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1、10申请公布号CN104147600A43申请公布日20141119CN104147600A21申请号201310547210822申请日20131108A61K39/39520060171申请人首都医科大学附属北京友谊医院地址100050北京市西城区永安路95号72发明人杨桦蔺莉54发明名称一种LN1免疫致小鼠生育障碍模型的构建57摘要本发明公开一种生育障碍，即复发性流产及不孕的小鼠模型的建立方法。该小鼠模型的建立方法通过用LN1主动免疫免疫BALBC小鼠，产生层粘连蛋白1自身抗体LN1，该抗体会引起自身免疫反应，诱导小鼠的流产及不孕。抗层粘连蛋白1自身抗体抗LN1抗体具有引起早孕阶段的习惯。
2、性流产甚至不孕的特点。该模型稳定，安全可靠，可重复率高，可用于目前发病率越来越高的复发性流产及不孕症的医学基础研究及临床研究，并且可以用为对药物疗效的观察，有良好的应用前景。51INTCL权利要求书1页说明书2页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书2页附图1页10申请公布号CN104147600ACN104147600A1/1页21选取810周雌性BALBC小鼠。2雌性小鼠后脚真皮内注射15UGLN1蛋白免疫小鼠，3周后加强免疫一次，第8周小鼠合笼。3本发明采用的小鼠为BALBC清洁级近交系小鼠。权利要求书CN104147600A1/2页3一种LN1免疫。
3、致小鼠生育障碍模型的构建0001技术领域生育功能障碍方面0002背景技术生殖是医学研究的热点，复发性流产是生育期妇女常见的妊娠并发症，复发性自然流产的病因及病理机制非常复杂，其中有大约50尚无明确病因，研究发现，免疫因素在其病理机制中占有重要位置。近代生殖免疫研究表明，复发性流产和不孕的病因，除染色体、解剖和内分泌异常外，约5060与免疫有关。流产史的猴子血清中，并且该抗体尤其与子宫内膜异位证的复发性流产及不孕有相关性。从生殖免疫观点看来，妊娠是一种成功的半同种移植，妊娠失败、流产可看为移植失败。除常见原因染色体、解剖、内分泌、感染之外，许多原因不明的流产可能与免疫排斥，即自身抗体的存在有关。。
4、国外文献报道抗层粘连蛋白1抗体与复发性流产及不孕相关。层粘连蛋白1是由1，1，1链组成的异三聚体，最初是由RUPERTIMP等于20世纪70年代从小鼠EHSENGELBRETHHOLMSWARM肉瘤中分离出来的。层粘连蛋白1属于黏附分子整合素蛋白家族，为细胞外基质的主要成分，是细胞黏附于基质的重要介质，与其受体结合后直接或间接控制细胞活动，如粘附或转移、极化和分化、增殖或凋亡、基因表达及刺激癌细胞产生胶原酶等，并在滋养细胞的黏附、侵入过程中有重要作用。抗LN1的自身抗体在生殖中有重要作用。动物实验表明，习惯性流产或不孕与自身抗体有关，抗层粘连蛋白1自身抗体首先发现于有习惯性流产史的猴子血清中，。
5、用鼠层粘连蛋白1或其层粘连蛋白1残基免疫猴，猴血清会引起胚胎毒性，不孕或习惯性流产。定位该抗体，发现其位于来自胚胎的REICHERS膜和卵黄囊内胚层细胞。临床研究显示，习惯性流产患者血清中的IGG层粘连蛋白1自身抗体明显升高。而且，其增高与其它IGG自身抗体如2糖蛋白1依赖的抗心磷脂抗体，狼疮抗体，抗DNA抗体，抗核抗体等无关。推测血清中的层粘连蛋白1自身抗体可能引起人类早孕阶段的习惯性流产。构建动物模型可以更好的进行医学基础及临床研究，但鉴于国情及各医学院校的条件，构建猴子、狗等动物模型不切实际，故我们构建小鼠的模型更加具有普遍性。建立可行的LN1免疫流产小鼠模型，为研究相关流产及不孕的病因。
6、的基础研究提供研究对象，为探讨复发性流产及不孕药物治疗的新途径提供研究平台。0003发明内容层粘连蛋白1自身抗体可能引起早孕阶段的习惯性流产。0004选取雌性BALBC小鼠，810周。在模型组的雌性小鼠后脚真皮内注射15UGLN1蛋白免疫小鼠；空白组仅注射完全弗氏佐剂。3周后加强免疫一次，第8周小鼠合笼，观察妊娠结局及进行相关指标的检测。0005本发明采用的小鼠为BALBC清洁级近交系小鼠。0006该抗体可用于建立习惯性流产及不孕的小鼠模型，可用于复发性流产及不孕症的基础及临床研究。0007附图说明图1本发明的技术路线。0008具体实施方式11实验动物雌性BALBC小鼠，810周，45只，体重。
7、2022克，由北京维通利华实验动物有限公司提供。000912药物抗层粘连蛋白1LN1SIGMA产001013试剂聚丙乙烯板上包被，胎牛血清，辣根过氧化物酶，含双氧水的邻苯二胺，说明书CN104147600A2/2页4硫酸。001114实验方法0012141实验分组对照组30只、模型组45只0013142将免疫用的LN1与完全弗氏佐剂乳化；0014143在模型组的雌性小鼠后脚真皮内注射15UGLN1蛋白免疫小鼠；空白组仅注射完全弗氏佐剂。00151443周后模型组的雌性小鼠同一部位再次注射含15UGLN1的PBS，对照组注射PBS。00161458周后对2组小鼠采血测定抗LN1抗体，与雄性11交。
8、配一周，等到生产后3天再次采血，测定抗LN1抗体，计算各组妊娠率，流产率，产子率。0017145应用ELASE方法，取各组血清进行层粘连蛋白1抗体测定。0018146在490NM处测定光密度OD值。分别计算出的平均OD值，得出抗体滴度。00192结果002021小鼠的妊娠率及流产率对照组30只中27只生产，其中2只共有4只死胎；模型组45只中4只生产，其中1只有流产现象，生产数量不明，另一只难产，辅助取胎，6只小鼠均为死胎。结果对照组妊娠率90，模型组组妊娠率889，对照组流产率为0，模型组组流产率25。故生育障碍的模型小鼠建立成功。0021顺产流产难产产活子数妊娠率正常组7003590对照组。
9、2111825002222不同组LN1值的比较0023抗LN1抗体滴度交配前抗LN1抗体滴度产后3天对照组01059000490162201260模型组255691104326116149400024221模型组抗LN1抗体的值显著高于对照组，P005，具有统计学意义，说明已小鼠模型建立成功。0025层粘连蛋白1自身抗体可能引起早孕阶段的习惯性流产，该抗体可用于建立习惯性流产及不孕的鼠模型。该模型稳定，安全可靠，可重复率高，可用于目前发病率越来越高的复发性流产及不孕症的医学基础研究及临床研究，并且可以用为对药物疗效的观察，有良好的应用前景。说明书CN104147600A1/1页5图1说明书附图CN104147600A。