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1、10申请公布号CN104056276A43申请公布日20140924CN104056276A21申请号201310090753122申请日20130320CCTCCNOV20130220130305A61K48/00200601A61K39/145200601A61P31/1620060171申请人上海生物制品研究所有限责任公司地址200052上海市长宁区延安西路1262号72发明人陈则易应磊74专利代理机构上海翼胜专利商标事务所普通合伙31218代理人施春花翟羽54发明名称一种流感病毒减毒活疫苗及其制备方法57摘要本发明公开了一种流感病毒减毒活疫苗，保藏编号为CCTCCNOV201302，其。
2、基于M基因的突变而制备获得，该疫苗候选株具有较好的基因稳定性，减毒特性，具有较强的免疫原性，不仅能够诱导流感病毒特异性血清抗体和粘膜抗体，也能够诱导产生T细胞的不同亚群和分泌IFN的CD8T细胞数量，在现有的生产能力和技术下，能够有效的扩大免疫人群，在流感大流行时具有重要的社会意义和使用价值。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书8页序列表2页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页序列表2页附图5页10申请公布号CN104056276ACN104056276A1/1页21一种流感病毒减毒活疫苗，其保藏编号为CCTCCNOV201302。2权。
3、利要求1所述流感病毒减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤（1）从接种流感病毒的鸡胚尿囊液中抽提病毒的RNA，利用RTPCR的技术制备CDNA，扩增流感病毒的基因片段，分别构建到表达质粒上；（2）M基因定点突变，构建到质粒上并测序验证，突变后的M基因序列如SEQIDNO1所示；（3）突变的M基因质粒和未突变的其他基因质粒共同转染293T细胞；（4）细胞培养上清接种鸡胚，验证稳定性、减毒特性，以及安全性和有效性评价。3根据权利要求2所述流感病毒减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，所述流感病毒为A型流感病毒。4突变的M基因在制备预防流感疫苗制剂中的应用，其特征在于，所述突变的M基因序列如SE。
4、QIDNO1所示。5根据权利要求4所述突变的M基因在制备预防流感疫苗制剂中的应用，其特征在于，所述疫苗制剂的免疫方式是经鼻腔免疫。6根据权利要求4所述突变的M基因在制备预防流感疫苗制剂中的应用，其特征在于，所述流感病毒为A型流感病毒。权利要求书CN104056276A1/8页3一种流感病毒减毒活疫苗及其制备方法技术领域0001本发明涉及生物制品领域，更具体地讲，涉及一种流感病毒减毒活疫苗及其制备方法。背景技术0002流感病毒流行大致可以分为世界大流行、局部流行及散发三种。2009年4月以来，一种新型流感病毒（甲型H1N1）在墨西哥开始蔓延并迅速引起了世界范围内流感大流行MEXICOFLUDEA。
5、THSRAISEFEARSOFGLOBALEPIDEMICMSNBC20090424。截止到2011年5月26日，在全世界范围内共造成了1,353,141人感染，死亡人数为15,934人。0003预防流感病毒流行的最有效的手段是疫苗接种。0004与传统的灭活疫苗相比，流感病毒减毒活疫苗具有较多优点，其保留了病毒原有的部分活性，在接种人群后能通过病毒在上呼吸道复制模拟自然感染，可以诱导机体产生更全面的免疫应答，使受试者获得更广泛有效的保护。同时减毒活疫苗能够在机体内存在较长时间，故引起有效免疫应答的时间更加强烈和持久长，更加难得的是一些减毒活疫苗能够诱导机体产生较强的交叉免疫反应，对表面抗原发生。
6、漂变的流行株病毒有一定的交叉保护作用。此外，其使用方法简便容易。0005现在，上市的流感病毒减毒活疫苗主要包括美国研制的冷适应减毒活疫苗和俄罗斯研制的减毒活疫苗。该疫苗在人的正常体温37时复制能力受到了极大的限制，对人不具有或具有较低的致病性能力，但是在25和33能进行有效的复制的流感病毒株，具有冷适应和温度敏感的特性AMBROSECS,LUKEC,COELINGHKCURRENTSTATUSOFLIVEATTENUATEDINFLUENZAVACCINEINTHEUNITEDSTATESFORSEASONALANDPANDEMICINFLUENZAINFLUENZAOTHERRESPIVIR。
7、USES2008,26193202。但是由于专利和知识产权的限制和保护，该类型的减毒活疫苗还没有在中国批准上市。0006流感病毒的基质蛋白，在其复制周期中发挥着重要的作用，基质蛋白M1是流感病毒颗粒中含量最多的蛋白，参与了病毒壳骨架的构成，此外其还能与病毒的RNA结合，与RNP复合体相互作用，在病毒的复制和感染中起着重要的作用SHAB,LUOMSTRUCTUREOFABIFUNCTIONALMEMBRANERNABINDINGPROTEIN,INFLUENZAVIRUSMATRIXPROTEINM1NATSTRUCTBIOL1997,43239244。M2蛋白具有离子通道和调节膜内PH值的作用。
8、，该作用能够影响HA蛋白的构像，从而影响病毒的出芽和感染TAKEUCHIK,LAMBRAINFLUENZAVIRUSM2PROTEINIONCHANNELACTIVITYSTABILIZESTHENATIVEFORMOFFOWLPLAGUEVIRUSHEMAGGLUTININDURINGINTRACELLULARTRANSPORTJVIROL1994,682911919。基于以上理由，本发明研究了基于M基因突变制备流感病毒减毒活疫苗的方法和技术。发明内容0007本发明所要解决的第一个技术问题是，提供一种流感病毒减毒活疫苗。说明书CN104056276A2/8页40008本发明所要解决的第二个技。
9、术问题是，提供一种流感病毒减毒活疫苗的制备方法。0009本发明所要解决的第三个技术问题是，提供突变的M基因在制备预防流感疫苗制剂中的应用。0010为了解决上述第一个技术问题，本发明提供了一种流感病毒减毒活疫苗，其保藏编号为CCTCCNOV201302。0011为了解决上述第二个技术问题，本发明提供了流感病毒减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤0012（1）从接种流感病毒的鸡胚尿囊液中抽提病毒的RNA，利用RTPCR的技术制备CDNA，扩增流感病毒的基因片段，分别构建到表达质粒上；0013（2）M基因定点突变，构建到质粒上并测序验证，突变后的M基因序列如SEQIDNO1所示；0014（。
10、3）突变的M基因质粒和未突变的其他基因质粒共同转染293T细胞；0015（4）细胞培养上清接种鸡胚，验证稳定性、减毒特性，以及安全性和有效性评价。0016作为一个优选方案，所述流感病毒为A型流感病毒。0017为了解决上述第三个技术问题，本发明提供了突变的M基因在制备预防流感疫苗制剂中的应用，其特征在于，所述突变的M基因序列如SEQIDNO1所示。0018作为一个优选方案，所述疫苗制剂的免疫方式是经鼻腔免疫。0019作为又一个优选方案，所述流感病毒为A型流感病毒。0020本发明所要保护的流感病毒减毒活疫苗命名为甲型流感病毒INFLUENZAVIRUSAMPR8（下称MPR8），保藏在中国典型培养。
11、物保藏中心（保藏地址湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学中国典型培养物保藏中心邮编430072），保藏日期为2013年3月5日，保藏编号为CCTCCNOV201302。0021本发明的有益效果本发明提供了一种流感病毒减毒活疫苗，基于M基因的突变而制备获得，该疫苗候选株具有较好的基因稳定性，减毒特性，具有较强的免疫原性，诱导机体强烈的免疫应答，不仅能够诱导流感病毒特异性血清抗体和粘膜抗体，也能够诱导产生T细胞的不同亚群和分泌IFN的CD8T细胞数量，在现有的生产能力和技术下，能够有效的扩大免疫人群，在流感大流行时具有重要的社会意义和使用价值。附图说明0022图1本发明实施的技术路线图。002。
12、3图2对比MPR8和PR8流感病毒在MDCK细胞上的生长水平，分别在MDCK细胞上接种0001MOI的PR8和MPR8，分别收获接种后24H，48H,72H,96H的样本，使用半数组织感染剂量的方法检测各个样本的病毒滴度。表示与PR8组比较有显著性差异（P005）。0024图3肺部病毒滴度，每组3只68周龄小鼠，滴鼻接种20L105TCID50剂量MPR8或PR8病毒液，3天后处死小鼠，使用2ML的PBS含01BSA冲洗气管肺泡，使用半数组织感染剂量的方法检测各个样本的病毒滴度，表示与PR8组比较有显著性差异（P005）。0025图4不同剂量的MPR8疫苗免疫三周后，检测其脾细胞中IFN的分泌。
13、水平。每说明书CN104056276A3/8页5组3只68周龄小鼠，分别滴鼻接种20L10TCID50,100TCID50，1000TCID50剂量MPR8病毒液，对照组滴鼻接种20L的PBS，21天后处死小鼠，分离脾细胞，使用ELISPOTASSAY检测脾细胞中IFN的分泌水平，表示与对照组比较有显著性差异（P005）。0026图5分析疫苗免疫后的小鼠的脾细胞中CD3CD4T细胞的频率，A,阴性对照；B,10TCID50免疫组；C,100TCID50免疫组；D,1000TCID50免疫组。0027图6分析疫苗免疫后的小鼠的脾细胞中CD3CD8T细胞的频率，A,阴性对照；B,10TCID50免。
14、疫组；C,100TCID50免疫组；D,1000TCID50免疫组。0028图7不同剂量的MPR8免疫小鼠在10LD50剂量的同源病毒PR8致死攻击后体重变化。0029图8不同剂量的MPR8免疫小鼠在10LD50剂量的同源病毒PR8致死攻击后的存活率。0030图9不同剂量的MPR8免疫小鼠在10LD50剂量的异源病毒H9N2致死攻击后体重变化。0031图10不同剂量的MPR8免疫小鼠在10LD50剂量的异源病毒H9N2致死攻击后的存活率。具体实施方式0032下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明。
15、，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如SAMBROOK等人，分子克隆实验室手册NEWYORKCOLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS，1989中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。0033实施例1流感病毒减毒活疫苗的制备0034从接种A/PUERTORICO/8/34H1N1病毒的鸡胚尿囊液中抽提病毒的RNA，利用RTPCR的技术制备CDNA，扩增流感病毒的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS八个基因片段。利用重叠PCR的方法分别在M基因上引入突变，突变。
16、后的M基因序列如SEQIDNO1所示。在转染试剂脂质体LIPOFECTAMINE2000辅助下八质粒共同转染293T细胞。72小时后，收获样本，接种10日龄鸡胚，4872小时后，收获鸡胚尿囊液，血凝实验和基因抽提、测序验证病毒序列的正确性。该毒株命名为MPR8。0035MPR8毒株M基因序列（突变后序列）0036AGCGAAAGCATGTAGATATTGAAAGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTACTCTCTATCATCCCGTCAGGGCCCCTGAAAGCCGAGATCGCACAGAGACTTGAAGATGTCTTTGCAGGGAAGAACACTGATCTTG。
17、AGGTTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTTAATGGGAACGGGGATCCAAATAACATGGACAAAGCAGTTAAACTGTATAGGAAGCTCAAGAGGGAGATAACATTCCATGGGGCCAAAGAAATCTCACTCAGTTATTCTGCTGGTGCACTTGCCAGTTGTATGGGCCTCATATACAACAGGATGGGGGCTGTGACCA。
18、CTGAAGTGGCATTTGGCCTGGTATGTGCAACCTGTGAACAGATTGCTGACTCCCAGCATCGGTCTCATAGGCAAATGGTGACAACAACCAATCCACTAATCAGACAT说明书CN104056276A4/8页6GAGAACAGAATGGTTTTAGCCAGCACTACAGCTAAGGCTATGGAGCAAATGGCTGGATCGAGTGAGCAAGCAGCAGAGGCCATGGAGGTTGCTAGTCAGGCTAGACAAATGGTGCAAGCGATGAGAACCATTGGGACTCATCCTAGCTCCAGTGCTGGTCTGAAAAATGATCT。
19、TCTTGAAAATTTGCAGGCCTATCAGAAACGAATGGGGGTGCAGATGCAACGGTTCAAGTGATCCTCTCGCTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTACCGTCGCTTTAAATACGGACTGAAAGGAGGGCCTTCTACGGAAGGAGTGCCAAAGTCTATGAGGGAAGAATATCGAAAGGAACAGCAGAGTGCTGTGGATGCTGACGATGGTCATTTTGTCAGCATAGAGCTGGAGTAAAAAACTACATTGTTTC。
20、TACT。0037所述的M基因突变序列，不仅适用于所描述的A型流感减毒活疫苗，其它型别流感减毒活疫苗也在使用范围之内，比如B型流感减毒活疫苗。0038实施例2MPR8生物学特性的研究00391基因稳定性研究在MDCK细胞上接种MPR8病毒株，连续传10代，收取第1、5、10代细胞培养上清，抽提总RNA，反转录成CDNA，PCR扩增基因，构建到PMD18TVECTOR上，进行序列测定，软件比对基因，鉴定突变毒株能否稳定传代。00402）病毒株细胞水平上生长特性研究按照0001MOI接种病毒，分别测定病毒感染后24,48,72,96小时的TCID50，用来对比MPR8病毒与PR8病毒的生长情况。0。
21、0413）减毒特性的研究用戊巴比妥钠腹腔麻醉小鼠，每只小鼠经鼻滴注20L105TCID50的病毒液，3天后，麻醉断颈处死，无菌解剖，取肺，用病毒稀释液洗涤支气管肺泡灌洗液3次，离心，分装，用细胞半数感染剂量检测小鼠肺部病毒滴度。00424）流感病毒减毒活疫苗候选株MPR8病毒免疫原性的研究0043免疫程序和步骤68周龄的雌性BALB/C小鼠共分4组MPR8病毒株（1000TCID50），MPR8病毒株（100TCID50）MPR8病毒株（10TCID50）PBS空白对照组。一次免疫后21天，取血和鼻腔洗液，用于抗体滴度检测，并同时分离脾脏细胞，用于ELISPOT检测分泌IFN的T细胞和流式细胞。
22、仪检测T细胞亚群。0044A抗体检测0045（1）用10G/ML的PR8全病毒灭活疫苗包被96孔酶标板，4，孵育过夜。0046（2）用PBST洗涤三次后，加入100LPBST溶液（含8脱脂奶粉），37放置1小时。0047（3）血清或鼻腔洗液使用封闭液稀释后加入酶标板，37反应1小时。0048（4）PBST洗涤三次，每孔加入100L标记HRP的羊抗鼠二抗工作夜，37放置1小时。0049（5）PBST洗涤三次，每孔加入100LTMB液，室温反应1530分钟。0050（6）每孔加入50L2M的H2SO4终止反应，用酶标仪检出450NM出的OD值，记录数据，用对照组的平均值加上2SD,作为阳性结果的判。
23、断标准。0051B酶联免疫斑点实验（ELISPOT）0052为了检测小鼠的细胞免疫应答水平，使用ELISPOT检测了小鼠脾脏淋巴细胞分泌的细胞因子IFN的情况，简单介绍如下0053（1）预包被板的活化每孔加入200LDMEM，室温静置10MIN，扣出液体。0054（2）加入细胞悬液每孔加入100L浓度为1103CELLS/L脾脏单核细胞。0055（3）加入刺激物3复孔只加入100LDMEM,用作背景负对照，在正对照孔中加说明书CN104056276A5/8页7入10L工作浓度的PMA和IONOMYCIN，负对照孔中加入10LDMEM,实验组加入终浓度10G/ML的PR8全病毒灭活苗。0056（。
24、4）培养37，5CO2细胞培养箱中培养24HR。0057（5）裂解细胞倾倒扳内的培养基和细胞，加入200L预冷的去离子水，4放置10MIN，低渗裂解细胞。0058（6）洗板甩去孔内液体，用200L/孔1WASHINGBUFFER洗5次。0059（7）检测抗体每孔加入100L稀释好的生物素标记的一抗，37孵育1小时。0060（8）洗板甩去孔内液体，用200L/孔1WASHINGBUFFER洗6次。0061（9）酶联亲和素孵育每孔加入100L稀释好的酶表亲和素工作液，37孵育1小时。0062（10）洗板甩去孔内液体，用200L/孔1WASHINGBUFFER洗5次。0063（11）显色每孔加入10。
25、0现用现配的AEC显色液，室温避光显色30MIN左右。0064（12）终止倾倒孔内液体，打开底座，用去离子水洗涤5遍正反面，将板放置于阴凉处室温晾干。0065（13）ELISPOT斑点计数，统计分析数据。0066ELISPOT斑点计数是由达科为生物技术有限公司读数。0067C流式细胞仪检测CD4，CD8的T细胞亚群0068（1）脾细胞标本取有盖的FALCON管分别编号，编号1阴性对照、编号2CD3，编号3CD3CD4、编号4CD3CD8、编号5CD3CD4CD8,这六管用于用于调节补偿和电压，其余的实验组分别做好标记，用于检测，每管中分别加入500L106个对应的细胞。0069（2）取出FAL。
26、CON管，用2FCSPBS洗两遍，1000RPM，离心5分钟。慢慢吸出上清。0070（3）按照管上标记分别加入1GCD3APC,1GCD4FITC或1GCD8PE荧光抗体，实验组加入三种荧光抗体，混匀，室温避光孵育15分钟。0071（4）每管加入2ML含3PBSPBS，1000RPM，离心5分钟,洗两遍，留下200L上清，用枪吹打均匀细胞。0072（5）上机检测在CELLQUEST软件下，获取10万个细胞。0073（6）数据统计分析0074实施例3流感病毒减毒活疫苗MPR8候选株能提供针对同源病毒保护0075免疫程序和步骤68周龄的雌性BALB/C小鼠共分分4组MPR8病毒株（1000TCID。
27、50），MPR8病毒株（100TCID50）MPR8病毒株（10TCID50）PBS空白对照组。免疫一次,21天后10LD50的PR8攻毒，病毒攻击后3天，取支气管肺泡灌洗液测定病毒滴度，其余的观察体重变化和存活率。0076病毒滴度的测定将气管肺洗液作系列10倍稀释，用每个稀释度感染培养于96孔板中的MDCK细胞（密度约为8090），每个稀释度平行接种4个细胞孔，并将感染细胞置于CO2培养箱中。37培养72HR后，血凝试验检测每个温度下病毒的滴度，用REEDMUENCH方法计算TCID50。每个实验组病毒滴度是用每组所有5只小鼠样本的病毒滴度的平均值SD来表示。0077实施例4流感病毒减毒活疫。
28、苗候选株MPR8能提供针对异亚型病毒保护0078免疫程序和步骤68周龄的雌性BALB/C小鼠共分3组MPR8病毒株说明书CN104056276A6/8页8（1000TCID50），MPR8病毒株（100TCID50）MPR8病毒株（10TCID50）PBS空白对照组。免疫一次,21天后10LD50的H9N2攻毒，病毒攻击后3天，取支气管肺泡灌洗液测定病毒滴度，其余的观察体重变化和存活率。0079实验结果00801）病毒株遗传稳定性测定MPR8病毒株接种MDCK细胞进行连续传代10代，分别取第1,5,10代基因测序，比对基因序列，结果表明基因序列没有发生突变，证明了毒株具有较好的遗传稳定性。00。
29、812）MPR8病毒株生长特性研究按0001MOI接种病毒，分别测定病毒感染后24,48,72,96小时的病毒滴度，用来对比MPR8病毒株与PR8病毒株的生长情况。如图2所示，接种后24小时，2株病毒的的生长没有明显的差异。72小时时，MPR8病毒株与PR8病毒株相比，其病毒滴度降低了约300多倍，证明了病毒的复制能力有了较大的减弱，初步证明了MPR8病毒株具有减弱毒力的特性。00823减毒特性的研究每只小鼠经鼻滴注20L105TCID50的MPR8或者PR8病毒液，3天后取肺部支气管灌洗液，测定病毒滴度。结果表明滴注MPR8病毒株组的平均病毒滴度LOG1035TCID50/ML，PR8病毒感。
30、染组的平均滴度为LOG1064TCID50/ML，二者具有显著性的差异，说明MPR8在呼吸道内的复制受到了有效的抑制，显示了该毒株具有减毒或者弱毒的特性（图3）00834）MPR8病毒株免疫原性0084AELISA抗体0085为了评价壳MPR8减毒活疫苗能否诱导小鼠产生特异性抗体应答能力，小鼠免疫后21天采用眼球静脉取血的方法收集血清，通过ELISA方法测定血清中PR8特异性IGG抗体。结果表明（表1），1000TCID50MPR8组具有最高的血清抗体和鼻腔洗液抗体，且抗体滴度的增加存在剂量依赖关系。0086表1经鼻免疫不同剂量的MPR8疫苗在小鼠中诱导机体产生的抗体应答水平00870088注。
31、每组3只小鼠在MPR8疫苗免疫小鼠时诱导的抗体应答。免疫三周后，收集样本，使用ELISA检测抗体滴度。0089A结果用3只小鼠的平均值SD表示。0090B表示与对照组相比有显著性差异，P005。0091C表示与10TCID50免疫组相比有显著性差异，P005。0092D表示与100TCID50免疫组相比有显著性差异，P005。说明书CN104056276A7/8页90093E代表没有检测到。0094B酶联免疫斑点实验0095结果表明（图4），各免疫组分泌IFN的脾细胞数目随着免疫剂量的增加而增加，1000TCID50疫苗免疫组诱导的分泌IFN的脾细胞数目与对照组有显著性的差异（P005）。00。
32、96C流式细胞仪检测CD4，CD8的T细胞亚群0097结果表明（图5,6），所有免疫组的晓鼠的T细胞亚群CD4T,CD8T细胞都有着增长，这表明了细胞免疫的水平具有剂量依赖性。其中对照组的CD3CD4T细胞亚群，CD3CD8T细胞所占的比率分别为329,142，1000TCID50疫苗免疫组的CD3CD4T细胞,CD3CD8T细胞细胞所占的比率分别为1062,453。100TCID50疫苗免疫组的CD3CD4T细胞,CD3CD8T细胞细胞所占的比率分别为660,343。10TCID50疫苗免疫组的CD3CD4T细胞,CD3CD8T细胞细胞所占的比率分别为368,298。00984）流感病毒减毒。
33、活疫苗候选株MPR8能提供针对同源病毒PR8的保护0099A病毒滴度0100结果表明（表2），使用PR8病毒攻击时，PBS组平均肺病毒滴度约为107TCID50/ML和1046TCID50/ML。免疫100TCID50小鼠平均肺部病毒滴度和鼻腔洗液病毒滴度分别约为1054TCID50/ML和1037TCID50/ML，与PBS对照组有着显著性的差异。免疫1000TCID50小鼠平均肺部病毒滴度和鼻腔洗液病毒滴度分别约为1042TCID50/ML和1025TCID50/ML，与其它组别有着显著性的差异。0101表2免疫不同剂量的MPR8病毒后，小鼠抵抗致死剂量的同源PR8病毒攻击的效果01020。
34、103注每组3只68周龄小鼠，分别滴鼻接种20L10TCID50,100TCID50,1000TCID50剂量MPR8病毒液,对照组滴鼻接种20L的PBS，第21天10LD50的PR8病毒攻击，第24天处死小鼠，收获气管肺泡洗液和鼻腔洗液，使用半数组织感染剂量方法测定病毒滴度。0104A结果用3只小鼠的平均值SD表示。0105B表示与对照组相比有显著性差异，P0050106C表示与10TCID50免疫组相比有显著性差异，P005。说明书CN104056276A8/8页100107D表示与100TCID50免疫组相比有显著性差异，P005。0108B体重变化和存活率0109对照组在第7天时，全部。
35、死亡，1000TCID50免疫组存活率100，100TCID50免疫组存活率30。通过观察小鼠的体重变化，发现1000TCID50免疫组在攻毒后，小鼠的体重变化很小，在2周左右恢复到原来的体重，而100TCID50免疫组体重恢复相对较慢。01105）流感病毒减毒活疫苗候选株MPR8能提供针对异亚型病毒H9N2的保护0111A病毒滴度0112如表3所示，结果表明随着免疫剂量的增加，小鼠肺部的病毒滴度随之降低，与对照组相比，1000TCID50组的肺部病毒滴度和鼻腔洗液病毒滴度都有显著性的差异（P005）。0113表3免疫不同剂量的MPR8病毒后，小鼠抵抗致死剂量的异亚型H9N2病毒攻击的效果01。
36、140115注每组3只68周龄小鼠，分别滴鼻接种体积为20L的10TCID50,100TCID50,1000TCID50剂量的MPR8病毒液,对照组滴鼻接种20L的PBS，第21天10LD50的H9N2病毒攻击，第24天处死小鼠，收获气管肺泡洗液和鼻腔洗液，使用半数组织感染剂量方法测定病毒滴度。0116A结果用3只小鼠的平均值SD表示。0117B表示与对照组相比有显著性差异，P005。0118C表示与10TCID50免疫组相比有显著性差异，P005。0119D表示与100TCID50免疫组相比有显著性差异，P005。0120B体重变化和存活率0121结果如图9和图10表明，对照组和所有的免疫组。
37、攻毒后都出现了一定程度的临床症状，但是，1000TCID50免疫组体重减少程度较轻，并且回复的较快。在存活率方面，1000TCID50免疫组完全存活，保护率100，100TCID50免疫组存活率30，10TCID50免疫组存活率10，PBS组完全死亡。说明书CN104056276A101/2页1100010002序列表CN104056276A112/2页12序列表CN104056276A121/5页13图1图2说明书附图CN104056276A132/5页14图3图4说明书附图CN104056276A143/5页15图5图6说明书附图CN104056276A154/5页16图7图8说明书附图CN104056276A165/5页17图9图10说明书附图CN104056276A17。