一种抗病毒药物及其制备方法技术领域
本发明涉及抗流感病毒药物，特别是帕拉米韦的衍生物酯，具体为帕拉米韦和普乐沙福-N-烷酸的酯；本发明还涉及该抗病毒药物的制备方法。
背景技术
流行性感冒（简称流感）是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一种传染性强、传播速度快的疾病。其主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。典型的临床症状是：急起高热、全身疼痛、显著乏力和轻度呼吸道症状。一般秋冬季节是其高发期，所引起的并发症和死亡现象非常严重。该病是由流感病毒引起，可分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，甲型病毒经常发生抗原变异，传染性大，传播迅速，极易发生大范围流行。甲型H7N9也就是甲型一种。本病具有自限性，但在婴幼儿、老年人和存在心肺基础疾病的患者容易并发肺炎等严重并发症而导致死亡。
普乐沙福（结构式如下）为CXCR4趋化因子受体抑制剂，最初研发用作抗艾滋病毒药物，ErikDeClercq,BiochemicalPharmacology,77(2009):1655-1664揭露了普乐沙福的作用机理，其通过阻断CXCR4受体，阻止病毒进入细胞内。
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帕拉米韦（结构式如下）是一种新型的抗流感病毒药物，属神经氨酸酶抑制剂，现有临床试验证明对甲型和乙型流感有效。根据世界卫生组织的通报，H7N9属于甲型流感病毒亚型，初步试验结果显示，神经氨酸酶抑制剂对该病毒起作用。帕拉米韦是一种环戊烷衍生物，与环连接的基团有亲水的羧基和胍基,以及疏水的异戊基和乙酰氨基，4个极性不同的基团分别作用于流感病毒NA结构中不同的活性位点区域，强烈抑制NA活性。
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我们在分析上述作用机制和相互关系的基础上，设计并合成了一系列化合物（以下简称为帕拉米韦衍生物酯），在细胞培养试验中考察了这些化合物的抗病毒活性并与帕拉米韦进行比较，结果令人惊奇地发现，帕拉米韦衍生物酯显示了比帕拉米韦明显较高的活性（EC50）和选择性指数（SI=EC50/CC50）。以下述结构的化合物为典型代表，其选择性指数比帕拉米韦高数十倍，是一种更强效的抗流感药物。
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发明内容
本发明的目的是提供一种高活性和选择性指数的抗病毒药物及其制备方法。
为了实现以上目的，本发明一种如下通式的帕拉米韦衍生物酯及其药学上可接受的盐：
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其中，R为烷基、芳基、芳烷基、氨基、酰基、烷氧基。
“烷基”指具有一个到指定数目碳原子的直连或支链饱和烃基。例如甲基、乙基、异丙基、正丙基、正丁基、正戊基、正庚基、十二烷基、十八烷基等。
“芳基”指从芳香烃去除一个或多个氢原子所衍生的有机基团。优选的芳基在芳烃中有6-12个碳原子作为环碳原子。
“芳烷基”指衍生自芳基烷的有机基团，其中烷基氢原子被上述定义的芳基取代。
以帕拉米韦衍生物酯作为有效药物成分，优选一种或多种赋形剂或载体的帕拉米韦衍生物酯混合物，用于治疗病毒性和相关疾病的药物组合物。
上述帕拉米韦衍生物酯的制备方法是：
（1）(1S,2S,3R,4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基]丁基-4-二Boc-胍基环戊-1-羧酸苄酯
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将1当量的帕拉米韦、0.5-5当量的对甲苯磺酸、1-10当量的苯甲醇，加5-10倍量甲苯回流反应5-24小时（使用分水器），反应完成后，加入乙酸乙酯冷冻结晶，抽滤，用乙酸乙酯洗涤，滤饼加四氢呋喃溶解，加入0.5-5当量的三乙胺、加入2-10当量的二碳酸二叔丁酯（BOC酸酐），室温搅拌反应5-24小时，反应完成后加入5-10倍量的二氯甲烷，冰水浴下用盐酸调节pH至2-3，分出有机层，用饱和氯化钠洗涤，用无水硫酸钠干燥，减压蒸干，即得；
（2）4,8-二(叔丁氧羰基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷（“二Boc”化合物）和1,4,8-三(叔丁氧羰基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷（“三Boc”化合物）
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向1当量的1,4,8,11-四氮杂环十四烷的二氯甲烷溶液中，冰水浴冷却下加入1-10当量的二叔丁基二碳酸酯，溶液在室温下搅拌2-72小时。蒸干溶剂，通过硅胶柱层析分离得到“二Boc”化合物和“三Boc”化合物；
（3）5-[4,8-二(叔丁氧羰基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]-R-羧酸乙酯
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取1当量的“二Boc”化合物，1-10当量的碳酸钾，加入5-20倍量的乙腈，0.5当量的5-溴-R-羧酸乙酯，将反应混合物搅拌回流2-72小时，放冷，过滤，蒸干溶剂，残渣溶于乙酸乙酯中，用饱和氯化钠洗涤，用无水硫酸钠干燥，浓缩蒸干，通过硅胶柱层析分离得到目标化合物；
（4）5-[4,8-二(叔丁氧羰基)-11-(4-{[4,8,11-三(叔丁氧羰基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]-甲基}苯基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]-R-羧酸
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取1当量的“三Boc”化合物和1当量的5-[4,8-二(叔丁氧羰基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]-R-羧酸乙酯，加入5-20倍量的乙腈，2-10当量的碳酸钾，1当量的α,α’-二氯二甲苯，0.01-0.5当量的碘化钠，将反应混合物在氮气保护下回流8-72小时，放冷，抽滤，滤液减压蒸干，残渣溶于乙酸乙酯中，用5%枸橼酸水溶液洗涤，再用水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，残渣溶于四氢呋喃中，加5NNaOH，0.01-0.5当量的TritonB，搅拌2-24小时，通过硅胶柱层析，得到目标化合物；
（5）(1S,2S,3R,4R)-1’-羧酸苄酯-3’-[(1S)-1’’-乙酰胺基-2’’-乙基]丁基-4’-二BOC胍基环戊-2’-氧-{5-[4,8-二(叔丁氧羰基)-11-(4-{[4,8,11-三(叔丁氧羰基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]甲基}苯基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]}-R-羧酸酯
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取1当量的5-[4,8-二(叔丁氧羰基)-11-(4-{[4,8,11-三(叔丁氧羰基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]-甲基}苯基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]-R-羧酸，加5-20倍量的二氯甲烷，加入0.01-0.5当量的DMAP，2-10当量的三乙胺，加入1当量的(1S,2S,3R,4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基]丁基-4-二Boc-胍基环戊-1-羧酸苄酯溶于DMF/CH2Cl2的溶液，加入1-10当量的PyBOP，在氮气保护下在室温下搅拌过夜，减压蒸出溶剂，残渣溶于乙酸乙酯中，用5%枸橼酸水溶液洗涤，再用水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，经硅胶柱层析得到目标化合物；
（6）(1S,2S,3R,4R)-1’-羧酸-3’-[(1S)-1’’-乙酰胺基-2’’-乙基]丁基-4’-胍基环戊-2’-氧-{5-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]甲基}苯基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]}-R-羧酸酯
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取1当量的(1S,2S,3R,4R)-1’-羧酸苄酯-3’-[(1S)-1’’-乙酰胺基-2’’-乙基]丁基-4’-二BOC胍基环戊-2’-氧-{5-[4,8-二(叔丁氧羰基)-11-(4-{[4,8,11-三(叔丁氧羰基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]甲基}苯基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]}-R-羧酸酯，加入5-20倍量的甲醇，加入0.2-3当量的10%Pd-C，用H2氢化4-24小时，过滤，滤液减压蒸干，加入5-20当量1MHCl-Et2O溶液，室温搅拌过夜，减压浓缩，抽滤，用乙醚洗涤滤饼，减压干燥，得到目标产物。
经核磁共振波谱和高分辨质谱分析，确证合成出的产物为上述目标结构的化合物。
典型地，R为正丁基，其化学名称是：(1S,2S,3R,4R)-1’-羧酸-3’-[(1S)-1’’-乙酰胺基-2’’-乙基]丁基-4’-胍基环戊-2’-氧-{5-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]甲基}苯基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]}-戊酸酯，该化合物结构式为：
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本发明的帕拉米韦衍生物酯，与帕拉米韦相比具有以下显著优势：
（1）体外试验表明，显著提高了半数有效浓度（EC50），并降低了半数致死浓度（CC50），从而显著增加了选择性指数（SI=EC50/CC50）；
（2）体内试验表明，死亡保护率显著提高，显著延长了小鼠的生存时间；
（3）对帕拉米韦进行结构修饰后，降低了帕拉米韦的胃肠道刺激作用。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明一种抗病毒药物及其制备方法作进一步详细说明。
本发明一种抗病毒药物及其制备方法，该抗病毒药物的化学名称是(1S,2S,3R,4R)-1’-羧酸-3’-[(1S)-1’’-乙酰胺基-2’’-乙基]丁基-4’-胍基环戊-2’-氧-{5-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]甲基}苯基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]}-R-羧酸酯，其通式化合物结构式为：
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实施例1(1S,2S,3R,4R)-1’-羧酸-3’-[(1S)-1’’-乙酰胺基-2’’-乙基]丁基-4’-胍基环戊-2’-氧-{5-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]甲基}苯基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]}-戊酸酯
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（1）(1S,2S,3R,4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基]丁基-4-二Boc-胍基环戊-1-羧酸苄酯
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将32.8g（100mmol）的帕拉米韦、21.3g（112mmol）的对甲苯磺酸、54.1g（500mmol）的苯甲醇，加500mL甲苯回流反应24小时（使用分水器），反应完成后，加入乙酸乙酯冷冻结晶，抽滤，用乙酸乙酯洗涤，滤饼加200mL四氢呋喃溶解，加入30.3g（300mol）的三乙胺、加入109.1g（500mmol）的二碳酸二叔丁酯（BOC酸酐），室温搅拌反应24小时，反应完成后加入400mL的二氯甲烷，冰水浴下用盐酸调节pH至2-3，分出有机层，用饱和氯化钠洗涤，用无水硫酸钠干燥，减压蒸干，即得；
（2）4,8-二(叔丁氧羰基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷（“二Boc”化合物）和1,4,8-三(叔丁氧羰基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷（“三Boc”化合物）
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向10.0g（50.0mmol）的1,4,8,11-四氮杂环十四烷的二氯甲烷1250mL溶液中，冰水浴冷却下加入20.0g（90.0mmol，1.8当量）二叔丁基二碳酸酯，溶液在室温下搅拌4小时。蒸干溶剂，通过硅胶柱层析分离（MeOH/CH2Cl25:95）得到“二Boc”化合物和“三Boc”化合物；
（3）5-[4,8-二(叔丁氧羰基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]戊酸乙酯
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取“二Boc”化合物7.7g（19.3mmol），碳酸钾8.0g，加入乙腈400mL，搅拌使混匀，加入0.5当量的5-溴戊酸乙酯（2.0g，9.6mmol），将反应混合物搅拌回流过夜，放冷，过滤，蒸干溶剂，残渣溶于乙酸乙酯中，用饱和氯化钠洗涤，用无水硫酸钠干燥，浓缩蒸干，通过硅胶柱层析分离（MeOH/CH2Cl25:95）得到目标化合物；
（4）5-[4,8-二(叔丁氧羰基)-11-(4-{[4,8,11-三(叔丁氧羰基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]-甲基}苯基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]戊酸
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取“三Boc”化合物4.0g（8.0mmol，1当量）和5-[4,8-二(叔丁氧羰基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]戊酸乙酯4.3g（8.0mmol，1当量），加入乙腈100mL，碳酸钾3.3g（24.1mmol，3当量），α,α’-二氯二甲苯2.1g（8.0mmol），碘化钠500mg，将反应混合物在氮气保护下回流过夜，放冷，抽滤，滤液减压蒸干，残渣溶于乙酸乙酯中，用5%枸橼酸水溶液洗涤，再用水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，残渣溶于四氢呋喃40mL中，加5NNaOH20mL，TritonB160mg，搅拌4小时，通过硅胶柱层析（MeOH/CH2Cl2梯度洗脱，5:95→20:80），得到目标化合物；
（5）(1S,2S,3R,4R)-1’-羧酸苄酯-3’-[(1S)-1’’-乙酰胺基-2’’-乙基]丁基-4’-二BOC胍基环戊-2’-氧-{5-[4,8-二(叔丁氧羰基)-11-(4-{[4,8,11-三(叔丁氧羰基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]甲基}苯基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]}-戊酸酯
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取5-[4,8-二(叔丁氧羰基)-11-(4-{[4,8,11-三(叔丁氧羰基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]-甲基}苯基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]戊酸2.18g（2.0mmol，1当量），加二氯甲烷10mL使溶解，加入DMAP0.36g，三乙胺5mL，加入(1S,2S,3R,4R)-2-羟基-3-[(1S)-1-乙酰胺基-2-乙基]丁基-4-二Boc-胍基环戊-1-羧酸苄酯1.22g（2.0mmol，1当量）溶于DMF/CH2Cl2（1:1）的10mL溶液，加入PyBOP1.24g（2.4mmol，1.2当量），在氮气保护下在室温下搅拌过夜，减压蒸出溶剂，残渣溶于乙酸乙酯中，用5%枸橼酸水溶液洗涤，再用水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，经硅胶柱层析（MeOH/CH2Cl2梯度洗脱）得到目标化合物；
（6）(1S,2S,3R,4R)-1’-羧酸-3’-[(1S)-1’’-乙酰胺基-2’’-乙基]丁基-4’-胍基环戊-2’-氧-{5-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]甲基}苯基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]}-戊酸酯
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取(1S,2S,3R,4R)-1’-羧酸苄酯-3’-[(1S)-1’’-乙酰胺基-2’’-乙基]丁基-4’-二BOC胍基环戊-2’-氧-{5-[4,8-二(叔丁氧羰基)-11-(4-{[4,8,11-三(叔丁氧羰基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]甲基}苯基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]}-戊酸酯1.7g（1mmol），加入17mL甲醇，加入0.5g10%Pd-C，用H2氢化12小时，过滤，滤液减压蒸干，加入1MHCl-Et2O溶液10mL（10mL/1mmol），室温搅拌过夜，减压浓缩，抽滤，用乙醚洗涤滤饼，减压干燥，得到目标产物。高分辨质谱（+ESI，m/z）：914.2935[M+H]+；1H-NMR(DMSO-d6,600MHz):δ11.0(s,1H),8.0(s,1H),6.94(s,4H),4.29(m,1H),3.56-3.62(m,5H),2.94-2.97(m,2H),2.36-2.67(m,35H),2.00-2.25(m,16H),1.84(m,1H),1.68(m,2H),1.49-1.53(m,8H),1.29-1.39(m,6H),0.96(t,6H)；13C-NMR(DMSO-d6,150MHz):δ180.0,173.1,170.5,158.0,134.1,128.6,69.5,60.4,59.0,58.6,57.1,56.7,56.4,54.1,47.5,45.7,45.3,45.0,44.7,41.5,40.7,40.5,40.2,33.9,27.8,26.8,24.6,23.6,23.5,22.8,22.4,11.9。
实施例2(1S,2S,3R,4R)-1’-羧酸-3’-[(1S)-1’’-乙酰胺基-2’’-乙基]丁基-4’-胍基环戊-2’-氧-{5-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]甲基}苯基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]}-十八烷酸酯
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同实施例1制备，将第（3）步的5-溴戊酸乙酯替换为18-溴-十八烷酸乙酯，得到目标化合物；高分辨质谱（+ESI，m/z）：1096.6419[M+H]+。
实施例3(1S,2S,3R,4R)-1’-羧酸-3’-[(1S)-1’’-乙酰胺基-2’’-乙基]丁基-4’-胍基环戊-2’-氧-{5-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]甲基}苯基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]}-甲基-苯基-戊酸酯
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同实施例1制备，将第（3）步的5-溴戊酸乙酯替换为对溴甲基-苯戊酸乙酯，得到目标化合物；高分辨质谱（+ESI，m/z）：1004.4098[M+H]+。
下面通过试验例对本发明提供的帕拉米韦衍生物酯的选择性指数、死亡保护率作进一步比较说明。
试验例1
体外抗病毒评价
药物抗流感病毒作用检测：将MDCK细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，用100TCID50的流感病毒感染细胞，再加入系列浓度的供试品溶液（DMSO作为溶剂），继续培养3天，经CPE法确定药物对流感病毒的抑制作用。EC50为50%抑制流感病毒的浓度（μmol/L）。
药物的细胞毒性检测：将MDCK细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，加入不同浓度的供试品溶液（DMSO作为溶剂），继续培养3天，用MTT法检测药物对MDCK细胞的毒性。CC50为导致MDCK细胞50%死亡的浓度（μmol/L）。
通过EC50和CC50计算选择性指数，选择性指数（SI）=EC50/CC50。
结果如表1所示。表中“戊酸酯”表示实施例1制备的(1S,2S,3R,4R)-1’-羧酸-3’-[(1S)-1’’-乙酰胺基-2’’-乙基]丁基-4’-胍基环戊-2’-氧-{5-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]甲基}苯基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]}-戊酸酯；“十八烷酸酯”表示实施例2制备的(1S,2S,3R,4R)-1’-羧酸-3’-[(1S)-1’’-乙酰胺基-2’’-乙基]丁基-4’-胍基环戊-2’-氧-{5-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]甲基}苯基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]}-十八烷酸酯；“甲基苯基戊酸酯”表示实施例3制备的(1S,2S,3R,4R)-1’-羧酸-3’-[(1S)-1’’-乙酰胺基-2’’-乙基]丁基-4’-胍基环戊-2’-氧-{5-[1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]甲基}苯基)-1,4,8,11-四氮杂环十四烷基]}-甲基-苯基-戊酸酯。
表1各化合物的抗病毒评价
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上述结果表明将帕拉米韦变为帕拉米韦衍生物酯显著增加了选择性指数，增加达20倍以上。
试验例2
体内抗病毒评价
流感病毒对小鼠半数致死量（LD50）的测定：昆明种小鼠20只，雌雄各半，雌雄分笼饲养。分别滴鼻感染不同稀释度的病毒液，每天观察，至感染后第14天为止。以死亡和生存为指标，计算病毒的半数致死量（LD50）。
药物对流感病毒感染小鼠的死亡保护试验：昆明种小鼠每组20只，雌雄各半，雌雄分笼饲养。经滴鼻感染10×LD50的流感病毒后，给予药物，共给药六天。各组小鼠均自感染之日起观察二周，观察小鼠发病症状，记录死亡时间，死亡数，计算死亡率（%），死亡保护率（%）和生命延长率（%）。死亡率=死亡动物数/动物总数*100%，死亡保护率=（动物总数-死亡动物数）/动物总数*100%，生命延长率=（给药动物平均生存天数/对照动物平均生存天数-1）*100%。
表2各化合物的体内抗病毒评价
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上述结果表明帕拉米韦衍生物酯给药后小鼠的死亡率明显降低，且生存时间延长，有许多动物给药后的观察时间结束后仍然存活。
本发明可制成各种制剂，如制剂例1～4。
制剂例1
硬胶囊剂
混合100mg帕拉米韦衍生物酯、79.2mg乳糖、70mg微晶纤维素和1.3mg硬脂酸镁，通过60目筛后，将这些粉末装入250mg的3号明胶胶囊制成胶囊剂。
制剂例2
片剂
混合100mg帕拉米韦衍生物酯、174mg乳糖、25mg微晶纤维素和1mg硬脂酸镁，通过压片机压片，制成1片300mg的片剂；根据需要可以对该片剂进行包衣。
制剂例3
溶液剂
取300mg帕拉米韦衍生物酯、蔗糖12mg、苯甲酸钠0.2mg，加入注射用水10ml，用0.1N盐酸调节pH至约6，经0.22μm滤膜过滤，装入玻璃瓶，121℃高压灭菌10min，即得。
制剂例4
注射液
取300mg帕拉米韦衍生物酯，加入生理盐水100ml，用0.1N盐酸调节pH至约6，经0.22μm滤膜过滤，装入玻璃瓶，121℃高压灭菌15min，即得。