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1、10申请公布号CN104066447A43申请公布日20140924CN104066447A21申请号201280067891122申请日2012112161/563,12820111123US61/654,40120120601USA61K39/385200601C07K14/43520060171申请人拜奥文斯瑞有限公司地址百慕大群岛哈密尔顿申请人基思艾伦查尔顿E德杭特72发明人基思艾伦查尔顿E德杭特74专利代理机构北京派特恩知识产权代理有限公司11270代理人张颖玲孟桂超54发明名称重组蛋白及其治疗用途57摘要一种重组蛋白，该重组蛋白在免疫原性表达上或在免疫原性表达内表达一种或多种人类生。
2、长因子、肿瘤抗原和/或受体或其表位，从而产生产生重组蛋白。其中，一个或多个表位存在于在其天然构象的序列的表面上。以合适的内部位置或在末端作为单一表达或作为两个或更多个串联重复，可在编码序列内表达生长因子、肿瘤抗原和/或受体序列。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014072386PCT国际申请的申请数据PCT/IB2012/0028762012112187PCT国际申请的公布数据WO2013/076580EN2013053051INTCL权利要求书4页说明书24页附图29页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书4页说明书24页附图29页10申请公布号CN104。
3、066447ACN104066447A1/4页21一种重组蛋白，包括多肽序列；和顺着所述多肽序列表达生长因子的至少一部分的序列。2根据权利要求1所述的重组蛋白，其中，所述多肽序列含有免疫原性的多肽序列。3根据权利要求1所述的重组蛋白，其中，所述多肽序列含有霍乱毒素B蛋白。4根据权利要求1所述的重组蛋白，其中，所述生长因子含有表皮生长因子。5根据权利要求1所述的重组蛋白，其中，所述生长因子的所述至少一部分含有表皮生长因子的B环。6根据权利要求1所述的重组蛋白，其中，所述生长因子的所述至少一部分含有生长因子的中和结构域。7根据权利要求1所述的重组蛋白，其中，所述生长因子的所述至少一部分含有下列生长。
4、因子中的一种或多种的全长或其部分含有但并不限于IGF1、IGF2、FGF1、FGF2、TGF、TGF、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGF、D、PDGF、NGF、EGF、HGF、BMP16和IL16。8根据权利要求1所述的重组蛋白，其中，所述生长因子的所述至少一部分含有在所述合成蛋白中存在的至少两种不同的生长因子的全长或中和结构域。9根据权利要求1所述的重组蛋白，其中，所述生长因子的所述至少一部分含有在所述蛋白中作为单一结构域或作为两个或更多个串联重复的一种或多种生长因子的全长或中和结构域。10根据权利要求1所述的重组蛋白，其中，所述生长因子的所述至少一部分或该生长因子的中和结构域通过。
5、肽“间隔区”与剩余的合成蛋白隔离开。11根据权利要求10所述的重组蛋白，其中，所述肽“间隔区”部分地包括生长因子或该生长因子的中和结构域。12根据权利要求10所述的重组蛋白，其中，所述肽“间隔区”含有一个或多个宿主T细胞表位。13一种制备多价分子的方法，包括从单体亚单元组装多聚体以形成合成蛋白，所述合成蛋白含有一种或多种生长因子或其部分。14一种制备疫苗制剂的方法，包括将一种或多种单一的单价多聚体混合在一起来制备含有合成蛋白的多价疫苗，所述合成蛋白含有一种或多种生长因子或其部分。15一种治疗患者的方法，包括在疫苗接种期间，在同一日或隔日或间隔一定时间将一种或多种单价体、一种生长因子、合成蛋白独。
6、立地给予所述患者。16一种重组蛋白，包括多肽序列；和顺着所述多肽序列表达肿瘤抗原的至少一部分的第一序列。17根据权利要求16所述的重组蛋白，其中，所述多肽序列含有免疫原性的多肽序列。18根据权利要求16所述的重组蛋白，其中，所述多肽序列含有霍乱毒素B蛋白。19根据权利要求16所述的重组蛋白，其中，所述肿瘤抗原是前列腺特异性抗原。权利要求书CN104066447A2/4页320根据权利要求16所述的重组蛋白，其中，所述肿瘤抗原的所述至少一部分含有下列肿瘤抗原中的一种或多种的全长或其部分含有但并不限于PSA及其它的肿瘤抗原。21根据权利要求20所述的重组蛋白，其中，所述肿瘤抗原的所述至少一部分含有。
7、在所述合成蛋白中存在的两种至四种不同的肿瘤抗原的全长或一部分。22根据权利要求20所述的重组蛋白，其中，所述肿瘤抗原的所述至少一部分含有在所述合成蛋白中作为单一表位或作为两个或更多个串联重复的一种或多种肿瘤抗原的全长或一部分。23根据权利要求16所述的重组蛋白，进一步包括顺着所述多肽序列表达生长因子的至少一部分的第二序列。24根据权利要求23所述的重组蛋白，其中，所述生长因子的所述至少一部分含有下列生长因子中的一种或多种的全长或其部分含有但并不限于IGF1、IGF2、FGF1、FGF2、TGF、TGF、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGF、D、PDGF、NGF、EGF、HGF、BMP1。
8、6和IL16。25根据权利要求24所述的重组蛋白，其中，所述生长因子的所述至少一部分含有在所述合成蛋白中存在的两种至四种不同的生长因子的全长或中和部分。26根据权利要求24所述的重组蛋白，其中，所述生长因子的所述至少一部分含有在所述合成蛋白中作为单一表位或作为两个或更多个串联重复的一种或多种生长因子的全长或中和部分。27根据权利要求24所述的重组蛋白，其中，所述生长因子的所述至少一部分或该生长因子的中和部分通过肽“间隔区”与剩余的合成蛋白隔离开。28根据权利要求27所述的重组蛋白，其中，所述肽“间隔区”部分地包括生长因子或该生长因子的中和部分。29根据权利要求27所述的重组蛋白，其中，所述肽“。
9、间隔区”含有一个或多个T细胞表位。30根据权利要求16所述的重组蛋白，进一步包括顺着所述多肽序列表达受体的至少一部分的序列。31根据权利要求30所述的重组蛋白，其中，所述受体的所述至少一部分含有下列受体中的一种或多种的全长或其部分含有但并不限于人类表皮生长因子受体2、人类表皮生长因子受体3和其它的受体。32根据权利要求31所述的重组蛋白，其中，所述受体的所述至少一部分含有在所述合成蛋白中存在的两种至四种不同的受体的全长或一部分。33根据权利要求31所述的重组蛋白，其中，所述受体的所述至少一部分含有在所述合成蛋白中作为单一表位或作为两个或更多个串联重复的一种或多种受体的全长或一部分。34一种重组。
10、蛋白，包括多肽序列；和顺着所述多肽序列表达受体的至少一部分的第一序列。35根据权利要求34所述的重组蛋白，其中，所述多肽序列含有免疫原性的多肽序列。36根据权利要求34所述的重组蛋白，其中，所述多肽序列含有霍乱毒素B蛋白。37根据权利要求34所述的重组蛋白，其中，所述受体的所述至少一部分含有下列受权利要求书CN104066447A3/4页4体中的一种或多种的全长或其部分含有但并不限于人类表皮生长因子受体2、人类表皮生长因子受体3和其它的受体。38根据权利要求37所述的重组蛋白，其中，所述受体的所述至少一部分含有在所述合成蛋白中存在的两种至四种不同的受体的全长或一部分。39根据权利要求37所述的。
11、重组蛋白，其中，所述受体的所述至少一部分含有在所述合成蛋白中作为单一表位或作为两个或更多个串联重复的一种或多种受体的全长或一部分。40根据权利要求34所述的重组蛋白，进一步包括顺着所述多肽序列表达生长因子的至少一部分的第二序列。41根据权利要求40所述的重组蛋白，其中，所述生长因子的所述至少一部分含有下列生长因子中的一种或多种的全长或其部分含有但并不限于IGF1、IGF2、FGF1、FGF2、TGF、TGF、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGF、D、PDGF、NGF、EGF、HGF、BMP16和IL16。42根据权利要求41所述的重组蛋白，其中，所述生长因子的所述至少一部分含有在所述合。
12、成蛋白中存在的两种至四种不同的生长因子的全长或中和部分。43根据权利要求41所述的重组蛋白，其中，所述生长因子的所述至少一部分含有在所述合成蛋白中作为单一表位或作为两个或更多个串联重复的一种或多种生长因子的全长或中和部分。44根据权利要求41所述的重组蛋白，其中，所述生长因子的所述至少一部分或该生长因子的中和部分通过肽“间隔区”与剩余的合成蛋白隔离开。45根据权利要求44所述的重组蛋白，其中，所述肽“间隔区”部分地包括生长因子或该生长因子的中和部分。46根据权利要求44所述的重组蛋白，其中，所述肽“间隔区”含有一个或多个T细胞表位。47根据权利要求40所述的重组蛋白，进一步包括顺着所述多肽序列。
13、表达肿瘤抗原的至少一部分的第三序列。48根据权利要求47所述的重组蛋白，其中，所述肿瘤抗原是前列腺特异性抗原。49根据权利要求47所述的重组蛋白，其中，所述肿瘤抗原的所述至少一部分含有下列肿瘤抗原中的一种或多种的全长或其部分含有但并不限于PSA和其它的肿瘤抗原。50根据权利要求49所述的重组蛋白，其中，所述肿瘤抗原的所述至少一部分含有在所述合成蛋白中存在的两种至四种不同的肿瘤抗原的全长或一部分。51根据权利要求49所述的重组蛋白，其中，所述肿瘤抗原的所述至少一部分含有在所述合成蛋白中作为单一表位或作为两个或更多个串联重复的一种或多种肿瘤抗原的全长或一部分。52一种制备多价分子的方法，包括从单体。
14、亚单元组装多聚体以形成重组蛋白，所述重组蛋白含有生长因子或其部分、肿瘤抗原或其部分以及受体或其部分中的至少一种。53一种制备疫苗制剂的方法，包括将一种或多种单一的单价多聚体混合在一起来制备含有重组蛋白的多价疫苗，所述重组蛋白含有生长因子或其部分、肿瘤抗原或其部分以及受体或其部分中的至少一种。权利要求书CN104066447A4/4页554一种治疗患者的方法，包括在疫苗接种期间，在同一日或隔日或间隔一定时间将一种或多种单价重组蛋白独立地给予所述患者，所述单价重组蛋白含有生长因子或其部分、肿瘤抗原或其部分以及受体或其部分中的至少一种。权利要求书CN104066447A1/24页6重组蛋白及其治疗用。
15、途技术领域0001本发明涉及重组蛋白用于治疗疾病的领域。0002相关申请的交叉引用0003本申请要求于2011年11月23日递交的名称为“免疫原性的合成重组蛋白”的美国专利申请序列号61/563,128的优先权，以及于2012年6月1日递交的名称为“免疫原性的合成重组蛋白”的美国专利申请序列号61/654,401的优先权，这两个申请通过引用而整体并入本申请中。背景技术0004癌症免疫学是对免疫系统和癌细胞例如，肿瘤或恶性肿瘤之间的相互作用的研究。免疫应答的启动，诸如癌症特异性抗原的识别是特别重要的，其中，癌症特异性抗原由人类肿瘤表达并且在正常组织中是不表达的。通常，控制恶性细胞分裂和增殖的方法。
16、是分离这些抗原并呈递这些抗原，从而使它们作为异己抗原而被免疫系统识别到并引起特异性免疫应答。0005目前，存在大量经鉴定的生长因子，并且还已经证实了该经鉴定的生长因子的大部分即使不是全部除了与其它疾病病症相关之外，还是各种癌症中细胞增殖的重要介质。通常，生长因子是可溶性血清蛋白，其识别并结合位于细胞表面的一组生长因子受体。特定生长因子可能对单一受体具有特异性，或可与多种密切相关的受体结合，且该结合具有不同的亲和力。同样，一些受体仅结合单一生长因子配体，而其它受体可与通常具有不同亲和力的多个相关的生长因子结合。在与其天然受体相结合时，受体的胞浆区被磷酸化，并且该磷酸化将启动细胞内的信号级联，从而。
17、导致对一个或多个基因转录的调节以及最终通过细胞周期和细胞增殖进行。0006生长因子和它们的受体是生物体生长、发育和修复的正常过程中的基本组分，并且它们的组织分布概况和表达水平紧密调控细胞的生长。许多研究表明生长因子能够在体内和体外刺激多种细胞类型的增殖COHENS,CARPENTERG,PNASUSA美国72,1317,1975,WITSCHE等人PHYSIOLOGY25285101,2010。此外，已经表明某些生长因子刺激一些癌细胞株的增殖，例如表皮生长因子EGF能够刺激非小细胞肺癌细胞的增殖OSBORNECK等人CANRES40,23611980。其它生长因子，诸如血管内皮生长因子VEGF。
18、、成纤维细胞生长因子FGF和血小板衍生生长因子PDGF在若干肿瘤学疾病中是重要的，这些肿瘤学疾病诸如非小细胞肺癌NSCLCBALLASMS,CHACHOUAA,ONCOTARGETSANDTHERAPY4,43582011、前列腺癌COXME等人；PROSTATE69133402009和乳腺癌LAWJ等人,CANCERRES；68,2410238103462008。0007已经报道在恶性组织中的各种生长因子受体的高水平。例如，在表皮源的恶性肿瘤，诸如肺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、阴道癌、结肠癌、肺部癌、脑癌和食道癌中检测到异常高水平的表皮生长因子受体EGFR。生长因子及其受体在调控肿瘤生长中所。
19、起的作用是说明书CN104066447A2/24页7未知的，但是暗示肿瘤细胞中生长因子受体的表达提供自分泌生长刺激机制，从而导致不受控的增殖SCHLESSINGERJ,SCHREIBERAB,LEVIA,LIBERMANT,YARDENYCRITREVBIOCHEM1983,14293111。此外，LIAOY等人HUMPATHOL3611118611962005和COXME等人PROSTATE69133402009描述了增加的胰岛素INSULAR受体和生长因子在转移性前列腺癌中所起的作用。0008在癌症治疗中，靶向生长因子信号传导的一种治疗方案已经使用了被动免疫治疗法，诸如利用针对相关的特定受。
20、体/多种受体的单克隆抗体。这些研究已经证实通过受体抗体的特异性识别能够抑制配体的结合，从而对恶性细胞的促细胞分裂具有抑制效果SATOJD,等人METHODSINENZYMOLOGY,第146卷PP6381,1987。然而，鼠源性抗体通常将会引起人类抗小鼠抗体的应答HAMA，因而限制了它们的单一给药。0009其它治疗方案已经使用了利用疫苗的主动免疫治疗法，其中疫苗包含感兴趣的生长因子，以诱导针对该分子的免疫应答，从而抑制该生长因子对肿瘤的增殖影响。例如，DAVILA等人的题为VACCINECOMPOSITIONCOMPRISINGAUTOLOGOUSEPIDERMALGROWTHFACTOROR。
21、AFRAGMENTORADERIVATIVETHEREOFHAVINGANTITUMORACTIVITYANDUSETHEREOFINTHETHERAPYOFMALIGNANTDISEASES具有抗肿瘤活性的包括自体表皮生长因子或其片段或其衍生物的疫苗组合物及其在治疗恶性疾病中的应用的美国专利号5,984,018,中公开了一种疫苗的用途，该疫苗包含利用戊二醛化学偶联在一起的生长因子和免疫原性即，非人类载体蛋白的混合物。然而，在不受任何特定理论限制的情况下，认为化学偶联阻碍了针对疫苗的免疫应答。0010因为它需要宿主对“自身抗原”产生免疫反应，而脊椎动物的免疫系统已经进化到了防止这种反应的发生，。
22、所以这是在技术上具有挑战的方法。在对自身抗原产生强烈的免疫应答时，通常导致例如辅助型T细胞的激活、自身免疫疾病状态。多年来，已经假设了一些自体免疫疾病，例如，狼疮、多发性硬化MS、糖尿病等可能是由于较早地暴露于环境因素所引起的，这些环境因素包括紧密模拟宿主自身表位的免疫原性表位T细胞表位。这可能导致与宿主表位进行交叉反应的辅助型T细胞的刺激。稍后暴露于环境因素可能导致抗自身免疫应答ALBERT,LJ,和INMAN,RDNEWENGLANDJOURNALOFMEDICINE,DEC30THPP20682074,1999。已证实了病毒抗原确实能够产生针对神经细胞蛋白的抗自身的免疫应答LEVIN,M。
23、C等人,NATUREMEDICINE第8卷5PP509513,2002。0011CASIMIRO等人题为METHODFORTREATMENTOFMALIGNANTANDINFECTIOUSCHRONICDISEASES治疗恶性且传染性慢性疾病的方法654公开的美国专利公布号2006/0251654中公开了一种治疗患恶性或传染性慢性疾病受试者的方法，包括利用疫苗对受试者进行免疫的方法，该疫苗包含与恶性或传染性慢性疾病相关的自身抗原，该自身抗原与载体蛋白相偶联；利用免疫调节剂对受试者进行治疗；以及利用步骤1的疫苗和选自氢氧化铝和MONTANIDEISA51SEPPIC赛比克，巴黎，法国的合适的佐剂。
24、来对受试者再次进行免疫。遗憾地是，认为通过化学偶联制备的疫苗阻碍了免疫应答。0012上述的大多数疫苗均表现出有一定的限制，这些限制的产生主要来自于制作方法和潜在缺乏一致性和同源性的蛋白产物。上述疫苗通常包括由利用戊二醛化学偶联的重组载体蛋白和人源多肽的混合物。遗憾地是，该反应性试剂能够在各种化学基团之间不期望地形成共价交联键，并且通常导致形成高度异质的产物。因此，所得到的疫苗可能不仅包说明书CN104066447A3/24页8括载体蛋白分子，该载体蛋白分子还附接有不同数目例如，0、1、2、3等的靶人类多肽；该人类多肽均能经由不同的原子附接至载体，而且能够在不同位置且以不同取向附接至载体。此外，。
25、靶多肽和载体蛋白分子可偶联至它们自身，从而产生多种同源多聚体，该多种同源多聚体可能不具有临床效应并且可能不在患者中产生抗癌的免疫应答。发明内容0013本公开针对多种重组蛋白及其相应的制备方法；重组蛋白的特征及利用重组蛋白治疗慢性疾病，诸如肺癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、外阴癌、结肠癌、直肠癌、小肠癌、肺部癌症、脑癌、食道癌、其它癌症或其它疾病的治疗方法。0014在示例性实施方式中，重组蛋白是免疫原性蛋白分子，该免疫原性蛋白分子表达折叠成物理结构的一种或多种序列，例如，表达来自于霍乱弧菌VIBRIOCHOLERA的霍乱毒素BCTB蛋白或合成等价体的一个或多个序列，以及表达来自于人类生长因。
26、子的一个或多个表位的一个或多个序列。生长因子或其部分的表达可以作为单一抗原以串联的方式存在于多个位点处，和/或在每个位点作为较长链的抗原分子存在。0015在另一示例性实施方式中，重组蛋白是免疫原性蛋白分子，该免疫原性蛋白分子表达折叠成物理结构的一种或多种序列，例如表达来自于霍乱弧菌VIBRIOCHOLERA的霍乱毒素B蛋白CTB或合成等价体的一个或多个序列，以及表达一种或多种肿瘤抗原或其部分的一个或多个序列。重组蛋白也可含有一种或多种生长因子或其部分的一个或多个序列，和/或一种或多种受体或其部分的一个或多个序列。0016在另一示例性实施方式中，重组蛋白是免疫原性蛋白分子，该免疫原性蛋白分子表达。
27、折叠成物理结构的一种或多种序列，例如表达来自于霍乱弧菌VIBRIOCHOLERA的霍乱毒素B蛋白CTB或合成等价体的一个或多个序列，以及表达一种或多种受体或其部分的一个或多个序列。重组蛋白也可含有一种或多种生长因子或其部分的一个或多个序列，和/或一种或多种肿瘤抗原或其部分的一个或多个序列。0017在这些示例性实施方式中，肿瘤抗原或其部分、受体或其部分和/或生长因子或其部分的表达可以作为单一抗原或受体以串联的方式存在于多个位点处，和/或在每个位点以较长链的抗原分子或受体的方式存在。0018在示例性实施方式中，肿瘤抗原的序列可含有前列腺特异性抗原PSA或其部分的序列。在示例性实施方式中，受体的序列。
28、可含有人类表皮生长因子受体2HER2或其部分的序列，和/或人类表皮生长因子受体3HER3或其部分的序列。0019在示例性实施方式中，生长因子的序列可含有表皮生长因子EGF的序列或EGF的合适的编码区域的序列，该编码区域包括在重组蛋白内一个或多个位置的EGF的中和结构域。在其它示例性实施方式中，生长因子的序列可含有下列生长因子和/或替代自身抗原中一种或多种的全长或其部分例如但并不限于EGF、IGFL、IGF2、FGF、TGF、TGF、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PDGF、NGF、EGF、HGF、BMP16BMPS16和IL16ILS16。在本公开的范围内可以预期的是生长因子可。
29、选自人源或非人源。在本公开的范围内可进一步预期的是所述生长因子的序列可基本相似于人类生长因子或非人类生长因子，或所述序列可包含其功能部分。此外，重组蛋白可含有其它序列的一种或多种表达，该其它序列可在重组免疫原性蛋白序列内功能性模拟生长因子的部分或全部。在一个说明书CN104066447A4/24页9实施方式中，额外的侧翼残基也可被表达或被添加至最小的序列，从而使分子的整个中和结构域以天然构象的形式存在，并且容易地被呈递至免疫系统的细胞。0020在本公开的上下文中，“中和结构域”被定义为特异性结合对例如生长因子及其同源受体中的任一成员的区域或两个成员的区域，其中不是该特异性结合对的成员的第三分子。
30、与上述区域的结合将防止该特异性结合对的两个成员的后续结合。第三分子可为含有但并不限于抗体的其它蛋白分子，或者可为小的非蛋白分子，并且其来源可以是天然的或合成的。中和结构域通常将含有特异性结合对的成员在结合过程中直接接触的那些区域，并且还将含有上述区域外的区域，第三分子在该区域的结合引入了足够的空间位阻以防止特异性结合对的成员的直接结合。0021在本领域中公认地是，通过受体的结合位点和配体的特定分子标志表位之间的相互作用来确定配体被其同源受体特异性识别。因此结合到受体结合位点或者锁定在受体结合位点的抗体，或结合到配体的识别表位或者锁定在配体的识别表位的抗体将防止配体受体的相互作用。这样的抗体被描。
31、述为“中和”。在本公开的上下文中，期望在给予重组蛋白时，通过宿主产生中和抗体，并且因此蛋白序列可表达或含有一种或多种源自生长因子或肿瘤抗原的全部序列或适当序列，从而使受体结合所需的表位存在于功能性原生构象中。0022除了表达单一肿瘤抗原、受体和/或生长因子的多拷贝，在每个物理位点以单一肿瘤抗原、受体和/或生长因子或其部分存在，和/或作为重复肿瘤抗原、受体和/或生长因子序列的链存在例如，N1或大于1之外；根据本公开，该蛋白也可含有在重组蛋白的序列内的不同位置以单一形式或链的形式存在的两个或更多个不同的肿瘤抗原、受体或生长因子的一个或者多个表位或结合位点的表达。0023所得到的蛋白质可为表达在重组。
32、蛋白序列内的肿瘤抗原、受体和/或生长因子或它们的一个或多个表位或其结合位点的单一多肽。在示例性的实施方式中，重组蛋白的序列表达CTB序列的一个或多个部分并且在天然构象的重组蛋白的表面上存在肿瘤抗原、受体、和/或生长因子表达或它们的表位或结合位点的一个或者多个的表达。0024在另一示例性实施方式中，公开了一种制备蛋白制剂的方法。在该示例性实例方式中，该方法包括将一种或多种单一单价单体或者多价单体组装在一起；制备含有重组蛋白的多价疫苗，该重组蛋白含有一种或者多种肿瘤抗原、受体和/或生长因子或它们的部分。0025在又一示例性实施方式中，公开了一种用于治疗患者的方法。在该示例性实施方式中，该方法包括在。
33、疫苗接种期间，以同一日或隔日或间隔一定时间的方式将一种或多种单价体或多价体、一种肿瘤抗原、受体和/或生长因子、合成蛋白单独给予患者。0026在进一步的示例性实施方式中，公开了一种用于治疗患者的方法。在该示例性实施方式中，该方法包括将在药学可接受的载体中的一种或多种单价疫苗或者多价疫苗、一种肿瘤抗原、受体、和/或生长因子、合成蛋白给予患者，其中药学可接受的载体含有促进免疫应答的佐剂。附图说明0027本公开所述的实施方式例示在附图中，是示例性而非限制性的，其中相似的附图说明书CN104066447A5/24页10标记用于表示相似或相应的部分，并且其中0028图1示出了一些生物体的EGF分子的序列和。
34、结构的表；0029图2示出了含有EGF中和结构域的人类EGF分子的结构的实施方式；0030图3示出了含有EGF中和结构域的EGF分子的半胱氨酸对的简化线结构的实施方式；0031图4示出了以正确构象存在EGF中和结构域的EGF分子的最小序列的实施方式；0032图5示出了表达EGF中和结构域的改性合成分子的结构的实施方式；0033图6示出了与RHUEGF结合的MAB10825和MAB10827的柱状图，且光密度OD是在450NM下测量的；0034图7示出了在与源自中和结构域的游离的可溶性肽竞争下，与RHUEGF结合的MAB10825和MAB10827的柱状图；0035图8示出了抗EGF中和结构域的。
35、MAB10827与直接吸附在ELISA板上的6种EGFCTB合成蛋白结合的线型图；0036图9示出了抗EGF中和结构域的MAB10827与通过兔抗CTB抗体捕获的6种EGFCTB合成蛋白结合的线型图；0037图10示出了在天然未经煮沸的条件，6种单价合成EGFCTB蛋白进行SDS凝胶电泳，并且使用抗CTB抗体进行检测的蛋白印迹WESTERNBLOT；0038图11示出了抗EGF中和结构域的MAB10827与合成EGFCTB蛋白结合的线型图，该合成EGFCTB蛋白含有两个全长的EGF序列E2或两个部分的EGF序列B2；0039图12示出了二价合成EGFCTB蛋白进行的非变性SDSPAGE凝胶电泳。
36、的WESTERN印迹；0040图13示出了含有两个全长EGF序列有下划线和CTB序列斜体的合成蛋白序列；0041图14示出了含有两个EGF中和结构域序列有下划线和CTB序列斜体的合成蛋白序列；0042图15示出了含有两个EGF分子的部分序列有下划线和CTB序列斜体的合成蛋白序列，该两个EGF分子的部分序列含有CYS6到CYS31的EGF中和结构域；0043图16示出了显示出PH值变化对天然CTB蛋白的多聚化影响的WESTERN印迹。在凝胶分析之前，将在凝胶右侧上的样品在所示PH下孵育5分钟。在凝胶分析之前，将在凝胶左侧上的样品在所示的PH下孵育5分钟，随后中和回至PH70保持1小时；0044图。
37、17示出了含有表达EGF和CTB的序列的T1T6、E2和B2构建体的表；0045图18示出了E2构建体和B2构建体的WESTERN印迹；0046图19示出了含有表达EGF和CTB的序列的构建体E2、E2N和E2C；0047图20示出了含有EGF和CTB的序列并且包含延长的氨基酸接头的构建体；0048图21示出了E2、E2N和E2C构建体的WESTERN印迹；0049图22示出了含有延长的氨基酸接头的许多N末端构建体的WESTERN印迹；以及0050图23示出了含有延长的氨基酸接头的许多C末端构建体的WESTERN印迹；0051图24示出了含有IGF1有下划线、EGF有下划线和斜体和CTB序列斜。
38、体的合成蛋白序列；说明书CN104066447A106/24页110052图25示出了捕获ELISA的柱型图，该捕获ELISA证实在单一重组蛋白上同时存在IGF、EGF和CTB序列。柱A和柱B被抗EGF抗体捕获，而柱C被抗IGF抗体捕获。对蛋白的检测如下A为抗CTB，B为抗IGF和C为抗CTB；0053图26示出了含有HUIGF1序列有下划线和CTB序列斜体的合成蛋白序列；0054图27示出了捕获ELISA的柱型图，其中检测IGFCTB和EGFCTB的异聚体。所有样品均含有在CTB的C末端的IGF。样品A和样品B含有在CTB的C末端的EGF，而样品B和样品D包括在CTB的N末端EGF。样品A和。
39、样品B被抗EGF抗体捕获并且检测IGF，而样品C和样品D被抗IGF抗体捕获并且检测EGF；0055图28AE示出了合成蛋白序列，其A含有CTB序列斜体和TGF1的生长因子序列有下划线的合成蛋白序列，B含有含有CTB序列斜体和FGF2的生长因子序列有下划线的合成蛋白序列，C含有CTB序列斜体和HGFNK1的生长因子序列有下划线的合成蛋白序列，D含有CTB序列斜体和IGF1/2的生长因子序列有下划线的合成蛋白序列以及E含有CTB序列斜体和VEGFA/C的生长因子序列VEGFC序列用下划线和斜体标出的合成蛋白序列；0056图29示出了多种嵌合重组蛋白的捕获ELISA的柱型图，其中嵌合重组蛋白含有源自。
40、一种或多种生长因子的序列和CTB的序列。在每种情况下，重组蛋白被对于该重组蛋白的序列特异性的抗体捕获，然后被对如下不同序列具有特异性的抗体检测0057HGF和TGFB1被HGF抗体和TGFB1抗体捕获，并且检测CTB；0058FGF2被CTB抗体捕获并且检测FGF2；0059VEGFA/C被IVEGFA抗体和IIVEGFC抗体捕获并且在这两种情况下都检测CTB；0060在两种情况下IGF1/2被IGF1抗体捕获，并且被ICTB抗体和IIIGF2抗体检测；0061图30示出了根据图28A的天然重组TGFB1CTB蛋白的SDSPAGE凝胶电泳的WESTERN印迹，证实了初级五聚体重组蛋白的存在；0。
41、062图31示出了合成蛋白序列，其中，A含有TGFB1序列有下划线和CTB斜体的合成蛋白序列以及B含有TGFBETA2受体配体结合结构域序列下划线和CTB序列斜体的合成蛋白序列；0063图32示出了包含TGFBETAR2序列和CTB序列的重组蛋白的捕获ELISA的柱型图。该图证实了这两个序列能够在两个方向上同时结合而不产生偏差；0064图33示出了包含源自TGF的序列和CTB的序列的重组蛋白能够与包含源自TGF受体2和CTB配体结合结构域的序列的重组蛋白相结合；0065图34示出了免疫接种后，以1/100稀释的第1组小鼠血清对RIGF的IGG抗体应答；0066图35示出了免疫接种后，以1/10。
42、0稀释的第2组小鼠血清对REGF的IGG抗体应答；0067图36示出了免疫接种后，以A1/100稀释和B1/8稀释的第3组小鼠血清对REGF的IGG抗体应答；说明书CN104066447A117/24页120068图37示出了免疫接种后，以A1/100稀释和B1/8稀释的第3组小鼠血清对RIGF的IGG抗体应答；0069图38示出了免疫接种后，以A1/100稀释和B1/8稀释的第4组小鼠血清对REGF的IGG抗体应答；0070图39示出了免疫接种后，以A1/100稀释和B1/8稀释的第4组鼠血清对RIGF的IGG抗体应答；0071图40示出了免疫接种后，以1/8稀释除了样品178以1/100稀。
43、释的第5组小鼠血清对RIGF的IGG抗体应答；0072图41示出了免疫接种后，以1/100稀释的第6组小鼠血清对ARIGF和BRHUEGF的IGG抗体应答；0073图42示出了单神经节苷脂GM1、霍乱毒素亚单元B的天然结合伴侣的结构；0074图43示出了市售D半乳糖共轭到固相支撑体PIERCE公司的结构；以及0075图44示出了来源于使用CTB表达载体转化的三株大肠杆菌细胞菌株的培养液上清培养基的RCTB纯化的SDSPAGE凝胶电泳，如下第一泳道显示的是蛋白大小的标记物SIZEMARKER，第2、5和8泳道显示的是原培养液上清。泳道3、6、9显示的是原周质馏分。泳道4、7和10显示了被洗脱纯化。
44、的CTB。泳道11显示的是通过IMAC纯化的带组氨酸标签的CTB。具体实施方式0076在此公开了本重组蛋白或疫苗的详细实施方式，然而，应当要理解的是，所公开的实施方式仅为示例性的，其可能以各种形式来体现。因此，在此所公开的特异功能性细节不应被解释为限制，而是仅仅作为权利要求的基础，并作为用来教导本领域技术人员以各种方式来采用本文所公开的重组蛋白的有代表性的基础。0077本公开提供了一种同质的重组蛋白，用于改善作为免疫原性重组蛋白的元件存在的生长因子表位、肿瘤抗原表位和/或受体结合位点的最大数目。在一个示例性实施方式中描述了一种重组蛋白，该重组蛋白表达整个或部分的霍乱毒素BCTB、人类表皮生长因。
45、子EGF、肿瘤抗原和/或受体。在替代的示例性实施方式中，蛋白可表达基于已知的免疫原性蛋白为模型的其它免疫原性重组蛋白。在本公开的范围内考虑地是这样的重组蛋白将表达对人类免疫系统具有高度免疫原性的多肽。优选地，重组蛋白赋予嵌合蛋白额外的性质，例如，高表达率和易于制造、口服稳定性和跨过肠道进入血流的能力，和/或在人类中在先的安全使用PREVIOUSSAFEUSE。0078在示例性实施方式中，本文所公开的重组蛋白可含有或表达作为总分子量的函数的高比例的蛋白序列，该蛋白序列源自靶点自身抗原。例如，这可通过利用包含多种生长因子表位的大蛋白模型来实现。这些生长因子表位可为单一生长因子的整体或部分的多个拷贝。
46、，或为多种不同生长因子的整体或部分的拷贝。0079根据本公开，生长因子表位的表达应进行折叠，以允许它们的天然构象被基本保留并呈递至宿主免疫系统的组分，从而激发对所述表位的强的宿主免疫应答。模拟重组蛋白的表位支撑结构域的合适的天然蛋白质模型的实例包括但并不限于霍乱毒素B亚单位、大肠杆菌热不稳定LT和LTII肠毒素B亚单元、肠毒、百日咳毒素、空肠弯曲菌肠毒说明书CN104066447A128/24页13素、志贺毒素、李斯特菌毒素、破伤风类毒素、白喉类毒素、脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白、噬菌体外壳蛋白、腺病毒及其它病毒外壳蛋白。或者，蛋白质的非己组分可能是小的。作为最低限度，非己序列在长度上应包括约9、10。
47、、11或更多个氨基酸，并含有至少一个人类T细胞表位的全部或部分。或者，可使用非天然的“合成”多肽，满足为整个蛋白赋予免疫原性的要求，并且允许将生长因子、受体、肿瘤抗原或它们的表位适当地呈递至宿主免疫系统。0080在示例性实施方式中，表位支持结构域无论是源自天然重组蛋白或源自合成的重组蛋白均应当具有在适当的化学/环境条件下自组装成寡聚多聚体的能力，或在替代的条件下被还原为单体的能力。理想情况下，多聚化结构域将与少量的亚单元，例如二聚物、三聚物、四聚物、五聚物等组装成稳定的多聚体，以便于产生均一大小的产物。天然多肽的实例包括但并不限于亮氨酸拉链LEUCINEZIPPER，乳糖阻遏蛋白LACREPR。
48、ESSORPROTEIN、链霉亲和素/抗生物素蛋白、霍乱毒素B亚单元、其它AB5毒素的B亚单元、假单胞菌三聚化结构域，和病毒衣壳蛋白。0081根据本公开，重组蛋白无论是生长因子或其部分、细胞受体或其部分、肿瘤抗原或其部分均涉及到参与慢性疾病或癌症的生长因子和受体的广泛的细胞通路，且涉及到利用在所述合成蛋白内的肿瘤抗原的实体瘤的尽可能广泛的范围。该蛋白为重组蛋白的形式，并且可以用于治疗慢性疾病，例如，乳腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、外阴癌、结肠癌、肺动脉癌、脑癌、结肠癌、结肠直肠癌、头颈癌和食管癌。由于在所述疾病中可表达不同的肿瘤抗原并且过表达多种细胞受体和生长因子，下文所述的蛋白可包含与疾病相关。
49、的一种或多种不同的肿瘤抗原，一或多个细胞通路的一种或多种不同的受体或生长因子。这些蛋白被称为“多价体”。0082在示例性实施方式中公开了一种包括均质重组蛋白的蛋白，所述均质重组蛋白表达一种或多种表皮生长因子EGF中和结构域。该蛋白为重组蛋白的形式，并且可用于治疗慢性疾病，例如，乳腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、外阴癌、结肠癌、肺动脉癌、脑癌、结肠直肠癌、头颈癌和食道癌。在示例性实施方式中，该蛋白是表达或含有EGF序列和CTB序列的重组蛋白。0083在另一示例性实施方式中公开了一种包括均质重组蛋白的蛋白，所述均质重组蛋白表达一种成纤维细胞生长因子FGF。在示例性实施方式中，该蛋白是表达或含有FGF序列和CTB序列的重组蛋白。0084在进一步的示例性实施方式中公开了一种包括均质重组蛋白的蛋白，所述均质重组蛋白表达一种转化生长因子1TGF1。在示例性实施方式中，该蛋白是表达或含有TGF1序列和CTB序列的重组蛋白。0085在又一示例性实施方式中公开了一种包括均质重组蛋白的蛋白，所述均质重组蛋白表达一种转化生长因子1TGF1。在示例性实施方式中，该蛋白是表达或含有TGF1序列和CTB序列的重组蛋白。0086在一个示例性实施方式中公开了一种包括均质重组蛋白的蛋白，所述均质重组蛋白表达一种胰岛素样生长因子1IGF1。在示例性实施方式中，该蛋。