血小板裂解物凝胶.pdf

本发明涉及包含血小板裂解物的药物组合物及其在治疗创伤、肛裂、阴道萎缩或皱纹中的应用。

1.  一种药物组合物，所述药物组合物包含：(a)治疗性血小板裂解物，(b)至少一种药物可接受的聚合物，和(c)至少一种药物可接受的带正电荷的化学物种，所述化学物种选自由赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、聚氨基酸、鱼精蛋白、氨基胍、锌离子和镁离子组成的组，其中，所述组合物是室温下粘度为1000mPa·s(cP)至500,000mPa·s(cP)的水性凝胶。

2.  如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述血小板裂解物的浓度为0.1μg/g组合物至1,000μg/g组合物。

3.  如权利要求1或2所述的药物组合物，其中，所述聚合物是纤维素聚合物。

4.  如权利要求3所述的药物组合物，其中，所述纤维素聚合物是羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或甲基纤维素。

5.  如权利要求3或4所述的药物组合物，其中，所述纤维素聚合物的浓度是1.5％(w/w)至4.0％(w/w)，并且所述聚合物的分子量为450,000至4,000,000。

6.  如权利要求1或2所述的药物组合物，其中，所述聚合物是普流尼克酸，可选地为Pluronic F-127。

7.  如权利要求1、2和6中任一项所述的药物组合物，其中，所述聚合物的浓度为15％(w/w)至30％(w/w)。

8.  如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，带电荷的所述物种的浓度为0.1％(w/w)至3.0％(w/w)。

9.  如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，所述粘度在25℃为50,000mPa·s(cP)至150,000mPa·s(cP)。

10.  如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，所述组合物还包含选自由对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和间甲酚组成的组的防腐剂。

11.  如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中，所述血小板裂解物来自人。

12.  一种制备血小板裂解物的方法，所述方法包括对血小板群进行至少1个冷冻-解冻循环，其中，每个循环的冷冻部分在等于或小于-78℃的温度下进行。

13.  如权利要求12所述的方法，其中，所述方法包括对所述血小板群进行3个或4个冷冻-解冻循环。

14.  如权利要求12或13所述的方法，其中，使用液氮作为制冷手段，由此，在每个循环的冷冻部分中，浸入液氮导致了95％以上的血小板裂解，从而导致更多的生长因子释放以及改进的细胞生长、修复和再生功能，这可通过成纤维细胞和PGDF测定来测量，但不限于成纤维细胞和PGDF测定。

15.  如权利要求12至14中任一项所述的方法，其中，使用干冰(固态二氧化碳)和有机溶剂作为每个循环的冷冻部分中的制冷手段。

16.  一种制备血小板裂解物的方法，所述方法包括：对血小板群进行机械均化(“韦林氏搅切器”)、液体匀化、超声处理、利用醇和干冰或其他方式的冷冻-解冻、在液氮中机械磨碎从而以>75％、但通常>90％裂解，由此使生长因子从血小板和α颗粒中释放到溶液中，而旋转刀片则将细胞和组织磨碎和分散；通过强迫细胞或组织悬液通过狭窄空间而对细胞或组织悬液进行剪切；高频声波剪切细胞；反复的冷冻和解冻循环通过冰晶形成而破坏细胞；磨碎组织，在液氮中冷冻，其中裂解使生长因子从血小板和α颗粒中释放到溶液中。

17.  如权利要求12至16中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括将所述血小板裂解物冻干。

18.  一种用权利要求12至17中任一项所述的方法制备的血小板裂解物。

19.  权利要求1至11中任一项所述的药物组合物或权利要求18所述的血小板裂解物，其用于治疗有需要的患者的创伤、肛裂、阴道萎缩或皱纹。

20.  一种治疗有需要的患者的创伤、肛裂、阴道萎缩或皱纹的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1至11中任一项所述的药物组合物或权利要求18所述的血小板裂解物。

21.  一种制备权利要求1至11中任一项所述的药物组合物的方法，所述方法包括将血小板裂解物与至少一种药物可接受的聚合物和至少一种药物可接受的带正电荷的化学物种混合，从而使所得到的组合物是室温下粘度为1000mPa·s(cP)至500,000mPa·s(cP)的水性凝胶。

22.  一种制备权利要求1至11中任一项所述的药物组合物的方法，所述方法包括：(a)用权利要求12至17中任一项所述的方法制备血小板裂解物，和(b)将所述血小板裂解物与至少一种药物可接受的聚合物和至少一种药物可接受的带正电荷的化学物种混合，从而使所得到的组合物是室温下粘度为1000mPa·s(cP)至500,000mPa·s(cP)的水性凝胶。

血小板裂解物凝胶
技术领域
本发明涉及包含血小板裂解物的药物组合物及其在治疗创伤、肛裂、阴道萎缩或皱纹中的应用。
背景技术
约15％的糖尿病患者在其一生中会具有溃疡。每年，患有1型或2型糖尿病的人中有1％至3.6％的基于人口的发病率。到2030年，每年将有约1300万人患有糖尿病性足部溃疡。足部溃疡之后是超过84％的非创伤性下肢截肢。此外，首次截肢后的3年死亡率据估计高达20％～50％。治愈单个溃疡的平均成本为$8,000，治愈受感染的溃疡的平均成本是$17,000，而大截肢术的平均成本是$45,000。出现溃疡后2年期间由足部溃疡及其后遗症导致的高额成本是平均每个患者$27,987(美国糖尿病协会；美国卫生与公共服务部；糖尿病护理；Journal of Clinical investigations；JAMA293:217-228,2005；Diabetes Care22:157-162,1999)。
流向受伤部位的自由的血流为信号传导分子和营养物质提供了通道。对胶原蛋白形成的增殖和重塑的调控需要分子过程的协调配合(例如蛋白酶和蛋白酶抑制剂的平衡)。免疫和炎症反应确保细菌和碎片被吞噬和除去，以预防感染(J Invest Dermatol.2007年5月；127(5):1018-29)。如果不治疗，糖尿病性溃疡可能从受刺激但未破损的小皮肤斑块发展为潜在威胁生命的涉及大范围组织坏死和感染的创伤。对糖尿病性皮肤溃疡的治疗可包括使创伤干燥、对坏死组织进行清创(切除)和施用全身性抗生素(美国足踝外科医生学院；Medscape网站；Clinical Diabetes Spring2009，第27卷，第2期，52-58)。
对于在化妆品中使用血小板裂解物，众所周知健康的皮肤需要生理、细胞和分子水平上的紧密协调。持续健康的皮肤所需要的三个关键功能包括有功能的结缔组织细胞、完好的皮肤细胞外基质(ECM)和对增殖与重塑过程的严密分子调控。
形成新组织的过程需要包括蛋白酶、组织抑制剂和促炎及抗炎分子在内的许多因 素的作用和平衡。这些因素的协调调控确保了在临时支架降解时可产生永久的胶原蛋白组织。
有功能的结缔组织细胞
细胞外基质(ECM)发挥皮肤结构框架功能，其合成、维护和提供都需要皮肤内的细胞，例如成纤维细胞和角质形成细胞。特别重要的是，产生皮肤中大部分胶原蛋白的成纤维细胞能够保持健康和弹性[1]。基于血小板和生长因子的溶液通过增加有益因子的局部浓度来促进创伤愈合[2,3]。目前的疗法是侵入性的，或最低限度地加速创伤愈合过程。先进的敷料(例如水状胶体凝胶)相对于糖尿病溃疡治疗中传统的非贴附性纱布的改进有限[6]。在过去15年中创伤愈合方面的技术突破也是有限的，就病人的质量调整寿命年数(QALY)结果而言，几乎没有改善[7]。
在健康的皮肤中，真皮中的完好的I型胶原蛋白原纤维为成纤维细胞提供机械稳定性和附着位点。成纤维细胞表面上的受体(整联蛋白)附着至胶原蛋白(以及真皮细胞外基质中的其他蛋白)。成纤维细胞内的细胞骨架机构(肌动蛋白-肌球蛋白微丝，未示出)在完整的胶原基质上拉动，进而提供机械阻力。所产生的动态机械张力促进细胞内支架(微管/中间丝，未显示)的组装，细胞内骨架向外推从而使成纤维细胞伸展。这种伸展是成纤维细胞产生正常水平的胶原蛋白和蛋白酶所需的。
完好的皮肤细胞外基质(ECM)
对于健康的、无皱纹的皮肤而言，完好的胶原蛋白(ECM中最丰富的蛋白质)、弹性蛋白、透明质酸、蛋白聚糖、纤连蛋白和层粘连蛋白的健康平衡是必需的。这些成分产生了支撑皮肤的支架并赋予其均匀分布的纹理[8]。
对增殖与重塑过程的严密分子调控
新组织的形成需要包括蛋白酶、组织抑制剂和促炎及抗炎分子在内的多种因子的作用和平衡。这些因子的协调调控确保产生永久性的胶原组织、确保受损的分子被切割和清除，并且确保结缔组织的整体健康[9]。
所有的原纤维胶原蛋白都由以三螺旋结构相互缠绕的三条多肽链组成。该可溶性三螺旋称为前胶原，在成纤维细胞的内部组装。前胶原由成纤维细胞分泌，并且在胞外空间中通过两种酶去除肽的末端[10]。除去末端后产生胶原蛋白，胶原蛋白自发地组装(即成熟)成酶促交联的较大纤维。该交联对于正常结构支撑而言是必需的[11]。I型胶原蛋白通过酶促降解而发生自然分解；然而，这种降解在人类皮肤中极为缓慢 [12]。人仅表达四种能够引发I型胶原分解的酶[13]。
这些胶原蛋白酶是基质蛋白降解酶(称为基质金属蛋白酶(MMP))家族的成员[14]。MMP负责多种胞外基质蛋白的生理降解[12]。在人类所表达的4种胶原蛋白酶中，只有间质胶原酶(MMP-1)参与皮肤胶原蛋白的正常周转[14]。在健康的年轻皮肤中，MMP-1的表达极低，接近最灵敏的测量方法的检测极限。
一旦被MMP-1切割，胶原就会解开，然后解开的胶原蛋白(称为明胶)由MMP家族的其他成员(称为明胶酶)进一步降解。在正常皮肤中这些明胶酶也以非常低的水平表达[14，15]。此外，皮肤还表达这些MMP的天然抑制剂。这种基质金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)进一步作用以延缓胶原蛋白的分解。因此，人皮肤中的I型胶原蛋白非常稳定，需要平均约30年来更换[1，12]。
皱纹
皱纹由习惯性的面部表情、衰老、晒伤、吸烟、水化较差以及其他各种因素造成。在应激下，成纤维细胞产生更少的ECM分子和更多的分解已有基质的分子。这在反馈回路中导致结缔组织细胞的进一步功能失调。
结缔组织细胞的功能失调
在人皮肤中，在机械张力、胶原蛋白的合成和由胶原蛋白酶(COLase)导致的胶原碎片化之间，存在着精密的关系。在老化的人皮肤中，丧失了成纤维细胞与整联蛋白的附着，并且碎片化的胶原蛋白原纤维不能提供足够的机械稳定性来维持正常的机械张力。降低的机械张力使成纤维细胞塌缩，塌缩的成纤维细胞产生更少的前胶原和更多的胶原酶(COLase)。胶原蛋白的产量下降和胶原酶催化的胶原碎片化的增加导致机械张力的进一步降低，从而引起胶原蛋白的持续丧失[1]。
已有ECM的分解
已有ECM分子(特别是胶原纤维)因物理、化学或蛋白水解性破坏而分解，从而在整个ECM中留下胶原蛋白和其他分子碎片。
I型胶原蛋白周转的速度缓慢，这使得损害其功能的年龄依赖性修饰得以积累。这些改变包括形成由糖衍生的新交联[14]。重要的是，在MMP介导的周转的缓慢的正常过程中，这些交联不能被高效地分解和去除，从而使碎片化的胶原蛋白在细胞外基质中随皮肤老化而积累[15，16]。交联阻止了胶原蛋白片段的彻底清除。这些片段不能被修复，也不能并入新产生的胶原蛋白原纤维中，因此在三维胶原蛋白基质中造 成缺陷。这些缺陷破坏了真皮的结构和机械完整性，从而有害地改变了其功能。碎片化胶原蛋白的积累成为人皮肤外观的年龄相关变化的核心[1]。
失调的分子信号传导
塌缩的成纤维细胞和降解的ECM不成比例地提高了皱纹部位的基质金属蛋白酶相对于金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)的浓度，从而阻碍了组织再生[1，10-20]。
活性氧物种(ROS)是环境诱发的老化和固有的老化的副产物，其在皮肤内引起生化反应级联，导致基质金属蛋白酶(MMP)和促炎细胞因子的产生。由成纤维细胞和角质形成细胞分泌的MMP减少胶原蛋白的形成并加剧胶原蛋白的降解，从而促进了真皮基质的分解[19]。
现有的皱纹疗法
市场上现有的治疗均是失败的，这些治疗并不能重建具有持久效果的年轻外表。这些治疗的目的是治疗皱纹症状，但未解决根本成因。毒素暂时放松拉紧皮肤的面部肌肉，但不会修复底层的细胞外基质。和可导致“冻脸”，但具有吞咽、讲话和呼吸问题。填料(例如透明质酸、胶原蛋白、聚L-乳酸和羟磷灰石)可短期“填补空隙”，但不能使皮肤恢复至正常的生理状态或阻止退化周期。
化妆品行业的技术突破在过去的30年里十分有限，在过去的十年仅有零星的进步。第一代和第二代注射疗法起效快，但效果持续时间有限。
血小板裂解物疗法
几个长期存在的问题影响了血小板裂解物(PL)在临床上的大泛围适应和使用。主要问题有(但不局限于)以下方面：供体来源的样品在处理过程中面临污染风险；在计数和分泌有益生长因子的能力方面，患者与患者之间的血小板质量存在差异，这使得制品不一致；需要在医师办公室试剂盒中进行血小板定量；由于血小板计数的固有差异，治疗性制品导致患者与患者间的差异性较高，影响功效；现有方法不方便，临床医生必须离心血液以从血液中分离出血小板，而这个可持续25分钟～30分钟的过程的差异性同样导致误差；而且，现有的过程成本效益低，估计每次治疗成本为130美元(Plateltex)。本发明是对这些长期持续存在的问题的一种非显而易见的解决方案。
附图说明
图1显示了用于制备本发明的血小板裂解物和本发明的药物组合物的规程的流 程图。
图2和3显示出本发明提供了方便、始终一致并且符合cGMP标准的具有成本效益的差异化产品。
图4至7显示出本发明解决了长期持续存在的对提供质量可控制、使用方便且具有成本效益的始终一致的创伤护理产品的需求。
发明内容
本发明提供了一种包含血小板裂解物的药物组合物。所述组合物可以治疗性地应用于创伤(例如溃疡性创伤)、肛裂、阴道萎缩或皱纹。
发明人还设计了裂解血小板的更高效的方法，从而使血小板将其生长因子释放到溶液中成为血小板裂解物。该新型血小板裂解物自身可用作治疗剂，或可以配制成本发明的药物组合物。
本发明的组合物或裂解物可被冻干，从而产生稳定的含有所述生长因子的冷冻干燥粉末，其可用于创伤愈合方面的治疗性应用，还可用于对递送天然生长因子的需求日益增加的其他治疗性应用。
本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：(a)治疗性血小板裂解物，(b)至少一种药物可接受的聚合物，和(c)至少一种药物可接受的带正电荷的化学物种，所述化学物种选自由赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、聚氨基酸、鱼精蛋白、氨基胍、锌离子和镁离子组成的组，其中所述组合物是室温下粘度为1000mPa·s(cP)至500,000mPa·s(cP)的水性凝胶。
本发明还提供：
-一种制备血小板裂解物的方法，所述方法包括对血小板群进行至少1个冷冻-解冻循环，其中，每个循环的冷冻部分在等于或小于-78℃的温度下进行；
-一种制备血小板裂解物的方法，所述方法包括：对血小板群进行机械均化(“韦林氏搅切器”)、液体匀化、超声处理、利用醇和干冰或其他方式的冷冻-解冻、液氮中的机械磨碎从而以>75％、但通常>90％裂解，由此使生长因子从血小板和α颗粒中释放到溶液中，而旋转刀片则将细胞和组织磨碎和分散；通过强迫细胞或组织悬液通过狭窄空间而对细胞或组织悬液进行剪切；高频声波剪切细胞；反复的冷冻和解冻循 环通过冰晶形成而破坏细胞；磨碎组织，在液氮中冷冻，其中裂解使生长因子从血小板和α颗粒中释放到溶液中；
-利用本发明的方法制备的血小板裂解物；
-本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物，用于治疗有需要的患者的创伤、肛裂、阴道萎缩或皱纹；
-一种治疗有需要的患者的创伤、肛裂、阴道萎缩或皱纹的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物；
-一种制备本发明的药物组合物的方法，所述方法包括将血小板裂解物与至少一种药物可接受的聚合物和至少一种药物可接受的带正电荷的化学物种混合，以使所得到的组合物是室温下粘度为1000mPa·s(cP)至500,000mPa·s(cP)的水性凝胶；和
-一种制备本发明的药物组合物的方法，所述方法包括：(a)利用权利要求14至20中任一项所述的方法制备血小板裂解物，和(b)将所述血小板裂解物与至少一种药物可接受的聚合物和至少一种药物可接受的带正电荷的化学物种混合，以使所得到的组合物是室温下粘度为1000mPa·s(cP)至500,000mPa·s(cP)的水性凝胶。
具体实施方式
发明详情
本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物会进入应用，并且所有成分均将接受严格测试以确保本发明的产品对患者安全且有效。这些过程包括血小板筛选和可以制备无菌血小板凝胶的方法。本发明执行安全、有效且无菌的工艺。在优选的实施方式中，将无菌血小板裂解物与无菌甲基纤维素凝胶混合，以产生本发明的治疗性血小板组合物。本发明规程流程图可见于图10。
本发明的药物组合物对皱纹的有效性
本发明提供了一种再生疗法，其直接解决与皱纹有关的各种问题，并且增强皮肤和下层支架。用本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物进行的治疗会使受伤皮肤的退行性循环逆转为正常皮肤中所见的健康生理学。本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物通过使结缔组织中的细胞重获均衡、使分子信号传导达到平衡和恢复细胞外基质来发挥作用。自然愈合及组织再生过程导致胶原蛋白的合成增加、胶原蛋白细胞外基质的再生以及基质内成纤维细胞的增殖。
结缔组织中重获均衡的细胞
由于本发明的药物组合物源自血小板，其通常包含源自血小板并促进细胞生长的各种生长因子。本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物通常包含以下生长因子中的一种以上、优选全部：PDGF、VEGF、FGF、EGF、TGF(尤其是TGF-β)和CTGF。所述组合物优选包含2、3、4、5或6种上述生长因子。
血小板源性生长因子(PDGF)促进细胞生长和生成、血管修复和胶原蛋白产生。血管内皮生长因子(VEGF)促进血管内皮细胞的生长和产生。成纤维细胞生长因子(FGF)促进组织修复、细胞生长、胶原蛋白产生和透明质酸产生。上皮生长因子(EGF)促进上皮细胞的生长、血管发生和创伤愈合。转化生长因子(TGF)，尤其是TGF-β，促进上皮细胞的生长和新生以及创伤愈合。结缔组织生长因子(CTGF)促进创伤修复。
本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物因此促进新成纤维细胞的形成。这些新成纤维细胞开始是弹性和健康的，产生新胶原蛋白和更少的金属蛋白酶。成纤维细胞(合成、保持和提供结构支架的主要细胞)的恢复导致更健康的恢复的皮肤[1]。
还已经显示PDGF增加了成纤维细胞的移动力，使得成纤维细胞可再定位至施用位点。
恢复的细胞外基质(ECM)
存在于血小板的α-颗粒中的天然生长因子(如PDGF，VEGF，FGF，EGF和TGF)促进胶原蛋白和透明质酸的产生、组织修复、内皮细胞和上皮细胞的生长和再生、以及新血管形成(其储存氧，并清除不需要的分子)。所有这些因子都有助于使有皱纹和损伤的ECM再生回到其健康状态。这些生长因子中的每一种均在皮肤再生和恢复中发挥作用，既单独作用又相互协作地一同作用。刺激产生未碎片化的新胶原蛋白的治疗将为老化部位的外观和健康提供大幅改善[1]。
经平衡的分子信号传导
在皱纹下施加血小板裂解物提供了浓缩剂量的TIMP蛋白以解决金属蛋白酶失衡，防止ECM的进一步降解，并提高皮肤再生速度。向皮肤直接施加血小板裂解物提供了浓缩剂量的TIΜΡ蛋白以解决金属蛋白酶失衡，从而支持胶原组织增殖和重塑。血小板含有例如TIMP-2，TIMP-2抑制大部分MMP，但优先抑制MMP-2和MMP-9[20]。本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物通常包含TIMP金属肽酶抑制剂2(TIMP-2)。
本发明的优点
本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物将容易适应慢性创伤愈合市场，并相对于富含血小板的血浆以及其他自体再生细胞疗法具有以下优点。
1.制备
内部的按比例扩大的符合cGMP标准的体外血小板制备平台，提供高产量的安全、纯净且具有活性的血小板。
2.制剂
裂解血小板以释放重要的生长因子。裂解物被浓缩至标准功效的治疗剂量，并冷冻干燥以在冷冻温度下长期贮存。人造皮肤测定中的QC测试确保在所有批次中获得一致的高浓度生长因子，并且对于富含自体血小板的血浆，未见患者间差异性。
3.施用
高效的一步工序：(a)施用本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物、(b)使冷冻干燥的本发明的血小板裂解物再水化、(c)将冷冻干燥的本发明的血小板裂解物与聚合物凝胶化因子混合、或(d)使本发明的药物组合物再水化，这为临床医师简化了现有过程并标准化了患者给药剂量。
现有的富含血小板的血浆疗法的工序包括离心血液并分离未浓缩的未表征的血浆，该血浆的生长因子浓度随患者而有所不同。不同于其他的真皮刺激剂(例如，聚L-乳酸)，血小板疗法迅速产生其效果。其是可重复的且易于使用。
其他优点如下表1所示。
表1.与之前各代产品相比，本发明的治疗性组合物(标为第4代)的优点。

1 随患者可变，2 异常的血液或血小板生理学
血小板疗法是天然的持续性方案，而已知产品均为非天然并且是临时的，本发明的药物组合物和本发明的血小板裂解物为患者提供了更好的方案，具有更少的访问次数且节约成本。不同于已知产品，本发明的药物组合物和本发明的血小板裂解物将血小板和生长因子的浓度标准化，从而获得了一致的结果。
另外，该治疗性组合物为提供质量可控、方便使用且具有成本效益的始终一致的真皮再生产品克服了障碍。
制备：本发明的组合物是符合cGMP标准的标准化产品，可确保一致的真皮再生结果。
适用性：本发明的组合物是一步施加的血小板裂解物制剂，可为医师节约大量时间。
成本：与其它富含血小板的血浆疗法相比，本发明的组合物以具有成本效益的价格提供了真皮再生。
所要解决的问题的其他非显而易见的解决方案在于：市场上没有其他商业血小板裂解物/甲基纤维素凝胶，文献中没有其他血小板裂解物/甲基纤维素凝胶。
糖尿病溃疡
糖尿病患者通常患有阻碍血流的外周动脉疾病，这限制了创伤部位对信号传导分子和营养物质的获取。高浓度的细胞因子增加了创伤部位处金属蛋白酶相对于抑制剂的浓度，从而阻碍了正常的组织再生。免疫调节因子的较差激活与低水平的杀菌性一氧化氮的组合增加了感染的可能性和严重性[21]。虽然还没有完全理解创伤愈合的确切过程，但已知的是血小板分泌了一组对该过程至关重要的因子。对于创伤愈合重要的因子由血小板、巨噬细胞和成纤维细胞自然分泌。PDGF、EGF和TGF被认为是创伤愈合过程中的关键因子。其他因子也起着重要的作用，并由巨噬细胞和成纤维细胞分泌，由血小板募集至创伤部位。皮肤大概是受伤最多的器官。皮肤修复是一个复杂的过程，可以分为4个阶段，通常被描述为炎症、肉芽组织形成、结缔组织基质的上皮化和结缔组织基质的重塑。这些阶段中的每一个本身就很复杂，并且很显然的是，为了实现良好的创伤愈合，这些过程必须接连地且协调地发生。良好的创伤愈合可以定义为皮肤(包括真皮和表皮部分)以下述方式恢复：所生成的瘢痕组织在结构上、组织学上、功能上和美学上最大限度地模仿未受伤的皮肤，显然这样的瘢痕组织不同于肥厚性瘢痕或瘢痕疙瘩。
为清楚起见，下文简述了人皮肤的组成。上层部分由表皮构成，主要含有上皮细胞，一些。表皮中存在五个不同的层。表皮的基底，即在层状结构的底部，通过基底膜而附着至真皮。真皮由结缔组织(包括成纤维细胞和其它结缔组织细胞)和结缔组织基质物质组成。血管、神经、感觉器官、汗腺、皮脂腺和毛囊存在于真皮中。临床实验证明，应用血小板裂解物制品可诱导慢性创伤(例如溃疡)及烧伤的创伤愈合。
糖尿病性溃疡是糖尿病患者下肢中的神经病和血液循环减少的结果。这些难以愈合的创伤形成了大量渗出液，这些渗出液目前的处理方式是通过由特定创伤敷料吸收掉大部分。渗出液含有多种蛋白和细胞。这些蛋白中的一种是凝血酶(当前假说，需要确认)，凝血酶是激活血小板的凝血级联中的一种组分。血小板是血液中的小细胞，其在激活时形成血凝块并释放其生长因子内容物。血小板由组织损伤激活，而血凝块阻止了进一步出血。生长因子促进受损组织的再生和修复。许多研究者已尝试以多种制剂(例如富含血小板的血浆、血小板裂解物、血小板凝胶和血小板)来捕获血小板的创伤愈合能力。这些产品用体外活化的血小板制备，并随后制备成合适的制剂并应用于伤口。
治疗性血小板浓度据描述为1×10⁹个血小板/ml，本发明人通过离心分离和浓缩血小板而实现了这一浓度。理想的浓度需要通过临床评估来确定，但其范围很可能是从富含血小板的血浆中的浓度(该浓度大约是外周血中浓度的两倍，即4×10⁸血小板/ml，如果患者血液水平为2×10⁸血小板/ml的话))到2×10⁹血小板/ml。金标准是：室温下储存分离的血小板，同时搅拌它们直到它们完成处理(遵循Welsh Blood Service的标准指南)。
血小板裂解物
已表明血小板裂解物(PL)对创伤愈合有正效果。治疗性血小板裂解物是适用于疗法的血小板裂解物。本发明的血小板裂解物或在本发明的药物组合物中使用的血小板裂解物通常包括上文所述的PDGF、VEGF、FGF、EGF和TGF中的一种或多种，优选包含其全部。它还通常包含TIMP-2。
血小板的裂解可以通过化学手段(即，CaC1₂)、渗透压手段(使用蒸馏水)或通过冷冻/解冻程序来完成。用于本发明的血小板裂解物还可以来源于全血，并且可以按照美国专利5,198,357号[22]所述的方式来制备，通过引用将其并入本文。
此前，已经通过在-20至-80度范围内的不同温度下的冷冻-解冻循环(很少使用超 过1个循环)制备了PL。发明人的数据显示，完整血小板的数量仅受到在-80/+37度的冷冻-解冻循环的轻微影响。事实上，在比较-20度、-80度和液氮冷冻时，只有液氮能实现90％的裂解，而-20度和-80度分别实现80％和50％的裂解。然而，值得注意的是，上述实验包含3个冷冻-解冻循环，由此表明以一个冷冻-解冻循环采用-80度的现有技术中的PL制备只能实现约20％裂解。液氮还具有能够在一个小时内进行3个以上冷冻-解冻循环的优点，因此对于临床环境是非常合适的方法。另外，液氮促进过程标准化，因为氮气的液体形式始终是-196℃，而冰箱的温度则会随时间变化，特别是当有多个使用者自然地频繁开门时；标准化在制备临床用产品时特别重要。
本发明提供一种制备血小板裂解物(PL)的方法，所述方法包括对血小板群进行至少1个冷冻-解冻循环，其中每个循环的冷冻部分在等于或小于-78℃的温度下进行。该方法可包括任何数量的冷冻-解冻循环，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30个或更多。所述方法优选包括对血小板群进行5个以下冷冻-解冻循环，例如4个以下冷冻-解冻循环、3个以下冷冻-解冻循环或2个以下冷冻-解冻循环。所述方法更优选包括对血小板群进行仅1个冷冻-解冻循环、仅2个冷冻-解冻循环、仅3个冷冻-解冻循环或仅4个冷冻-解冻循环。
每个循环中的解冻温度可以是使血小板组合物解冻的任何温度，例如约5℃至约50℃、例如约10℃至约45℃、或约20℃至约40℃。每个循环中的解冻温度通常为约37℃。
每个循环中的冷冻温度优选小于或等于约-79℃、小于或等于约-80℃、小于或等于约-81℃、小于或等于约-82℃、小于或等于约-83℃、小于或等于约-84℃、小于或等于约-85℃、小于或等于约-86℃、小于或等于约-87℃、小于或等于约-88℃、小于或等于约-89℃、小于或等于约-90℃、小于或等于约-100℃、小于或等于约-110℃、小于或等于约-120℃、小于或等于约-130℃、小于或等于约-140℃、小于或等于约-150℃、小于或等于约-160℃、小于或等于约-170℃、小于或等于约-180℃、小于或等于约-190℃或为约-196℃。
同一方法的不同循环中的冷冻和解冻温度通常相同。
在优选的实施方式中，液氮用作各冷冻循环中的制冷手段。每个循环的冷冻部分中的液氮浸入通常导致95％以上的血小板裂解，从而获得更多的生长因子释放和改进的细胞生长、修复和再生功能，这可通过但不限于成纤维细胞和PGDF测定来测量。
本发明还提供用本发明的方法生产的血小板裂解物。所述血小板裂解物不同于已知的裂解物，原因是它来自大于约80％的血小板裂解，例如大于约85％或大于约90％的血小板裂解。因此，它包含更多生长因子并具有改进的细胞生长、修复和再生功能，这可通过但不限于成纤维细胞和PGDF测定来测量。
在本发明的药物组合物中，血小板裂解物的存在浓度为约0.1μg至约1,000μg/g组合物，例如约0.2μg至约750μg/g组合物、约0.5μg至约500μg/g组合物、约1μg至约250μg/g组合物、约2μg至约200μg/g组合物或约10μg至约100μg/g组合物。
本发明的血小板裂解物或在本发明的药物组合物使用的血小板裂解物可源自任何哺乳动物的血小板。所述哺乳动物优选是人。不过，其可以是非人动物。合适的非人动物包括但不限于：灵长类动物，例如狨猿或猴；商业养殖的动物，例如马、牛、绵羊、山羊、羊驼、原驼、鹿或猪；宠物，例如狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠、雪貂、沙鼠或仓鼠；或野生动物，例如獾或鹿。
药物可接受的聚合物
本发明的药物组合物包含至少一种药物可接受的聚合物。所述组合物可包含任何数量的药物可接受的聚合物，例如1、2、3、4、5、10种或更多种。
如果其适合用于治疗，则聚合物就是药物可接受的。聚合物优选适合于对创伤(例如本文所述的任何创伤)、肛裂、阴道萎缩或皱纹进行局部施用。
药物可接受的聚合物是本领域熟知的。任何此类聚合物均可以按照本发明使用。
所述聚合物的浓度优选为约15％(w/w)至约30％(w/w)，例如约17％(w/w)至约25％(w/w)，或约20％(w/w)至约23％(w/w)。
所述聚合物优选为纤维素聚合物。合适的纤维素聚合物在本领域中已知。纤维素聚合物是羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或甲基纤维素。纤维素聚合物的浓度优选为约1.5％(w/w)至约4.0％(w/w)，例如约2.0％(w/w)至约3.0％(w/w)。纤维素聚合物的分子量优选为约450,000至约4,000,000，例如约500,000至约3,500,000、约500,000至约3,000,000或约750,000至约2,500,000或约1000,000至约2,000,000。
所有聚合物优选为普流尼克酸(pluronic acid)，可选地为Pluronic F-127。
药物可接受的带正电荷的化学物种
本发明的药物组合物包含至少一种药物可接受的带正电荷的化学物种，所述化学物种选自由赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、脯氨 酸、丝氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、聚氨基酸、鱼精蛋白、氨基胍、锌离子和镁离子组成的组。
如果其适合用于治疗，则物种就是药物可接受的。所述物种优选适合于对创伤(例如本文所述的任何创伤)、肛裂、阴道萎缩或皱纹进行局部施用。
所述组合物可包含任何数量的药物可接受的物种，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种所列物种。
该带电物种的浓度优选为约0.1％(w/w)至约3.0％(w/w)，例如约0.2％(w/w)至约2.5％(w/w)、约0.5％(w/w)至约2.0％(w/w)或约1.0％(w/w)至约1.5％(w/w)。
粘度
本发明的药物组合物是水性凝胶。所述组合物中的聚合物形成了分散有水分子的网络结构。本发明的药物组合物优选为水凝胶。
所述水性凝胶在室温下的粘度为约1000至约500,000微帕斯卡秒(mPa·s)(也称为厘泊；cP)。粘度是凝胶对剪切应力或拉伸应力引起的变形的抗性的量度。粘度可以使用本领域中已知的任何方法来测量。合适的方法包括但不限于使用粘度计或流变仪。
室温通常为约18℃至约25℃，例如约19℃至约24℃或约20℃至约23℃或约21℃至约22℃。室温优选为18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃和25℃中的任一种。粘度最优选在25℃下测量。
凝胶的粘度优选在室温下为约1000至约500,000mPa·s，例如室温下为约1500至约450,000mPa·s、室温下为约2000至约400,000mPa·s、室温下为约2500至约350,000mPa·s、室温下为约5000至约300,000mPa·s、室温下为约10,000至约250,000mPa·s、室温下为约50,000至约200,000mPa·s或室温下为约50,000至约150,000mPa·s。
凝胶的粘度最优选为25℃下约50,000至约150,000mPa·s(cP)。
防腐剂
本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物还可以包含一种或多种防腐剂。适合的防腐剂是本领域已知的。适合的防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和间甲酚。
其他生长因子
除了源自血小板裂解物的生长因子外，本发明的药物组合物或本发明的血小板裂 解物还可以包含一种或多种其他或外源生长因子。可存在任何生长因子。
可以在本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物中加入额外量的PDGF、VEGF、FGF、EGF、TGF(特别是TGF-β)和CTGF中的一种或多种，优选全部。
本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物还可以包含一种或多种抗生素、止痛药或清创剂。本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物还可以包含银。
细胞
本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物还可以包含一种或多种干细胞。这些干细胞能够辅助组合物的创伤愈合特性。干细胞可以是间充质干细胞(MSC)或造血干细胞。
本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物还可以包含一种或多种祖细胞、单个核细胞或内皮祖细胞。
本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物还可以包含国际申请PCT/GB2012/051600号描述的中胚层谱系祖细胞。这些细胞表达可检测水平的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD271，且不表达可检测水平的CD14、CD34和CD45。
存在于所述组合物或裂解物中的任何细胞优选是自体同源的。换言之，所述细胞优选源自将要施用该细胞的患者。作为另一选择，所述细胞优选是同种异体细胞。换言之，该细胞优选源自与将要施用该细胞的患者在免疫学上相容的患者。
定义
提供以下定义是为了便于理解本文常用的某些术语，而不意味着限制本公开的范围。
“血小板裂解物”(即“释放的血小板”)是指已经通过裂解血小板而得到释放的包含在所述血小板中的天然生长因子的集合。
“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用，表示氨基酸聚合物或两个以上相互作用或结合的氨基酸聚合物的组。
“干细胞”是指具有下述特性的任何细胞：未特化，并且能够通过细胞分裂而长期更新，并且可经诱导变为具有特化功能的细胞。
“冻干(lyophilisation)”(即冷冻-干燥、冻干或冻结干燥(cryodesiccation))是通常用来保存易腐烂的材料或使该材料更便于运输的脱水过程。冷冻干燥通过将材料冷冻然 后降低周围压力以使材料中冷冻的水直接从固相升华至气相来起作用。冻干组合物的方法是本领域已知的。
冻干
冻干的优点在于所得到的物质更容易存储、能够置于更小的地方、容易处理、能够应用于根据场合而选择的制剂(例如，干燥的粉末、软膏、悬浮液、溶液、凝胶、乳膏或生物相容的合成或天然固体基质)、能够以最佳剂量施用、通常具有更长的保存期、并且可以容易地筛选出最有活性的制品。冻干的细胞提取物的一个优点是该材料在需要时可容易得到，这与提取物凝胶截然不同。
本发明还提供了使用本发明的方法制备的血小板裂解物，其中血小板裂解物被冻干或为冻干形式。本发明还涉及使用本发明的方法制备的血小板裂解物的提取物，其中血小板裂解物被冻干或为冻干形式。本发明的制备血小板裂解物的方法还可以包括将血小板裂解物冻干。适合于冻干血小板裂解物的方法是本领域已知的。
所述提取物可以以常规方式形成。术语“提取物”是指从人类细胞裂解物获得的保留了其愈合活性的裂解物产品。这样的提取物在上文讨论过。血小板裂解物提取物可以在例如裂解和/或破碎血细胞后进行上述冻干之后制得。
所述冻干的组合物可作为根据场合而选择的干粉来应用，或应用在根据场合而选择的软膏、悬浮液、溶液、凝胶、乳膏或生物相容的合成或天然固体基质中，并以最佳剂量施用。
本发明的药物组合物可以被冻干或者为冻干形式。本发明药物组合物的制造方法还可以包括将药物组合物冻干。适合于将药物组合物冻干的方法是本领域已知的。
药物、方法和治疗性应用
本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物可用于人或动物体的治疗方法中。因此，本发明提供了用于治疗有需要的患者的创伤、肛裂、阴道萎缩或皱纹的本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物。
本发明还提供了治疗有需要的患者的创伤、肛裂、阴道萎缩或皱纹的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物。
本发明涉及向患者施用治疗有效量的本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物。治疗有效量是改善创伤、肛裂、阴道萎缩或皱纹的一种或多种症状的量。治疗 有效量优选是修复创伤、肛裂、阴道萎缩或皱纹的量。合适的量在下文中更详细地描述。
本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物可以施用给任何合适的患者。患者可以是任何哺乳动物。患者通常是人类患者。患者可以是婴儿、少年或成人。患者通常已知患有创伤、肛裂、阴道萎缩或皱纹。
用于制备本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物的血小板优选是自体同源的。换言之，所述血小板优选源自将要施用本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物的患者。作为另一选择，所述血小板优选是同种异体的。换言之，该血小板优选源自与将要施用本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物的患者在免疫学上相容的患者。
疗法中使用的本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物可包含一种或多种上文讨论的干细胞或中胚层谱系祖细胞。其也可以包括如上所述的其他生长因子。
本发明可以与治疗创伤、肛裂、阴道萎缩或皱纹或者提供疼痛缓解的其他手段和物质组合使用。在一些情况下，本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物可以与计划用于修复创伤、肛裂、阴道萎缩或皱纹或者提供疼痛缓解的其他物质同时、依次或分开施用。本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物可以与针对创伤、肛裂、阴道萎缩或皱纹的现有治疗组合使用，并且可以例如与这些治疗简单混合。因此本发明可用于提高现有治疗或化妆品的功效。
药物组合物及施用
本发明的药物组合物和本发明的血小板裂解物可以用制药领域的常规方法与药物可接受的载剂和/或赋形剂一起配制。制剂的确切特性将取决于若干种因素，包括所述组合物或裂解物的特性和所需的施用途径。合适的制剂类型完整地描述于Remington's Pharmaceutical Sciences，第19版，Mack Publishing Company，Eastern Pennsylvania，美国。
本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物通常为无菌的。
本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物可通过任何途径施用。本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物通常局部施用至创伤、肛裂、阴道萎缩或皱纹处。
本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物可以与生理可接受的载剂或稀释剂制备在一起。合适的载剂或赋形剂例如为水、盐水、右旋糖或甘油等及其组合。通 常在治疗应用之前使冻干的组合物或裂解物再水化。
此外，如果需要，本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物可含有少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、和/或增强有效性的佐剂。此类试剂是本领域已知的。
本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物以与剂型相容的方式施用，并且施用量是治疗有效量。所要施用的量取决于所要治疗的受试对象、受试对象的免疫系统的能力和所需的修复程度。所需施用的精确量可依赖于从业医师的判断，并且可能对每个受试对象是特有的。
可以向受试对象施用任何适合的量的本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物。例如，通常使用足以覆盖创伤、肛裂、阴道萎缩或皱纹的量。所施用的实际量因此将取决于创伤、肛裂、阴道萎缩或皱纹的尺寸。例如，所施用的本发明的药物组合物的量可以为0.1g至100g，例如约0.5g至约75g、约1g至约50g、约2g至约20g或约3g至10g.
本发明的药物组合物或血小板裂解物(二者中的任一个都可以为冻干形式)可治疗性地应用于伤口。对血小板的处理会使生长因子释放到溶液中，冻干过程将产生由这些因子组成的稳定的冷冻干燥的药粉。这种冻干的药物组合物或血小板裂解物可以与其它技术结合以有效地治疗临床受伤患者，且在不同温度下都具有高得多的长期稳定性。这将规避制品的物流过程和治疗的转移。
一个实施方式是干燥的冻干的本发明的药物组合物或干燥的冻干的血小板裂解物。在即将治疗前与水结合时，将形成凝胶样的稠度。
在其它实施方式中，作为替代方式，本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物可以与以下不同的方法或治疗结合：
●制剂/递送方法，例如：
○洗剂、摇荡洗剂、乳膏、软膏、凝胶、泡沫、透皮贴、粉末、固体、海绵、胶带、糊剂、绷带、纱布、注射器、喷雾剂
●治疗，例如：
○间充质干细胞、造血干细胞、单个核细胞、内皮祖细胞、中胚层祖细胞、抗生素、止痛剂、银、清创剂、医疗器械
●包装方法，例如：
○无菌的包装、瓶、盒、罐
●储存方法
○理想地，室温粉末；需要时，冷藏或冷冻
本发明还涉及含有作为活性物质的上述提取物的药物组合物，所述提取物优选为冻干形式并且可用于促进表面创伤愈合，例如皮肤(例如人的皮肤)的创伤愈合。该药物组合物优选包含适合应用到表面创伤上的制剂中的冻干提取物。这样的制剂可以作为干粉或以下述形式直接应用至表面创伤：凝胶、乳膏、软膏、悬浮液、溶液、或生物相容的合成或天然固体基质，其中任一种均可以采用常规的方法制备，如果需要，可以与常规的药物可接受的赋形剂和添加剂制备到一起。通常，冻干提取物以取决于所治疗的表面创伤类型和组合物的使用环境的浓度添加到所述组合物中。例如，本发明的冻干的血小板裂解物提取物的应用浓度可以使每平方厘米的用于创伤愈合的活性物质的量相当于存在于制品中的活性物质的量。
创伤
本发明所要治疗的创伤优选为皮肤创伤。所述皮肤创伤优选为溃疡。
可用本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物治疗的创伤类型包括但不限于：热、化学、电和辐射所诱导的皮肤烧伤创伤；以网状皮肤自体移植物覆盖的烧伤创伤，全厚度和部分厚度；机械创伤，例如切口、擦伤和撕裂伤；这些类型的创伤还包括皮肤的外科手术创伤和切除创伤；皮肤的各种溃疡，例如褥疮、静脉和动脉溃疡以及由内在疾病(例如糖尿病和血管炎)引起的溃疡；角膜创伤；鼓膜损伤；和由例如大疱性类天疱疮、大疱性表皮松解和红斑狼疮等病理状况引起的损伤。
本发明还涉及通过对创伤表面施加本发明的药物组合物来促进表面创伤(例如皮肤中、如人皮肤中的创伤)的愈合。
肛裂
肛裂是肛管皮肤的破裂或撕裂。这种裂口可以通过对其施加本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物来治疗。
阴道萎缩
萎缩性阴道炎(也称为阴道萎缩或泌尿生殖道萎缩)是因该组织的变薄和萎缩以及润滑作用的减少而造成的阴道(和外尿道)炎症。它通常由雌激素分泌下降引起。该萎缩可以通过局部应用本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物来治疗。
皱纹
根据本发明治疗的皱纹通常是皮肤皱纹。可通过对皱纹应用本发明的药物组合物或本发明的血小板裂解物来治疗皱纹。
以下实施例阐释了本发明。
实施例1-血小板裂解物
采集全血样品并保存，以用于进行血小板数量分析，该分析作为监测裂解过程的方式。对全血进行离心(120×g，15分钟，无制动，室温)以将血小板与剩余的血细胞分离。血小板最终在黄色血浆中，被称为富含血小板的血浆(PRP)，其位于剩余血细胞的暗红色柱的顶部。
留存少量PRP样品以分析血小板，分析显示血小板浓度高于全血，原因是血小板已被浓缩到更小体积中。血浆体积在个体之间是不同的，但与性别有关，例如在男性中该体积会更小，因此在男性中，全血中血小板浓度与PRP相比会高出更多。
将PRP转移至另一容器中，例如50ml试管，然后浸入液氮(-196℃)中直至冷冻或保持浸入5分钟。然后将试管转移到37℃水浴中或其他热源(例如孵育箱)中，直至PRP解冻。这被称为一个液氮冷冻/解冻循环。将该循环再重复三(3)次，即总共四(4)个冷冻/解冻循环。在这些循环后，得到的产物称为C4PL(血小板裂解物)，其通过4个冷冻/解冻循环产生；经分析，其含有PRP中血小板初始数量的约5％。C4PL含有血小板碎片的凝胶块，这种凝胶块可通过下述方式除去：将C4PL转移至新试管中(较重的凝胶块会落到该试管底部)，或对其进行离心(3200×g,20分钟,有制动)并采用上清液。C4PL还含有在显微镜下可见的显微碎片。
实施例2-血小板裂解物凝胶
将实施例1中制备的血小板裂解物转移到有刻度的无菌Falcon管中。如果是预先冷冻的，则先将血小板裂解物在室温下解冻。向血小板裂解物中加入适当比例的葡萄糖酸钙或凝血酶。如果血浆是预先冷冻的，则在使用前将其在37℃解冻。此处使用的适当比例包括：例1：5份血小板裂解物、2份血浆、2份葡萄糖酸钙；例2：3份血小板裂解物、1份凝血酶和0.5份葡萄糖酸钙。对所得悬浮液进行小心缓慢的摇动，以完成10至12个360°管绕转，然后按尺寸分级到无菌的分配装置中。该装置包括注射器和微针分配器。在一些情况下，根据所要治疗的溃疡的尺寸和形状来确定尺寸分级。
实施例3-血小板裂解物凝胶应用
对于治疗阴道萎缩：每日或每隔一日在阴道内应用2ml至10ml粘度为约1000cP的血浆裂解物凝胶，并进行1周至2周。如果症状复发，则重复该过程一周。
对于治疗直径5mm的糖尿病性足部溃疡：每日或每隔一日在溃疡上局部应用2ml至3ml粘度为70,000cP至100,000cP的血浆裂解物凝胶，并进行2周至3周。
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