苄氧基取代吲哚化合物及其类似物，制备方法和应用 【技术领域】
本发明属药物合成领域，涉及苄氧基取代吲哚化合物及其类似物，具体涉及一种5位或6位有苄氧基取代的吲哚类化合物及其类似物，及其制备方法和在医学上的应用。
背景技术
噻唑烷二酮类药物(thiazolidinediones，TZDs)是近年来新研制开发的很有前途的胰岛素增敏剂，据报道，其可增强组织对胰岛素的敏感性，提高细胞对葡萄糖的利用；改善胰岛素抵抗状态，纠正糖及脂肪代谢异常；对糖化血红蛋白水平也有降低作用。代表药物有下述结构的曲格列酮(troglitazone)、罗格列酮(rosiglitazone)和吡格列酮(pioglitazone)。
已知，PPARγ是一类由配体激活的核转录因子，是过氧化物酶体增殖激活受体PPAR的一种亚型。当被特定的小分子激活以后，通过对基因表达的调控可以对脂肪的储存、转运和分解代谢起到很好的调控作用。深一步的研究发现，被激活的PPARγ还可以增加外周组织的胰岛素敏感性，从而改善胰岛素抵抗，降低血糖浓度；此外还发现PPARγ可以改善减少炎症反应，防止动脉粥样硬化，调控细胞周期，还与某些癌症的形成有关。
有研究报道，噻唑烷二酮类药物是PPARγ激动剂，通过激动PPARγ后产生药理作用。其后又研究开发了多种不同类型的PPARγ激动剂，如α-取代苯丙酸类、L-酪氨酸类和1，3-二羧酸类化合物。代表性化合物如下BRL48482、SB213068、化合物a等，
葛兰素公司于1996年研究发现，非甾体抗炎药(nonsteroidal anti-inflammaorydrug，NSAID)吲哚美辛(Indomethacin)可以和PPARγ结合并产生激动活性，在10-4mol/L浓度下，可诱导PPARγ产生40倍的活性；在10-5浓度下，其激动活性的EC50值大约达到4×10-5mol/L，与已经上市的PPARγ激动剂罗格列酮相近；另外吲哚美辛和罗格列酮在PPARγ蛋白受体竞争抑制实验中，IC50值达到1×10-4mol/L。实验数据说明，以吲哚为母环的吲哚美辛是个很有效的PPARγ激动剂。
1999年，Henke等学者在吲哚美辛的基础上又发现了一个化合物(b)，对PPARγ也有很好的激动活性。在与PPARγ受体蛋白结合实验中，其pKi值为7.32±0.07，而阳性对照罗格列酮为7.33±0.02；其pEC50值为7.36±0.21，罗格列酮为7.05±0.07。这些数据说明，同样以吲哚为中间母环的化合物也是一个活性很强的PPARγ激动剂。另外，该化合物的一些衍生物也显示了较好地PPARγ活性激动活性。
发明内容：
本发明的目的是提供具有良好的PPARγ结合活性的新型吲哚类化合物，具体涉及一种5位或6位有苄氧基取代的吲哚类化合物及其类似物。
本发明的另一目的是提供上述有苄氧基取代的吲哚类化合物及其类似物的制备方法。
本发明新型吲哚类化合物具有通式(I)的结构：
X＝NH，S，O；Y＝NH，S，O；AA＝氨基酸；
Ar1＝苯基，取代苯基，芳杂环，取代芳杂环；
Ar2＝2，4-噻唑烷二酮，2，4-硫代噻唑烷二酮及其生物电子等排体；
R1＝氢，烷基，芳基，环烷基；
R2＝氢，烷基，芳基，环烷基；
本发明新型化合物初步药效学研究，通过与PPARγ蛋白结合实验，显示了良好的活性，可研制开发为具有PPARγ激动活性的新型抗2型糖尿病药物。本发明的优选化合物是具有下述化合物1或2或3的结构：
本发明所述的新型吲哚类化合物采用苄氧基苯甲醛和α-叠氮基乙酸乙酯经过缩合、环合、水解、脱羧得到两个重要中间体6-苄氧基吲哚和6-苄氧基吲哚-2-甲酸。反应式为：
经下述过程制备本发明化合物1：
化合物1的制备工艺包括：苄氧基苯甲醛和α-叠氮基乙酸乙酯经过缩合、环合、水解得到中间体6-苄氧基吲哚-2-甲酸，然后在DCC催化脱水下与甘氨酸乙酯缩合，后经水解得到化合物1。
经下述过程制备本发明化合物2：
化合物2制备工艺包括：中间体6-苄氧基吲哚以醋酸、四氢呋喃为溶剂，与甲醛水溶液和二甲胺水溶液反应引入二甲胺基甲基，然后以无水甲苯为溶剂，氢氧化钠碱性条件下与丙二酸二乙酯缩合得到化合物2。
经下述过程制备本发明化合物3：
化合物3备工艺包括：中间体6-苄氧基吲哚与DMF、三氯氧磷发生Vilsmeier反应生成6-苄氧基吲哚-3-甲醛；然后在醋酸/醋酸钠体系或哌啶/苯甲酸体系中与2，4-噻唑烷二酮缩合得到化合物3。
本发明的新型吲哚类化合物可以激活PPARγ，进而产生药理作用，如增加外周组织的胰岛素敏感性；改善胰岛素抵抗；降低血糖浓度；改善减少炎症反应；防止动脉粥样硬化等。
本发明新型吲哚类化合物通过PPARγ蛋白结合实验初步药效学研究，结果显示，本发明化合物有很好的PPARγ蛋白结合活性。其中化合物1的结合Kd值为2.58×10-6mol/L；化合物2的结合Kd值为7.23×10-6mol/L；化合物3结合Kd值为1.04×10-6mol/L，阳性对照物罗格列酮结合Kd值为4.98×10-6mol/L。表明本发明化合物可以研制开发新型抗2型糖尿病药物。
【具体实施方式】
实施例1合成化合物1，N-[2-(6-苄氧基吲哚)-甲酰基]-甘氨酸1)合成2-叠氮基-3-(4-苄氧基苯基)丙烯酸乙酯
2000ml圆底三颈烧瓶接冷凝管、干燥管，加入无水乙醇400ml，称取金属钠15.6g，做成乙醇钠，冷却至-8℃以下。将4-苄氧基苯甲醛48.2g(0.227mol)和α-叠氮基乙酸乙酯88.0g(0.682mol)溶解于350ml乙醇中。在氮气保护下缓慢滴加入烧瓶，温度始终控制在-5℃以下。滴加完毕，继续在氮气保护下-5℃反应1h。后TLC检验(展开剂∶氯仿∶甲醇＝10∶1)，显示反应结束。后将反应液倾入大量冰水中，搅拌均匀，有大量淡黄色固体析出，抽滤，用冰水洗涤固体至中性。后真空闭光干燥，得产物淡黄色固体66.1g(85.0％)m.p.96-98℃。1H-NMR(CDCl3)δ：1.39(t，3H，-CH2-CH3，J＝7.15)，4.35(q，2H，-CH2-CH3，J＝7.15)，5.10(s，2H，Ar-CH2-O-)，6.88(s，1H)，6.96～7.00(m，2H，phenyl-H)，7.32～7.45(m，5H，phenyl-H)，7.78～7.82(m，2H，phenyl-H)。
2)合成2-乙氧羰基-6-苄氧基吲哚
在1000ml圆底三颈烧瓶中，加入二甲苯300ml，加热至回流。将2-叠氮基-3-(4-苄氧基苯基)丙烯酸乙酯30.2g(0.099mol)溶解于300ml二甲苯中，在氮气保护回流的状态下，逐滴缓慢加入到烧瓶中。滴加完毕后继续在氮气保护下回流1.5h，后TLC检验(展开剂∶氯仿)，显示反应结束。自然冷却至室温放置过夜。有大量晶体析出，抽滤。滤液水泵减压浓缩至小体积，冷却至室温后有晶体析出，抽滤，用少量二甲苯洗涤。后两次晶体合并，真空干燥，得产物白色晶体23.4g(80.1％)m.p.132-134℃(文献m.p.135℃)。1H-NMR(CDCl3)δ：1.40(t，3H，-CH2-CH3，J＝7.24)，4.38(q，2H，-CH2-CH3，J＝7.24)，5.11(s，2H，Ar-CH2-O-)，6.89～6.92(m，2H，indole-3，7-H)，7.16(dd，1H，J＝0.58，1.95，indole-5-H)，7.32～7.48(m，5H，phenyl-H)，7.56(dd，1H，J＝0.58，9.98，indole-4-H)，8.76(s，1H，indole-NH)
MSm/e：295(M+)91(100％)91，204，295，158，130，176，65，102
3)合成6-苄氧基吲哚-2-甲酸
在500ml圆底烧瓶中加入2-乙氧羰基-6-苄氧基吲哚3.9g(0.0132mol)、2mol/L氢氧化钠溶液200ml、无水乙醇150ml，加热回流1h，TLC检验(展开剂∶氯仿∶甲醇∶甲酸＝10∶1∶0.1)，显示反应结束。后减压蒸馏掉乙醇，冷却至室温，有晶体析出。抽滤，晶体用适量氯仿洗涤后抽干，转移至250ml烧杯中。加入蒸馏水和乙酸乙酯各80ml，搅拌均匀后缓慢滴加10％盐酸，调节pH至酸性2-3，静置后分液。分离乙酸乙酯层和水层，水层用适量新的乙酸乙酯萃取三次。后合并乙酸乙酯层，用饱和食盐水洗涤至中性，无水硫酸镁干燥过夜。折滤掉硫酸镁，乙酸乙酯减压蒸干，后用乙酸乙酯重结晶得产物白色固体3.2g(90.8％)m.p.199-201℃(文献m.p.203-205℃)。1H-NMR(DMSO-d6)δ：5.10(s，2H，Ar-CH2-O-)，6.78(dd，1H，J＝2.55，8.74，indole-5-H)，6.93(d，1H，J＝1.82，indole-3-H)，6.99(d，1H，J＝1.46，indole-7-H)，7.29～7.46(m，5H，phenyl-H)，7.50(d，1H，J＝8.74，indole-4-H)，11.55(s，1H，-COOH)，12.69(s，1H，indole-NH)
MSm/e：267(M+)91(100％)91，267，65，158，92，130，176，102
4)合成N-[2-(6-苄氧基吲哚)-甲酰基]-甘氨酸乙酯
在250ml圆底烧瓶中加入甘氨酸乙酯盐酸盐287mg(0.002mol)，再加入二氯甲烷100ml溶解，冷却至-5℃以下，逐滴加入三乙胺0.3ml(0.0022mol)，后缓慢分批加入6-苄氧基吲哚-2-甲酸0.5g(0.00187mol)、DCC0.45g(0.0022mol)，后干燥条件下室温搅拌反应过夜。TLC检验(展开剂∶乙酸乙酯∶石油醚＝1∶2)，显示反应基本结束。过滤掉不溶固体，二氯甲烷层用大量饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥过夜。后用硅胶柱层析(洗脱剂∶石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)纯化得产物白色固体0.37g(56.2％)m.p.131～134℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ：1.20(t，3H，-CH2-CH3，J＝7.03)，3.99(d，2H，-NH-CH2-，J＝5.81)，4.11(q，2H，-CH2-CH3，J＝7.03)，5.09(s，2H，Ar-CH2-O-)，6.76(dd，1H，indole-5-H，J＝2.13，8.56)，6.95(d，1H，indole-7-H，J＝2.13)，7.06(d，1H，indole-3-H，J＝1.84)，7.29～7.32(m，1H，phenyl-4-H)，7.36～7.39(m，2H，phenyl-2，6-H)，7.45～7.46(m，2H，phenyl-3，5H)，7.50(d，1H，indole-4-H，J＝8.56)，8.79(t，1H，CO-NH-，J＝5.81)，11.41(s，1H，indole-NH)
MSm/e：352(M+)91(100％)91，187，261，352，158，131，65，103
5)合成N-[2-(6-苄氧基吲哚)-甲酰基]-甘氨酸
在250ml圆底烧瓶中加入甘氨酸乙酯吲哚(46)100mg(2.84×10-4mol)，再加入100ml乙醇搅拌溶解，后用冰浴冷却，然后缓慢滴加2mol/L氢氧化钠水溶液50ml，室温搅拌反应2h。TLC检验(展开剂∶氯仿∶甲醇∶甲酸＝10∶1∶0.1)，显示反应结束。过滤掉不溶固体，后减压蒸掉乙醇，再加入乙酸乙酯100ml，冰浴搅拌条件下用10％稀盐酸溶液调节pH至2。再静置分液，分出乙酸乙酯层，水层再用少量乙酸乙酯提取三次。合并乙酸乙酯层，用饱和食盐水洗至中性，再用无水硫酸镁干燥5h。折滤掉硫酸镁固体，后用硅胶柱层析(洗脱剂∶氯仿∶甲醇∶乙酸＝10∶1∶0.1)纯化得产物白色固体58mg(61.2％)m.p.189～193℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ：3.93(d，2H，-NH-CH2-，J＝5.85)，5.10(s，2H，Ar-CH2-O-)，6.77(dd，1H，indole-5-H，J＝2.34，8.78)，6.96(s，1H，indole-3-H)，7.05(d，1H，indole-7-H，J＝1.17)，7.29～7.33(m，1H，phenyl-4-H)，7.36～7.40(m，2H，phenyl-2，6-H)，7.45～7.47(m，2H，phenyl-3，5H)，7.49(d，1H，indole-4-H，J＝8.59)，8.63(t，1H，CO-NH-，J＝5.85)，11.34(s，1H，indole-NH)MS m/e：324(M+)91(100％)91，324，233，187，158，130，65，103
实施例2：合成化合物2 2-乙氧羰基-3-[3-(6-苄氧基吲哚)]-丙酸乙酯1)合成6-苄氧基吲哚
在500ml圆底烧瓶中加入6-苄氧基吲哚-2-甲酸17.8g(0.066mol)、铜粉5.0g、喹啉200ml，在氮气保护下加热回流1.5h。TLC检验(展开剂∶氯仿)，显示反应结束。冷却至室温后减压蒸馏掉喹啉，冷却后加入200ml乙酸乙酯，搅拌溶解后过滤掉不溶铜粉。后用适量10％盐酸洗涤，再用饱和食盐水洗至中性，然后用适量饱和碳酸氢钠溶液洗涤，再用饱和食盐水洗至中性，用适量无水硫酸镁干燥过夜。折滤掉硫酸镁，减压蒸干，得棕色固体。后用硅胶柱层析(洗脱剂∶氯仿)纯化得产物白色固体12.1g(82.2％)m.p.112-114℃(文献m.p.111-112℃)。1H-NMR(CDCl3)δ：5.12(s，2H，Ar-CH2-O-)，6.49(brs，1H，indole-2-H)，6.89(dd，1H，J＝2.20，8.52，indole-5-H)，6.95(d，1H，J＝1.92，indole-7-H)，7.10(t，1H，J＝3.30，2.47，indole-3-H)，7.31～7.34(m，1H，phenyl-4-H)，7.37～7.41(m，2H，phenyl-2，6-H)，7.46～7.48(m，2H，phenyl-3，5-H)，7.52(d，1H，J＝8.52，indole-4-H)，8.02(s，1H，indole-NH)
2)合成3-二甲氨基甲基-6-苄氧基吲哚
在500ml圆底烧瓶中加入33％二甲胺水溶液6.5ml，后冷却至5℃以下，缓慢加入冰醋酸20ml，后加入甲醛水溶液3.4ml，然后再加入四氢呋喃120ml，搅拌均匀。后将6-苄氧基吲哚9.1g(0.0408mol)溶解于100ml四氢呋喃中，在冰浴条件下缓慢滴加入烧瓶。后在氮气保护下，室温反应2h后TLC检验(展开剂∶氯仿)，显示反应基本结束。后加入5％硫酸水溶液200ml，搅拌均匀后过滤，收集滤液。然后滤液用2N的氢氧化钠水溶液缓慢调节pH至12以上，有大量白色絮状固体析出。后抽滤，固体用大量蒸馏水洗涤后减压干燥，得产物白色固体10.8g(91.0％)m.p.177～178℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ：2.12(s，6H，-N(CH3)2)，3.47(s，2H，-CH2-N-)，5.10(s，2H，Ar-CH2-O-)，6.71(dd，1H，indole-5-H，J＝1.92，8.52)，6.91(d，1H，indole-7-H，J＝1.92)，7.05(s，1H，indole-2-H)，7.30～7.33(m，1H，phenyl-4-H)，7.37～7.41(m，2H，phenyl-2，6-H)，7.45～7.47(m，3H，phenyl-3，5-H，indole-4-H)，10.69(s，1H，indole-NH)
3)合成2-乙氧羰基-3-[3-(6-苄氧基吲哚)]-丙酸乙酯
在250ml三颈圆底烧瓶中加入用金属钠干燥的甲苯120ml，0.5g NaOH，后加入丙二酸二乙酯1.5ml，接干燥管、回流冷凝管回流1h后冷却至室温，溶液显出白色浑浊。后加入3-二甲氨基甲基-6-苄氧基吲哚1.0g(3.57×10-3mol)，加热回流，并在整个体系内鼓吹入干燥氮气，回流10h后，TLC检验(展开剂∶氯仿∶甲醇∶三乙胺＝10∶1∶0.1)，显示反应基本结束。后减压蒸干甲苯，冷却后用足量乙酸乙酯搅拌溶解，后折滤掉不溶固体。乙酸乙酯层用饱和食盐水洗涤三次后用无水硫酸镁干燥过夜。折滤掉无水硫酸镁，减压蒸干乙酸乙酯后，用硅胶柱层析(洗脱剂∶石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1)纯化得产物2-乙氧羰基-3-[3-(6-苄氧基吲哚)]-丙酸乙酯白色固体781mg(55.4％)m.p.162～165℃。1H-NMR(CDCl3)δ：1.21(t，6H，2(-CH2-CH3)，J＝7.10)，3.34～3.37(m，2H，-CH2-CH-)，3.74(t，1H，-CH2-CH-，J＝7.60)，4.13～4.20(m，4H，2(-CH2-CH3))，5.09(d，2H，Ar-CH2-O-，J＝3.91)，6.87～6.92(m，3H，indole-2，5，7-H)，7.31～7.33(m，1H，phenyl-4-H)，7.36～7.40(m，2H，phenyl-2，6-H)，7.44～7.49(m，3H，phenyl-3，5-H，indole-2-H)，7.88(m，1H，indole-NH)
MSm/e：395(M+)304(100％)304，395，91，305，145，396，158，236
实施例3合成化合物3 3-[5-(2，4-噻唑烷二酮)-烯基]-6-苄氧基吲哚1)合成6-苄氧基吲哚-3-甲醛
在500ml圆底烧瓶中加入DMF50ml，冷却至-5℃以下，然后缓慢滴加氧氯化磷7ml，滴加完毕后将6-苄氧基吲哚6.2g(0.0278mol)溶解于50ml DMF中，缓慢滴加入烧瓶中，温度保持在-5℃以下。滴加完毕后在45～50℃搅拌反应3h，TLC检验(展开剂∶乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1)，显示反应基本结束。后冰浴条件下缓慢加入100g冰水，然后剧烈搅拌下加入2N氢氧化钠水溶液200ml，后加热回流至无二甲胺气体放出。冷却至室温，抽滤固体，后用大量水洗至中性，抽干减压干燥后用硅胶柱层析(洗脱剂∶氯仿∶甲醇＝20∶1)得产品淡棕色固体6.7g(97.4％)m.p.210～214℃(文献m.p.℃)。1H-NMR(DMSO-d6)δ：5.13(s，2H，Ar-CH2-O-)，6.93(dd，1H，indole-5-H，J＝2.47，8.66)，7.05(d，1H，indole-7-H，J＝2.47)，7.29～7.33(m，1H，phenyl-4-H)，7.36～7.40(m，2H，phenyl-2，6-H)，7.45～7.47(m，2H，phenyl-3，5-H)，7.93(d，1H，indole-4-H，J＝8.52)，8.14(d，1H，indole-2-H，J＝3.02)，9.84(s，1H，-CHO)，11.93(s，1H，indole-NH)
2)合成3-[5-(2，4-噻唑烷二酮)-烯基]-6-苄氧基吲哚
在250ml圆底烧瓶中加入6-苄氧基吲哚-3-甲醛(72)1.0g(3.9×10-3mol)、2，4-噻唑烷二酮0.558g(4.8×10-3mol)、苯甲酸80mg(6.2×10-4mol)，然后加入Na干燥处理的甲苯100ml，后滴加哌啶0.2ml，后接分水器、回流冷凝管、干燥管。加热回流2h后TLC检验(展开剂∶乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1)，显示反应基本结束。冷却至室温后有大量黄色固体析出，抽滤后先用甲苯洗涤，再用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1的混合溶剂进行洗涤。固体减压干燥后得到黄色粉末状固体1.33g(95.5％)m.p.167～169℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ：5.14(s，2H，Ar-CH2-O-)，6.89(d，1H，indole-5-H，J＝8.76)，7.03(s，1H，indole-7-H)，7.29～7.33(m，1H，phenyl-4-H)，7.36～7.40(m，2H，phenyl-2，6-H)，7.45～7.47(m，2H，phenyl-3，5-H)，7.58(d，1H，indole-CH＝，J＝2.20)，7.76(d，1H，indole-4-H，J＝8.76)，7.97(s，1H，indole-2-H)，11.91(s，1 H，thio-NH，J＝2.75)，12.26(s，1H，indole-NH)
MSm/e：350(M+)91(100％)91，259，350，188，351，160，260，65
实施例4.PPARγ蛋白结合实验
实验原理：
用BL21(DE3)细胞和pET15b-hPPARγ-LBD质粒经过培养可得到转录表达的PPARγ-LBD(PPARγ ligand binding domain)。该蛋白经纯化后溶解稀释到醋酸钠缓冲溶液中。使该缓冲溶液在25℃，流速为20μL/min情况下进入表面等离子共振生物传感器。该传感器的生物芯片上联有亲水性羧甲基取代的右旋糖苷。当PPARγ-LBD蛋白流经芯片时，蛋白就能够通过氨基偶联反应与右旋糖苷以共价键形式偶联，从而使PPARγ-LBD蛋白固定到该生物芯片上。当PPARγ配基在缓冲溶液中与固定在芯片上的PPARγ-LBD蛋白结合时，传感器可以感受芯片上的信号变化，来评价蛋白-配基结合反应的平衡常数KD(即该结合反应速率达到最高速率一半时的样品浓度，该数值越小，说明蛋白与配基的结合能力越强)。
(A：PPARγ-LBD，B：ligand，AB：complex)
实验仪器及试剂：
表面等离子共振生物传感器(Biacore3000型，购于Biacore公司)；
pET15b-hPPARγ-LBD质粒(购于Department of Structural Chemistry，Pharmacia andUpjohn，Stockholm，Sweden)；
LB培养基、BL21(DE3)细胞、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)；镍-氨三乙酸分离柱；
DMSO、Hepes(N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-2-乙烷磺酸钠)、醋酸钠、咪唑、NaCl、EDTA、表面活化剂P20(均为国产分析纯)；
阳性对照罗格列酮(购于CAYMAN Chem.Co.USA)。
1.在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中加入BL21(DE3)细胞和pET15b-hPPARγ-LBD质粒，在37℃下进行培养。再加入0.2mM异丙基B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，20℃培养5小时，使PPARγ-LBD得到转录表达。然后加入NaCl/Pi缓冲溶液通过超声波降解阻断转录。离心后分离上清液，然后将上清液通过一个镍-氨三乙酸分离柱进行柱层析，洗脱剂先后分别用缓冲溶液A(NaCl/Pi，含有10mM咪唑，pH8.8)和B(NaCl/Pi，含有25mM咪唑，pH8.8)。最后再用缓冲溶液C(NaCl/Pi，含有500mM咪唑，pH8.8)洗脱，对得到的缓冲溶液C进行分离浓缩即可得到PPARγ-LBD蛋白和咪唑的复合物。最后用HBS-EP缓冲溶液(10mM Hepes、150mM NaCl、3.4mM EDTA、0.005％表面活化剂P20，pH7.4)对该复合物进行透析，可得到经纯化的PPARγ-LBD蛋白。
2.配制pH4.3的10nM的醋酸钠缓冲溶液，加入表达纯化的PPARγ-LBD，混合均匀。后使该缓冲溶液进入表面等离子共振生物传感器，25℃，流速为20μL/min情况下流经芯片探头，直至PPARγ-LBD蛋白固定到该生物芯片上，使基线达到稳定。
3.待测样品及阳性对照物分别溶解于DMSO中，配制成10-2mol/L溶液。后用HBS-EP溶液分别稀释至10-5mol/L，10-6mol/L浓度。
4.将待测样品进样至生物传感器中，25℃，流速为20μL/min情况下流经固定在芯片探头上PPARγ-LBD蛋白，通过检测传感器接收信号的变化，评价蛋白-配基结合反应的平衡常数KD。
表1是化合物1、2、3的PPARγ蛋白结合实验结果。
表1
编号 化合物结构 蛋白结合试验
反应平衡常数
KD(mol/L)
1 2.58×10-6
2 7.23×10-6
3 1.04×10-6
ROG
阳性对照 4.98×10-6
结果表明，本发明化合物1(2.58×10-6mol/L)和3(1.04×10-6mol/L)的结合活性要优于阳性对照罗格列酮(4.98×10-6mol/L)，化合物2(7.23×10-6mol/L)的结合活性和罗格列酮相似。