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1、10申请公布号CN104059135A43申请公布日20140924CN104059135A21申请号201410245111922申请日20140603C07K14/325200601C12N15/32200601C12N15/82200601A01H5/0020060171申请人浙江大学地址310027浙江省杭州市西湖区浙大路38号72发明人凃巨民陈浩张集文74专利代理机构杭州天勤知识产权代理有限公司33224代理人胡红娟54发明名称一种BT蛋白及其编码基因和应用57摘要本发明公开了一种BT蛋白及其编码基因和应用，BT蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO1所示，其编码基因的碱基序列如SEQID。
2、NO2所示。所述应用是BT蛋白在提高植物抗虫性能中的应用。与转WBT基因水稻，将所述编码基因转化水稻获得的转MBT基因水稻，其MBT基因的表达活性比WBT基因强约2050；对鳞翅目昆虫稻纵卷叶螟和二化螟的抗性也大大提高，主要表现在稻纵卷叶螟能在转WBT基因水稻的叶片上形成一定的枯黄危害症状，而在转MBT基因水稻的叶片上则不形成或仅在剪口附近形成极小的枯黄危害症状；在转WBT基因水稻上，二化螟危害引起的白穗率为1101，而在转MBT基因水稻上白穗率均为0。51INTCL权利要求书1页说明书7页序列表9页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表9页附图。
3、1页10申请公布号CN104059135ACN104059135A1/1页21一种BT蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO1所示。2如权利要求1所述BT蛋白的编码基因，其特征在于，碱基序列如SEQIDNO2所示。3含有如权利要求2所述编码基因的表达单元。4含有如权利要求2所述编码基因的重组载体。5如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，其原始载体为PSB130ACTINTNOS。6含有如权利要求2所述编码基因的转化子。7如权利要求1所述BT蛋白在提高植物抗虫性能中的应用。8如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻。权利要求书CN104059135A1/7页3一种BT蛋白及其编。
4、码基因和应用技术领域0001本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种BT蛋白及其编码基因和应用。背景技术0002水稻螟虫等鳞翅目害虫是水稻丰产稳产的重要制约因素之一。迄今为止，尚未发现任何对稻螟虫等鳞翅目害虫具有抗性的稻种资源。过去，对稻螟虫的防治主要以喷施化学农药为主，但大量的农药残毒不仅造成严重的环境污染，而且也使稻米的卫生品质下降，影响人们的身体健康。作为水稻生产大国，鳞翅目害虫每年给我国水稻生产造成了巨大损失。0003BT蛋白是苏云金芽孢杆菌BACILLUSTHURINGIENSIS在其产胞过程中产生的一种晶体蛋白质，具有对鳞翅目昆虫专一性的毒杀作用。80年代，第一个编码BT蛋白的基因。
5、被克隆，BT蛋白对靶标害虫具有高效的和专一的杀虫活性，易于在环境中降解，且无任何残留，这些优点都是普通化学杀虫剂所无法比拟的。在长达逾百年的生产应用过程中，从未曾观察到BT蛋白对环境及非靶标昆虫或哺乳类和鸟类动物等具有不良的影响或毒害作用。0004将来源于细菌的BT基因经过人工改造，导入植物，可以使植物自身产生BT蛋白，从而对鳞翅目昆虫具有抗性。近年来，通过转BT基因培育转基因抗虫作物，已经在烟草、番茄、棉花、马铃薯、玉米、水稻和油菜等作物上获得成功。转BT基因棉花和玉米等先后在美国、加拿大、阿根廷、巴西和印度等国家大面积推广应用，都取得了保产增收作用。2009年，全球转BT基因抗虫作物的种植。
6、面积超过3800万公顷；中国的BT棉种植面积也达到380万公顷，约占全国总种植面积的66，减少化学农药用量约80余万吨，减量达7080，为棉农增产增收累计超过300亿元。2009年11月，农业部批准了转BT基因抗虫水稻华恢1号以及用华恢1号为恢复系配制的杂交组合BT汕优63的生物安全证书农基安证字2009第072号转CRY1AB/CRY1AC基因抗虫水稻华恢1号在湖北省生产应用的安全证书，从而使我国转基因水稻的商业应用迈开了令世界注目的第一步。0005修改BT基因的编码序列，是进一步提高其在植物中应用价值的重要途径。迄今为止，已经公开许多经过人工改造的可用于植物的BT蛋白基因。0006公开号为。
7、CN1083884C的中国专利文献公开了两种编码杀虫蛋白质基因和双价融合表达载体及其应用，通过双链合成DNA的方法，人工合成了全长1824BP的GRY1AB和GRY1AC融合的GFM杀虫基因，结果BT蛋白在植物中的表达量大幅度提高，全合成基因比原基因的表达提高了近百倍。0007范云六等在研制成功了苏云金杆菌BT内毒素CRY1AB/AC杂种蛋白序列以下简称WBT，并于1996年提供给本申请人在水稻中使用，获得了表达WBT杂种蛋白的抗虫转化体TUJ，ETAL1998。0008但现有BT蛋白的杀虫活性仍有待进一步提高。发明内容说明书CN104059135A2/7页40009本发明提供了一种BT蛋白，。
8、该BT蛋白对鳞翅目昆虫的抗性比现有BT蛋白更强。0010一种BT蛋白，氨基酸序列如SEQIDNO1所示。0011本发明还提供了所述BT蛋白的编码基因，碱基序列如SEQIDNO2所示。0012本发明的BT蛋白MBT蛋白及其编码基因是在WBT杂种蛋白氨基酸序列如SEQIDNO3所示及其编码基因碱基序列如SEQIDNO4所示的基础上进行改造而获得的。其改造程序为00131在WBT杂种蛋白第3、4位氨基酸残基之间插入一段多肽，该多肽的氨基酸序列为NPNINECI，对MBT蛋白的空间结构具有稳定作用；0014在WBT杂种蛋白第3、4位氨基酸残基之间插入该多肽，能够引起WBT杂种蛋白空间构型的改变，从而使。
9、获得的MBT蛋白的空间结构更为稳定；00152对WBT杂种蛋白第97、480、521位氨基酸残基进行氨基酸替换型修饰第97位的D替换为Q，第480位的R替换为K，第521位的N替换为H，这几个氨基酸对WBT杂种蛋白的杀虫活性和专一性起关键作用，进行氨基酸替换型修饰后，MBT蛋白的杀虫活性和专一性得到进一步提高；00163根据植物基因表达的密码子偏好性，在不改变氨基酸序列的前提下，对步骤2获得的编码序列进行密码子优化；00174密码子优化完成后，在MBT蛋白编码序列的5端添加植物核糖体结合序列AACA，以增强其表达活性。0018由此获得的MBT基因与WBT基因的碱基序列一致性为967，MBT蛋白。
10、与WBT蛋白的氨基酸序列一致性为982。0019本发明还提供了含有所述编码基因的表达单元、重组载体、转化子，所述重组载体的原始载体为PSB130ACTINTNOS。0020本发明还提供了所述BT蛋白在提高植物抗虫性能中的应用。作为优选，所述植物为水稻。与转WBT基因水稻，将本发明BT蛋白的编码基因MBT基因转化水稻获得的转MBT基因水稻，其MBT基因的表达活性比WBT基因强约2050；对鳞翅目昆虫稻纵卷叶螟和二化螟的抗性也大大提高，主要表现在稻纵卷叶螟能在转WBT基因水稻的叶片上形成一定的枯黄危害症状，而在转MBT基因水稻的叶片上则不形成或仅在剪口附近形成极小的枯黄危害症状；在转WBT基因水稻。
11、上，二化螟危害引起的白穗率为1101，而在转MBT基因水稻上，白穗率均为0。0021与现有技术相比，本发明的有益效果为0022本发明的MBT基因在水稻中的表达活性明显增强，转MBT基因水稻对鳞翅目昆虫的抗性也大大提高，能够有效防治鳞翅目昆虫，保证水稻丰产稳产。附图说明0023图1为重组载体PSBMBT的质粒图谱；其中，目的基因MBT表达单位在第一TDNA区，标记基因HPH表达单位在第二TDNA区，用于其转移的边界序列分别为LB1及RB1和LB2及RB2，用于质粒自身筛选的标记基因为抗卡那霉素基因KAN；0024图2为携带MBT基因的5个日本晴独立转化体的PCR检测分析结果；其中，M为DNA分子。
12、量标记；P为MBT质粒阳性对照；N为非转基因的日本晴阴性对照；15分别为转MBT基说明书CN104059135A3/7页5因的5个日本晴独立转化体；0025图3为携带MBT基因的5个日本晴独立转化体的银标免疫检测试纸分析结果；其中，CK为转WBT基因的日本晴阳性对照；CK为非转基因的日本晴阴性对照；15分别为转MBT基因的5个日本晴独立转化体；0026图4为非转基因的日本晴叶片上、转MBT基因的水稻叶片中和转WBT基因的水稻叶片下对稻纵卷叶螟的抗虫性鉴定结果比较。具体实施方式0027下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。0028实施例1MBT基因的获得0029MBT基因的修饰改造。
13、是利用本领域技术人员熟知的技术，即PCR引物定点引入突变碱基技术PCR定点诱变技术来实现的，其具体步骤是00301在WBT杂种蛋白第3、4位氨基酸残基之间插入一段对该蛋白质起稳定作用的多肽，该多肽的氨基酸序列为NPNINECI；00312在对杀虫活性和专一性起关键作用的第97、480和521号残基上进行氨基酸替换型修饰，其中，第97位的D替换为Q，第480位的R替换为K，第521位的N替换为H；00323根据水稻基因的密码子偏好性，在不改变氨基酸序列的前提下，对步骤2获得的编码序列进行密码子优化；00334密码子优化完成后，在其5端添加植物核糖体结合序列AACA，以增强其表达活性，最终获得MB。
14、T基因，其碱基序列如SEQIDNO2所示。0034由此获得的MBT基因与WBT基因的DNA序列一致性为967，氨基酸序列一致性为982；而与公开号为CN1083884C的中国专利文献公开的GFM杀虫基因的氨基酸序列一致性为979。0035实施例2制备转基因水稻00361构建重组载体00371MBT基因插入片段的制备通过引物设计和PCR扩增，在MBT基因编码序列的5端和3端分别引入酶切位点NCOI和KPNI，使用AXYGEN公司AXYPREPPCR清洁试剂盒纯化PCR产物，操作步骤如下00381在PCR反应液中，加3个体积的BUFFERPCRA若BUFFERPCRA不足100L，加至100L；混。
15、匀后，转移到制备管中，将制备管置于2ML离心管试剂盒内提供中，12000RPM离心1MIN，弃滤液。00392将制备管置回2ML离心管中，加700LBUFFERW2，12000RPM离心1MIN，弃滤液；注确认在BUFFERW2原液中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。00403可选步骤将制备管置回2ML离心管中，加400LBUFFERW2，12000RPM离心1MIN；注从离心机中取出2ML离心管时，注意不要让管底的BUFFERW2接触到制备管。00414将制备管置于洁净的15ML离心管试剂盒内提供中，在制备管膜中央加2530L去离子水，室温静置LMIN；12000RPM离心1MIN洗脱DN。
16、A，获得MBT基因插入片段。00422表达载体及插入片段的双酶切表达载体PSB130ACTINTNOS和MBT基因插入片段都用NOCI和KPNI于37下过夜酶切，酶切反应体系见表1。说明书CN104059135A4/7页60043表1酶切反应体系00440045酶切完纯化，使用AXYGEN公司AXYPREPDNAGELEXTRACTIONKIT纯化酶切产物，操作步骤如下00461紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶注意尽量缩短暴露紫外灯下的时间，称取凝胶重量。00472加入3倍凝胶体积的BUFFERDEA100MG凝胶，计100L体积，混合均匀后，于65加热68MIN，直至凝胶完全融化。00。
17、483加05倍BUFFERDEA体积的BUFFERDEB，混合均匀，当分离的DNA片段小于400BP时，加入1倍凝胶体积的异丙醇。00494吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管置于2ML离心管中，12000G离心1MIN。弃滤液。00505将制备管置回2ML离心管中，加700LBUFFERW1，12000G离心30SEC，弃滤液。00516将制备管置回2ML离心管中，加700LBUFFERW2，12000G离心30SEC，弃滤液。重复一次。00527将制备管置回2ML离心管中，12000G离心1MIN。彻底去除残余的液体。00538将制备管置于15ML离心管中，在制备膜中央，加2530L预。
18、热至65的洗脱液或去离子水，室温静置1MIN。12000G离心1MIN洗脱DNA。00543表达载体及插入片段的连接对回收的载体片段及目的基因进行浓度测定，然后于16连接过夜，连接反应体系见表2。0055表2连接反应体系005600572转化大肠杆菌0058将连接产物转化大肠杆菌DH5感受态细胞，方法如下吸取10L连接产物加入到100L的大肠杆菌感受态中并用移液枪吹打均匀，于冰上放置30MIN，42热击90S后，说明书CN104059135A5/7页7迅速置于冰上2MIN；再向管加入1ML的LB液体培养基，于37度振荡仪振荡1H；待菌液复苏后，离心并吸除800L上清液，将剩下200L上清液与菌。
19、块混匀，均匀的涂布于LB固体筛选50MG/L的卡那霉素培养基表面，37过夜培养。00593阳性菌落鉴定0060挑选透明菌落并用牙签沾取作为模板，进行菌落PCR扩增。PCR反应体系见表3。0061表3MBT基因的PCR反应体系00620063PCR反应程序是94变性5MIN；96变性15S，、55退火30S、72延伸2MIN，35个循环；72延伸10MIN，转入10保存。0064PCR产物经08琼脂糖凝胶电泳鉴定，拍照后保存。然后，挑选PCR鉴定为阳性的菌落摇菌，按AXYGEN公司的质粒纯化试剂盒提取质粒，并对质粒进行酶切和测序上海英俊公司验证。00654农杆菌转化0066取05L经酶切和测序验。
20、证的质粒，加入到含有60L农杆菌电击感受态EHA105的离心管15ML中，待枪头吸打混匀后移入电极杯中；电击后，迅速加入1MLLB液体培养基，吸打混匀后移入先前的15ML离心管中，于28振荡仪摇上1H；菌液复苏后，吸取100L菌液，均匀涂布于含50MG/L的卡那霉素和25MG/L的利福平的LB固体筛选培养基表面，28培养2天；菌落PCR验证阳性克隆后，挑阳性克隆摇菌于50的甘油浓度和80条件下保存备用。00675转MBT基因水稻的培育0068以日本晴水稻为受体，通过农杆菌介导法进行基因转化，具体步骤如下00691胚愈伤组织的诱导0070去壳的成熟种子先用70乙醇浸泡12分钟，然后用3次氯酸钠溶。
21、液浸泡1015分钟，进行表面灭菌最好在摇床上进行，无菌水冲洗34次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，接种到MS愈伤诱导培养基上，28暗培养。约1015天后，剥下成熟胚盾片长出说明书CN104059135A6/7页8的愈伤组织，转入MS继代培养基上，在相同条件下继代培养。以后每两周继代培养一次，直至形成色泽鲜黄、质地致密且成颗粒状的胚性愈伤。之后，在临转化前挑选胚性愈伤继代培养45天，随即用于农杆菌侵染和共培养。00712农杆菌的培养0072将含有重组载体的农杆菌EHA105接种到含有50MG/L卡那霉素的LB培养基上，于28黑暗培养1天，离心，重悬浮于AA液体培养基中，调整菌体浓度至OD60。
22、0为0206，加入乙酰丁香酮，使乙酰丁香酮终浓度为100M，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。00733农杆菌侵染和共培养0074将步骤1预培养的水稻愈伤组织放入到适量农杆菌悬浮液中，室温放置20MIN，并不时晃动。用带滤网的勺子取出愈伤组织置于铺有无菌滤纸的一次性培养皿中，于超净工作台上晾干510MIN，在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上28黑暗培养2天。00754转MBT基因抗性愈伤组织的筛选0076将共培养后的愈伤组织接种于含有500MG/L头孢霉素和50MG/L或适量潮霉素的N6筛选培养基上，28暗培养1214天，新长出的抗性愈伤每1214天继代一次。
23、，至第二四轮会有抗性愈伤出现加速生长的情况，再继代12次即可取出其中的一半进行绿苗的分化，另一半继代备用。00775转MBT基因绿苗的分化0078将经过筛选培养基筛选获得的抗性愈伤组织转至含有50MG/L或适量潮霉素的N6预分化培养基上，先28暗培养79天，然后转至N6分化培养基上于25和16H/D光照条件下分化培养，直至绿苗形成。00796转MBT基因绿苗的栽培0080当绿苗长至812CM高时，揭开再生瓶的瓶盖，并向瓶内加入2040ML自来水用于炼苗，之后，从再生瓶中拔出绿苗并用自来水洗去培养基，移栽入温室的盆栽钵或隔离的水泥池中，栽培至成熟。00817转MBT基因绿苗的分子验证0082转M。
24、BT基因绿苗的分子验证通过常规的PCR扩增和BT蛋白银标免疫检测试纸北京银土地生物技术有限公司法进行。0083试验结果表明PCR检测呈阳性图2的转化体均在银标免疫检测试纸的检测线上显现目标带图3，其检测信号大都比转WBT基因阳性对照的检测信号强，说明MBT基因比WBT基因的表达活性强。0084实施例3转MBT基因水稻的抗虫性鉴定0085以转MBT基因的日本晴水稻为对象，鉴定MBT基因对水稻稻纵卷叶螟和二化螟的抗性，并分别以转WBT基因和非转基因的日本晴植株作正负对照。0086稻纵卷叶螟抗性鉴定采用离体叶片法进行即在水稻分蘖中期，分别自各供试稻株上，随机从3个分蘖剪取24CM长的叶片倒一叶6片，。
25、并在叶片两端压上用01G/L苯骈眯唑保鲜液浸渍过的小滤纸片。然后，将叶片移置小平底玻管95CM15CM内，每管分别接入5头蚁螟，管口塞紧脱脂棉花塞，重复鉴定3株/转化体。自开始接虫后第47天逐日检查叶片的受害情况，并拍照纪录。说明书CN104059135A7/7页90087二化螟抗性鉴定采用单株网罩鉴定法进行即将待测稻株分别栽于加塑料罩直径12CM，高70CM的盆栽桶中，于抽穗前7天左右每株接种15头初孵二化螟蚁螟，接种3株/转化体。接虫2周后移去塑料罩，3周后调查二化螟危害引起的白穗率，调查结果见表4和图4。0088表4各供试水稻的抗虫性鉴定结果008900900091实验结果表明修饰改造后。
26、的MBT基因和未修饰改造的WBT基因都高抗稻纵卷叶螟和二化螟，但前者对两个靶标害虫的抗性优于后者。主要表现在稻纵卷叶螟能在转WBT基因水稻的叶片上形成一定的枯黄危害症状，而在转MBT基因水稻的叶片上则不形成或仅在剪口附近形成极小的枯黄危害症状图4；二化螟危害造成的白穗率在日本晴上为56812，在转WBT基因水稻上为1101，在转MBT基因的5个独立转化体植株上则全部为0表4。说明书CN104059135A1/9页1000010002序列表CN104059135A102/9页110003序列表CN104059135A113/9页120004序列表CN104059135A124/9页130005序列表CN104059135A135/9页140006序列表CN104059135A146/9页150007序列表CN104059135A157/9页160008序列表CN104059135A168/9页170009序列表CN104059135A179/9页18序列表CN104059135A181/1页19图1图2图3图4说明书附图CN104059135A19。