用大肠杆菌生产色氨酸 本发明涉及用大肠杆菌生产色氨酸。
本发明提供了一种宿主以及生长该宿主以便在缺乏抗生素的条件下稳定地维持质粒，导致发酵中色氨酸的高产率的方法。它对以前的方法提供了明显的改进并生产无任何酪氨酸和苯丙氨酸污染的色氨酸，从而简化了下游加工。
现在有许多遗传操作微生物以制备有效地超额生产特定氨基酸的菌株的例子。
本领域一般公认的是，如果要成功地获得特定氨基酸的生产，干扰控制生物合成途径的基因之表达的正常调节线路，选择其酶不再受到反馈抑制的突变子并破坏能分解所需产物的酶是必需的。还发现经过将质粒上额外的基因拷贝导入细胞来增加某些生物合成基因的拷贝数是有用的。这些一般性原则可见Tribe，D.E.and J.Pit-tard.(1979).Appl.Environ，Microbiol.38：181-190.特别是其中涉及地色氨酸生产。
在该文章中也说明了芳香族途径中的第一个酶(DAHP合成酶)及末端色氨酸途径中的第一个酶的反馈抑制的意义和取消抑制的必要性。
同样地，很久就已知道灭活抑制色氨酸操纵子基因表达的trpR阻遏蛋白是必需的。这一点在上面提到的文献中进行了讨论。
对于大肠杆菌的色氨酸基因，有一个第二控制系统称为衰减。即使在trpR细胞中，色氨酸或更具体地说，负载的色氨酸-tRNA控制色氨酸操纵子的表达。当负载的色氨酸-tRNA过量存在时，在每10个转录子中编码生物合成酶的序列达到大约9个前终止trp操纵子基因mRNA的转录(Yanofsky.c.(1981)，Nature(London)289，751-758)。这种转录的成熟前终止可经各种遗传操作如克隆在异源启动子之后的trp基因或去掉衰减子基因座来阻止。Tribe和Pittard(Appl.Envtron.Microbiol.(1979).38：181-190)报道了克服衰减的不同方法，其中他们使用了含部分缺陷型色氨酸-tRNA合成酶的突变子。
当含trp操纵子的结构基因的质粒导入这些trp基因的表达不再受控制且缺乏任何对质粒编码功能的强选择之细胞中时，随后对该细胞及其子代的操作常导致质粒从群体中丢失。如果原始宿主是色氨酸原养型，丢失质粒的细胞比保留质粒的细胞生长更迅速，遗传修饰(如缺失或插入)已减少或阻止存在于质粒上的trp基因表达的细胞也一样。经过多次传代，这种缺陷型细胞(分离子和突变子)成为群体中的主要成员，如果该群体作为发酵的基础，则发酵失败。
为稳定质粒的遗传已发展了各种方法。通常使用的方法包括在质粒上的抗生素抗性基因和向发酵培养液中加抗生素。然而，该方法昂贵且对环境有害。使用在为生长所需的一些化合物生物合成上有缺陷的宿主以及携带补偿该突变缺陷之基因的质粒的方法以前已使用(例如见Anderson et al.，美国专利4,371,614)，但随着它们继续合成该营养成份几代时分离子会积累(表型滞后)。由于其所需与积累的营养成份相同，分离子也可利用已经积累的营养成份。使用运输缺陷型宿主已取得了有限的进展，但这仅在培养基中色氨酸较低的条件下实现(Imanaka，专利公开A No.3-43074)。
对能生产高水平的色氨酸的微生物的需要仍然存在。与之相关的是对在所说的微生物中稳定质粒遗传之方法的需要。
经过提供具有色氨酸生产能力且在其基因组中包含编码部分缺陷型色氨酰-tRNA合成酶基因(将温控性色氨酸营养缺陷型导入宿主)及进一步在染色体上破坏由arop.mtr和tnaB编码的运输系统的突变的E.coli K-12(该菌株含编码在高色氨酸浓度时对反馈抑制有抗性的邻氨基苯甲酸合成酶的trpE等位基因)来达到本发明的这些和其它目的，这些目的在下文的描述中将会变得更显而易见。
经过提供经发酵生产L-色氨酸的方法实现了本发明的另一目的，该方法包含在不同的生长和生产条件下培养前文所述的细菌并从培养基中回收产生的L-色氨酸。附图描述：图1
JP7847(trpS+)和JP6006(trpS378)在30℃的生长速率，作为培养基中色氨酸浓度的函数。培养基是半强度缓冲液56(Monod，J.，G.Cohen-Bazire and M.cohen(1951)，Biochimica et Biophysica Acta1：585-599)补充10μg/ml的硫胺素和0.2％的葡萄糖)。两个菌株都是色氨酸营养缺陷型，因为△trpLE1413缺失，两个都在有效吸收色氨酸上有缺陷，因为mtr-24，tna-1和aroP519突变。另外它们都是sac+aroF363 aroG103(FBR)trpR363tyrR366。图2
产色氨酸菌株(JP6015/pMU91)在不同温度的瓶中生长时的稳定性和产率。图3
产色氨酸菌株(JP6015/pMU91)在不同浓度的酵母提取物存在的条件下在30℃的瓶中生长的稳定性和产率。图4
具有野生型trpE等位基因的菌株(JP6768/pMU3018)和具有trpE476突变(JP6768/pMU3019)和trpE483突变(JP6768/pMU3025)的菌株邻氨基苯甲酸合成酶对体外反馈抑制的敏感性比较。图5
在42℃下aroB+trps+菌株(JP8820)在基础培养基中以及aroB+trps378菌株(JP1451)在补充了不同水平的色氨酸的基础培养基中的生长曲线。图6
pMU3018(图6a)，pMU3019(图6b)和pMU3025(图6c)的限制性图谱。在每个例子中载体(pMU578)以黑色表示。使用含trp操纵子5′端的2.9kbSmaI/HindIII片段，用trpE476而不是trpE野生型接与pMU3018相似的方法构建pMU3019。pMU3025按实施例2所述经诱变从pMU3018获得。图7
将trpE483插入trp操纵子中。图8
pMU3028的限制性图谱。载体(pLG339)以黑色表示。在2步克隆中构建：
(I)将携带SerA+的2.6kb片段克隆进pLMI339的Smal位点；
(II)将携带来自pMU3027(见图7)的trpE483DCBA的8.1kbSalI片段克隆进所得质粒的xhoI位点。图9
pMU91的限制性图谱。
本发明提供了经使用E.coli K-12菌株发酵生产高水平的L-色氨酸的方法。
这些具有L-色氨酸生产能力的菌株在其基因组中包含编码部分缺陷型色氨酰-tRNA合成酶的突变基因，该基因将温控性色氨酸营养缺陷型导入宿主中并在染色体上进一步产生破坏由arop.mtr和tnaB编码的运输系统的突变，该菌株用含有编码不受色氨酸的反馈抑制的邻氨基苯甲酸合成酶的色氨酸操纵子之质粒转化。
正如第2部分所述，超额生产特定营养成份的菌株存在问题，其中稳定性的维持仅取决于宿主对超额生产的营养成份的需要，至于分离子继续生长，首先是因为表型滞后，其次是因为它们易于利用已经积累的营养成份。即使宿主菌株是营养成分有效转运缺陷型的，只有当营养成份浓度相当低时选择才会成功。如图1所示，例如色氨酸水平为1mM或更大时，色氨酸营养缺陷型不能有效地运输色氨酸，但随着正常倍增时间而生长。当产色氨酸菌株生长时，色氨酸浓度迅速达到1mM或大约0.2g/l，因此在生产条件下迅速失去选择质粒稳定性的可能。
我们已发现了具有突变的trp-菌株，特别是例如trpS378，它部分灭活色氨酸-tRNA合成酶，在细胞内需要非常高浓度的色氨酸。图1表明：如果转运阴性突变子也携带这种trpS378突变，为了出现良好的生长，即使在30℃它需要至少5mM色氨酸。这意味着在培养基中色氨酸浓度达到1g/l前，由质粒丢失产生的任何分离子将处于生长劣势。在分离子生长时充分竞争前对非常高的色氨酸浓度的需要是一种有意义的改进，因为它不仅在接种物生长期间，而且在最终发酵期间的大部分生长期维持着对滞留质粒的选择。这种转运阴性突变与特别是trpS378的组合与trpS+转运阴性组合相比明显提高了色氨酸产量。所说的突变优选破坏由arop.mtr.和tnaB编码的转运系统。典型的菌株包括但不限于含有其特征为aroP579，mtr-24和tnaA1之突变的等位基因的菌株。
使用携带trpS378等位基因的超额生产型菌株和携带编码反馈抗性邻氨基苯甲酸合成酶之trpE476DcBA的质粒在单独的实验中我们证实了温度敏感性等位基因trpS378可在有利于稳定性或生产能力的选定温度下有效地使用。我们发现这种携带trpS378的生产菌株在大约30℃时比大约37℃更稳定。在大约37℃时，生产能力增加而稳定性降低。生产菌株JP6015/pMU91的结果如图2所示。在这一例子中提供了serA+/-补充，经过选择培养温度可明显提高稳定性水平。对于其它菌株获得了相似的结果。
我们还发现加入酵母提取物可进一步降低30℃时的生产能力，这样色氨酸水平不超过0.2到0.3g/l。这种稳定性明显增加的结果如图3所示。一些菌株在超过60代时仍保持稳定。邻氨基苯甲酸合成酶的反馈抑制
在大肠杆菌野生型菌株中邻氨基苯甲酸合成酶活性对色氨酸的反馈抑制非常敏感，在0.02mM的低色氨酸浓度时显示出大约50％的抑制。在各种文献中已报道了反馈抗性突变体，例如，Aiba et al.，加拿大专利申请号1182409，Tribe and Pittard.(1979).Applied andEnvironmental Microbiol.38：181-190and Environmental Microbiol.43：289-297。在每个例子中，这种突变体的分离涉及对色氨酸类似物引起的生长抑制的抗性选择。典型地，为超额生产色氨酸的目的而选择的突变子保留了一些反馈抑制，但50％发生在大约13mM而不是0.02mM的浓度(见Atba等，加拿大专利申请号1182409)。其中描述了涉及更高反馈抗性的突变子(比20mM抑制值高50％)，它们导致积累的色氨酸下降，很可能是由于反馈抗性酶的活性减少(Aiba et al.(1982).Applied and Envi-ronmental Mtcrobiol.43：289-297)。
我们分离的2个反馈抗性突变子是以前在色氨酸超额生产中所使用的典型菌株，含有编码在1mM色氨酸下表现出抑制活性不超过10％的酶的等位基因trpE476和trpE382(见实施例2)。
当具有这种突变的生产菌株在发酵罐中使用时，观察到在发酵终止时，每积累1克色氨酸也积累酪氨酸和苯丙氨酸各大约20-60mg。尽管这些氨基酸是芳族产物的一小部分，但它们是在后续的色氨酸回收中产生主要困难的副产物。
在寻找这种积累的基础时，发现色氨酸浓度为128/l(60mM)时，这两种反馈抗性邻氨基苯甲酸合成酶被抑制60-80％。换句话说，在1mM的浓度下出现抗性的酶在工业发酵的实际条件下不能有效地发挥功能。本领域没有文献涉及具有对反馈抑制有抗性的酶的超额生产菌株，其抗性争对很可能存在于发酵罐中的极高水平的反馈抑制，同时维持正常的活性，因而提高了生产能力。
为了克服邻氨基苯甲酸合成酶在高色氨酸浓度时的抑制问题，我们分离了一个新的反馈抗性突变子(trpE483)。它产生的邻氨基苯甲酸合成酶在13.5g/l的高色氨酸浓度下表现出不超过10％的抑制活性(见图4)。当构建具有trpE483等位基因的生产菌株并用于在以前每产生1g色氨酸时产生的酪氨酸和苯丙氨酸各大约为20-60mg的条件下发酵时，检测不到酪氨酸和苯丙氨酸并保持高色氨酸产量。这与以前Aiba et al(Applied and Environmental Microbiol.(1982)43：289-297)用显示出极高水平的色氨酸抗性而色氨酸产率减少的邻氨基苯丙氨酸合成酶突变子报道的结果显著相反。
按实施例2所述，使用携带trp操纵子的质粒实现了trpE483等位基因的分离。使用已知的技术，如限制性酶消化、连接和转化(Maniatis，T.，E.F.Fritsch and J.Sambrook，Molecular cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.(1982))可很容易地构建携带trp操纵子的这种质粒。TRP操纵子可来自大肠杆菌染色体DNA或来自特化的转导噬菌体，80pt190h(Hershfield.V.etal.(1974).proc.Natl.Acad.Sci.USA.71：3455-3459)，且可以插入许多合适载体的任何一个中，这些载体包括但不限于来自pSC101(Cohen，S.N.and A.C.Chang(1977).J.Bacteriol：132，734-737)，R388(Datta，N.and R.W.Hedges(1971).J.Gen Microbiol.72∶349)等的载体。而且，该载体可携带以相似技术克隆的SerA+基因。然后经转化将这样构建的质粒导入大肠杆菌K-12宿主中。
本发明还涉及生长和发酵显示出高生产能力的所说的大肠杆菌K-12菌株的方法。当微生物在一批培养物中生长以产生一种氨基酸时，氨基酸的实际生产仅在最终发酵容器的少数几代期间需要。对于100,0001发酵罐，在最终发酵罐中仅需要5至10代，而为接种该容器需要50或更多代。
使用所述方法，利用与特定生长条件相结合的特定遗传突变可保证必需菌株的稳定性而在最终发酵罐生长期间允许得到最大色氨酸生产能力。在最终发酵中即使不使用抗生素也可实现色氨酸的高产量(实施例6)。使用JP4735/pMU3028导致高产率的色氨酸而没有酪氨酸和苯丙氨酸的明显形成。
下列大肠杆菌K-12菌株按布达佩斯条约保藏在DeutscheSammlung Von Mtkroorganismen und 2 ell Kulturen(DSM)in Braun-schweig(Germany)培养物保藏中心：
JP7847保藏号为DSM101119
JP6006保藏号为DSM10118
JP6768/pMU3018保藏号为DSM10120
JP6768/pMU3025保藏号为DSM10121
JP4735/pMU3028保藏号为DSM10122
JP6015/pMU91保藏号为DSM10123。实施例1
具有trpS基因突变的温度敏感性色氨酸营养突变型的分离
以Adelberg，Mandel和Chen(Biochem Biophys Res Commum.(1965).18：788-795)的方法用诱变剂N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍处理大肠杆菌K-12，KA56(galE-thi-)菌株(Russell，R.R.B.and A.J.Pittard.(1971).J.Bacteriol.108：790-798)。用诱变剂处理后，洗涤细胞并重悬于含酪蛋白氨基酸及作碳源的甘油之基础培养基中以及使用本实验室建立的富集方法(Russell.P.R.B.andA.J.Pittard.(1971).J.Bacteriol.108：790-798)。32℃生长几小时后，将培养物转移到42℃并再培养1小时后加入半乳糖至终浓度为2％。缺乏尿苷二磷酸半乳糖-4-表异构酶(即galE-)但能合成半乳糖激酶和半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶作为对加入半乳糖的反应的细胞积累UDP半乳糖，它对细胞有毒性并引起细胞溶解(Fuka-sawa，T.，and H.Nikaido.(1959).Nature(London).(84：1168-1169)。在42℃的甘油半乳糖酪蛋白氨基酸培养基中不能合成新酶的细胞不形成该化合物并不被杀死。在这些幸存者中可发现具有trpS基因突变的温度敏感性营养缺陷型。(酪蛋白氨基酸含非常低水平的色氨酸)。在半乳糖存在的条件下42℃培养5小时后回收细胞，洗涤并(1)在32℃加入营养培养基并培养至指数中期或(2)涂布到营养琼脂平板上使每板产生大约200个集落并在32℃培养48小时。将每个营养琼脂板上的集落复制到mm和含10-3ML-色氨酸的mm(mm＋trp)的两个平板上。(mm代表半强度培养基56(Mon-od，Cohen-Bazire and Cohen，(1951).Biochim.Biophys.Acta 1，585)，使用1％Oxoid No.1琼脂固化，并含有葡萄糖和硫胺素)。一套平板(mm和mm＋Trp)在32℃培养，另一套在42℃培养。能在32℃的mm上生长但不能在42℃的mm上生长且可在42℃的mm+Trp培养基上生长的集落是潜在的温度敏感性色氨酸营养缺陷型。在这些集落中，为了鉴别trpS基因改变的突变子，必需制备许多克隆的P1转导噬菌体并将aroB+转导进aroB-突变子(如AB2826(Pittard，J.and B.J.Wallace.(1966).J.Bacteriol.91：1494-1508))并在32℃的mm上选择Aro+转导子。然后试验这些转导子在42℃的mm和mm＋Trp上生长的能力。在TrpS基因上突变的原始色氨酸营养缺陷型中，大约50％的Aro+转导子在42℃时生长需要色氨酸。在一可供选择的方法中，制备的生长有培养物的营养培养液在用半乳糖杀死后用于制备P1溶胞产物。再将该溶胞产物与AB2826一起使用以便在32℃的mm上选择aroB+转导子。然后筛选这种转导子获得向培养基中加入色氨酸后仅能在42℃的mm上生长的克隆。图5显示了两个转导子在含不同水平的色氨酸的葡萄糖基础培养基中42℃时的生长曲线，一个是aroB+trpS378(JP1451)，另一个是aroB+trpS+(JP8820)可见在非随意的温度下以高水平的色氨酸可逆转温度敏感性表型。实施例2
对极高水平色氨酸的反馈抑制有
抗性的邻氨基苯甲酸合成酶突变子的选择
质粒pMU3018(图6)在2.9kb SmaI Hind III片段上携带trp启动子，trpE基因和部分trpD基因。pMU3018来自pMV578，它是携带galK′-Lae′Za融合体的单拷贝TpR质粒，与启动子克隆载体pMU575(Andrews A.E.，B.Lawley，and A.J.Pittard.(1991).J.Bar-teriol.173，5068-5078)相似，但用SmaI EcoR I Bgl II接头代替SmaI位点，却掉DraI片段并缺失LacY和LacA。如果用这工种酶消化pMU3018DNA并以低熔点琼脂糖凝胶电泳片段，可以简便地分离并纯化trpEtrpD′2.9kb片段及更大的13kb载体片段。除了向诱变混合物中加入精胺(1mM)外，按照Ray等(Ray，J.M.，C.Yanofsky and R.Bauerle.(1988).J.Bacteriol.170：5500-5506)的方法用50mM亚硝酸诱变这一2.9kb的片段60分钟。诱变后，将该片段与较大的13kb片段重新连接，将连接产物转化进菌株JP6768。它是一种trpR-的大肠杆菌菌株，其中染色体上的trpE基因缺失，但trpDC B和A具有充分功能(△trpLE1413(Miozzari，G.F.and C.Yanofsky.(1978).J.Bacteriol.133：1457-1466)。在含三甲氧苄二氨嘧啶的Luria琼脂上选择大约2,000个转化子。这些筛选的转化子在补充了15mM色氨酸类似物与氟色氨酸的基础培养基上生长。生长的克隆是邻氨基苯甲酸合成酶改变的潜在的反馈抗性突变子。在极高色氨酸水平(13.5g/l)存在的条件下使用Cho.K-O和C.Yanofsky.(1988).J.Mol.boil.204：41-50描述的试验检测每个克隆的邻氨基苯甲酸合成酶活性。在抗性突变子中鉴定出在极高水平色氨酸存在时显示出抑制不超过10％的邻氨基苯甲酸合成酶活性的克隆。存在于该菌株中的突变等位基因称为trpE483。在比较中，等位基因trpE476编码的邻氨基苯甲酸合成酶在1g/l色氨酸时具有较好的抗性但在13.5g/l色氨酸时抑制超过60％。图4比较了具有野生型等位基因的菌株(JP6768/pMU3018)和具有trpE483等位基因(JP6768/pMU3025)和trpE476等位基因(JP6768/pMU3019)的菌株邻氨基苯甲酸合成酶的反馈敏感性。
为了用trpE483等位基因重新构建trp操纵子，将携带该等位基因的2.9kb的片段连接到来自pMU575的pMU 1881的21kb HindIII SmaI片段上，pMU1881携带trpDCBA基因。由此产生质粒pMU3027。图7概述了这一过程。接着将插入了trpE483的新trp操纵子转移到携带SerA+来自pSC101的pLG339(Stoker.N.G.et al(1982).Gene 18，335-341)上以产生pMU3028，如图8所示。
在具有trpE476等位基因的菌株积累酪氨酸和苯丙氨酸的条件下，具有trpE483等位基因的菌株产生根本检测不到的酪氨酸(见实施例6)。无副产物(如酪氨酸和苯丙氨酸)的培养液优选用于进一步的纯化程序，这对本领域的技术人员而言是显而易见的。实施例3
具有温敏性trpS等位基因及阻止色氨酸运输进细胞的正常活性之突变的大肠杆菌菌株的构建
已鉴定，克隆和测序编码将色氨酸有效地运输进大肠杆菌的各种系统的基因(Sarsero.J.P.，P.J.Wookey.P.Gounick，C.Yanofskyand A.J.Pitlard.(1991)，J.Bacteriol.173：3231-3234；and Honore，N.and S.T.Cole.(1990).Nucleic Acids Research 18∶653)。也描述了这些系统(TnaB，Mtr和AroP)中各个缺陷型突变子。经过在tnaA基因(tnaA)上发生突变可阻止TnaB蛋白质的表达，tnaA基因对tnaB表达具有极性作用(Stewart，V.and C.Yanofsky.(1985).J.Bacteriol.164：731-740)。这是一种特别有用的突变，因为同时失活的tnaA基因编码可降解色氨酸的色氨酸酶。已描述了mtr基因的各种突变，根据对色氨酸类似物5-甲基—色氨酸的抗性选择突变子。Hiraga最先描述了一个这样的突变mtr-24(Hiraga，S.，K.Ito，T.Matsuyama，H.Ozeki and T.Yura.(1968).J.Bacteriol.96：1880-1881)。
经过选择对芳香氨基酸类似物的抗性也可分离一般芳香族运输系统的突变。Brown(Brown K.D.(1970).J.Bacteriol.104：177-188)描述了aro P579突变。
使用转座子Tn10和噬菌体P1介导的转导容易构建具有trpS基因突变和色氨酸运输系统各基因突变的菌株。用λTn10转座子λNK370感染原养型菌株W3110并接Kleckner，N.，D.F.Barker，D.G.Ross and D.Botstein.(1978)，Genetics 90：427-450所述选择四环素抗性菌落。经过使用P1转导，获得TMO与aroP519，mtr-24和tnaAl紧密相连的分离物。然后P1溶胞产物用于将各种突变依次导入trpS菌株中，并根据Bochner，B.R.，H.C.Huang，G.L.Shieven and B.N.Ames.(1980).J.Bacteriol.143：926-1033的方法选择四环素敏感性衍生菌株。
经过用trps+克隆的溶胞产物转导并在42℃含0.5mM色氨酸的平板上生长进行选择可获得这种突变子的TrpS+衍生菌株。实施例4
trpS378与色氨酸有效运输及其生物合成
缺陷型trpS+菌株的生长速率比较
具有野生型trpS等位基因且能将色氨酸有效运输进细胞的色氨酸营养缺陷型在补充了5×10-5M低水平的色氨酸的基础培养基中以较高速率生长。
有效运输色氨酸缺陷的色氨酸营养缺陷型最适生长需要的水平更高(～10-3M)，而还具有trpS378突变的菌株在达到最大生长速率前需要5×10-3M的高浓度。
图1比较了trpS378与还具有失活Mtr.AroP和TnaB蛋白质突变的色氨酸营养缺陷型trpS+衍生物(△trpLE1413)对色氨酸的生长反应。JP6006来自JP4153，它使用Tn10作连接标记以P1转导导入△trpLE1413并分离四环素敏感性变异体，接着使用P1溶胞产物在Sac+菌株GA122上生长经P1转导导入Sac+(alaeddinoglu，N.G.and H.P.Charles.(1979).J.Gen.Microbiol.110：47-59)。JP4153是aroF363 aroG103(FBR)aroH371(FBR)trpE382(FBR)tr-pR363tyrR366trpS378 aroP579mtr24tna-1.JP784是JP6006的trps+衍生物，以P1转导分离。
细胞在30℃下在补充了不同水平的色氨酸的基础培养基上生长。用Klett比色计测光密度来测量生长，从每个生长曲线的指数期计算倍增时间。实施例5
温度和添加酵母提取物对菌株稳定性和生产能力的影响
经过测量携瓶中培养物的色氨酸和邻氨基苯甲酸的生产能力可试验菌株的稳定性，其中每24小时进行1％的系列转移。以磷酸盐浓度，以可从酵母提取物中获得的磷酸盐或以两者的混合将生物量限定为大约0.4mg/ml。在该系列中通过各瓶传代代表细胞数增加100倍或6.7代。
对于许多瓶，色氨酸生产能力特征性地保持接近菌株正常值的100％，且检测到的邻氨基苯甲酸可忽略不计。在沿该系列某一位置的瓶中，色氨酸生产能力一般突然下降到40％-50％。且伴随着出现邻氨基苯甲酸。细胞计数表明：以高色氨酸生产能力且无邻氨基苯甲酸向低色氨酸生产能力且含邻氨基苯甲酸的转变与分离子或突变子从0-10％增加到40-70％的相对应。
从如下无菌贮液制备每个菌株的培养基：
葡萄糖(20％)或蔗糖(20％) 10ml
MOPS基础培养基(X10)* 20ml
B1(硫胺素)(0.01％) 0.2ml
磷酸盐(15mM KH2PO4) 2.0ml
四环素(10mg/ml)，如果需要的话 0.2ml
无菌蒸馏水 170ml
*MOPS基础培养基(X10)每升含167.44g MOPS，1.41g柠檬酸三钠2H2O，0.13g FeSO4.7H2O，19.2gNH4Cl，4.0gMgSO4.7H2O，2.4gKCl，0.15mgCaCl2.2H2O和微量元素(14μg CoCl2.6H2O，5μg CuSO4.5H2O，48μgH3BO3，57μgZnSO4，7H2O，32μgMnCl2.4H2O和8μg(NH4)6MO7O24，4H2O)。
用新鲜试验菌株接种10ml培养液，在30℃下摇动培养过夜。从转化到这一时期的过程大约经历34代，在分析中不包括这些代。过夜的培养物用于接种该系列中的第一瓶。
以24小时的间隔进行1％的转移(100μl转移进10ml中)，直到培养物的色氨酸生产能力下降，同时出现邻氨基苯甲酸。在这些实验条件下转移前每个培养物达到静止期，每瓶经历大约6.7代。在第6瓶中色氨酸和邻氨基苯甲酸水平出现显著变化，例如稳定性记录为5×6.7或33.5代。在每次转移时测定24小时培养物的光密度，离心样品，使用注射器将上清液过滤通过一次应用的滤膜(Milli-pore，0.45μm)。以HPLC测定色氨酸和邻氨基苯甲酸的浓度。瓶中生产能力(YP/X)的测量：
在所需温度下摇动生长试验菌株，24小时和48小时后，测量生产能力。培养基与在稳定性试验中所用的相同。从新鲜小批量中接种10ml培养物，摇动培养过夜。将它用于接种含15ml相同培养基的试验瓶。24小时后取样。使用分光光度计在660λ下测光密度并使用标准曲线计算干重。离心，过滤样品，使用合适的标准品以HPLC测量色氨酸，酪氨酸和邻氨基苯甲酸浓度。生产能力(YP/X)定义为色氨酸产量(g/l)除以生物量或干重产量(g/l)。
培养温度对携带trpS378等位基因和含编码反馈抗性邻氨基苯甲酸合成酶的trp操纵子之质粒的超额生产菌株稳定性和生产能力的影响如图2所示。低温有利于高稳定性和低生产能力，而高温有利于生产能力，但有损于稳定性。这可用不同第一选择在各种生产菌株中得到证实。图2的资料显示的是JP6015/pMU91，第一选择是Ser+。JP6015来自JP4153(见实施例4)，经过转导导入Sac+，且经过用紧密相连的Tn10转座子共转导导入SerA-，并随后选择四环素敏感性变异体。pMU91是来自pSc101的质粒(Cohen，S.N.and A.C.Chang(1977)/J.Bacteriol.132：734-737)携带TeR，trpE476DCBA和SerA+(见图9)。使用特化转导噬菌体80pt190h分离trpE476DCBA等位基因(Herschfielol.V.et al(1974).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71：3455-3459)。将携带80pt190h的trpE-菌株涂布到含(mM5-甲基色氨酸(5MT)的基础培养基上。经紫外线诱导细胞收集物产生随后用于转导的溶胞产物，选择trp+5MTR转导子。其中的一些用于试验邻氨基苯甲酸合成酶活性，trpE476DCBA等位基因的特征为编码在10mML-色氨酸时具有70％完全活性的邻氨基苯甲酸合成酶。将在7.9kbXhoI/SalI片段上的trp基因克隆进pSC101的XhoI位点。将serA+基因导入219kb SalI片段的xhoI位点。
在各种色氨酸超额生产菌株中还证实了存在或不存在酵母提取物对稳定性和生产能力的影响。资料如图3所示，使用JP6015/pMU91和Ser+第一选择证实了酵母提取物的使用降低生产能力且增加稳定性。实施例6
用大肠杆菌JP6015/pMU9生产色氨酸
经过在30℃培养48小时在补充了葡萄糖(2g/l)，酵母提取物(5g/l)和四环素(5mg/l)的MM琼脂(见实施例1)上生产大肠杆菌K-12菌株JP6015/pMU91的单个菌落。经过在30℃和250rpm(每分种转数)下培养大约16小时在10ml培养物(100ml瓶)中进一步增殖一个单菌落。
从无菌贮液如下制备用于培养物的培养基：
葡萄糖(20％) 10ml
MOPS基础培养基(X10) 20ml(见实施例5)
酵母提取物(20％) 1ml
四环素(10mg/l) 0.1ml
无菌蒸馏水 170ml
将1ml大肠杆菌K-12菌株JP6015/pMU91的培养物接种到装于2000ml体积的Erlenmeyer氏瓶的300ml种子培养基(表1显示了其组成)中，在30℃150rpm的携床上摇动培养24小时。
将70ml所得的种子培养物接种到700ml容于21发酵罐的发酵培养基(表2显示了其组成)中，在30℃培养24小时。以25％氨水控制PH值为6.7；经过以1/3vvm的速率通气和用280至380rpm之间的速率搅拌使PO2保持在40％以上。
将所得的OD值为20(在660nm下测量)的预培养物接种到容于101发酵罐中的6.31具有表3所示组成的主要发酵培养基中。
在33℃下以0.5vvm通气，经在700至1200rpm之间搅动培养物使PO2保持在40％以上进行发酵；使用25％氨水将pH维持在7.0。6.5小时后，将620g/l(W/V)葡萄糖溶液连续加到培养基中，加入方式是使发酵罐中葡萄糖的浓度值不超过17g/l。32小时后完成发酵。以高效液相色谱定量测定积累的L-色氨酸和副产物L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的量。结果在表4中列出。实施例7
用大肠杆菌JP4735/pMU3028生产色氨酸
经过在30℃培养48小时在补充了葡萄糖(2g/l)。酵母提取物(5g/l)和四环素(2.5mg/l)的MM琼脂(见实施例1)上生产大肠杆菌K-12菌株JP4735/pMU3028的单个菌落。经过在30℃，250rpm(每分钟转数)下培养大约16小时将一个单菌落在10ml培养物(100ml瓶)中进一步增殖。
从无菌贮液如下制备培养物的培养基：
葡萄糖(20％) 10ml
MOPS基础培养基(X10) 20ml(见实施例5)
酵母提取物(20％) 1ml
四环素(10mg/l) 0.05ml
无菌水 170ml
将1ml大肠杆菌K-12菌株JP4735/pMU3028的培养物接种到容于2000ml体积的Erlenmeyer氏瓶中的300ml种子培养基(表1显示了其组成中，在30℃下，在150rpm的摇床上摇动培养24小时。将70ml所得的种子培养物接种到容于21发酵罐的700ml预发酵培养基(表2显示了其组成中，在30℃培养24小时。以25％氨水控pH值为6.7；以1/3vvm速率通气和用280至380rpm之间的速率搅拌将PO2保持在40％以上。
将所得的OD值为20(在660nm下测定)的预培养物接种到容于101发酵罐中的表3所示组成的6.31发酵培养基中。
在33℃下，以0.5vvm通气且以700至1200rpm之间搅拌培养物保持PO2在40％以上的条件下进行发酵，使用25％氨水将pH维持在7.0。6.5小时后，将620g/l(w/v)葡萄糖溶液连续加到培养物中，加入方式是使发酵罐中葡萄糖浓度值不超过27g/l。45小时后完成发酵。以高效液相色谱定量测定积累的L-色氨酸量。结果在表4中列出。
表1
种子培养基的组成
葡萄糖*H2O 4g/l
酵母提取物 1.1g/l
吗啉代丙烷磺酸 16.7g/l
柠檬酸三钠*2H2O 0.14g/l
FeSO4*7H2O 13mg/l
MgSO4*7H2O 0.4g/l
(NH4)2SO4 1.29g/l
KCI 0.24g/l
KH2PO4 1.05g/l
盐酸硫胺素 5mg/l
四环素 2.5mg/l
微量元素 2ml/l用25％氨水将pH调至大约7.0微量元素包括：Na2MoO4*H2O 0.15g/lH3BO3 2.5g/lCoCl2*6H2O 0.7g/lCuSO4*5H2O 0.25g/lMnCl2*4H2O 1.6g/lZnSO4*7H2O 0.3g/l
表2
预发酵培养基的组成葡萄糖*H2O 27.5g/l酵母提取物 7.5g/l柠檬酸三钠*2H2O 1g/lFeSO4*7H2O 1.1g/lMgSO4*7H2O 3.15g/l(NH4)2SO4 8.65g/lKH2PO4 0.75g/l盐酸硫胺素 24mg/l四环素 2.5mg/lK2SO4 2.3g/l微量元素(见表1) 2ml/l
表3
主发酵培养基的组成葡萄糖*H2O 27.5g/l柠檬酸三钠*2H2O 1g/lFeSO4*7H2O 1.4g/lMgSO4*7H2O 3.15g/l(NH4)2SO4 8.65g/lKH2PO4 1.5g/lK2SO4 2.3g/l微量元素(见表1) 4ml/l
表4 菌株 L-色氨酸L-苯丙氨酸(g/l) L-酪氨酸 JP6015/pMU91 18.3 1.0 0.8 JP4735/pMU3028 19.5 0 0