用于增强植物生长的脂壳寡糖组合和方法.pdf

公开的是增强植物生长的方法，包括用有效量的至少两种脂壳寡糖处理植物种子或从种子萌发的植物，其中，与未经处理的植物或从未经处理的种子收获的植物相比，在收获时该植物表现出按蒲式耳/英亩测量的增加的植物产量、增加的根数量、增加的根长度、增加的根质量、增加的根体积和增加的叶面积中的至少一种。

1.  一种增强植物生长的方法，包括用有效量的至少两种脂壳寡糖(LCO)处理植物种子或从种子萌发的植物，其中，与未经处理的植物或从未经处理的种子收获的植物相比，在收获时所述植物表现出按蒲式耳/英亩测量的增加的植物产量、增加的根数量、增加的根长度、增加的根质量、增加的根体积和增加的叶面积中的至少一种。

2.  根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两种LCO包括由下式表示的LCO：

其中R₁表示C14:0、3OH-C14:0、异-C15:0、C16:0、3-OH-C16:0、异-C15:0、C16:1、C16:2、C16:3、异-C17:0、异-C17:1、C18:0、3OH-C18:0、C18:0/3-OH、C18:1、OH-C18:1、C18:2、C18:3、C18:4、C19:1氨基甲酰基、C20:0、C20:1、3-OH-C20:1、C20:1/3-OH、C20:2、C20:3、C22:1和C18-26(ω-1)-OH(包括其C18、C20、C22、C24和C26羟基化种类以及C16:1Δ9、C16:2(Δ2,9)和C16:3(Δ2,4,9))；R₂表示氢或甲基；R₃表示氢、乙酰基或氨基甲酰基；R₄表示氢、乙酰基或氨基甲酰基；R₅表示氢、乙酰基或氨基甲酰基；R₆表示氢、阿拉伯糖基、岩藻糖基、乙酰基、硫酸酯、3-0-S-2-0-MeFuc、2-0-MeFuc和4-0-AcFuc；R₇表示氢、甘露糖基或甘油；R₈表示氢、甲基或-CH₂OH；R₉表示氢、阿拉伯糖基或岩藻糖基；R₁₀表示氢、乙酰基或岩藻糖基；且n表示0、1、2或3。

3.  根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两种LCO包括图1a中示出的LCO。

4.  根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两种LCO包括图2a中示出的LCO。

5.  根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两种LCO包括由下式表示的LCO：

其中n＝1或2；R₁表示C16、C16:0、C16:1、C16:2、C18:0、C18:1Δ9Z或C18:1Δ11Z；且R₂表示氢或SO₃H。

6.  根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两种LCO包括图3a中示出的LCO。

7.  根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两种LCO包括图4a中示出的LCO。

8.  根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两种LCO包括图5中示出的LCO。

9.  根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两种LCO包括从根瘤菌菌株获得的LCO。

10.  根据权利要求9所述的方法，其中所述根瘤菌菌株选自根瘤菌(Rhizobium sp.)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)、中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)和固氮根瘤菌(Azorhizobium sp.)。

11.  根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两种LCO包括从大豆慢生根瘤菌(B.japonicum)获得的LCO。

12.  根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两种LCO包括从豌豆根瘤菌蚕豆生物变异型(R.leguminosarum biovar viciae)获得的LCO。

13.  根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两种LCO包括从草木樨中华根瘤菌(S.meliloti)获得的LCO。

14.  根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两种LCO包括从根内球囊霉(Glomus intraradicus)获得的LCO。

15.  根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两种LCO包括重组LCO。

16.  根据权利要求15所述的方法，其中所述重组LCO具有至少60％的纯度。

17.  根据权利要求15所述的方法，其中所述重组LCO具有至少70％的纯度。

18.  根据权利要求15所述的方法，其中所述重组LCO具有至少80％的纯度。

19.  根据权利要求15所述的方法，其中所述重组LCO具有至少90％的纯度。

20.  根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两种LCO包括合成LCO。

21.  根据权利要求1所述的方法，其中在种植之前或者在大约种植时 将所述至少两种LCO施用于种子。

22.  根据权利要求21所述的方法，其中所述至少两种LCO的有效量为大约10^-5至大约10^-14摩尔。

23.  根据权利要求1所述的方法，其中在犁沟中将所述至少两种LCO施用于种子。

24.  根据权利要求23所述的方法，其中所述至少两种LCO的有效量为1μg/英亩至大约70μg/英亩。

25.  根据权利要求1所述的方法，其中经由叶处理将所述至少两种LCO施用于所述植物。

26.  根据权利要求21所述的方法，其中所述至少两种LCO的有效量为1μg/英亩至大约30μg/英亩。

27.  根据权利要求1所述的方法，进一步包括将至少一种农艺学有益的试剂施用于所述植物或其种子。

28.  根据权利要求27所述的方法，其中所述至少一种农艺学有益的试剂是痕量营养素。

29.  根据权利要求28所述的方法，其中所述痕量营养素选自维生素和痕量矿物质。

30.  根据权利要求27所述的方法，其中所述至少一种农艺学有益的试剂是植物信号分子。

31.  根据权利要求30所述的方法，其中所述植物信号分子是壳寡糖(CO)。

32.  根据权利要求30所述的方法，其中所述植物信号分子选自几丁质化合物；类黄酮；茉莉酸及其衍生物、亚油酸及其衍生物、亚麻酸及其衍生物；和卡里金及其衍生物。

33.  根据权利要求27所述的方法，其中所述农艺学有益的试剂是除草剂、杀虫剂、杀真菌剂或其任意组合。

34.  根据权利要求27所述的方法，其中所述农艺学有益的试剂是解磷微生物、固氮生物(根瘤菌菌剂)和/或菌根真菌。

35.  根据权利要求34所述的方法，其中至少一种解磷微生物包括真菌青霉属(Penicillium)的菌株。

36.  根据权利要求34所述的方法，其中至少一种解磷微生物包括拜赖青霉(P.bilaiae)的菌株。

37.  根据权利要求36所述的方法，其中所述拜赖青霉的菌株选自NRRL50162、NRRL50169、ATCC20851、ATCC22348和ATCC18309。

38.  根据权利要求34所述的方法，其中至少一种解磷微生物包括P.gaestrivorus的菌株。

39.  根据权利要求1所述的方法，其中所述植物或其种子是豆科的。

40.  根据权利要求39所述的方法，其中所述豆科植物或其种子是大豆。

41.  根据权利要求1所述的方法，其中所述植物或其种子是非豆科的。

42.  根据权利要求41所述的方法，其中所述非豆科植物或其种子是大 田作物植物或种子。

43.  根据权利要求42所述的方法，其中所述大田作物植物或种子是玉米。

44.  根据权利要求41所述的方法，其中所述非豆科植物或其种子是蔬菜作物植物或种子。

用于增强植物生长的脂壳寡糖组合和方法
背景技术
革兰氏阴性土壤菌根瘤菌科(Rhizobiaceae)和慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)与豆科植物例如大豆之间的共生关系有较多文献记载。这些关系的生化基础包括分子信号传导的交换，其中，植物对细菌的信号化合物包括黄酮、异黄酮和黄烷酮类，而细菌对植物的信号化合物包括慢生根瘤菌和根瘤菌nod基因表达的终产物，称为脂壳寡糖(LCO)。这些细菌与豆科植物之间的共生使得豆科植物能够固定大气氮用于植物生长，由此免去对氮肥的需求。由于氮肥会显著增加作物的成本，并且与许多污染效应相关，农产业继续努力运用这种生物关系并开发新的用于提高植物产量而不增加氮类肥料的使用的试剂和方法。
美国专利第6,979,664号教导了增强植物作物的种子萌发或出苗的方法，包括以下步骤：提供包含有效量的至少一种脂壳寡糖和农业上适用的载体的组合物，以及在种子或幼苗的紧邻处以相较于未经处理的种子或幼苗能增强种子萌发或出苗的有效量施用该组合物。
关于该概念的进一步拓展在WO2005/062899中有过教导，其涉及至少一种植物诱导剂(即LCO)与杀真菌剂、杀虫剂或其组合的结合，以增强植物特性如植物挺立(plant stand)、生长、强健度(vigor)和/或产量。教导称这些组合物和方法适用于豆科植物和非豆科植物，并且可以用于处理种子(临种植前)、幼苗、根或植物。
相似地，WO2008/085958教导了用于在豆科植物和非豆科植物中增强植物生长和作物产量的组合物，其包含LCO与另一种活性剂如几丁质或壳聚糖、类黄酮化合物、或除草剂的组合，其可以同时或相继地施用于种子和/或植物。与在'899公开中的情况一样，'958公开教导了在临种植前对种子进行处理。
最近，Halford，“Smoke Signals”，Chem.Eng.News(2010年4月12日)第37～38页报道，在森林起火后，烟中所含的卡里金(karrikin) 或丁烯羟酸内酯起到生长刺激剂的作用并促使种子萌发，并且能滋补已储存的种子如玉米、番茄、莴苣和洋葱。这些分子是美国专利第7,576,213号的主题。
但是，对于促进或增强植物生长的体系仍存在需求。
发明内容
本发明的第一方面涉及增强植物生长的方法，包括：a)用有效量的至少两种脂壳寡糖(LCO)来处理(例如，施用于)植物种子或从种子萌发的植物，其中，与未经处理的植物或者从未经处理的种子收获的植物相比较，在收获时上述植物表现出以下的至少一种：按蒲式耳/英亩测量的增加的植物产量、增加的根数目、增加的根长度、增加的根质量、增加的根体积和增加的叶面积。
如上下文中清晰可见，两种LCO彼此不同。在一些实施方式中，对种子的处理包括将至少两种LCO直接施用于种子，然后其可以进行种植或者在种植之前储存一段时间。对种子的处理还可以包括间接处理，例如，通过将至少两种LCO引入至土壤中(在本领域中称为犁沟施用)。在另外的实施方式中，可以例如经由叶喷将至少两种LCO施用于由种子萌发的植物。该方法可以进一步包括使用其它的农艺学有益的试剂，例如痕量营养素，植物信号分子(例如脂壳寡糖、几丁质化合物(例如CO)，类黄酮、茉莉酸、亚油酸、亚麻酸及它们的衍生物、以及卡里金)，除草剂，杀真菌剂和杀虫剂，解磷微生物，固氮生物(根瘤菌菌剂)，和/或菌根真菌。
本发明的方法同样适用于豆科植物和非豆科植物。在一些实施方式中，豆科种子是大豆种子。在一些其它实施方式中，经处理的种子是非豆科种子，例如大田作物种子，譬如谷类(如玉米)，或蔬菜作物种子(如马铃薯)。
附图说明
图1a和2a示出了可用于实践本发明的两种脂壳寡糖化合物的化学结构。
图1b和2b示出了与图1a和2a中的LCO对应的相应的壳寡糖化合物(CO)的化学结构，并且其也可用于实践本发明。
图3a和4a示出了可用于实践本发明的其它LCO(Myc因子)的化学结构。
图3b和4b示出了也可用于实践本发明的相应的Myc CO的化学结构。
图5示出了可用于实践本发明的脂壳寡糖的化学结构。
图6是如下的条形图，示出以幼苗长度(以mm为单位，根+根上部)表示的用本发明的LCO组合相比于对照来处理紫花大翼豆(Macroptilium atropurpureum)的种子的效果。
图7和图8是这样的条形图，示出以叶绿度表示的用本发明的LCO组合相比于用单一LCO和用对照来处理紫花大翼豆植物的效果。
图9是如下的条形图，示出以每处理剂的花总量表示的用本发明的LCO组合相比于用单一LCO和用对照来处理紫花大翼豆植物的效果。
图10是如下的条形图，示出以每处理剂的果实总数表示的用本发明的LCO组合相比于用单一LCO和用对照来处理紫花大翼豆植物的效果。
图11是如下的条形图，示出以每株植物的平均果实数量表示的用本发明的LCO组合相比于用单一LCO和用对照来处理紫花大翼豆植物的效果。
图12是如下的条形图，示出以每株植物的平均产量(克)的总数表示的用本发明的LCO组合相比于用单一LCO和用对照来处理紫花大翼豆植物的效果。
图13是如下的条形图，示出以平均根长表示的用多种本发明的LCO组合相比于用单一LCO和用对照(水)来处理番茄种子的效果。
具体实施方式
在领域内也称为共生Nod信号或Nod因子的脂壳寡糖化合物(LCO)由在非还原端缩合有N-连接的脂酰链的β-l,4-连接的N-乙酰基-D-葡糖胺(“GIcNAc”)残基的寡糖骨架构成。LCO在骨架中GIcNAc残基的数目、脂酰链的长度和饱和度、以及还原和非还原糖残基的取代方面不同。参见，例如，Denarie等人,Ann.Rev.Biochem.65:503-35 (1996)，Hamel等人,Planta232:787-806(2010)(例如其中的图1，其示出了几丁质、壳聚糖、CO和对应的Nod因子(LCO)的结构；Prome等人,Pure&Appl.Chem.70(1):55-60(1998)。LCO的例子如以下的式I所示：

其中：
G是己糖胺，其可以例如在氮上被乙酰基取代，在氧上被硫酸根、乙酰基和/或醚基取代，
R₁、R₂、R₃、R₅、R₆和R₇可以相同或不同，表示H、CH₃CO--、C_xH_yCO--(其中x是0～17的整数，且y是1～35的整数)、或任何其它酰基例如氨基甲酰基，
R₄表示含有至少12个碳原子的单、二或三不饱和的脂肪链，且n是1～4的整数。
LCO可以得自(分离自和/或纯化自)例如根瘤菌的细菌，诸如根瘤菌(Rhizobium sp.)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)、中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)和固氮根瘤菌(Azorhizobium sp.)。LCO结构对于各个这些细菌物种是特有的，并且各个菌株可以产生多种具有不同结构的LCO。例如，来自草木樨中华根瘤菌(S.meliloti)的具体LCO已记载于美国专利第5,549,718号中，具有式II：

其中，R表示H或CH₃CO--，且n等于2或3。
更加具体的LCO包括NodRM、NodRM-1、NodRM-3。当被乙酰化时(R＝CH₃CO--)，它们分别变成AcNodRM-1和AcNodRM-3(美国专利第5,545,718号)。
来自大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)的LCO记载于美国专利第5,175,149和5,321,011号中。广泛而言，它们是包括甲基岩藻糖的五糖植物激素。大量的这些源自大豆慢生根瘤菌的LCO被记载：BjNod-V(C_18:1)；BjNod-V(A_C，C_18:1)、BjNod-V(C_16:1)；和BjNod-V(A_C，C_16:0)，其中“V”表示存在五个N-乙酰基葡糖胺；“Ac”表示乙酰化；“C”后面的数字表明脂肪酸侧链中碳的数目；且“:”后面的数字表示双键的数目。
本发明实施方式中使用的LCO可以从产生LCO的细菌菌株，例如固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、慢生根瘤菌属(包括大豆慢生根瘤菌)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、根瘤菌属(包括豌豆根瘤菌(R.leguminosarum))、中华根瘤菌属(包括草木樨中华根瘤菌)的菌株以及遗传工程改造为产生LCO的菌株中获得(即，分离和/或提纯)。 从这些根瘤菌和慢生根瘤菌微生物获得的两种或更多种LCO的组合包含在本发明的范围内。
LCO是豆科植物共生中宿主特异性的主要决定因子(Diaz等人,Mol.Plant-Microbe Interactions13:268-276(2000))。由此，在豆科中，根瘤菌的特定属和种与特定的豆科宿主发展出共生的固氮关系。这些植物-宿主/细菌组合记载于Hungria等人,Soil Biol.Biochem.29:819-830(1997)。这些细菌/豆科植物共生伙伴关系的实例包括草木樨中华根瘤菌/苜蓿和草木樨；豌豆根瘤菌蚕豆生物变异型(R.leguminosarum biovar viciae)/豌豆和小扁豆；豌豆根瘤菌菜豆生物变异型(R.leguminosarum biovar phaseoli)/菜豆；大豆慢生根瘤菌/大豆；以及豌豆根瘤菌三叶草生物变异型(R.leguminosarum biovar trifolii)/红三叶草。Hungria还列举了有效的根瘤菌菌种的类黄酮Nod基因诱导物，和由不同根瘤菌菌种产生的具体LCO结构。然而，LCO特异性仅需用来在豆科植物中建立结瘤。在本发明的实践中，给定LCO的用途并不限于对其共生豆科植物伙伴的种子进行处理，从而与由未经处理的种子收获的植物相比，或与由使用信号分子在临种植前或在种植的一周或更短时间内处理的种子而收获的植物相比，实现按蒲式耳/英亩测量的增加的植物产量、增加的根数目、增加的根长度、增加的根质量、增加的根体积和增加的叶面积。
因此，通过进一步的实例，可用于实施本发明的LCO及其非天然出现的衍生物由下式表示：

其中R₁表示C14:0、3OH-C14:0、异-C15:0(iso-C15:0)、C16:0、3-OH-C16:0、异-C15:0、C16:1、C16:2、C16:3、异-C17:0、异-C17:1、C18:0、3OH-C18:0、C18:0/3-OH、C18:1、OH-C18:1、C18:2、C18:3、C18:4、C19:1氨基甲酰基、C20:0、C20:1、3-OH-C20:1、C20:1/3-OH、 C20:2、C20:3、C22:1和C18-26(ω-1)-OH(根据D'Haeze等人，Glycobiology12:79R-105R(2002)，其包括C18、C20、C22、C24和C26羟基化种类以及C16:1Δ9、C16:2(Δ2,9)和C16:3(Δ2,4,9))；R₂表示氢或甲基；R₃表示氢、乙酰基或氨基甲酰基；R₄表示氢、乙酰基或氨基甲酰基；R₅表示氢、乙酰基或氨基甲酰基；R₆表示氢、阿拉伯糖基、岩藻糖基、乙酰基、硫酸酯、3-0-S-2-0-MeFuc、2-0-MeFuc和4-0-AcFuc；R₇表示氢、甘露糖基或甘油；R₈表示氢、甲基或-CH₂OH；R₉表示氢、阿拉伯糖基或岩藻糖基；R₁₀表示氢、乙酰基或岩藻糖基；且n表示0、1、2或3。该结构所包括的天然出现的根瘤菌LCO的结构描述于以下文献中：D'Haeze等人,同上。
通过再进一步其他的实例，图1a所示的获自大豆慢生根瘤菌的LCO可以用于处理大豆以外的豆科种子以及非豆科种子(例如玉米)。作为另一个例子，图2a所示的可获自豌豆根瘤菌蚕豆生物变异型(Rhizobium leguminosarum biovar viciae)的LCO(称作LCO-V(C18:1),SP104)也可以用于处理豌豆以外的豆科种子和非豆科植物。因此，在一些实施方式中，图1a和2a图示的两种LCO的组合被用于本发明的方法中。
本发明还包括从菌根真菌例如球囊菌群组真菌(如根内球囊菌)获得(即，分离和/或提纯)的LCO的用途。获自这些真菌的代表性LCO的结构描述于WO2010/049751和WO2010/049751中(其中所述的LCO也称作“Myc因子”)。代表性的源自菌根真菌的LCO及其非天然出现的衍生物由以下结构表示：

其中n＝1或2；R₁表示C16、C16:0、C16:1、C16:2、C18:0、C18:1Δ9Z或C18:1Δ11Z；并且R₂表示氢或SO₃H。在一些实施方式中，LCO由菌根真菌产生，如图3a和4a所示。在一些实施方式中，这些LCO用 于本发明的方法中。
在一些其它实施方式中，在本发明的方法中使用的两种LCO的一种是从草木樨中华根瘤菌(S.meliloti)获得，并且示于图5中。因此，在本发明的一些实施方式中，LCO包括在图1a、图2a、图3a、图4a和图5中所示出的LCO中的至少两种。广义而言，本发明包括任意两种或更多种LCO的用途，包括天然存在的(例如，根瘤菌的、慢生根瘤菌的和真菌的)、重组的、合成的以及其非天然存在的衍生物。在一些实施方式中，该至少两种LCO都是重组的。
本发明还包括合成型LCO化合物例如WO2005/063784中所述者以及通过基因工程产生的重组型LCO的用途。基本的天然出现的LCO结构可以含有在天然出现的LCO中发现的修饰或取代，例如以下文献中所述：Spaink,Crit.Rev.Plant Sci.54:257-288(2000)和D'Haeze，同上。构建LCO的前体寡糖分子(CO，如下文所述，在本发明中也可用作植物信号分子)也可以通过基因工程改造的有机体合成，例如，如以下文献中所述：Samain等人,Carbohydrate Res.302:35-42(1997)；Cottaz等人,Meth.Eng.7(4):311-7(2005)；和Samain等人,J.Biotechnol.72:33-47(1999)(例如，其中图1显示了可以在具有基因nodBCHL的不同组合的大肠杆菌中重组产生的CO的结构)。因此，在一些实施方式中，至少两种LCO的组合包括选自图1a、图2a、图3a、图4a和图5中所示LCO的LCO的组合。
LCO可以以多种纯度形式进行利用，并且可以单独使用或以LCO产生细菌或真菌的培养物的形式进行使用。例如，(从Novozymes BioAg Limited市售可得)含有产生图1a中所示的LCO(LCO-V(C18:1，MeFuc)，MOR116)的大豆慢生根瘤菌的培养物。提供基本纯的LCO的方法包括，简单地从LCO与微生物的混合物中去除微生物细胞，或通过LCO溶剂相分离以及之后的HPLC色谱而继续分离并纯化LCO分子，例如在美国专利第5,549,718号中记载的。通过重复的HPLC可以增强纯化，且可以将纯化的LCO分子进行冻干以用于长期储存。可以使用如上所述的壳寡糖(CO)作为产生合成型LCO的起始原料。出于本发明的目的，适合用于本发明的重组型LCO为至少60％纯，例如至少60％纯，至少65％纯，至少70％纯，至少75％纯，至少80％纯， 至少85％纯，至少90％纯，至少91％纯，至少92％纯，至少93％纯，至少94％纯，至少95％纯，至少96％纯，至少97％纯，至少98％纯，至少99％纯，直至100％纯。
种子可以用至少两种LCO以多种方式例如喷洒或滴液进行处理。喷洒和滴液处理可以通过在通常为水性性质的农业上可接受的载体中配制有效量的该至少两种LCO，并通过连续处理系统(其已校准为以预定速率与种子的连续流成比例地施加处理)例如卧筒式处理器将组合物喷洒或滴到种子上而进行。这些方法有利地采用相对少量的载体，从而使经过处理的种子相对快速地干燥。按照这样方式，大量的种子可以被有效处理。也可以采用分批系统，其中将预定批量的种子和信号分子组合物输送至混合器。用于进行这些工序的系统和装置可以商购自许多供应商，例如Bayer CropScience(Gustafson)。
在另一实施方式中，处理涉及用该至少两种LCO涂覆种子。一种这样的工序涉及用组合物涂覆圆形容器的内壁，添加种子，然后转动容器以使种子与内壁和组合物接触，在领域内称为“容器涂覆”的工序。种子可以通过涂覆方法的组合进行涂覆。浸泡通常需要使用含有植物生长增强剂的水溶液。例如，种子可以浸泡约1分钟至约24小时(例如，至少1min、5min、10min、20min、40min、80min、3hr、6hr、12hr、24hr)。一些类型的种子(例如，大豆种子)趋向于对湿度敏感。因此，将这些种子浸泡延长的时间段可能并不可取，在这种情况下，浸泡通常执行约1分钟至约20分钟。
在涉及在施用至少两种LCO后将种子储存的那些实施方式中，在储存期间的任意部分时间内，LCO对种子的附着并不是关键性的。不期望受任何特定操作理论的束缚，申请人认为，即使处理可能不会使植物信号分子在处理后和任意储存时段保持与种子表面接触，LCO也可以通过称为种子记忆或种子感知的现象而实现其预期效果。参见，Macchiavelli等人,J.Exp.Bot.55(408):1635-40(2004)。申请人还认为，在处理后，LCO朝着发育中的幼根扩散，并激活共生和发育基因，引起植物根构型的改变。尽管如此，在期望的程度上，含有LCO的组合物还可以包含粘着剂或涂覆剂。出于美观的目的，组合物还可以含有涂覆聚合物和/或着色剂。
在一些实施方式中，至少两种LCO通过同一组合物(即，它们配制在一起)而施用至种子(直接或间接地)或施用至植物。在其它实施方式中，进行单独配制，其中两种LCO组合物均被施用至种子或植物，或者在一些实施方式中，LCO中的一者被施用至种子且另一者被施用至植物。
至少两种LCO的总量能有效增强生长，从而在收获时，该植物与未经(任一活性物)处理的植物或从未经(任一活性物)处理的种子收获的植物相比，表现出按蒲式耳/英亩测量的增加的植物产量、增加的根数量、增加的根长度、增加的根质量、增加的根体积和增加的叶面积中的至少一种。用于处理种子的该至少两种LCO的有效量，以浓度单位表示，通常为约10^-5至约10^-14M(摩尔浓度)，在一些实施方式中为约10^-5至约10^-11M，在一些其他实施方式中为约10^-7至约10^-8M。以重量单位表示，有效量通常为约1至约400μg/英担(cwt)种子，在一些实施方式中为约2至约70μg/cwt种子，在一些其他实施方式中为约2.5至约3.0μg/cwt种子。
出于间接处理种子即犁沟处理的目的，该至少两种LCO的有效量通常为1μg/英亩至约70μg/英亩，在一些实施方式中为约50μg/英亩至约60μg/英亩。出于施用至植物的目的，LCO的有效量通常为1μg/英亩至约30μg/英亩，在一些实施方式中为约11μg/英亩至约20μg/英亩。
种子可以用至少两种LCO在临种植前或在种植时进行处理。在种植时的处理可以包括如上所述的直接施用至种子，或者在一些其他实施方式中通过将活性物引入至土壤中(领域内已知为犁沟处理)。在涉及处理种子之后进行储存的那些实施方式中，种子随后可以根据标准技术包装在例如50-lb或100-lb袋或散装袋或容器中。种子可以在领域内已知的适当储存条件下储存至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月，甚至更长，例如，13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36个月或者更久。大豆种子可能需要在下一季节中播种，而玉米种子可以储存长得多的时间，包括3年以上。
其它农艺学有益的试剂
本发明可以进一步包括将种子或从种子萌发的植物用至少一种农业/农艺学有益的试剂处理。如本文和本领域所使用的，术语“农业或农艺学有益”是指当施用至种子或植物时，试剂导致植物特性例如植物挺立(stand)、生长(例如，如关联LCO所定义的)或强健度与未经处理的种子或植物相比有所提高(其在统计学上可以是显著的)。可以将这些试剂与至少两种LCO配制在一起，或者经由单独配制而施用至种子或植物。可用于实施本发明的这类试剂的代表性实例包括痕量营养素(例如，维生素和痕量矿物质)、(LCO以外的)植物信号分子、除草剂、杀真菌剂和杀虫剂、解磷微生物、固氮生物(根瘤菌菌剂)、和/或菌根真菌。
痕量营养素
可用于实施本发明的代表性维生素包括泛酸钙、叶酸、生物素和维生素C。可用于实施本发明的痕量矿物质的代表性实例包括硼、氯、锰、铁、锌、铜、钼、镍、硒和钠。
用于处理种子的至少一种痕量营养素的量以浓度单位表达时，范围通常为10ppm至100ppm，在一些实施方式中，为大约2ppm至大约100ppm。以重量单位表达时，在一个实施方式中，有效量范围通常为大约180μg/英担(cwt)种子至大约9mg/英担(cwt)种子，在一些实施方式中，当施用于叶子时，为大约4μg/植物至大约200μg/植物。换言之，出于处理种子的目的，至少一种痕量营养素的有效量范围通常为30μg/英亩至大约1.5mg/英亩，在一些实施方式中，当在叶上施用时，为大约120mg/英亩至大约6g/英亩。
植物信号分子
本发明还可以包括将种子或植物用LCO以外的植物信号分子处理。出于本发明的目的，可以与“植物生长增强剂”互换使用的术语“植物信号分子”广泛地指代任何在植物或微生物中天然出现的和合成的(其可以是非天然出现的)试剂，其直接或间接地活化植物生化通路，导致相比未经处理的植物或从未经处理的种子收获的植物而言增加的植物生长，这至少在以下至少一方面是可度量的：按蒲式耳/英亩测量的增加的产量、增加的根数目、增加的根长度、增加的根质量、增加的根体积和增加的叶面积。可以用于实施本发明的植物信号分子的代表性实例包括 几丁质化合物、类黄酮、茉莉酸、亚油酸和亚麻酸及其衍生物(同上)、和卡里金。
壳寡糖
本领域已知CO是β-1-4连接的N-乙酰基葡糖胺结构，其被鉴别为几丁质寡聚物，也被鉴别为N-乙酰基壳寡糖。CO具有独特且不同的侧链修饰，这使其与几丁质分子[(C₈H₁₃NO₅)_n，CAS No.1398-61-4]和壳聚糖分子[(C₅H₁₁NO₄)_n，CAS No.9012-76-4]不同。本发明的CO相对于几丁质和壳聚糖也是相对水溶性的，在一些实施方式中，如下文所述，是五聚的。描述可适用于本发明的CO的结构和制备的代表性文献如下：Muller等人,Plant Physiol.124:733-9(2000)；Van der Holst等人,Current Opinion in Structural Biology,11:608-616(2001)(例如，其中图1)；Robina等人,Tetrahedron58:521-530(2002)；D'Haeze等人,Glycobiol.12(6):79R-105R(2002)；Hamel,et al.,Planta232:787-806(2010)(例如图1，其示出几丁质、壳聚糖、CO和对应的Nod因子(LCO)的结构)；Rouge等人,Chapter27,"The Molecular Immunology of ComplexCarbohydrates"in Advances in Experimental Medicine and Biology,Springer Science；Wan等人,Plant Cell21:1053-69(2009)；PCT/F100/00803(9/21/2000)；和Demont-Caulet等人,Plant Physiol.120(1):83-92(1999)。
就结构而言CO与LCO的不同之处主要在于其缺少侧边的(pendant)脂肪酸链。可以用于实施本发明的源自根瘤菌的CO以及其非天然出现的合成衍生物可以用下式表示：

其中R₁和R₂各自独立地表示氢或甲基；R₃表示氢、乙酰基或氨基甲酰基；R₄表示氢、乙酰基或氨基甲酰基；R₅表示氢、乙酰基或氨基甲酰基；R₆表示氢、阿拉伯糖基、岩藻糖基、乙酰基、硫酸酯、 3-0-S-2-0-MeFuc、2-0-MeFuc和4-0-AcFuc；R₇表示氢、甘露糖基或甘油；R₈表示氢、甲基或-CH₂OH；R₉表示氢、阿拉伯糖基或岩藻糖基；R₁₀表示氢、乙酰基或岩藻糖基；且n表示0、1、2或3。对应的根瘤菌LCO的结构描述于D'Haeze等人中,同上。
图1b和2b中显示了两种可适用于本发明的CO。它们分别对应于大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)和豌豆根瘤菌蚕豆生物变异型(R.leguminosarum biovar viciae)产生的LCO，它们分别与大豆和豌豆共生相互作用，但缺少脂肪酸链。
其它的可适用于实施本发明的CO的结构很容易从获自(即，分离自和/或提纯自)菌根真菌例如球囊菌(Glomerocycota)群组的真菌(例如根内球囊霉(Glomus intraradices))的LCO得到。参见，例如WO2010/049751和Maillet等人,Nature469:58-63(2011)(其中所述的LCO也称作“Myc因子”)。代表性的源自菌根真菌的CO由以下结构表示：

其中n＝1或2；R₁表示氢或甲基；且R₂表示氢或SO₃H。图3b和4b分别显示了两种可适用于本发明的其他CO，其一是硫酸化的，另一种是非硫酸化的。它们对应于前述由菌根真菌根内球囊霉所产生的两种不同的LCO，其显示于图3a和4a中。
CO可以是合成的或重组的。合成型CO的制备方法描述于，例如以下文献中：Robina,同上。例如使用大肠杆菌(E.coli)作为宿主制备重组型CO的方法是本领域已知的。参见，例如，Dumon等人,ChemBioChem7:359-65(2006)；Samain等人,Carbohydrate Res.302:35-42(1997)；Cottaz等人,Meth.Eng.7(4):311-7(2005)和Samain等人,J.Biotechnol.72:33-47(1999)(例如其中的图1，其显示了可以在具有基因nodBCHL的不同组 合的大肠杆菌中重组产生的CO的结构)。出于本发明的目的，重组型CO为至少60％纯，例如至少60％纯，至少65％纯，至少70％纯，至少75％纯，至少80％纯，至少85％纯，至少90％纯，至少91％纯，至少92％纯，至少93％纯，至少94％纯，至少95％纯，至少96％纯，至少97％纯，至少98％纯，至少99％纯，直至100％纯。
其它几丁质化合物包括几丁质和壳聚糖，其是真菌细胞壁以及昆虫和甲壳类动物的外骨骼的主成分，也由GIcNAc残基构成。几丁质化合物包括几丁质(IUPAC：N-[5-[[3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟甲基)环氧乙烷-2基]甲氧基甲基]-2-[[5-乙酰氨基-4,6-二羟基-2-(羟甲基)环氧乙烷-3-基]甲氧基甲基]-4-羟基-6-(羟甲基)环氧乙烷-3-基]乙酰胺)、和壳聚糖(IUPAC：5-氨基-6-[5-氨基-6-[5-氨基-4,6-二羟基-2(羟甲基)环氧乙烷-3-基]氧-4-羟基-2-(羟甲基)环氧乙烷-3-基]氧-2(羟甲基)环氧乙烷-3,4-二醇)。这些化合物可以商购自例如Sigma-Aldrich，或者可以从昆虫、甲壳类动物的壳或真菌细胞壁制得。制备几丁质和壳聚糖的方法为领域内已知，并已记载于例如美国专利第4,536,207号(由甲壳类动物的壳制备)、Pochanavanich等人,Lett.Appl.Microbiol.35:17-21(2002)(由真菌细胞壁制备)和美国专利第5,965,545号中(由蟹壳以及市售壳聚糖的水解进行制备)。还参见，Jung等人,Carbohydrate Polymers67:256-59(2007)；Khan等人,Photosynthetica40(4):621-4(2002)。可以得到小于35％至大于90％去乙酰化的去乙酰化几丁质和壳聚糖，且其涵盖较广范围的分子量，例如小于15kD的低分子量壳聚糖寡聚体和0.5～2kD的几丁质寡聚体；分子量为约15OkD的“实用级(practicalgrade)”壳聚糖；和高达70OkD的高分子量壳聚糖。配制用于种子处理的几丁质和壳聚糖组合物也市售可得。市售产品包括，例如(Plant Defense Boosters,Inc.)和BEYOND^TM(Agrihouse,Inc.)。
类黄酮是具有两个芳族环由三碳桥连接的一般结构的酚类化合物。类黄酮由植物产生并具有多种功能，例如，作为有益的信号传导分子，以及作为对抗昆虫、动物、真菌和细菌的保护物质。类黄酮的分类包括查耳酮、花青素、香豆素、黄酮、黄烷醇、黄酮醇、黄烷酮和异黄酮。参见，Jain等人,J.Plant Biochem.&Biotechnol.11:1-10(2002)；Shaw等人,Environmental Microbiol.11:1867-80(2006)。
可用于实施本发明的代表性类黄酮包括染料木黄酮、大豆黄酮、芒柄花素、柚皮素、橙皮素、木樨草素和芹菜素。类黄酮化合物可以从例如Natland International Corp.,Research Triangle Park,NC；MPBiomedicals,Irvine,CA；LC Laboratories,Woburn MA商购得到。类黄酮化合物可以从植物或种子中分离，例如，如在美国专利第5,702,752；5,990,291；和6,146,668号中所记载。类黄酮化合物还可以通过遗传工程有机体例如酵母来产生，如Ralston等人,Plant Physiology137:1375-88(2005)中所记载。
茉莉酸(JA，[1R-[1α,2β(Z)]]-3-氧代-2-(戊烯基)环戊烷乙酸)及其衍生物(其包括亚油酸和亚麻酸(其在以上关联脂肪酸及其衍生物进行描述))可以用于实施本发明。茉莉酸及其甲酯(茉莉酸甲酯(MeJA))，统称为茉莉酮酸酯，是在植物中天然出现的十八烷(octadecanoid)类化合物。茉莉酸由小麦幼苗的根部产生，以及通过真菌微生物例如可可球二孢菌(Botryodiplodia theobromae)和藤仓赤霉(Gibbrella fujikuroi)、酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))以及大肠杆菌(Escherichia coli)的致病性菌株和非致病性菌株产生。亚油酸和亚麻酸在茉莉酸的生物合成过程中产生。比如，亚油酸和亚麻酸、茉莉酸酮酯(及其衍生物)被报道为根际细菌(rhizobacteria)nod基因表达或LCO产生的诱导物。参见，例如Mabood,Fazli,Jasmonates induce the expression of nod genes in Bradyrhizobiumjaponicum,May17,2001。
可用于实施本发明的茉莉酸、亚油酸和亚麻酸的有用衍生物包括酯、酰胺、糖苷和盐。代表性的酯是其中茉莉酸、亚油酸和亚麻酸的羧基已被--COR基取代的化合物，其中R是--OR¹基，其中R¹为：烷基，例如C₁～C₈无支链或支链的烷基，如甲基、乙基或丙基；烯基，例如C₂～C₈无支链或支链的烯基；炔基，例如C₂～C₈无支链或支链的炔基；具有例如6～10个碳原子的芳基；或具有例如4～9个碳原子的杂芳基，其中杂芳基中的杂原子可以是例如N、O、P或S。代表性的酰胺是其中茉莉酸、亚油酸和亚麻酸的羧基已被--COR基取代的化合物，其中R是NR²R³基，其中R²和R³独立地为：氢；烷基，例如C₁～C₈无支链或支链的烷基，如甲基、乙基或丙基；烯基，例如C₂～C₈无支 链或支链的烯基；炔基，例如C₂～C₈无支链或支链的炔基；具有例如6～10个碳原子的芳基；或具有例如4～9个碳原子的杂芳基，其中杂芳基中的杂原子可以是例如N、O、P或S。酯可以通过已知方法进行制备，例如酸催化的亲核加成，其中羧酸与醇在催化量的无机酸的存在下进行反应。酰胺也可以通过已知方法进行制备，例如通过使羧酸与合适的胺于中性条件下在偶联剂比如二环己基碳二亚胺(DCC)的存在下进行反应。茉莉酸、亚油酸和亚麻酸的合适的盐包括，例如碱加成盐。可以用作制备这些化合物的代谢上可接受的碱盐的试剂的碱包括源自阳离子例如碱金属阳离子(例如钾和钠)和碱土金属阳离子(例如钙和镁)的那些。这些盐可以通过将亚油酸、亚麻酸或茉莉酸的溶液与碱溶液混合在一起而容易地制备。盐可以从溶液中沉淀出，并通过过滤收集或可以通过其他方法例如通过溶剂蒸发而回收。
卡里金是插烯型4H-吡喃酮例如2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮，包括其衍生物和类似物。这些化合物的实例由以下结构表示，或是其生物学可接受的盐：

其中：Z是O、S或NR₅；R₁、R₂、R₃和R₄各自独立地为H、烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、羟基、羟烷基、烷氧基、苯氧基、苄氧基、CN、COR₆、COOR＝、卤素、NR₆R₇或NO₂；且R₅、R₆和R₇各自独立地为H、烷基或烯基。这些化合物的生物学可接受的盐的实例可以包括与生物学可接受的酸形成的酸加成盐，其实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐或硫酸氢盐、磷酸盐或磷酸氢盐、乙酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、葡糖酸盐；甲磺酸盐、苯磺酸盐和对甲苯磺酸。其它生物学可接受的金属盐可以包括与碱形成的碱金属盐，其实例包括钠盐和钾盐。该结构所包含的且可以适用于本发明的化合物的实例包括以下：3-甲基-2H- 呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R₁＝CH₃，R₂、R₃、R₄＝H)、2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R₁、R₂、R₃、R₄＝H)、7-甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R₁、R₂、R₄＝H，R₃＝CH₃)、5-甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R₁、R₂、R₃＝H，R₄＝CH₃)、3,7-二甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R₁、R₃＝CH₃，R₂、R₄＝H)、3,5-二甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R₁、R₄＝CH₃，R₂、R₃＝H)、3,5,7-三甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R₁、R₃、R₄＝CH₃，R₂＝H)、5-甲氧基甲基-3-甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R₁＝CH₃，R₂、R₃＝H，R₄＝CH₂OCH₃)、4-溴-3,7-二甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮(其中R₁、R₃＝CH₃，R₂＝Br，R₄＝H)、3-甲基呋喃并[2,3-c]吡啶-2(3H)-酮(其中Z＝NH，R₁＝CH₃，R₂、R₃、R₄＝H)、3,6-二甲基呋喃并[2,3-c]吡啶-2(6H)-酮(其中Z＝N-CH₃，R₁＝CH₃，R₂、R₃、R₄＝H)。参见，美国专利第7,576,213号。这些分子也称为卡里金。参见，Halford，同上。
用于处理种子的至少一种植物信号分子的量，以浓度单位表示，通常为约10^-5至约10^-14M(摩尔浓度)，在一些实施方式中为约10^-5至约10^-11M，在一些其他实施方式中为约10^-7至约10^-8M。以重量单位表示，有效量通常为约1至约400μg/英担(cwt)种子，在一些实施方式中为约2至约70μg/cwt种子，在一些其他实施方式中为约2.5至约3.0μg/cwt种子。
出于间接处理种子即犁沟处理的目的，至少一种植物信号分子的有效量范围通常为1μg/英亩至大约70μg/英亩，在一些实施方式中，为大约50μg/英亩至大约60μg/英亩。出于施用至植物的目的，至少一种植物信号分子的有效量范围通常为1μg/英亩至大约30μg/英亩，在一些实施方式中，为大约11μg/英亩至大约20μg/英亩。
除草剂、杀真菌剂和杀虫剂
适当的除草剂包括苯达松、氟锁草醚、氯嘧磺隆、乳氟禾草灵、广灭灵、吡氟禾草灵、草铵膦、草甘膦、稀禾定、咪唑乙烟酸、甲氧咪草烟、氟磺胺草醚、氟烯草酸、灭草喹、和烯草酮。含有这些化合物中的每一种的市售产品容易可得。组合物中除草剂的浓度将通常与所标记的对于特定除草剂的使用量相对应。
本文和本领域所用的“杀真菌剂”是杀灭或抑制真菌生长的试剂。 如果相对于未经处理的群，使用杀真菌剂的处理引起(例如，土壤中的)真菌群的杀灭或真菌群的生长抑制，则本文所用的杀真菌剂针对特定真菌菌种“表现出活性”。根据本发明的有效杀真菌剂将适当地针对较广范围的病原体表现出活性，病原体包括但不限于疫霉属(Phytophthora)、丝核菌属(Rhizoctonia)、镰孢菌属(Fusarium)、腐霉菌属(Pythium)、拟茎点霉属(Phomopsis)或核盘菌属(Selerotinia)和层锈菌属(Phakopsora)及其组合。
市售杀真菌剂可适用于本发明。适当的市售可得的杀真菌剂包括RIVAL或ALLEGIANCE FL或LS(Gustafson,Plano,TX)、WARDEN RTA(Agrilance,St.Paul,MN)、APRON XL、APRON MAXXRTA或RFC、MAXIM4FS或XL(Syngenta,Wilmington,DE)、CAPTAN(Arvesta,Guelph,Ontario)和PROTREAT(Nitragin Argentina,BuenosAres,Argentina)。在这些和其他市售杀真菌剂中的活性成分包括，但不限于，咯菌腈、精甲霜灵、嘧菌酯和甲霜林。市售杀真菌剂最适合根据制造商的说明以推荐的浓度进行使用。
如果相对于未经处理的群，使用杀虫剂的处理引起昆虫群的杀灭或昆虫群的抑制，则本文所用的杀虫剂针对特定昆虫物种“表现出活性”。根据本发明的有效杀虫剂将适当地针对较广范围的昆虫表现出活性，昆虫包括但不限于，线虫、切根虫、蛴螬、玉米根虫、种蝇、跳甲、麦长蝽、蚜虫、叶壳、和椿象。
市售杀虫剂可适用于本发明。合适的市售可得的杀虫剂包括CRUISER(Syngenta,Wilmington,DE)、GAUCHO和PONCHO(Gustafson,Plano,TX)。在这些和其他市售杀虫剂中的活性成分包括噻虫嗪、噻虫胺、和吡虫啉。市售杀虫剂最适合根据制造商的说明以推荐的浓度进行使用。
解磷微生物、固氮生物(根瘤菌菌剂)和/或菌根真菌
本发明可以进一步包括将种子用解磷微生物处理。本文所使用的“解磷微生物”是能够增加植物可利用的磷量的微生物。解磷微生物包括真菌菌株和细菌菌株。在实施方式中，解磷微生物是产孢子微生物。
解磷微生物的非限制性实例包括选自不动杆菌属(Acinetobacter)、 节杆菌属(Arthrobacter)、节丛孢属(Arthrobotrys)、曲霉属(Aspergillus)、固氮螺菌属(Azospirillum)、芽孢杆菌属(Bacillus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、假丝酵母属(Candida)、金色单胞菌属(Chryseomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、正青霉属(Eupenicillium)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、克吕沃尔菌属(Kluyvera)、微杆菌属(Microbacterium)、毛霉属(Mucor)、拟青霉属(Paecilomyces)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、青霉属(Penicillium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、链孢囊菌属(Streptosporangium)、Swaminathania属、硫杆菌属(Thiobacillus)、孢圆酵母属(Torulospora)、弧菌属(Vibrio)、黄色杆菌属(Xanthobacter)和黄单胞菌属(Xanthomonas)的菌种。
解磷微生物的非限制性实例选自乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)、节杆菌(Arthrobacter sp.)、少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)、黑曲霉(Aspergillus niger)、曲霉菌(Aspergillus sp.)、Azospirillum halopraeferans、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、越南伯克霍尔德菌(Burkholderiavietnamiensis)、克瑞斯假丝酵母(Candida krissii)、浅黄金色单胞菌(Chryseomonas luteola)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、肠杆菌(Enterobacter sp.)、泰洛肠杆菌(Enterobacter taylorae)、微细正青霉(Eupenicillium parvum)、微小杆菌(Exiguobacterium sp.)、克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)、栖冷克吕沃尔菌(Kluyvera cryocrescens)、微杆菌(Microbacterium sp.)、多枝毛霉(Mucor ramosissimus)、蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepialid)、马昆德拟青霉(Paecilomyces marquandii)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillusmacerans)、胶质类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)、成团泛菌(Pantoea aglomerans)、扩展青霉(Penicillium expansum)、Pseudomonascorrugate、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、Pseudomonas lutea、草假单胞菌(Pseudomonas poae)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、平凡假单胞菌(Pseudomonas trivialis)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、链霉菌(Streptomycessp.)、链孢囊菌(Streptosporangium sp.)、Swaminathania salitolerans、氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)、球有孢圆酵母(Torulosporaglobosa)、解蛋白弧菌(Vibrio proteolyticus)、敏捷黄色杆菌(Xanthobacter agilis)和野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)。
在具体的实施方式中，解磷微生物是青霉属真菌的菌株。可用于实施本发明的青霉属真菌的菌株包括拜赖青霉(P.bilaiae，早先称为P.bilaii)、微白青霉(P.albidum)、桔灰青霉(P.aurantiogriseum)、产黄青霉(P.chrysogenum)、黄暗青霉(P.citreonigrum)、桔青霉(P.citrinum)、指状青霉(P.digitatum)、常现青霉(P.frequentas)、褐青霉(P.fuscum)、P.gaestrivorus、光孢青霉(P.glabrum)、灰黄青霉(P.griseofulvum)、纠缠青霉(P.implicatum)、微紫青霉(P.janthinellum)、淡紫青霉(P.lilacinum)、微黄青霉(P.minioluteum)、蒙大拿青霉(P.montanense)、黑青霉(P.nigricans)、草酸青霉(P.oxalicum)、P.pinetorum、嗜松青霉(P.pinophilum)、产紫青霉(P.purpurogenum)、P.radicans、放射青霉(P.radicum)、雷斯青霉(P.raistrickii)、皱褶青霉(P.rugulosum)、简青霉(P.simplicissimum)、离生青霉(P.solitum)、变幻青霉(P.variabile)、毡毛青霉(P.velutinum)、鲜绿青霉(P.viridicatum)、灰绿青霉(P.glaucum)、P.fussiporus和扩展青霉(P.expansum)。
在一个具体的实施方式中，青霉属菌种是拜赖青霉。在另一具体的实施方式中，拜赖青霉菌株选自ATCC20851、NRRL50169、ATCC22348、ATCC18309、NRRL50162(Wakelin等人,2004.Biol Fertil Soils40:36-43)。在另一具体的实施方式中，青霉属菌种是P.gaestrivorus菌株，例如NRRL50170(参见，Wakelin，同上)。
在一些实施方式中，使用多于一种的解磷微生物，例如，至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种，包括不动杆菌属、节杆菌属、节丛孢属、曲霉属、固氮螺菌属、芽孢杆菌属、伯克霍尔 德氏菌属、假丝酵母属、金色单胞菌属、肠杆菌属、正青霉属、微小杆菌属、克雷伯氏菌属、克吕沃尔菌属、微杆菌属、毛霉属、拟青霉属、类芽孢杆菌属、青霉属、假单胞菌属、沙雷氏菌属、寡养单胞菌属、链霉菌属、链孢囊菌属、Swaminathania属、硫杆菌属、孢圆酵母属、弧菌属、黄色杆菌属和黄单胞菌属的任意组合，包括选自以下的一种菌种：乙酸钙不动杆菌、不动杆菌、节杆菌、少孢节丛孢菌、黑曲霉、曲霉菌、Azospirillum halopraeferans、解淀粉芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、越南伯克霍尔德菌、克瑞斯假丝酵母、浅黄金色单胞菌、产气肠杆菌、阿氏肠杆菌、肠杆菌、泰洛肠杆菌、微细正青霉、微小杆菌、克雷伯氏菌、栖冷克吕沃尔菌、微杆菌、多枝毛霉、蝙蝠蛾拟青霉、马昆德拟青霉、浸麻类芽孢杆菌、胶质类芽孢杆菌、成团泛菌、扩展青霉、Pseudomonas corrugate、荧光假单胞菌、Pseudomonas lutea、草假单胞菌、恶臭假单胞菌、斯氏假单胞菌、平凡假单胞菌、粘质沙雷氏菌、嗜麦芽寡养单胞菌、链霉菌、链孢囊菌、Swaminathaniasalitolerans、氧化亚铁硫杆菌、球有孢圆酵母、解蛋白弧菌、敏捷黄色杆菌和野油菜黄单胞菌。
在一些实施方式中，相同菌种的两个不同菌株也可以组合，例如，使用青霉属的至少两个不同菌株。使用至少两个不同的青霉属菌株的组合具有以下优点。当施用至已经含有不溶性(或难溶性)磷酸盐的土壤时，与仅使用一个青霉属菌株相比，组合真菌菌株的使用将引起植物可摄取的磷的量的增加。与单独使用单个菌株相比，这进而可以引起磷酸盐摄取的增加和/或土壤中生长的植物的产量的增加。菌株的组合还能使不溶性磷酸岩用作用于有效磷量不足的土壤中的有效肥料。因此，在一些实施方式中，使用拜赖青霉的一个菌株和P.gaestrivorus的一个菌株。在其他实施方式中，两个菌株为NRRL50169和NRRL50162。在另外的实施方式中，至少两个菌株为NRRL50169和NRRL50170。在另外的实施方式中，至少两个菌株为NRRL50162和NRRL50170。
解磷微生物可以使用本领域技术人员已知的任何适合方法进行制备，例如，使用适当碳源的固态或液体发酵。解磷微生物优选以稳定 孢子的形式进行制备。
在一个实施方式中，解磷微生物是青霉属真菌。根据本发明的青霉属真菌可以使用固态或液体发酵以及适当的碳源而生长。青霉属分离株可以使用本领域技术人员已知的任何合适方法而生长。例如，真菌可以在例如马铃薯右旋糖琼脂或麦芽汁琼脂的固体生长介质上、或在含有合适的液体介质例如Czapek-Dox培养基或马铃薯右旋糖肉汤的摇瓶中进行培养。这些培养方法可以用在青霉菌接种物的制备中，该接种物用于处理(例如，涂覆)种子和/或应用至将要施用于土壤的农艺学上可接受的载体。本说明书中使用的术语“接种物”意在指代任意形式的解磷微生物，真菌细胞、菌丝体或孢子、细菌细胞或细菌孢子，其能够在温度、湿度等条件有利于真菌生长时在土壤上或土壤中增殖。
青霉属孢子的固态生产可以通过接种固体介质例如泥炭或蛭石类基质或谷物而实现，谷物包括但不限于燕麦、小麦、大麦或稻。对灭菌的介质(通过高压灭菌或辐照而实现)接种适当青霉菌的孢子悬浮液(1x10²～1x10⁷cfu/ml)，并依据基质将湿度调节至20～50％。将材料在室温下孵育2～8周。孢子也可以通过液体发酵而产生(Cunningham等人,1990.Can J Bot.68:2270-2274)。液体生产可以通过在能够根据本领域标准步骤而确定的适当pH和温度条件下在任何合适的介质例如马铃薯右旋糖肉汤或蔗糖酵母提取物培养基中培养真菌而实现。
可以直接使用所得材料，或者可以收获孢子，经离心浓缩，配制并然后使用空气干燥、冷冻干燥、或流化床干燥技术进行干燥(Friesen等人,2005,Appl.Microbiol.Biotechnol.68:397-404)，以生产可润湿的粉末。然后将可润湿的粉末悬浮于水中，施用至种子的表面，并使其在种植前干燥。可润湿的粉末可以与其他种子处理组合使用，其他种子处理例如但不限于，化学种子处理、载体(例如，滑石、粘土、高岭土、硅胶、高岭石)或聚合物(例如，甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮)处理。或者，合适的青霉菌的孢子悬浮液可以应用至合适的与土壤相容的载体(例如，泥炭类粉末或颗粒)，达到适当的最终含水量。材料可以在使用前在室温下孵育，通常为约1天至约8周。
除用于培养解磷微生物的成分(包括例如以上在青霉属培养中提 及的成分)外，解磷微生物可以使用其他农艺学上可接受的载体进行配制。在本文中与“载体”关联使用的术语“农艺学上可接受的”是指，任何可以用于将活性物递送至种子、土壤或植物的材料，并且优选载体能够添加(至种子、土壤或植物)而对植物生长、土壤结构、土壤排水等没有不利影响。合适的载体包括但不限于，小麦壳、糠、地面麦秆、泥炭类粉末或颗粒、石膏类颗粒和粘土(例如，高岭土、斑脱土、蒙脱石)。当将孢子加至土壤时，颗粒制剂将是优选的。作为液体、泥炭或可润湿粉末的制剂将适合于涂覆种子。当用于涂覆种子时，材料可以与水混合，应用至种子并使其干燥。其他载体的实例包括湿的糠，将其干燥、过筛并施用至事先涂覆有粘合剂如阿拉伯树胶的种子。在涉及单一组合物形式的活性物制剂的实施方式中，农艺学上可接受的载体可以是水性的。
至少一种解磷微生物的量根据种子或土壤的类型、作物植物的类型、土壤中存在的或加至其中的磷源和/或痕量营养素源的量等而变化。合适的施用量可以通过针对各个特定情形的简单试验和错误实验而确定。通常，例如，对于青霉属，施用量落入每公顷0.001～1.0Kg真菌孢子和菌丝体(鲜重)的范围、或每个种子(当使用包衣种子时)10²～10⁶个菌落形成单位(cfu)的范围，或者在颗粒载体上施用每公顷1x10⁶～1x10¹¹个菌落形成单位。例如孢子形式的真菌细胞和载体可以添加至根高度处的土壤中的种子行，或者可以用于在种植之前涂覆种子。
在例如涉及使用至少两个解磷微生物菌株例如两个青霉菌株的实施方式中，商业肥料可以被添加至土壤中以替代(或者甚至连同)天然磷酸岩。磷源可以含有对于土壤为天然的磷源。在其他实施方式中，磷源被可以添加至土壤中。在一个实施方式中，磷源是磷酸岩。在另一实施方式中，磷源是制造的肥料。市售可得的制造的磷酸盐肥料有许多类型。一些常见类型为，含有磷酸一铵(MAP)、三过磷酸钙(TSP)、磷酸二铵、普通过磷酸盐和聚磷酸铵的肥料。所有这些肥料通过在大规模肥料制造设施中对不溶性天然磷酸岩进行化学加工而产生，且产品昂贵。通过本发明的方式，可以降低这些肥料施用至土壤的量并仍然维持从土壤中摄取的相同量的磷。
在另一实施方式中，磷源是有机的。有机肥料是指从天然来源获 得的土壤改良剂，其至少保障最低限百分比的氮、磷酸盐和碳酸钾。实例包括植物和动物副产品、岩石粉末、海草、接种物和调理剂。具体的代表性实例包括骨粉、肉粉、动物粪肥、堆肥、污水污泥或海鸟粪。
其它肥料例如氮源、或其它土壤改良剂当然也可以在与解磷微生物大约相同的时间或在其它时间添加至土壤，只要该其它材料对真菌无毒性。
固氮生物是将大气氮气固定成更可用的形式例如氨的细菌和古生菌。固氮生物的实例包括来自根瘤菌属(例如解纤维素根瘤菌(R.cellulosilyticum)、大田市根瘤菌(R.daejeonense)、菜豆根瘤菌(R.etli)、山羊豆根瘤菌(R.galegae)、高卢根瘤菌(R.gallicum)、贾氏根瘤菌(R.giardinii)、海南根瘤菌(R.hainanense)、洪特拉根瘤菌(R.huautlense)、木兰根瘤菌(R.indigoferae)、豌豆根瘤菌(R.leguminosarum)、黄土根瘤菌(R.loessense)、羽扇豆根瘤菌(R.lupini)、R.lusitanum、草木樨根瘤菌(R.meliloti)、蒙古根瘤菌(R.mongolense)、R.miluonense、岩黄芪根瘤菌(R.sullae)、热带根瘤菌(R.tropici)、居水根瘤菌(R.undicola)和/或杨凌根瘤菌(R.yanglingense))、慢生根瘤菌属(例如B.bete、B.canariense、埃氏慢生根瘤菌(B.elkanii)、B.iriomotense、大豆慢生根瘤菌(B.japonicum)、B.jicamae、辽宁慢生根瘤菌(B.liaoningense)、B.pachyrhizi和/或圆明慢生根瘤菌(B.yuanmingense))、固氮根瘤菌属(例如茎瘤固氮根瘤菌(A.caulinodans)和/或德贝莱纳固氮根瘤菌(A.doebereinerae))、中华根瘤菌属(例如S.abri、粘着中华根瘤菌(S.adhaerens)、美洲中华根瘤菌(S.americanum)、木本树中华根瘤菌(S.aboris)、费氏中华根瘤菌(S.fredii)、S.indiaense、柯斯帝中华根瘤菌(S.kostiense)、鸡眼草中华根瘤菌(S.kummerowiae)、苜蓿中华根瘤菌(S.medicae)、草木樨中华根瘤菌(S.meliloti)、墨西哥中华根瘤菌(S.mexicanus)、莫雷兰中华根瘤菌(S.morelense)、萨赫勒中华根瘤菌(S.saheli)、多宿主中华根瘤菌(S.terangae)和/或新疆中华根瘤菌(S.xinjiangense))、中慢生根瘤菌属(合欢中慢生根瘤菌(M.albiziae)、紫穗槐中慢生根瘤菌(M.amorphae)、查克中慢生根瘤菌(M.chacoense)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌 (M.ciceri)、华癸中慢生根瘤菌(M.huakuii)、百脉根中慢生根瘤菌(M.loti)、地中海中慢生根瘤菌(M.mediterraneum)、M.pluifarium、北方中慢生根瘤菌(M.septentrionale)、温带中慢生根瘤菌(M.temperatum)和/或天山中慢生根瘤菌(M.tianshanense))的菌及其组合。在具体实施方式中，固氮生物选自大豆慢生根瘤菌、豌豆根瘤菌、草木樨根瘤菌、草木樨中华根瘤菌及其组合。在另一实施方式中，固氮生物是大豆慢生根瘤菌。在另一实施方式中，固氮生物是豌豆根瘤菌。在另一实施方式中，固氮生物是草木樨根瘤菌。在另一实施方式中，固氮生物是草木樨中华根瘤菌。
菌根真菌与维管植物的根形成共生关系，并因菌丝体相对较大的表面积提供例如对水和矿质营养的吸收能力。菌根真菌包括内生菌根真菌(也称作泡囊丛枝菌根、VAM、丛枝菌根、或AM)、外生菌根真菌或其组合。在一个实施方式中，菌根真菌是球囊菌门以及球囊霉(Glomus)属和巨孢囊霉(Gigaspora)属的内生菌根。在又一实施方式中，内生菌根是聚丛球囊霉(Glomus aggregatum)、Glomusbrasilianum、明球囊霉(Glomus clarum)、沙漠球囊霉(Glomusdeserticola)、幼套球囊霉(Glomus etunicatum)、集球囊霉(Glomusfasciculatum)、根内球囊霉(Glomus intraradices)、单孢球囊霉(Glomusmonosporum)、或摩西球囊霉(Glomus mosseae)、珠状巨孢囊霉(Gigaspora margarita)、或其组合的菌株。
菌根真菌的实例包括担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)和接合菌门(Zygomycota)的外生菌根。其它实例包括双色蜡蘑(Laccaria bicolor)、红蜡蘑(Laccaria laccata)、彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius)、Rhizopogon amylopogon、Rhizopogonfulvigleba、浅黄根须腹菌(Rhizopogon luteolus)、Rhizopogon villosuli、光硬皮马勃(Scleroderma cepa)、黄硬皮马勃(Scleroderma citrinum)、或其组合的菌株。
菌根真菌包括杜鹃花类菌根(ecroid mycorrhizae)、浆果莓类菌根(arbutoid mycorrhizae)、或水晶兰类菌根(monotropoid mycorrhizae)。丛枝和外生菌根与许多属于杜鹃花目的植物形成杜鹃花类菌根，而与一些杜鹃花目形成浆果莓类菌根和水晶兰类菌根。在一个实施方式中， 菌根可以是优选子囊菌门的杜鹃花类菌根，例如石楠柔膜菌(Hymenoscyphous ericae)或树粉孢属真菌(Oidiodendron sp.)。在另一实施方式中，菌根还可以是优选担子菌门的浆果莓类菌根。在又一实施方式中，菌根可以是优选担子菌门的水晶兰类菌根。在又一实施方式中，菌根可以是优选丝核菌属的兰科菌根。
本发明的方法适用于豆科种子，其代表性实例包括大豆、苜蓿、花生、豌豆、小扁豆、菜豆和三叶草。本发明的方法也适用于非豆科种子，例如禾本科(Poaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、锦葵科(Malvaceae)、菊科(Asteraceae)、藜科(Chenopodiaceae)和茄科(Solonaceae)。非豆科种子的代表性实例包括大田作物例如玉米、稻、燕麦、黑麦、大麦和小麦、棉花和油菜，以及蔬菜作物例如土豆、番茄、黄瓜、甜菜、莴苣和哈密瓜。
现将在以下非限定性实施例方面对本发明进行说明。除非有相反说明，使用水作为对照(表示成“对照”)。
实施例
温室试验
实施例1：由LCO组合体外增强的大翼豆幼苗生长
利用10％的漂白剂溶液对大翼豆(紫花大翼豆)种子进行表面消毒10分钟，随后用灭菌蒸馏水漂洗3次。然后将种子放置在含有15ml补充有图1a和图2a所示的LCO(且其在实施例中称为“大豆LCO”和“豌豆LCO”)(单独或组合地具有总共10^-8M的浓度)的无菌凝固琼脂培养基的试管中。将两种其它的LCO即豌豆LCO或图5所示的LCO(其在实施例中也被称为“苜蓿LCO”)加至大豆LCO以研究其组合效果。在20℃在生长光下以16/8小时的日/夜循环让种子生长7天，然后针对幼苗长度进行收获。
由大豆LCO结合另一种LCO(本发明实施方式)与单独的大豆LCO(非本发明的且可比较的)之间的比较所反映的，大豆和苜蓿的LCO的组合比单独的大豆LCO或其与豌豆LCO的组合更加有效(图6)。将总的根长和地上部(shoot)长度相加时，与苜蓿LCO结合的大豆LCO产生最高的幼苗。该差异是显著的。
实施例2：对樱桃番茄的LCO叶面施用
基于在大翼豆(实施例1)中对大豆LCO和苜蓿LCO的组合的发现，对于番茄进行进一步调查。佛罗里达小樱桃番茄植物(Florida petite)在温室塑料容器中从种子生长并在花芽开始期间对其以每植物5ml的施用率利用大豆LCO或其与苜蓿LCO的组合喷撒。第一次施用后一周还施行第二次喷撒。在不同的成熟度，测量叶片绿度、花数目、果实数目和最后的果实鲜重。
由本发明实施方式(大豆LCO+苜蓿LCO)所达到的结果表明，相比非本发明的可比较的大豆LCO，使用LCO组合的叶绿度略有增加(图7和图8)。从五天期间形成的花总量而言，LCO组合显著高于非本发明的大豆LCO。类似地，当在六天期间对果实数量进行计数时，本发明的大豆LCO与苜蓿LCO的组合显著高于大豆LCO(图9和图10)。在收获结束时，相比于对照处理，对于非本发明的大豆LCO和本发明的大豆-苜蓿LCO组合，每棵植物的平均果实数显著较高。然而，樱桃番茄的平均鲜重产量仅对于大豆-苜蓿LCO组合是显著的，超过对照和大豆LCO(图11和图12)。
实施例3：LCO和它们的组合对于番茄幼苗根系生长
将变种Royal Mounty的番茄种子放置于含有湿润(用处理溶液浸泡)的发芽纸的陪替氏平皿中。利用四种不同的LCO(即豌豆LCO AC(酰化)、豌豆LCO NAC(非酰化)、苜蓿LCO和大豆LCO)制备处理溶液。用于制造水基处理液的总LCO浓度维持在10^-9M。然后将陪替氏平皿放置在暗处于室温下以便发芽。发芽后八天，用手持标尺(hand held ruler)对幼苗测量其根长。
从该实验获得的结果表明，相比于对照，所有单独的LCO类型增强番茄幼苗的根长，但只有某些LCO组合即豌豆NAC和大豆LCO、豌豆AC加大豆LCO以及豌豆NAC加苜蓿LCO相比非本发明的可比较的单一LCO类型产生显著的根增强(图8)。从实验中可看出，对于番茄幼苗，豌豆NAC和大豆LCO组合是所有组合中最好的。结果还表明，某些LCO的组合比其它的更有利于番茄幼苗且其可以排除所有的四种LCO的组合更好。
在本说明书中引用的所有专利和非专利公开物均显示为本发明所 属领域的技术人员的技术水平。所有这些公开物均并入本文以作参考，其程度等同于各个单独公开物或专利申请均具体而独立地表明为并入以作参考。
尽管在此已参照具体实施方式描述了本发明，但应当理解，这些实施方式仅仅用来示例说明本发明的原理和应用。因此，应当理解的是，可以在不背离所附权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下对示例性的实施方式做出多种修改并可以设计其他布置。