大豆异黄酮主要单体组分的分离方法 技术领域
本发明涉及从大豆异黄酮中分离得到染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷、大豆苷四种主要单体组分的方法。
背景技术
大豆异黄酮是大豆的次生代谢产物，是由多种单体组分构成的混合物。根据化学结构的不同，大豆异黄酮可分为游离型的苷元和结合型的糖苷两大类，其中苷元约占其总量的2～5％，主要包括染料木黄酮和大豆苷元；糖苷约占其总量的95～98％，主要以染料木苷和大豆苷的形式存在。大豆异黄酮四种主要单体组分的化学结构式如下。
染料木黄酮 染料木苷
大豆苷元 大豆苷
大豆异黄酮具有多种生物活性，如抑制脂质过氧化、清除活性氧自由基、防癌抗癌、改善妇女更年期综合症、预防骨质疏松等。近年来的研究表明，大豆异黄酮地生物活性主要体现在染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷、大豆苷这四种单体组分上，而且其不同单体组分的生物活性不同。一般而言，大豆异黄酮的苷元较之糖苷的生物活性强，如在抗脂质过氧化、清除活性氧自由基、类雌激素活性、抗癌作用等方面，染料木黄酮的生物活性大于染料木苷，大豆苷元的生物活性大于大豆苷。同是大豆异黄酮的苷元，染料木黄酮的抗氧化、类雌激素及抗癌活性强于大豆苷元，而大豆苷元的抗溶血能力强于染料木黄酮。
据了解，有关大豆异黄酮提取分离的专利报道较多。例如：USP 5932221发明了丙酮萃取豆粕，再用冰水沉淀分离萃取物中染料木苷的方法，但该技术无法分离得到大豆异黄酮的其它单体组分。USPA 20010010930公开了以脱脂大豆等为原料，经酶解、超滤、离心、酸洗等步骤制备大豆异黄酮苷元的方法，但该法不能得到大豆异黄酮的糖苷，且工艺复杂，条件难以控制。CN 1375492A公开了以大豆胚轴为原料，采用不同溶剂分别萃取大豆异黄酮糖苷和苷元的方法，但其无法使不同糖苷或不同苷元之间得到分离。CN 1174839A公开了从大豆废糖蜜中回收大豆异黄酮的方法，但该方法的主要目的是分离大豆异黄酮的苷元。CN 1349987A公开了用极性大孔树脂法吸附大豆异黄酮的粗提液，以乙醇溶液解吸来纯化大豆异黄酮的方法，CN 1284503A公开了从大豆粕中分离并精制大豆异黄酮的方法，但该两种方法所得产品均为大豆异黄酮多种单体组分的混合物。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种分离大豆异黄酮中主要单体组分的方法，此种方法可同时得到纯度较高的染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷、大豆苷四种单体，为大豆异黄酮在医疗和保健食品等领域的更加精细化利用奠定基础。
本发明的技术方案：以含量不低于40％的大豆异黄酮的混合物为原料，以硅胶为吸附剂，以氯仿-甲醇溶液为洗脱体系，工艺步骤如下。
1、样品溶液制备
将大豆异黄酮的混合物用甲醇溶解，配制成浓度为1.0～2.0mg/ml的大豆异黄酮甲醇溶液。
2、吸附剂的处理与装柱
吸附剂硅胶经酸洗和碱中和后，水洗至中性，加热(105～115℃)活化，并用洗脱体系溶液浸泡平衡后，常规湿法装入分离柱。
3、上样
将样品溶液加入分离柱，加入量为柱有效体积的5～15％。
4、洗脱
控制洗脱液流速为每分钟柱有效体积的0.5～1.5％，分段收集洗脱液。
5、定性检测
分别对所收集的洗脱液定性检测，并与所需分离的大豆异黄酮主要单体组分的对照品进行比较。
6、单体组分的获取
合并相同组分的洗脱液，分别真空浓缩(温度40～60℃)和真空干燥(温度60～80℃)，即得到染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷、大豆苷四种大豆异黄酮的主要单体组分。
上述方法中，硅胶的优选粒度为37～49μm；洗脱体系中氯仿与甲醇的优选配方为氯仿∶甲醇＝5∶1(体积比)；分离柱的柱径∶柱高＝1∶10～20。
上述方法分离得到的染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷、大豆苷四种大豆异黄酮的主要单体组分采用高效液相色谱法检测，色谱条件：Agilent 1100 series高效液相色谱仪，色谱柱为Hypersil ODS C18(4.0mm×250mm，5μm)，进样量为20μL，流动相为15～40％甲醇(0～10min)和40～55％甲醇(11～40min)，流速为0.6ml/min，柱温为25℃，检测波长为254nm。分析结果表明，各单体组分的含量均可达到90％以上。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明所述的方法可以使大豆异黄酮中的染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷及大豆苷得到有效分离，各单体组分的含量均可达到90％以上。
2、本发明所述的方法操作简单，设备要求低，条件温和，能有效地保留各单体组分的生物活性。
3、本发明所述方法采用硅胶为吸附剂，并对硅胶的粒度进行了优选，因而在常压下即可使大豆异黄酮的四种主要单体组分得到有效分离，此外硅胶可再生重复使用，有利于降低分离成本。
4、本发明所述方法确定的氯仿-甲醇洗脱体系具有理想的分离大豆异黄酮四种主要单体组分的效果。
5、本发明所述方法确定了样品浓度、上样量、洗脱液流速、分离柱的径高比等工艺参数，有利于保证大豆异黄酮四种主要单体组分的分离效果。
6、本发明所述方法的实施可以促进大豆异黄酮的更加精细化利用。
具体实施方式
下面通过实施例进一步详细说明本发明，但不应对本发明的实施范围构成任何限制。
实施例1
本实施例中，以含量为40.75％的大豆异黄酮的混合物为原料，以37～49μm硅胶为吸附剂，以氯仿∶甲醇＝5∶1(体积比)的氯仿-甲醇溶液为洗脱体系，工艺步骤如下。
1、样品溶液制备
将大豆异黄酮的混合物用甲醇溶解，配制成浓度为1.0mg/ml的大豆异黄酮甲醇溶液。
2、吸附剂的处理与装柱
吸附剂硅胶经酸(1Mol/L HCl)洗和碱(1Mol/L NaOH)中和后，水洗至pH 6.8，110℃活化2h，再用洗脱体系氯仿-甲醇溶液浸泡24h达到平衡后，常规湿法装入分离柱。分离柱为φ24×300mm的玻璃柱。
3、上样
将样品溶液10ml加入分离柱。
4、洗脱
以1.5ml/min的流速洗脱，分段收集洗脱液。
5、定性检测
采用硅胶GF254薄层板分别对所收集的洗脱液定性检测，并与对照品的Rf值进行比较。
6、单体组分的获取
合并相同组分的洗脱液，分别于45℃真空(0.08MPa)浓缩和60℃真空(0.08MPa)干燥后得到大豆异黄酮的四种单体组分，即染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷及大豆苷。采用高效液相色谱法检测，检测结果为：染料木黄酮含量92.3％、大豆苷元含量91.6％、染料木苷含量90.7％、大豆苷含量90.2％。
实施例2
本实施例中，以含量为62.52％的大豆异黄酮的混合物为原料，以37～49μm硅胶为吸附剂，以氯仿∶甲醇＝5∶1(体积比)的氯仿-甲醇溶液为洗脱体系，工艺步骤如下。
1、样品溶液制备
将大豆异黄酮的混合物用甲醇溶解，配制成浓度为1.5mg/ml的大豆异黄酮甲醇溶液。
2、吸附剂的处理与装柱
吸附剂硅胶经酸(1Mol/L HCl)洗和碱(1Mol/LNaOH)中和后，水洗至pH 6.8，110℃活化2h，再用洗脱体系氯仿-甲醇溶液浸泡24h达到平衡后，常规湿法装入分离柱。分离柱为φ24×300mm的玻璃柱。
3、上样
将样品溶液10ml加入分离柱。
4、洗脱
以1.5ml/min的流速洗脱，分段收集洗脱液。
5、定性检测
采用硅胶GF254薄层板分别对所收集的洗脱液定性检测，并与对照品的Rf值进行比较。
6、单体组分的获取
合并相同组分的洗脱液，分别于45℃真空(0.08MPa)浓缩和60℃真空(0.08MPa)干燥后得到大豆异黄酮的四种单体组分，即染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷及大豆苷。采用高效液相色谱法检测，检测结果为：染料木黄酮含量93.5％、大豆苷元含量92.3％、染料木苷含量91.5％、大豆苷含量91.8％。
实施例3
本实施例中，以含量为79.32％的大豆异黄酮的混合物为原料，以37～49μm硅胶为吸附剂，以氯仿∶甲醇＝5∶1(体积比)的氯仿-甲醇溶液为洗脱体系，工艺步骤如下。
1、样品溶液制备
将大豆异黄酮的混合物用甲醇溶解，配制成浓度为2.0mg/ml的大豆异黄酮甲醇溶液。
2、吸附剂的处理与装柱
吸附剂硅胶经酸(1Mol/L HCl)洗和碱(1Mol/L NaOH)中和后，水洗至pH 6.8，110℃活化2h，再用洗脱体系氯仿-甲醇溶液浸泡24h达到平衡后，常规湿法装入分离柱。分离柱为φ24×300mm的玻璃柱。
3、上样
将样品溶液10ml加入分离柱。
4、洗脱
以1.5ml/min的流速洗脱，分段收集洗脱液。
5、定性检测
采用硅胶GF254薄层板分别对所收集的洗脱液定性检测，并与对照品的Rf值进行比较。
6、单体组分的获取
合并相同组分的洗脱液，分别于45℃真空(0.08MPa)浓缩和60℃真空(0.08MPa)干燥后得到大豆异黄酮的四种单体组分，即染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷及大豆苷。采用高效液相色谱法检测，检测结果为：染料木黄酮含量95.6％、大豆苷元含量95.2％、染料木苷含量93.8％、大豆苷含量92.1％。
实施例4
本实施例中，以含量为62.52％的大豆异黄酮的混合物为原料，以37～49μm硅胶为吸附剂，以氯仿∶甲醇＝5∶1(体积比)的氯仿-甲醇溶液为洗脱体系，工艺步骤如下。
1、样品溶液制备
将大豆异黄酮的混合物用甲醇溶解，配制成浓度为1.5mg/ml的大豆异黄酮甲醇溶液。
2、吸附剂的处理与装柱
吸附剂硅胶经酸(1Mol/L HCl)洗和碱(1Mol/L NaOH)中和后，水洗至pH 6.8，110℃活化2h，再用洗脱体系氯仿-甲醇溶液浸泡24h达到平衡后，常规湿法装入分离柱。分离柱为φ28×500mm的玻璃柱。
3、上样
将样品溶液30ml加入分离柱。
4、洗脱
以3.0ml/min的流速洗脱，分段收集洗脱液。
5、定性检测
采用硅胶GF254薄层板分别对所收集的洗脱液定性检测，并与对照品的Rf值进行比较。
6、单体组分的获取
合并相同组分的洗脱液，分别于45℃真空(0.08MPa)浓缩和60℃真空(0.08MPa)干燥后得到大豆异黄酮的四种单体组分，即染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷及大豆苷。采用高效液相色谱法检测，检测结果为：染料木黄酮含量91.8％、大豆苷元含量91.0％、染料木苷含量90.2％、大豆苷含量90.4％。