糖基神经酰胺增强对抗原的免疫反应的用途 相关应用的交叉参考
本申请要求于 2007 年 12 月 5 日提交的美国临时专利申请 No.60/992,460 的优先 权， 将其整体合并于本申请用于参考。
技术领域
本发明提供了糖基神经酰胺在增强对抗原的免疫应答中的应用。 背景技术 疫苗的基本目的是提供抗病理条件的持续免疫性。理论上， 疫苗提供功能活化的 抗体、 引起细胞介导的免疫、 并且激活具有高度特异反应性和 “记忆力” 的 T 淋巴细胞和 B 淋 巴细胞， 来提供对抗更多抗原入侵的保护作用。
佐剂是非特异地放大免疫应答的疫苗添加剂。佐剂增强免疫系统的机制各不相 同。佐剂可以归类为 “免疫调节” 或 “抗原递送” 系统。免疫调节佐剂通过改变淋巴因子产生 而调节免疫细胞的行为， 来准备启动免疫系统。 另一方面， 抗原递送系统行使向适宜的免疫 细胞递送抗原的功能。 此外， 佐剂可以增加应答的速度和持续期、 调节抗体亲和力、 特异性、
同型或亚类的分布、 刺激细胞介导的免疫、 促进粘膜免疫、 或在免疫学上未成熟个体或衰老 个体中增强免疫应答。佐剂可以影响自然、 体液或细胞介导的免疫应答， 或它们的组合。 发明内容
本发明的发明人发现， 一种特殊类别的合成糖脂， 当与疫苗联合使用时， 能够在向 受试者给药时激活体液免疫应答和细胞免疫应答。因此， 本发明提供了含有式 I 化合物的 组合物， 其中式 I 如下所示 ：
其中， R1 和 R2 独立地选自 -H 或 -OH ； x 为 18-26 的整数 ； n 为 10-15 的整数。还提 供了含有式 I 的化合物和抗原的组合物。
另一方面， 本发明提供了一种方法， 所述方法通过给药含有式 I 的化合物和抗原 的组合物， 增强了受试者对抗原的免疫应答。增强了的免疫应答可以是体液免疫应答、 CD4+T 细胞应答、 CD8+T 细胞应答或者抗原呈递细胞 (APCs) 的激活。受试者的免疫应答相 对于合适的对照是被增强的。
另一方面， 本发明的组合物是肌内注射的。 附图说明 图 1 为显示了静脉注射 (IV) 加入或不加卵白蛋白 (Ova) 的 PBS-96、 PBS-14 或 PBS-11 的小鼠血液中， 卵白蛋白特异 (Ova-specific) 的靶细胞的特异性裂解百分比的图 表。
图 2 为显示了静脉注射 (IV) 加入或不加卵白蛋白 (Ova) 的 αGalCer、 PBS-57、 PBS-96 或 PBS-14 的小鼠血液中， 卵白蛋白特异 (Ova-specific) 的靶细胞的特异性裂解百 分比的图表。
图 3 为显示了肌内注射 (IM) 加入或不加卵白蛋白 (Ova) 的 αGalCer、 PBS-57、 PBS-96 或 PBS-14 的小鼠血液中， 卵白蛋白特异 (Ova-specific) 的靶细胞的特异性裂解的 图表。
图 4A 为显示了接种不同浓度 PBS-57 后 24 小时内小鼠血清中， IFNγ 的积累的图 表； 图 4B 为显示了接种不同浓度 PBS-14 后 24 小时内小鼠血清中， IFNγ 的积累的图表 ； 图 4C 为显示了接种不同浓度 PBS-96 后 24 小时内小鼠血清中， IFNγ 的积累的图表 ； 图 4D 为 显示了接种不同浓度 αGalCer 后 24 小时内小鼠血清中， IFNγ 的积累的图表 ；
图 5 为比较了接种 100ng 的 PBS-57、 PBS-96、 PBS-14 或 PBS-11 后 24 小时内小鼠 血清中 IFNγ 的积累的图表 ；
图 6 为 显 示 了 静 脉 注 射 (IV) 加 入 或 不 加 卵 白 蛋 白 (Ova) 的 PBS-11、 PBS-57、 PBS-96 或 PBS-14 的小鼠血液中， 卵白蛋白特异 (Ova-specific) 的靶细胞的特异性裂解的 图表 ；
图 7 为 显 示 了 肌 内 注 射 (IM)100ng 加 入 或 不 加 卵 白 蛋 白 (Ova) 的 指 示 佐 剂 (indicated adjuvant) 的小鼠中， 卵白蛋白特异 (Ova-specific) 的靶细胞的特异性裂解 的图表 ；
图 8 为显示了肌内注射 (IM)10ng 加入或不加卵白蛋白 (Ova) 的指示佐剂的小鼠 中， 卵白蛋白特异 (Ova-specific) 的靶细胞的特异性裂解的图表 ；
图 9 为显示了肌内注射 (IM)1μg 加入或不加卵白蛋白 (Ova) 的指示佐剂的小鼠 中， 应答于 SIINFEKL 五聚物的 CD8+T 细胞的百分比的图表 ；
图 10 为显示了肌内注射 (IM)100ng 加入或不加卵白蛋白 (Ova) 的指示佐剂的小 鼠中， 应答于 SIINFEKL 五聚物的 CD8+T 细胞的百分比的图表 ；
图 11 为显示了肌内注射 (IM)100ng 加入或不加卵白蛋白 (Ova) 的指示佐剂的小 鼠血液中， IgG1 的效价 (titer) 的图表 ；
图 12 为显示了肌内注射 (IM)100ng 加入或不加卵白蛋白 (Ova) 的所指示佐剂的
小鼠血液中， IgG2a 的效价 (titer) 的图表 ；
图 13 描述了 PBS-14、 PBS-96、 PBS-11、 PBS-57 和 αGalCer 的结构式。 具体实施方式
在疫苗制备中， 佐剂通过多种方式增强抗原的免疫原性。有效的佐剂也能用于与 多种抗原联合， 来增强通过给药抗原引起的免疫应答。例如， 对于毒素， 需要良好的体液免 疫应答。对于细胞内细菌， 主要由细胞毒性的 T 细胞和 Th1 细胞介导的细胞介导应答， 是重 要的。对于病毒性感染， 体液免疫和细胞免疫都是控制感染的基础。佐剂不仅具有能增强 体液免疫应答的能力也具有能增强细胞介导的免疫应答的能力， 增加了发展为长效免疫的 可能性。
已经研究了脂类的佐剂特性。一些天然或合成的脂类分子由抗原呈递细胞 所 加 工， 并 被 CD1 分 子 呈 递 至 NKT 细 胞。 用 于 体 外 和 体 内 研 究 NKT 细 胞 激 活 的 原 型 化 合 物 是 KRN7000， 一 种 源 自 海 绵 (Agelas mauritianus) 的 α- 半 乳 糖 苷 神 经 酰 胺 (“αGalCer” )。 如 PCT 申 请 PCT/US07/66250 所 述， 在此通过参考将其公开的内容引 入， 新近鉴定了一些其它的化合物， 其中包括属于内源糖脂的异球三己糖苷神经酰胺 (isoglobotrihexosylceramide， “iGB3” ) 和修饰的 6“氨基 6” 脱氧半乳糖苷神经酰胺。这 些化合物在体外激活 NKT 细胞， 并上调细胞因子应答。但是， 在体内接种疫苗的背景下， 关 于这些化合物的脂质佐剂有效性尚不清楚。 本发明的发明人发现， 含有氨基基团和饱和脂肪酸链的式 I 的鞘糖脂， 出乎意料 地， 在体内具有刺激细胞介导免疫应答和体液免疫应答的能力。此外， 式 I 的化合物可以刺 激抗较弱的标称抗原 (weak nominal antigen) 的免疫应答来产生抗体， 并同时提供对表达 特异表面抗原的细胞的细胞介导的裂解。 已表明， 命名为 PBS-96 和 PBS-14 的两种式 I 的化 合物， 在体内刺激细胞介导的免疫应答和体液免疫应答。这些化合物也可以刺激抗较弱的 标称抗原 (weak nominal antigen) 的免疫应答来产生抗体， 并同时引起细胞介导的应答。 此外， 已发现， 这些化合物与其它鞘糖脂 ( 如 PBS-57 和 αGalCer) 相比， 在肌内注射时， 能 够刺激更强的应答或需要更低的剂量。
在一种实施方式中， 本发明提供了含有式 I 的化合物的组合物， 其中式 I 为 ：
其中， R1 和 R2 独立地选自 -H 或 -OH ； x 为 18-26 的整数 ； n 为 10-15 的整数。适宜 地， 式 I 的化合物在半乳糖或葡萄糖分子的 C6 位置上具有氨基基团， 并且在该化合物的神 经酰胺部分具有饱和的酰基链。该组合物可以进一步含有生理上可接受的载体。 “生理上 可接受” 的载体为适合于体内给药
( 如经口服、 经皮给药或注射给药 ) 或体外使用 ( 如细胞培养 ) 的任何载体。适用 于体内给药的生理上可接受的载体包括 ： 水、 缓冲液和葡萄糖溶液， 以及其他载体。除了所 述的生理上可接受的载体以外， 该组合物的其他成分可以包括 ： 赋形剂 ( 如稳定剂 )、 防腐 剂、 稀释剂、 乳化剂或润滑剂。合适的赋形剂包括， 但不限于 ： 吐温 20、 二甲基亚砜 (DMSO)、 蔗糖、 L- 组氨酸 (histadine)、 聚山梨醇酯 20 和血清。适宜地， 式 I 的化合物配置在脂质体 中。适宜地， 该脂质体为一种小型单层泡 (SUV)， 含有比例为 8 微摩尔 /2 微摩尔 /5 微摩尔 /1 毫克的磷脂酰胆碱 (PC)/ 磷脂酰甘油 (PG)/ 胆固醇。本领域的技术人员能够知道， 式I 的化合物可以制成多种剂型， 以用于受试者。
在另一种实施方式中， 本发明提供了通过给药含有抗原和式 I 的化合物的组合物 以在受试者中增强对抗原的免疫应答的方法。 此处所指的受试者为哺乳动物， 如小鼠， 或更 适合为人。 “增强免疫应答” 指的是 ： 相对于合适的对照， 该化合物增强受试者对抗原的体液 免疫应答和 / 或细胞调节的免疫应答的能力。增加的抗原呈递细胞的激活也包括在对受试 者增强的免疫应答中。为确定免疫应答相对于对照是否增强， 可以将接种抗原和该化合物 的受试者的样本的信号和只接种抗原的受试者的样本的信号， 进行定量比较。对抗原的免 疫应答可以用多种方法检测， 所述检测方法对本领域技术人员是显而易见的。 举例说， 免疫 应答可用细胞毒特异的细胞裂解分析、 五聚体结合分析、 或酶联免疫应答 (ELISA) 分析的 检测方法来检测， 所述检测方法是本领域技术人员所公知的。
在具体实施例中， 相对于合适的对照， 免疫应答增强至少 25 ％、 至少 30 ％、 至少 50 ％、 至少 60 ％、 至少 65 ％、 至少 70 ％、 至少 75 ％、 至少 80 ％、 至少 85 ％、 至少 90 ％、 至少 95 ％、 至少 100 ％、 至少 150 ％、 至少 200 ％、 至少 400 ％、 至少 500 ％、 至少 750 ％、 或至少 1000％。合适的对照为给药抗原但不使用本发明所述组合物的受试者。可以按以下公式计 算百分率的增强 ：
[( 用含有式 I 化合物的组合物处理后受试者的免疫应答值 )-( 对照的免疫应答 值 )/( 用含有式 I 化合物的组合物处理后受试者的免疫应答值 )]×100。
此处所指的 “给药” 、 “共给药” 和 “共给予” 指佐剂和抗原联用， 也就是， 在时间上 同时， 或循序 ( 也就是， 在给药佐剂后给药抗原， 或在给药抗原后给药佐剂 )。 在给药佐剂或 抗原后， 另一组分可大致上在其后立即给药， 或者在其后一段有效时期后给药 ； 所述有效时 期为实现组分给药的最大收益而给定的时间量。 作为另一种选择， 佐剂和抗原可以共制剂。
所述的抗原可以是 ： 多肽、 多核苷酸、 或碳水化合物部分、 或它们的组合， 如糖蛋 白。所述抗原适宜地来自传染原 ( 如病原微生物 )、 肿瘤或内源分子 ( 如 “自身” 分子 )， 或 者， 以研究为目的的， 标称抗原 (nominal antigen)， 如卵白蛋白 ( 此处所指的 “OVA” )。适 宜地， 所述抗原包含在疫苗中。 疫苗组合物适宜地制成包含式 I 的化合物的形式。 “疫苗” 指 一种组合物， 在给予受试者时， 诱导细胞免疫应答或体液免疫应答。 本发明的药物组合物适 宜地含有式 I 的化合物和疫苗。在一些具体实施方式中， 本发明的药物组合物含有 PBS-96 和抗原， 或 PBS-14 和抗原。PBS-96 和 PBS-14 的结构如图 13 所示。PBS-96 和 PBS-14 在体 内和体外激活 NKT 细胞。PBS-96 和 PBS-14 都在半乳糖的 C6 位置上具有氨基基团， 且在该 化合物的神经酰胺部分具有饱和的酰基链。在体内， PBS-96 和 PBS-14 增强 CD8+T 细胞对 抗原的应答， 并且 PBS-96 和 PBS-14 介导 IFN-γ 的释放。此外， 在低浓度使用时， 以及肌内 注射时， PBS-96 和 PBS-14 意想不到地优于其他鞘糖酯。 含有式 I 化合物的组合物可用多种本领域技术人员公知的制备方法和非活性成 分来配置 (Remington 的药学科学， Mack 出版公司， 2000， 在此合并为参考文献 )。本发明的 组合物也可以含有合适的抗原递送系统， 以将抗原靶向至免疫细胞。抗原递送系统为本领 域公知， 包括但不限于 ： 修饰的安卡拉病毒 (MVA)、 腺病毒、 慢病毒 (lentivirus)、 百日咳或 志贺毒素的易位亚单位、 或封有抗原的脂质体。在疫苗组合物中， 式 I 的化合物的有效剂量 可以由本领域技术人员决定， 虽然有效剂量可以典型地为每千克体重约 1000 微克或略少， 但典型的范围可以是每千克体重约 1 纳克到约 10000 微克。在一些具体实施方式中， 有效 剂量的范围是每千克体重约 10 纳克到约 1000 微克。在另一实施方式中， 有效剂量的范围 是每千克体重约 100 纳克到约 500 微克。在另一实施方式中， 有效剂量的范围是每千克体 重约 1 微克到约 250 微克。为了研究目的， 根据给药的途径， 对小鼠的剂量是每 100 微升剂 量 1 纳克到 1 微克式 I 的组合物。例如， 约 100 纳克的剂量适合于小鼠静脉注射， 小至 10 纳克的剂量也表明在肌内注射下有效。含有式 I 的化合物的组合物可以单次剂量来给药， 或者分为数周或数月的多次剂量。
在组合物中可以含有一种或多种抗原， 或者单独地制备。此处所指的 “抗原” 指当 给药于受试者时刺激免疫应答的分子。 容易得到， 抗原的剂量依赖于具体的抗原、 受试者的 年龄和免疫状态、 以及其它可以由本领域技术人员决定的相关因素。
整 体 微 生 物 或 微 生 物 的 部 分 ( 如 膜 血 影 (menbrane ghosts)、 天然的膜制品 (crude membrane preparation)、 裂解液或其它微生物制品 ) 可以用做抗原。适宜地， 抗原 来自弱化的或灭活的感染原。抗原可来自的感染原包括但不限于 ： 病原体或微生物， 如细 菌、 寄生虫和病毒。在一些环境中， 合适的抗原取自或来自与人类疾病有关的病毒性病原 体包括但不限于 ： HIV//AIDS( 逆转录病毒科 Retroviridae， 如， gp120 分子之于 HIV-1 和 HIV-2 种群、 HTLV-I， HTLV-II)、 流感病毒 ( 正粘病毒科 Orthomyxoviridae， 如 A 型、 B 型和 C
型 )、 疱疹 ( 如， 单纯性疱疹病毒， HSV-1 和 HSV-2 糖蛋白 gB、 gD 和 gH)、 轮状病毒感染 ( 呼肠 病毒科 Reoviridae)、 呼吸感染 ( 副流感病毒和呼吸道合胞病毒 )、 脊髓灰质炎 ( 小核糖核 酸病毒科 Picornaviridae， 如脊髓灰质炎病毒、 鼻病毒 )、 麻疹和流行性腮腺炎 ( 副黏液病 毒科 Paramyxoviridae)、 风疹 ( 披膜病毒科 Togaviridae， 如风疹病毒 )， 肝炎 ( 如肝炎病毒 A、 B、 C、 D、 E 和 / 或 G)、 巨细胞病毒 ( 如 gB 和 gH)、 肠胃炎 ( 杯状病毒科 Caliciviridae)、 黄热和西尼罗热 ( 黄病毒科 Flaviviridae)、 狂犬病 ( 弹状病毒科 Rhabdoviridae)、 朝鲜 出血热 ( 布尼雅病毒科 Bunyaviridae)、 委内瑞拉出血热 ( 沙粒病毒科 Arenaviridae)、 疣 ( 乳头瘤病毒 )、 猿猴免疫缺损病毒、 脑炎病毒、 水痘带状疱状病毒、 爱泼斯坦 - 巴尔二氐 (Epstein-Barr) 病毒、 和其它病毒科， 包括冠状病毒科 (Coronaviridae)、 双核糖核酸病毒 科 (Birnaviridae) 和线状病毒 (Filoviridae)。
合适的细菌抗原和寄生虫抗原也能取自或来自已知的致病体， 并可以用在抗疾病 疫苗组合物中， 所述疾病包括但不限于 ： 白喉、 百日咳、 破伤风、 结核病、 细菌性或真菌性肺 炎、 中耳炎、 淋病、 霍乱、 伤寒、 脑膜炎、 单核细胞增多症、 瘟疫、 志贺氏菌病 (shigellosis) 或沙门氏菌病、 军团菌病 (Legionnaires’ disease)、 莱姆病 (Lyme disease)、 麻风病、 疟 疾、 十二指肠病、 盘尾丝虫病、 血吸虫病、 锥体虫病、 利什曼病 (leishmaniasis)、 贾第虫病 (giardiases)、 阿米巴病 (amoebiasis)、 丝虫病 (filariasis)、 包柔氏螺旋体 (Borrelia) 和旋毛虫病。抗原还能取自或来自其它非常规的病原体， 比如 ： 库鲁病 (kuru)、 克劳伊登病 (CJD)、 痒病 (scrapie)、 貂传染性脑病 (transmissible mink encephalopathy) 和慢性消耗 病 (chronic wasting diseases) 的病原体 ； 或取自或来自传染性蛋白颗粒， 如与疯牛病相 关的朊病毒。
更加详细地， 可用于抗原的特殊病原体包括 ： 结核分枝杆菌 (M.tuberculosis)、 衣 原 体 (Chlamydia)、 淋 病 奈 瑟 菌 (N.gonorrhoeae)， 志 贺 氏 杆 菌 (Shigella)、 沙门氏 菌 (Salmonella)、 霍 乱 弧 菌 (Vibrio cholera)， 苍 白 密 螺 旋 体 (Treponema pallidum)、 假 单 胞 菌 (Pseudomonas)、 百 日 咳 杆 菌 (Bordetellapertussis)、 布 鲁 氏 菌 (Brucella)、 土拉弗朗西斯菌 (Francisellatularensis)、 幽门螺旋杆菌 (Helicobacter pylori)、 钩 端 螺 旋 体 (Leptospirainterrogans)、 嗜 肺 军 团 菌 (Legionellapneumophila)、 鼠疫菌 (Yersinia pestis)、 链球菌 (Streptococcus(A 型和 B 型 ))、 肺炎双球菌、 脑膜炎球菌、 流感嗜血杆菌 (Haemophilus influenza， b 型 )、 弓形虫 (Toxoplasma gondii)、 卡他莫 拉菌 (Moraxella catarrhalis)、 杜诺凡病、 以及放线菌 ； 真菌病原体， 包括念珠菌和曲霉 病； 寄生病原体， 包括绦虫 (Taenia)、 吸虫 (flukes)、 蛔虫、 阿米巴病 (amebiasis)、 贾第 虫 病 (giardiasis)、 隐 孢 子 虫 (Cryptosporidium)、 血 吸 虫 (Schistosoma)、 肺卡氏肺囊 虫 (Pneumocystis carinii)、 滴虫病 (trichomoniasis) 和旋毛虫病 (trichinosis)。本 发明还可以用来对多种动物疾病提供合适的免疫应答， 所述疾病如口蹄疫， 冠状病毒， 多 杀 性 巴 氏 杆 菌 (Pasteurella multocida)、 螺 杆 菌 (Helicobacter)、 普通圆形线虫 (Strongylusvulgaris)、 放线杆菌胸膜肺炎 (Actinobacillus pleuropneumonia)、 牛病毒 性腹泻病毒 (BVDV)， 克雷伯肺炎链球菌 (Klebsiellapneumoniae)、 大肠杆菌 (E.coli)、 百 日咳杆菌 (Bordetellapertussis)、 副百日咳 (parapertussis) 和支气管脓毒博德氏菌 (brochiseptica)。
在其他实施方式中， 包含在可以用于本发明的组合物中的抗原为肿瘤来源的抗原或自体或异体的肿瘤全细胞。适宜地， 肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原 (TSA) 或肿瘤相关性抗 原 (TAA)。若干种肿瘤抗原及其表达模式为本领域公知， 并能基于肿瘤治疗类型进行选择。 非限制性的肿瘤抗原的实例包括 ： cdk4( 黑色素瘤 )、 β- 连环蛋白 ( 黑色素瘤 )、 半胱天冬 酶 -8( 鳞状细胞癌 )、 MAGE-1 和 MAGE-3( 黑色素瘤、 乳腺癌、 胶质瘤 )、 酪氨酸酶 ( 黑色素 瘤 )、 独特型表面免疫球蛋白 ( 如 BCR)( 淋巴癌 )、 Her-2/neu( 乳腺癌、 卵巢癌 )、 MUC-1( 乳 腺癌、 胰腺癌 ) 和 HPVE6 和 E7( 子宫颈癌 )。其他合适的肿瘤抗原包括前列腺特异性抗原 (PSA)、 唾液酸 Tn(STn)、 热激蛋白和相关的肿瘤肽 ( 如 gp96)、 神经节苷脂分子 ( 如 GM2、 GD2 和 GD3)、 癌胚抗原 (CEA) 和 MART-1。
如本领域技术人员所了解的， 药物组合物适宜地制备成适用于给予途径的形式。 合适的给予途径的实例包括 ： 注射， 包括静脉注射、 皮内注射、 皮下注射、 肌内注射 ； 口服 ( 比如吸入 ) ； 肠内给予 ； 皮肤 ( 局部 ) 给予 ； 经粘膜给予和经直肠给予。如实施例中所示， 化合物 I 在肌内注射后显示， 提供了意料之外免疫应答的稳定增强。
本发明的另一种实施方式是刺激对抗原的体液免疫应答的方法。如上所述， 该方 法包括向受试者共给予式 I 的化合物和抗原。此处所指的 “体液免疫应答” 指通过 B 细胞 产生抗体， 以及相伴的其他附属过程， 包括但不限于 ： 如 Th2 的激活和细胞因子的产生、 生 发中心 (germinal center) 的形成和同型转换、 亲和成熟的产生 (affinity maturation production) 和记忆细胞的产生。 为了确定体液免疫应答是否激活， 可以将接种抗原和该化 合物的受试者的样本的信号和只接种抗原的受试者的样本的信号， 进行定量比较。体液免 疫应答可以通过检测抗体效果功能来衡量， 所述功能包括 ： 病原体或毒素的中和作用、 经典 的互补激活作用、 以及吞噬作用和病原体消除的亲菌素 (opsonin) 促进。由共给予式 I 化 合物和抗原诱发产生的抗体可以是任何类型， 比如 IgM、 IgA、 或 IgG( 如 IgG1 或 IgG2)。体 液免疫应答可以通过本领域公知的任何定量方法进行化验， 比如 ELISA、 单放射性免疫扩散 分析 (SRID)、 酶免疫分析 (EIA) 或血凝抑制试验 (HAI)。
本发明的另一种实施方式是激活受试者体内 CD4+T 细胞的方法。如本领域所公 知， CD4+T 细胞， 或 “T 辅助细胞” ， 是识别由抗原呈递细胞表面上的 II 型主要组织相容性标 记 (MHC) 呈递的抗原的细胞， 该细胞分泌淋巴因子以刺激细胞介导的和抗体介导的支路免 疫系统。CD4+T 细胞的激活促进了淋巴因子的分泌、 免疫球蛋白的同型转换、 抗体应答的亲 和成熟、 巨噬细胞的激活和天然杀伤 (NK) 细胞和细胞毒性 T(CTL) 细胞的增强活性。 淋巴因 子是由淋巴细胞分泌的蛋白， 可以影响他们自己的活性和 / 或其它细胞的活性。淋巴因子 包括但不限于 ： 白细胞介素和细胞因子， 如 IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-I0、 IL-12 或 IFNγ。 为了确定 CD4+T 细胞是否激活， 可以将接种抗原和该化合物的受试者的样本的信号和只接 种抗原的受试者的样本的信号， 进行定量比较。CD4+T 细胞激活的分析方法是本领域公知 的。
本发明的另一种实施方式是激活受试者体内 CD8+T 细胞的方法。CD8+T 细胞能够 识别由 MHC I 型分子呈递的抗原 ( 呈递在所有有核细胞表面上 )。MHC I 型多肽复合体的 形成， 导致裂解颗粒向靶细胞的传递， 引起靶细胞的裂解。CD8+T 细胞激活的所用的分析方 法为本领域公知， 包括但不限于 ： 酶联免疫斑点试验 (ELISPOT)、 ELISA、 分析四聚体 / 五聚 体结合的流式细胞术 (FACS)、 以及细胞毒性试验。可供替代选择地， 小鼠模型可以通过使 用荧光试验来检测细胞介导的细胞毒性， 以用于监测 CD8+T 细胞的激活， 如 Hermans 等的描述， 2004， 免疫学方法杂志， 285 ： 25-40， 在此整体引入作为参考 ) 所述。在该分析中， 小鼠 在第 0 天分别用加入测试化合物和未加测试化合物的疫苗进行免疫。同源靶细胞通过从第 二组小鼠中分离脾细胞得到， 并用两种独立的细胞标记荧光染料或高低的浓度单一荧光染 料， 标记所述细胞， 比如 CFSE 或 CMTMR。一组靶细胞加载抗体特异肽段， 同时第二组靶细胞 加载无关肽段。将两种靶细胞群等量混合后， 注射到免疫过的小鼠中。24 小时后， 处死小 鼠， 取得脾细胞和血液样品。 每组靶细胞的水平用流式细胞仪分析。 CD8+T 细胞的激活是通 过对接种抗原和测试化合物的样本中的靶细胞数目和只接种抗原的样本中的靶细胞数目， 进行定量比较而确定的。
参考以下非限制性的实施例和附图， 对本发明的其他方面进行详细的说明。 实施例 实施例 1 ： 在小鼠模型中检测静脉注射 PBS-96、 PBS-14 和 PBS-11 对 CD8+T 细胞应 答的增强作用
用小鼠模型来检测通过测试佐剂化合物和抗体经静脉注射引起的体内特异性细 胞毒性 T 细胞应答 (CD8+)。8 组 ( 每组 3 只 ) 小鼠在第 0 天用加和不加佐剂的抗原 ( 卵白 蛋白， Ova， 级别 VII， 西格玛， 圣路易斯， MO)、 单独佐剂、 或单独载体 ( 对照 )， 在 100 微升总 体积的 PBS 中， 经静脉 ( 尾侧静脉 ) 免疫。测试佐剂化合物为加或不加 50 微克的卵白蛋白 (OVA) 抗原的 1 微克 PBS-96、 1 微克 PBS-14、 1 微克 PBS-11。
同系基因型的靶细胞通过以下方式制备 ： 从第二组 C57/B1/6J CD45.2 雌性小鼠 中分离脾细胞， 并用低浓度 (0.6 微摩尔， 8 分钟， 37℃ ) 或高浓度 (6 微摩尔， 8 分钟， 37℃ ) 的 CFSE( 荧光染料 ) 标记分离的脾细胞。用高浓度 CFSE 标记的组， 用 5 微摩尔 SIINFEKL 肽段 ( 卵白蛋白特异肽段， NeoMPS， 有限公司， 圣地亚哥， CA) 预加载 (60 分钟， 37℃ )。用低 浓度 CFSE 标记的组， 用 5 微升 LCMV gp33-41 肽段 ( 卵白蛋白非特异肽段， NeoMPS， 有限公 司， 圣地亚哥， CA) 预加载 (60 分钟， 37℃ )。靶细胞以低浓度 CFSE 加载细胞与高浓度 CFSE 加载细胞之间的比例为 47/53 的终比例混合 ( 每 100 微升共 2×107 个细胞 )， 在第 10 天 时静脉注射到每只免疫过的小鼠体中。第 11 天时处死小鼠， 收集脾细胞和眼静脉窦血液样 本。通过流式细胞仪分析， 计算相对于对照组的肽段脉冲的靶细胞的平均存活率 ( 高浓度 CFSE 标记 )。细胞毒性活性用特异裂解百分率表示 (100 减去肽段脉冲靶细胞的平均存活 百分率 )。图 1 描述了免疫小鼠血液中靶细胞的特异裂解百分比。只有给药 Ova 和 PBS-96 或 PBS-14 导致了 Ova 特异靶细胞的细胞毒性裂解。相反， 给药 PBS-11 没有导致细胞的特 异裂解。
实施例 2 ： 在 小 鼠 模 型 中 比 较 静 脉 注 射 和 肌 内 注 射 PBS-96、 PBS-14、 PBS-11、 PBS-57 和 αGalCer 对 CD8+T 细胞应答的增强作用
为了确定测试佐剂化合物与抗原结合给药时， 介导特异性体内细胞毒 T 细胞应答 (CD8+) 的能力， 测试佐剂化合物用实施例 1 中所述的方法进一步分析。在第 0 天分别静脉 免疫 ( 第 1-9 组， 每组 3 只 ) 或肌内免疫 ( 第 10-18 组， 每组 3 只 ) 的 18 组小鼠为 ：
组1： 400 微克 Ova 溶于 100 微升 PBS 中， 静脉注射
组2： 1 微克 αGalCer 溶于 100 微升 PBS 中， 静脉注射
组3： 1 微克 PBS-57 溶于 100 微升 PBS 中， 静脉注射
组4： 1 微克 PBS-14 溶于 100 微升 PBS 中静脉注射 组5： 1 微克 PBS-96 溶于 100 微升 PBS 中静脉注射 组6： 400 微克 Ova+1 微克 αGalCer 溶于 100 微升 PBS 中， 静脉注射 组7： 400 微克 Ova+1 微克 PBS-57 溶于 100 微升 PBS 中， 静脉注射 组8： 400 微克 Ova+1 微克 PBS-14 溶于 100 微升 PBS 中， 静脉注射 组9： 400 微克 Ova+1 微克 PBS-96 溶于 100 微升 PBS 中， 静脉注射 组 10 ： 400 微克 Ova 溶于 50 微升 PBS 中， 肌内注射 组 11 ： 1 微克 αGalCer 溶于 50 微升 PBS 中， 肌内注射 组 12 ： 1 微克 PBS-57 溶于 50 微升 PBS 中， 肌内注射 组 13 ： 1 微克 PBS-14 溶于 50 微升 PBS 中， 肌内注射 组 14 ： 1 微克 PBS-96 溶于 50 微升 PBS 中， 肌内注射 组 15 ： 400 微克 Ova+1 微克 αGalCer 溶于 50 微升 PBS 中， 肌内注射 组 16 ： 400 微克 Ova+1 微克 PBS-57 溶于 50 微升 PBS 中， 肌内注射 组 17 ： 400 微克 Ova+1 微克 PBS-14 溶于 50 微升 PBS 中， 肌内注射 组 18 ： 400 微克 Ova+1 微克 PBS-96 溶于 50 微升 PBS 中， 肌内注射靶细胞以低浓度 CFSE 加载的细胞与高浓度 CFSE 加载的细胞之间的比例为 50/50 的终比例混合 ( 各浓度 1×107 个细胞， 每 100 微升共 2×107 个细胞 )， 在第 10 天时静脉注 射到每只免疫过的小鼠体中。第 11 天时处死小鼠， 收集脾细胞和眼静脉窦血液样本。OVA 特异性靶细胞的细胞裂解， 用外周血细胞的流式细胞术来检测。特异性细胞裂解按如上所 述的方法确定。
图 2 展示了静脉注射小鼠的结果。单独用 Ova 处理的小鼠的平均的 Ova 特异的细 胞毒性应答为 11.8±14.4％， Ova 和 αGalCer 为 79.9±.8％， 在用 Ova 和 PBS-57 处理的小 鼠中为 88.1±6.2％， 在用 Ova 和 PBS-14 处理的小鼠中为 83.3±6.1％， 在用 Ova 和 PBS-96 处理的小鼠中为 89.2±10.3％。结果表明 PBS-14 和 PBS-96 与 PBS-57 在介导体内 OVA 特 异的细胞毒性应答中效果一致。
图 3 展示了肌内注射小鼠的结果。单独用 Ova 处理的小鼠的平均的 Ova 特异的 细胞毒性应答为 1.60±14.33％， 在用 Ova 和 αGalCer 处理的小鼠中为 -5.85±11.01％， 在用 Ova 和 PBS-57 处理的小鼠中为 56.11±13.34％， 在用 Ova 和 PBS-14 处理的小鼠中为 52.07±29.56 ％， 在用 Ova 和 PBS-96 处理的小鼠中为 50.29±42.6 ％。结果证明 PBS-14 和 PBS-96 都与 PBS-57 在静脉注射和肌内注射中引起免疫应答中效果一致， 并且 PBS-14、 PBS-96 和 PBS-57 在肌内注射后比 αGalCer 有效得多。
实施例 3 ： 通过佐剂检测化合物在体内刺激 IFNγ
为了测试佐剂检测化合物 (adjuvant test conpounds) 在体内刺激细胞因子释 放的能力， C57BL/6 小鼠通过静脉给予不同浓度的化合物， 24 小时后用 ELISA 检测血清中 IFNγ 的生产量。每组 3 只小鼠， 按如下所述在第 0 天静脉 ( 尾静脉 ) 接种 ：
组1： 单独的 100 微升 PBS
组2： 1 微克 αGalCer 溶于 100 微升 PBS 中
组3： 100 纳克 αGalCer 溶于 100 微升 PBS 中
组4： 1 纳克 αGalCer 溶于 100 微升 PBS 中组5： 0.1 纳克 αGalCer 溶于 100 微升 PBS 中
组6： 100 纳克 αGalCer+400 微克 Ova 溶于 100 微升 PBS 中
组7： 1 微克 PBS-57 溶于 100 微升 PBS 中
组8： 100 纳克 PBS-57 溶于 100 微升 PBS 中
组9： 1 纳克 PBS-57 溶于 100 微升 PBS 中
组 10 ： 0.1 纳克 PBS-57 溶于 100 微升 PBS 中
组 11 ： 100 内克 PBS-57+400 微克 Ova 溶于 100 微升 PBS 中
组 12 ： 1 微克 PBS-14 溶于 100 微升 PBS 中
组 13 ： 100 纳克 PBS-14 溶于 100 微升 PBS 中
组 14 ： 1 纳克 PBS-14 溶于 100 微升 PBS 中
组 15 ： 0.1 纳克 PBS-14 溶于 100 微升 PBS 中
组 16 ： 100 内克 PBS-14 和 400 微克 Ova 溶于 100 微升 PBS 中
组 17 ： 1 微克 PBS-96 溶于 100 微升 PBS 中
组 18 ： 100 内克 PBS-96 溶于 100 微升 PBS 中
组 19 ： 1 纳克 PBS-96 溶于 100 微升 PBS 中
组 20 ： 0.1 纳克 PBS-96 溶于 100 微升 PBS 中
组 21 ： 100 纳克 PBS-96 和 400 微克 Ova 溶于 100 微升 PBS 中。
接 种 24 小 时 后， 收 集 小 鼠 血 液 样 品， IFNγ 水 平 用 ELISA 试 剂 盒 来 检 测。 使 用 了 两 个 ELISA 试 剂 盒， Quantikine 小 鼠 IFNγ(RD 系 统 ) 用 于 检 测 所 有 的 组， 而 ELISAmIFNγ(Diaclone) 用于检测组 1、 2、 3、 6、 7、 8、 11、 12、 13、 16、 17、 18 和 21。所有的血清 在用于 ELISA 前按如下所述进行稀释 ：
组1： 1/1 组2： 1/50 组3： 1/50
组4： 1/20 组5： 1/10 组6： 1/50
组7： 1/50 组8： 1/50 组9： 1/20
组 10 ： 1/10 组 11 ： 1/50 组 12 ： 1/50
组 13 ： 1/50 组 14 ： 1/20 组 15 ： 1/10
组 16 ： 1/50 组 17 ： 1/50 组 18 ： 1/50
组 19 ： 1/20 组 20 ： 1/10 组 21 ： 1/50
结果以血清中 IFNγ 浓度 ( 皮克 / 毫升 ) 表示， 并考虑到稀释比例。图 4 描述了 用 RD 系统的 Quantikine 小鼠 IFNγ 试剂盒得到的结果。图 4A 描述了接种 PBS-57 小鼠血 清中， IFNγ 水平的结果 ； 图 4B 描述了接种 PBS-14 小鼠血清中， IFNγ 水平的结果 ； 图 4C 描述了接种 PBS-96 小鼠血清中， IFNγ 水平的结果 ； 图 4D 描述了接种 αGalCer 小鼠血清 中， IFNγ 水平的结果。 在 0.1 纳克处， 所有的佐剂候选物都诱导细胞因子的释放， 但是接种 αGalCer 的小鼠产生的 IFNγ 是接种 PBS-57、 PBS-14 或 PBS-96 的三分之一到四分之一 ( 分 别为 1540.57±397.53 皮克 / 毫升， 4398.05±880.86 皮克 / 毫升， 6669.31±1231.82 皮克 / 毫升， 5823.33±720.69 皮克 / 毫升 )。在使用 1 纳克测试佐剂化合物时， PBS-57、 PBS-14 或 PBS-96( 平均值分别是 11425.98±833.04 皮克 / 毫升， 7481.15±3454.03 皮克 / 毫升， 6271.95±3737.53 皮克 / 毫升 ) 表现出比 αGalCer 更强的应答 ( 平均值 3802.99±586.02 皮克 / 毫升 )。在使用 100 纳克测试佐剂化合物时， PBS-57、 PBS-14 和 PBS-96 产生了比αGalCer 高 的 IFNγ 水 平 ( 平 均 值 分 别 是 PBS-57 的 21432.76±4312.76 皮 克 / 毫 升， PBS-96 的 19679.89±1443.48 皮 克 / 毫 升， PBS-14 的 19582.18±3421.20 皮 克 / 毫 升， αGalCer 的 7714.37±3529.07 皮克 / 毫升 )。在 1 使用微克测试化合物时， 与 100 纳克的 剂量 (21432.76±4312.76 皮克 / 毫升 ) 相比， PBS-57 表现出较低的应答 (3353.45±867.57 皮克 / 毫升 )， 同时， 与 100 纳克剂量相比 ( 应答分别是 19582.18±3421.20 皮克 / 毫升和 19679.89±1443.48 皮克 / 毫升 )， PBS-14 或 PBS-96 仍然表现出较低但是稳定的应答 ( 分 别是 16392.53±5957.70 皮克 / 毫升和 17720.11±2869.97 皮克 / 毫升 )。
另外一组小鼠用于通过上述方法比较佐剂化合物在体内刺激细胞因子释放的能 力。5 组 C57BL/6 小鼠静脉给予在 100 微升 PBS 中的 100 纳克的 PBS-57、 PBS-14、 PBS-96、 或 PBS-11， 或者单独给予 100 微升 PBS。24 小时后用 ELISA 测定小鼠血清中 IFNγ 的产生 量。图 5 描述了接种 100ng 的 PBS-11、 PBS-96、 PBS-14 和 PBS-57 的小鼠的结果。
总之， 使用 PBS-14 和 PBS-96 具有与使用 PBS-57 相似的 IFNγ 应答， 并且与使用 PBS-11 相比， 具有意想不到的较强的应答。
实施例 4 ： PBS-96、 PBS-14、 PBS-11 和 PBS-57 对 CD8+T 细胞应答增强的比较
为了确定测试佐剂化合物结合抗原诱导体内特异细胞毒性 T 细胞应答 (CD8+) 的 能力， 该测试化合物按实施例 1 中的方法进行测试。9 组小鼠按如下所述在第 0 天经静脉 (IV) 免疫 ：
组1： 400 微克 Ova 溶于 100 微升 PBS 中 ；
组2： 1 微克 PBS-11 溶于 100 微升 PBS 中 ；
组3： 1 微克新式 PBS-57 溶于 100 微升 PBS 中 ；
组4： 1 微克 PBS-14 溶于 100 微升 PBS 中 ；
组5： 1 微克 PBS-96 溶于 100 微升 PBS 中 ；
组6： 400 微克 Ova+1 微克 PBS-11 溶于 100 微升 PBS 中 ；
组7： 400 微克 Ova+1 微克新式 PBS-57 溶于 100 微升 PBS 中 ；
组8： 400 微克 Ova+1 微克 PBS-14 溶于 100 微升 PBS 中 ；
组9： 400 微克 Ova+1 微克 PBS-96 溶于 100 微升 PBS 中。
靶细胞， 以低浓度 CFSE 加载的细胞 / 高浓度 CFSE 加载的细胞为 50/50 的终比例 混合 ( 各浓度 1×107 细胞， 每 100 微升共 2×107 细胞 )， 在第 10 天时静脉注射到每只免疫 过的小鼠体中。第 11 天时处死小鼠， 收集脾细胞和眼静脉窦血液样本。OVA 特异靶细胞的 细胞裂解， 通过外周血细胞的流式细胞术来检测。特异细胞裂解按如上所述的方法确定。 结果见图 6。单独用 Ova 处理的小鼠的平均 Ova 特异细胞裂解为 11.8±14.4％， 用 Ova 和 PBS-11 处理的小鼠为 32.3±2.5％， 用 Ova 和 PBS-57 处理的小鼠为 88.1±6.2％， 用 Ova 和 PBS-14 处理的小鼠为 83.3±6.1％， 用 Ova 和 PBS-96 处理的小鼠为 89.2±10.3％。这些结 果证明在与抗原结合经静脉给予后， PBS-14 和 PBS-96 介导的体内细胞毒性应答与 PBS-57 一样有效。
实施例 5 ： 通过减少肌内注射佐剂数量比较 CD8+T 细胞应答的增强
为了确定测试佐剂化合物增强免疫应答的相对能力， 进行了与实施例 2 相似的实 验。在本实验中， 小鼠用减少量的佐剂 ( 分别是 10 纳克和 100 纳克 ) 与 50 微克 OVA 抗原， 在第 0 天， 按如下安排进行静脉注射。实验 A ： 组1： 50 微克 Ova 溶于 100 微升 PBS 中 组2： 100 纳克 αGalCer ； 组3： 100 纳克 PBS-11 ； 组4： 100 纳克 PBS-14 ； 组5： 100 纳克 PBS-57 ； 组6： 100 纳克 PBS-96 ； 组7： 50 微克 Ova+100 纳克 αGalCer ； 组8： 50 微克 Ova+100 纳克 PBS-11 ； 组9： 50 微克 Ova+100 纳克 PBS-14 ； 组 10 ： 50 微克 Ova+100 纳克 PBS-57 ； 组 11 ： 50 微克 Ova+100 纳克 PBS-96 ； 实验 B ： 组1： 50 微克 Ova 溶于 100 微升 PBS 中 组2： 10 纳克 αGalCer ；组3： 10 纳克 PBS-11 ；
组4： 10 纳克 PBS-14 ；
组5： 10 纳克 PBS-57 ；
组6： 10 纳克 PBS-96 ；
组7： 50 微克 Ova+10 纳克 αGalCer ；
组8： 50 微克 Ova+10 纳克 PBS-11 ；
组9： 50 微克 Ova+10 纳克 PBS-14 ；
组 10 ： 50 微克 Ova+10 纳克 PBS-57 ；
组 11 ： 50 微克 Ova+10 纳克 PBS-96 ；
靶细胞在实验的第 10 天给药， 第 11 天收集血液。 图 7 表示用 100 微克每种佐剂实 验 A 的结果。图 8 表示实验 B 的结果。图 7 和图 8 证明， 以低剂量以肌内给药时， 与其它佐 剂相比， PBS-14 和 PBS-96 在增强对抗原的 CD8+T 细胞应答上具有意料不到的好效果。 事实 上， 在肌内给药 OVA 和只给药 10 纳克的 PBS-14 或 PBS-96 后， 通过 CD8+T 细胞的靶细胞的 特异裂解百分率仍然高于 60％， 同时， 给药 OVA 和相同数量的 PBS-57、 PBS-11 或 αGalCer 后， 靶细胞的特异裂解百分率与对照无差别。
实施例 6 ： 肌内注射后通过减少佐剂的量比较 CD8+T 细胞应答的增强
为了验证用如上实施例中描述的体内细胞毒性试验得到的结果， 进行了相似的实 验， 通过用五聚体试验， 检测 OVA 特异的 CD8+T 细胞的百分比来确定 CD8+T 细胞的活化。简 要说， 小鼠用所述 OVA 和测试佐剂化合物， 分别以 1 微克或 100 纳克， 在第 0 天进行肌内注 射。
实验 A ：
组1： 100 微升 PBS
组2： 50 微克 Ova 溶于 100 微升 PBS 中
组3： 50 微克 Ova+1 微克 αGalCer组4： 50 微克 Ova+1 微克 PBS-11
组5： 50 微克 Ova+1 微克 PBS-14
组6： 50 微克 Ova+1 微克 PBS-57
组7： 50 微克 Ova+1 微克 PBS-96
实验 B ：
组1： 100 微升 PBS
组2： 50 微克 Ova 溶于 100 微升 PBS 中
组3： 50 微克 Ova+100 纳克 αGalCer
组4： 50 微克 Ova+100 纳克 PBS-11
组5： 50 微克 Ova+100 纳克 PBS-14
组6： 50 微克 Ova+100 纳克 PBS-57
组7： 50 微克 Ova+100 纳克 PBS-96
第二次注射在第 14 天对小鼠实施， 血液在第 21 天收集。收集淋巴细胞并在 FACS 上用 H-2Kb SIINFEKL 五聚体和 CD8 抗体分析， 以检测对 OVA 发生应答的 CD8+T 细胞。图 9 表示实验 A 的结果， 图 10 表示实验 B 的结果。图 9 证明了在接种后， 给药 1 微克 PBS-14、 PBS-96 和 PBS-57 增强了 OVA 特异的 CD8+T 细胞的百分率， 而 PBS-11 和 αGalCer 并不同样 有效。图 10 证明了在 100 纳克的低浓度下， PBS14 和 PBS-96 在增强 CD8+T 细胞对抗原应 答上意想不到地好于 PBS-57、 PBS-11 和 αGalCer。 实施例 7 ： 肌内注射佐剂和抗原后体液应答增强的比较。
为了衡量体液免疫应答和 CD4+T 辅助细胞免疫应答， 通过给药测试佐剂和抗原是 否也增强， 在用加入有 OVA 和未加入有 OVA 的测试佐剂接种的小鼠中， 检测了 IgG1 和 IgG2a 抗体应答。按如下设计， 单独使用 50 微克 OVA 或与 100 纳克的所述佐剂的结合 ( 弗氏佐剂 用做阳性对照 ) 肌内注射小鼠 ( 每组 6 只 ) ：
组1： 500 微克 Ova+CFA/IFA( 阳性对照 )
组2： 50 微克 Ova
组3： 50 微克 Ova 十 100 纳克 αGalCer
组4： 50 微克 Ova+100 纳克 PBS-11
组5： 50 微克 Ova+100 纳克 PBS-14
组6： 50 微克 Ova+100 纳克 PBS-57
组7： 50 微克 Ova+100 纳克 PBS-96
注射后 14 天， 收集血液样本， 用 OVA 同型 IgG1 或 IgG2a 特异的鼠单克隆抗体， 进行 IgG1 和 IgG2a 的 ELISA。以外周血中抗体 ( 纳克 / 毫升 ) 的效价表示结果。图 11 描述了 IgG1 的结果， 图 12 描述了 IgG2a 的结果。如图 11 所示， 与单独接种 OVA 或 OVA 与 PBS-11 或 αGalCer 结合相比， PBS-14， PBS-96 和 PBS-57 都能引起 IgG1 的稳定效价， 并增强了 OVA 特异的 IgG1 效价。出乎意料地， PBS-14 和 PBS-96 增强了 OVA 特异的 IgG2 效价的效果， 大 致与弗氏佐剂相同， 但好于 PBS-57。
虽然在示例性的实施方式中描述了本发明的组合物和方法， 但对本领域技术人员 而言， 在不背离本发明内容、 精神和范围的情况下， 显而易见的是， 在本组合物和方法、 以及 在所述方法的步骤或者步骤的顺序， 可以进行多种改变。更详细地说， 显而易见的是， 在化
学上和生理上相关的特定的药剂可以替代此处所述的药剂， 从而达到相同或相近的结果。 所有这种对本领域技术人员显而易见的相似的替代物和修饰物， 在本发明的精神、 范围和 内容以内。此外， 此处列出和描述的所有专利和出版物都的全文引入作为参考。
如本说明书和附加的权利要求所描述的， 除了在内容中特别说明以外， 单数形式 “一个” 和 “这个” 包括复数指示对象。因此， 例如， 参照一种含有 “一种多核苷酸” 的组合物， 包括两种或两种以上的多核苷酸的组合物的混合物。还需指出的是， 除了在内容中特别说 明以外， 术语 “或” 通常包括 “和 / 或” 的意思。本说明书中所有参考的出版物、 专利和专利 申请书是为说明本发明相关的本领域普通技术人员的水平。所有的出版物、 专利和专利申 请书在此明确地全文引入作为参考， 就如同每个相同内容的单独出版物或专利申请被详细 地和独立地以参考文献展示一样。如果本发明与引入的出版物、 专利和专利申请书发生抵 触， 以本发明的公开为准。
需要详细了解的是， 在此叙述的所有数值包括从低值到高值的所有数值， 也就是 所有在最低值和最高值之间的数值组合， 都在本申请中的范围内。