。目前已有报道的水产益生茵有乳酸茵属、双歧杆菌属、弧茵属、假单胞茵属、芽孢杆菌、硝化茵、光合茵等。乳酸茵、芽孢杆菌、酵母茵等已作为饵料添加剂应用于水产动物，起到很好的防治疾病和增进健康的作用。为陆生生物设计的微生态制剂应用于水产养殖中，不一定能尽快成为优势菌而进行微生态调节，而且，这些微生物很容易随着时间而逐渐消亡。益生菌目前已应用在对虾、贝类及其他海洋水产养殖动物上，但是适用于虾贝的益生菌并不一定在青蟹养殖中起作用或作用效果不明显。开发针对青蟹的益生菌种，对青蟹高密度及健康生态养殖模式意义重大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一株具有抑制抑制副溶血弧菌生长能力的枯草芽孢杆菌，本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌的培养方法，以及所述枯草芽孢杆菌的用途。
为实现上述目的，所采取的技术方案：一株枯草芽孢杆菌DCU/Bacillus subtilis DCU，已于2014年4月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC)，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO.2014118。
本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌的培养方法，所述培养方法为将所述枯草芽孢杆菌接种到成分为酵母提取物1g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 34g/L，Fe₃PO₄ 0.1g/L，自然PH的培养基中，在转速为180rpm，温度为28℃的条件下培养12h。
优选地，上述所述培养方法为将所述枯草芽孢杆菌接种到成分为蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，自然pH的培养基中，在转速为180rpm，温度为28℃的条件下培养12h。本申请发明人发现在该培养基中所述短小芽孢杆菌生长速率及最终到达的浓度均比其在上述所述培养基中好。
本发明还提供了上述所述的枯草芽孢杆菌在抑制副溶血弧菌生长中的用途。本申请发明人经过抑菌试验发现所述枯草芽孢杆菌DCU能够很好地 抑制常见致病菌副溶血弧菌生长繁殖。
本发明还提供了上述所述的枯草芽孢杆菌在制备益生菌制剂中的用途。本申请发明人通过试验发现所述枯草芽孢杆菌DCU能够很好地抑制致病菌生长繁殖，而且能够提高免疫相关蛋白的表达，进而提高机体免疫力。
本发明还提供了一种益生菌制剂，所述益生菌制剂含有上述所述的枯草芽孢杆菌。
本发明还提供了一种菌粉，所述菌粉是采用上述所述的枯草芽孢杆菌制备的。
本发明还提供了上述所述的菌粉作为饲料添加剂的用途。
本发明还提供了一种饲料，所述饲料含有上述所述的枯草芽孢杆菌。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一株枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌不仅具有良好的抗病原活性，能够很好地抑制致病菌生长繁殖，而且还能够提高机体的免疫力，其应用前景广泛，可以将其应用于益生菌制剂，也可以将其制成菌粉，作为饲料添加剂添加到饲料中，用来抑制动物体内致病菌生长，降低动物死亡率。
附图说明
图1为本发明所述枯草芽孢杆菌DCU的普通光学显微镜图片；
图2为本发明所述枯草芽孢杆菌DCU的扫描电子显微镜图片；
图3为本发明所述枯草芽孢杆菌DCU的系统发育树；
图4为本发明所述枯草芽孢杆菌DCU的抑菌图片；
图5为本发明实施例4中不同情况下所述青蟹体内免疫相关蛋白的表达情况对比图；
图6为本发明实施例4中不同情况下所述青蟹的死亡率对比图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：枯草芽孢杆菌DCU的分离纯化
1)菌株分离纯化：青蟹采集于广东汕头牛田洋青蟹养殖场(青蟹为患“牛奶病”后仍然存活的耐病蟹)，带回实验室，蒸馏水冲洗表面的污泥等杂物，酒精喷洒之后，于超净台下解剖并取肠道内容物，完成青蟹肠道内容物样品的采集。菌株分离于养殖的拟穴青蟹肠道，采用LB，2216E，TCBS培养基稀释涂平板，28℃培养过夜。其中一株菌对其他周围菌株具有疑似抑制效应，将其重新划平板，分离纯化。
2)菌株鉴定：通过平板菌落形态和扫描电镜观察细胞形态以及生理生化实验进行初步鉴定，用2216E平板于37℃培养24h后，单菌落为圆形，直径2.0-4.0厘米，边缘整齐，表面隆起呈乳白色，染色后显示为革兰氏阳性菌，普通光学显微镜观察结果如图1所示。电镜观察结果如图2，电镜观察到菌为细长直杆状，大小为0.7～1.2×2～4微米；芽孢为椭圆到柱状，大小为0.6～0.9×1.0～1.5微米。采用氧化酶试剂，API 50CHB试剂条对分离纯化的菌株分别进行7％NaCl生长、氧化酶、硝酸盐还原、甘油利用、明胶液化、淀粉水解、甘露糖发酵、甘露醇发酵、阿拉伯糖发酵及苦杏仁苷发酵试验，其生理生化试验结果如表1，通过与标准菌株比较，初步确定菌株为芽孢杆菌。
表1菌株常规生理生化试验结果


再通过16S rDNA序列克隆测序，16SrDNA序列分析采用的引物为通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')(SEQ ID:NO.2)和1492R(5'-TACCTTGTTACGA CTT-3')(SEQ ID:NO.3)进行PCR，克隆并测序，得到该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID:NO.1所示。该株菌与Bacillus subtilis同源性最高(99％)，其系统进化树如图3，命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis DCU(以下简称DCU)。
实施例2：枯草芽孢杆菌DCU的抑菌试验
将枯草芽孢杆菌DCU培养，采用纸片法，检测对拟穴青蟹养殖常见的病原菌-副溶血弧菌的抑菌效果。按照抑菌圈的大小观察其抑菌效果。
具体步骤：将从青蟹肠道分离的致病菌接种于相应的液体培养基中于28℃下180rpm振荡过夜培养，吸取培养液100μL涂布与90mm培养皿中，涂布均匀，置于平面向上干燥。将事先裁剪好并经高压蒸汽灭菌后置于烘箱中烘干的直径约6mm的滤纸片，浸入经活化并培养约24h的菌液中20min。用灭菌镊子夹出滤纸片，贴在瓶壁上至无明显液体流下，小心贴在平板表面，用镊子轻压，使滤纸片和培养基完全贴合，每个平板贴3个，使呈等三角形。倒置于28℃恒温培养箱培养24h，测量抑菌圈的直径。三次重复，以检测拮抗性的稳定性，致病菌选用实验室筛选的青蟹致病菌副溶血弧菌。
实验结果：菌株能够抑制副溶血弧菌生长且抑菌圈大于15mm，说明枯草芽孢杆菌DCU对副溶血弧菌有很好的抑菌效果。实验图片见图4。
实施例3：枯草芽孢杆菌DCU的培养方法
本申请发明人发现可以采用2216E(Zobell)培养基培养所述枯草芽孢杆菌DCU，2216E(Zobell)培养基：酵母提取物1g，蛋白胨5g，NaCl 34g，Fe₃PO₄ 0.1g，加蒸馏水800mL，自然PH，定容至1000mL。固体平板加入1.5％琼脂。培养条件为：转速180rpm，温度28℃，培养12h。
本申请发明人还采用营养琼脂培养基(NA)培养所述枯草芽孢杆菌 DCU，NA培养基组成为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，自然pH，用蒸馏水定容至1000mL。培养条件同上。结果显示NA培养基中菌株生长速率及最终到达的浓度均比其在2216E培养基中好。
实施例4：枯草芽孢杆菌DCU的应用
副溶血弧菌是拟穴青蟹养殖的主要细菌性病原，考察枯草芽孢杆菌DCU在青蟹养殖中的益生效应。青蟹养殖选用5±1g的幼蟹160只，将青蟹分为二类(喂养添加枯草芽孢杆菌DCU 10⁵CFU/g的饲料及无枯草芽孢杆菌DCU添加的饲料)，每类设4组，每组20只幼蟹。分别饲喂饲料30天后，将青蟹放入预先养好的副溶血弧菌(浓度为10⁵CFU/mL；从牛田洋青蟹养殖区分离，本实验室保存)浸泡48h后恢复原来的饲养状态。
1).利用实时荧光PCR(real time PCR)方法检测饲喂添加益生菌30天后受副溶血弧菌刺激的免疫应激情况，如图5所示，发现处理组proPO，SOD，CAT的表达显著高于对照组。
2).记录30天内的死亡情况，如图6所示，结果显示，与对照组(正常饲料组无枯草芽孢杆菌DCU)相比，喂养添加枯草芽孢杆菌DCU 10⁵CFU/g的饲料的青蟹组的死亡率极显著低于对照组。
从上述结果可以看出，该枯草芽孢杆菌不仅具有良好的抗病原活性，能够很好地抑制致病菌生长繁殖，而且还能够提高机体的免疫力。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。