一种布氏菌病治疗制剂.pdf

本发明公开了一种治疗布氏菌病的治疗制剂，其含有布氏菌104M菌株。本发明还公开了布氏菌104M菌株在制备治疗布氏菌病的治疗制剂中的用途。本发明的治疗制剂可用于布氏菌感染的哺乳动物的免疫治疗。

1.  一种用于治疗哺乳动物布氏菌病的治疗制剂，其特征在于，该制剂中含有 布氏菌104M菌株。

2.  如权利要求1所述的治疗制剂，其特征在于，所述治疗制剂为冻干制剂，在 冻干前每升中含有1×10¹¹-5×10¹⁴个布氏菌，优选每升中含有约5×10¹¹个布氏 菌。

3.  如权利要求2所述的治疗制剂，其特征在于，所述冻干制剂在冻干前每升 中还含有海藻糖40-60g、谷氨酸钠4-6g、硫脲4-6g和蔗糖40-60g，余量为 灭菌注射用水；优选含有海藻糖约50g、谷氨酸钠约5g、硫脲约5g和蔗糖 约50g，余量为灭菌注射用水。

4.  布氏菌104M菌株在制备用于免疫治疗哺乳动物布氏菌病的治疗制剂中的 应用。

5.  如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述治疗制剂通过皮内接种、鼻 腔接种、皮下接种或皮上划痕接种。

6.  如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物为人、牛、羊、 犬或猪。

7.  如权利要求4-6所述的应用，其特征在于，所述治疗制剂为冻干制剂，在冻 干前每升中含有1×10¹¹-5×10¹⁴个布氏菌，优选每升中含有约5×10¹¹个布氏菌。

8.  如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述冻干制剂在冻干前每升中还 含有海藻糖40-60g、谷氨酸钠4-6g、硫脲4-6g和蔗糖40-60g，余量为灭菌 注射用水；优选含有海藻糖约50g、谷氨酸钠约5g、硫脲约5g和蔗糖约50g， 余量为灭菌注射用水。

一种布氏菌病治疗制剂
技术领域
本发明涉及一种布氏菌病治疗制剂，该制剂可用于哺乳动物布氏菌感染的 免疫治疗，属于治疗类生物制品生产技术领域。
背景技术
布鲁氏菌病(简称布氏菌病、布病)是由布鲁氏菌属引起的一类人畜共患 疾病。可通过口腔粘膜、鼻腔、眼结膜、生殖道、甚至未损伤的皮肤而感染。 家畜感染后可引发母畜流产和不育，人感染则主要引起波浪热和转化为慢性感 染。据调查，全球已有170多个国家和地区有布病发生和流行。
我国50～60年代在我国人畜中有较重流行，自70年代布病疫情逐年下降， 至90年代初人间感染率仅为0.3％，发病率只有0.02/10万。但自1993年布病 疫情出现了反弹，1996年全国发病率为0.09人/10万人，2013年发病率升为3.36 人/10万人。十几年间，发病率已经增加近40倍，2013年卫计委报告新发病人 数多达46，289人。这个现象与世界上部分地区的布病疫情遥相呼应。该状态 已引起世界和我国有关部门的关注。
本病所累及的组织器官很广泛，但以单核—巨噬细胞系统、骨关节系统、 神经系统等常见。初期为炎性细胞渗出，组织细胞变性、坏死。亚急性和慢性 期为组织细胞增生，肝、脾、淋巴结等处能见增殖性结节和肉芽肿。慢性期部 分病人肉芽组织发生纤维硬化性变，临床则出现后遗症。
目前，布病感染急性期要以抗菌治疗为主。常用抗生素有链霉素、四环素 族药物、磺胺类及TMP，另外氯霉素、利福平、氨苄青霉素也可使用。有些药 物治疗有复发情况，如果治疗不规范，如治疗剂量不足或疗程不够会出现慢性 感染。对慢性布病无特效药物治疗，只能以对症治疗为主。
发明内容
本发明人发现布氏菌104M菌株对患有布氏菌病的哺乳动物有良好的免疫 治疗效果。将小鼠用羊种M5弱毒菌株感染，感染1个月后给予布氏菌104M菌 株进行免疫治疗，治疗1个月后进行解剖分离脾脏活菌数，治疗组小鼠脾脏荷 菌数(log₁₀)为2.98，未治疗对照组脾脏荷菌数(log₁₀)为5.17，差异显著(P ＜0.05)；治疗3个月后治疗组小鼠脾脏荷菌数均为0，未治疗对照组脾脏荷菌 数(log₁₀)为1.94，差异明显。
本发明提供了一种用于治疗哺乳动物布氏菌病的治疗制剂，该制剂中含有 布氏菌104M菌株。本发明还涉及布氏菌104M菌株在制备用于免疫治疗哺乳 动物布氏菌病的治疗制剂中的应用。
本发明的治疗制剂为活疫苗，是冻干制剂，在冻干前，每升中含有 1×10¹¹-5×10¹⁴个布氏菌，优选含有约5×10¹¹个布氏菌。进一步，本发明的治 疗制剂中还含有冻干保护剂，例如，在冻干前，每升中还含有海藻糖40-60g、 谷氨酸钠4-6g、硫脲4-6g和蔗糖40-60g，余量为灭菌注射用水；优选每升 疫苗中含有海藻糖约50g、谷氨酸钠约5g、硫脲约5g和蔗糖约50g，余量为 灭菌注射用水。
本发明的治疗制剂优选通过皮内接种、鼻腔接种、皮下接种或皮上划痕接 种。优选哺乳动物为人、牛、羊、犬或猪。
本发明的治疗制剂可以按照本领域已知的各种方法制备。例如，本发明的 冻干制剂的制备方法可以包括如下步骤：将布氏菌104M种子批传代培养，收 获时用冻干保护剂洗下菌苔或刮取菌苔于冻干保护剂内，得原液；用冻干保护 剂将原液稀释至所需浓度，例如，1×10¹¹-5×10¹⁴个/L，优选约5×10¹¹个/L；分 装，例如，每安瓿含0.5ml(5次人用剂量)；冻干，得成品。其中所使用的冻 干保护剂可以每升含有海藻糖40-60g、谷氨酸钠4-6g、硫脲4-6g和蔗糖 40-60g，优选含有海藻糖约50g、谷氨酸钠约5g、硫脲约5g和蔗糖约50g， 余量为灭菌注射用水。当然，也可以使用本领域已知的其他的冻干保护剂。
具体实施方式
实施例1、菌种检定
1.1菌体培养：取一支保存的104M菌株(CMCC55010)，接种于TSA中 管斜面培养基，35～37℃培养44～48小时；
1.2变异检查检查：
1.2.1热凝集试验：用无菌生理盐水将新鲜培养物制成浓度为2.5×10⁹个/ml 的菌悬液，置90℃水浴中30分钟，观察有无凝集现象。
1.2.2三胜黄素试管凝集试验：取浓度为2.5×10⁹个/ml的菌悬液，与1∶1000 三胜黄素水溶液等量混合，于37℃放24小时，观察有无凝集现象。
1.2.3结晶紫染色检查：用无菌生理盐水将新鲜培养物制成浓度为1×10³个 /ml的菌悬液，接种TSA平皿，每平皿0.1ml，共接种2个平皿，35～37℃培养 5天，然后用结晶紫菌落染色法检查，计算阳性率。
1.3培养特性：用无菌生理盐水将新鲜培养物制成浓度为1×10⁹个/ml的菌 悬液，分别接种在含有1∶50000碱性复红TSA中管斜面培养基及1∶50000硫 堇TSA中管斜面培养基上观察生长情况；另外，取菌液接种于TS A中管斜面 培养基，加入醋酸铅试纸条，观察有无硫化氢产生。
1.4分子生物学检查：取菌液提取基因组，进行16sRNA基因序列测定。
1.5结果：
粗造型特性检查结果见下表1，培养特性检查结果见下表2，16sRNA基因 序列比对表明104M菌株与布氏标准菌株序列完全一致。因此，所使用的104M 菌株具有典型布氏菌的培养特性及分子生物学特征。
表1

表2

实施例2、半数致死量(LD₅₀)测定
1.1菌体培养：取一支保存的104M菌株，接种于TSA中管斜面培养基，35～ 37℃培养44～48小时；
1.2菌液制备：用无菌生理盐水将新鲜培养物制成菌悬液，并稀释至7.5×10⁸个/ml、1.5×10⁹个/ml、3.0×10⁹个/ml、6.0×10⁹个/ml、1.2×10¹⁰个/ml、2.4×10¹⁰个/ml、4.8×10¹⁰个/ml、9.6×10¹⁰个/ml等浓度。取体重18～20g小鼠，随机分组， 每组5只，各组分别用不同浓度的菌悬液腹腔注射，每只0.5ml，观察7天，根 据存活数量计算LD₅₀。
1.3结果：本发明菌株注射小鼠，半数致死量为2.2×10⁹个菌，符合2010年 版《中华人民共和国药典》三部规定。
实施例3、治疗制剂制备
1.1第一代菌体培养：取一支保存的104M菌株接种于TSA中管斜面培养 基，35～37℃培养44～48小时，为第一代；
1.2第二代菌体培养：取第一代培养的104M菌株，转种于TSA中管斜面 培养基，35～37℃培养44～48小时，为第二代；
1.3第三代菌体培养：取第二代培养的104M菌株，转种于TSA中管斜面 培养基，35～37℃培养44～48小时，为第三代；
1.4收获：用冻干保护剂(每升冻干保护剂中含有：海藻糖约50g、谷氨酸 钠约5g、硫脲约5g和蔗糖约50g，余量为灭菌注射用水)收集第三代培养 物，进行纯菌检查，合格后用冻干保护剂稀释至浓度为5×10⁸个/ml，得半成品； 将半成品分装成每安瓿含0.5ml(5次人用剂量)，冻干封口为成品。
实施例4、治疗效果研究
1.1感染：取20只6-8周雌性BALB/C小鼠，体重18-22g，随机分成2组， 分别为本发明制剂治疗组及生理盐水对照组，所有动物均经皮下攻击羊种布氏 菌M5弱毒株，攻击剂量为5×10⁸CFU/只。
1.2治疗：感染后28天，治疗组经皮内接种本发明制剂(0.5×10⁸个/只)， 生理盐水对照组经皮内给予同等剂量的生理盐水。
1.3解剖：分别在治疗后1个月及3个月，每组各取5只动物处死后无菌取 脾脏，通过脾脏细菌计数评价制剂的治疗效果。
1.4结果：
感染1个月后用本发明的制剂进行免疫治疗，治疗1个月后进行解剖分离 脾脏活菌数，治疗组小鼠脾脏荷菌数(log₁₀)为2.98，未治疗对照组脾脏荷菌 数(log₁₀)为5.17，差异显著(P＜0.05)；治疗3个月后治疗组小鼠脾脏荷菌 数均为0，未治疗对照组脾脏荷菌数(log₁₀)为1.94，差异明显。具体结果见下 表3和表4。
表3 治疗后1个月结果