一种从海星中提取海星甾体皂甙的方法 【技术领域】
本发明涉及一种从海星中提取海星甾体皂甙的方法，具体是一种利用超临界CO2强化萃取的方法从海星中提取海星甾体皂甙的方法。
背景技术
合成抗生素与激素类药物的滥用导致人体、生物体、甚至整个生态系统的细菌耐药性不断增强，给生态环境安全带来重大隐患，使人类面临严峻的健康挑战。因此，从天然产物中制备活性独特、广谱抗菌的天然活性物质，以开发安全高效的天然抗病毒的药物，对于维护人类健康与生态环境安全具有重要意义。
海星是我国海域常见海洋生物，近年来，在海星体内发现多种结构独特，活性显著甾体皂甙化合物。生物化学与药理学的研究证实：海星甾体皂甙化合物普遍具有强烈的细胞毒性，具有抗真菌、镇静、抗炎的生理活性，根据海星皂甙这些生理活性，利用先进的分离技术，采取清洁生产的方式，最大限度地利用海星资源、能源，确保所获取的甾体物质为“绿色产品”，以开发为安全高效的抗病毒药物、生物农药。
目前对于海星甾体皂甙制备方法，多采用传统的溶剂提取法，存在工艺复杂、工序长、物耗与能耗大等缺点，在生产过程中也有大量有机溶剂和废水排除。此外，部分皂甙成分在长时间加热过程中易分解，使得产品生理活性降低，从而影响产品质量。超临界CO2萃取具有流程简单、操作方便、高效节能、快速、选择性好等优势，同时，由于CO2的化学惰性，不需进行溶剂后处理地萃取方式，能够保持提取成分和萃余物的天然活性，符合人们“回归自然，崇尚绿色”的要求是实现生物活性物质清洁生产的有效途径之一。将该技术引入到海星甾体皂甙的萃取，不仅工艺优越，质量上稳定且容易控制。从而有效地保证产品的有效性与安全性。
必须看到的是，由于SC-CO2较弱的范德华力和较低的介电常数的性质，不适宜于极性较大或大分子物质的萃取，极大地限制了其在生物资源萃取分离的应用。而海星甾体皂甙的极性较大，单纯用SC-CO2萃取效果不理想。因此，需要对SC-CO2萃取体系进行改进，使之能够萃取海星皂甙等极性物质，并提高萃取效率，克服SC-CO2萃取极性物质的局限，使该项技术真正得到大规模的运用。
【发明内容】
本发明的目的在于针对已有技术存在的缺点，提供一种经改进的SC-CO2萃取方法从海星中提取海星皂甙的方法。用本发明的方法萃取海星皂甙，提取方法简便，节能明显，工艺条件优越且容易控制，海星皂甙的产率得到较大提高。所制备的海星皂甙质量稳定可控，生理活性显著。
为达到上述目的，本发明采取了如下技术方案：
一种从海星中提取海星甾体皂甙的方法，包括如下步骤：
1、将海星全体洗净去杂，干燥后粉碎至粒径为20～40目；
2、将粉碎后的海星干粉放入超临界CO2萃取器中，加入溶有表面活性剂的溶剂作为助溶剂，其中，海星干粉∶助溶剂＝1∶1～3(g∶mL)；助溶剂中的表面活性剂浓度为0.01mol/L～0.05mol/L；
3、萃取及分离。
其中，步骤2所述的溶剂是甲醇、乙醇、正丁醇、蒸馏水、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、丙酮等常用溶剂的一种或一种以上的混合物；所述的表面活性剂可以是：十二烷基硫酸钠SDS、十二烷基苯磺酸钠SDBS、二辛酯琥珀酸磺酸钠AOT、CTBA十六烷基三甲基溴化铵、辛基酚聚氧乙烯醚Triton100，TX-10、缩水山梨醇单油酸酯Span80、聚氧乙烯缩水山梨醇单油酸酯Tween80的一种或一种以上的混合物；
步骤3所述的萃取及分离工艺为常规工艺，所涉及到的工艺参数为萃取温度为293～353K，萃取压力为10～40MPa，萃取时间为0.5～8h；分离温度为303～353K，分离压力为0～20MPa。
优选的助溶剂中的溶剂由乙醇、正丁醇及水组成，其中正丁醇体积分数为0.2～1.0，水的体积分数为0.05～0.25，其余为乙醇；助溶剂中的表面活性剂的浓度为0.01mol/L到0.05mol/L。
与已有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)使用表面活性剂的多元醇作为助溶剂，超临界CO2萃取不仅产率较传统溶剂法有较大提高，同时具有良好的选择性，直接可获得较高纯度的海星皂甙的萃取物。
(2)传统的溶剂提取法索氏法需要24h以上，冷浸法需更长的时间，使用超临界CO2海星皂甙仅需3h，处理时间大大缩短。同时简化了海星皂甙的制备流程，具有高效节能的特点。
(3)利用超临界CO2萃取技术制备的海星甾体质量稳定且易于控制，保持了海星甾体的生物活性，使得到的海星皂甙的细胞毒性明显高于溶剂法，充分体现了超临界CO2的“绿色”特性。
【附图说明】
图1为本发明方法所使用的装置的示意图；
其中，1-CO2钢瓶 2-过滤器 3-冷机 4-高压计量泵、5-换热器6-萃取器 7、8-分离器1、2，9-转子流量计 10-累积流量计。
【具体实施方式】
以下结合具体实施例来对本发明作进一步说明。
以下实施例所用到的海星是南海产多棘海星(Asterias amurensis)，所涉及的超临界流体是CO2，食品级，大于99.5％。工艺方法为一级萃取及二级分离，分别从分离器1、分离器2中接受萃取物，并进行分析。
实施例1
称取200g海星干粉放入萃取罐中，使用CO2做超临界流体，萃取压力为25MPa，萃取温度为323K。采取一级分离，分离柱压力为5MPa，分离柱温度为333K，萃取时间为3h。萃取物从分离器中放出，称重，并计算总提取物的产率。利用紫外可见分光光度法测定提取物中海星皂甙的含量，并计算产率。经测定，总提取物的产率为1.98％，海星皂甙基本未被萃出。
本实施例说明纯超临界CO2只能将海星脂溶性的部分萃取出来，而不能将极性较大的皂甙部位提取出来。
实施例2
称取200g海星干粉放入萃取罐中，按实施案例1的方法脱脂。萃取温度323K、压力25MPa，分别使用甲醇、95％乙醇作为助溶剂，先加入200mL助溶剂，静态萃取0.5h，1h后再用泵加入助溶剂100mL，1h后再用泵加入助溶剂100mL。其余条件和方法同实施例1。萃取结果见表1。
表1 不同类型助溶剂对海星皂甙萃取的影响
总提取物产率 海星皂甙的产率 总提取物中海星
助溶剂种类
(％) (％) 皂甙的含量
乙醇 2.18 0.59 27.06
甲醇 2.25 0.62 27.56
按实施案例1脱脂的目的是减少海星脂溶性物质中的甾体类物质对海星皂甙测定的干扰。本例还说明，乙醇与甲醇作为助溶剂海星总皂甙的收率基本相当，所以选择没有毒性的乙醇作为助溶剂。
实施例3
称取200g海星干粉放入萃取罐中，按实施案例1的方法脱脂。配制0.01mol/L的AOT、TX-10、CTBA、Span、AGP、Tween的表面活性剂-乙醇溶液为助溶剂，加入200mL于萃取器中，在温度323K、压力25MPa下静态萃取3h，按实施例1方法计算总提取物、海星皂甙的产率，以及提取物中海星皂甙的含量，结果如表2。
表2 不同类型表面活性剂对海星皂甙萃取的影响
总提取物产率 海星皂甙的产率 总提取物中海星皂
表面活性剂
(％) (％) 甙的含量(％)
无 1.06 0.25 23.58
AOT 1.32 0.36 27.27
TX-10 1.25 0.31 24.80
CTBA 1.22 0.29 23.77
Span 1.09 0.25 22.94
DDS 1.18 0.29 24.58
Tween 1.15 0.28 24.35
本实施例说明，部分表面活性剂对海星皂甙有增溶作用，其中AOT与TX-10的增溶效果比较明显。
实施例4
在乙醇中加入正丁醇，按正丁醇体积分数xi为0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1配制乙醇-正丁醇的多元醇溶液，以0.01mol/L的AOT上述多元醇溶液为助溶剂，在实施例3的条件下萃取海星皂甙，萃取结果如表3所示。
本实施例说明，中等碳链的脂肪醇有促使表面活性剂在SC-CO2形成反胶团能力，促进更多海星皂甙增溶。
表3 多元醇对海星皂甙萃取的影响
正丁醇体积分数 总提取物产率 海星皂甙的产率 总提取物中海星皂
xi(mL/mL) (％) m(％) 甙的含量c(％)
0 1.32 0.36 27.27
0.2 1.38 0.4 28.99
0.4 1.46 0.45 30.82
0.5 1.42 0.42 29.58
0.6 1.34 0.39 29.10
0.8 1.31 0.35 26.72
1 1.13 0.29 25.66
实施例5
按2∶3(V/V，体积比)配制正丁醇-乙醇混合醇，添加一定量的蒸馏水，使水的体积分数为0.05、0.1、0.15、0.2、0.25，以该混和溶液为助溶剂，萃取条件同实施例3，海星皂甙萃取结果如表4所示。
表4 水的体积分数对海星皂甙萃取的影响
水体积分数xi 总提取物产率 海星皂甙的产率 总提取物中海星
(mL/mL) (％) m(％) 皂甙的含量c(％)
0 1.46 0.45 30.82
0.05 1.58 0.49 31.01
0.1 1.62 0.54 33.33
0.15 1.69 0.59 34.91
0.2 1.59 0.45 28.30
0.25 1.46 0.39 26.71
本实施例说明，加入少量水后，使胶团膨胀形成微乳，微水核分散在SC-CO2中，使海星皂甙大量增溶。
实施例6
按水xi＝0.15、正丁醇xi＝0.34、乙醇xi＝0.51配制水/正丁醇/乙醇混合溶液，按0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mol/L的浓度配制表面活性剂/混合醇溶液，使用该混和溶液为助溶剂，其余萃取条件如实施例3，海星皂甙的萃取结果表5。
表5 AOT浓度对海星皂甙萃取的影响
AOT浓度 总提取物产率 海星皂甙的产率 总提取物中海星皂
(％) m(％) 甙的含量c(％)
0 1.01 0.27 26.73
0.01 1.69 0.59 34.91
0.02 1.78 0.68 38.20
0.03 1.85 0.79 42.70
0.04 1.82 0.79 43.41
0.05 1.78 0.75 42.13
本实施例说明，表面活性剂的浓度增大，形成的微乳数目更多，使得对海星皂甙的增溶量增大。当表面活性剂的浓度超过其在SC-CO2中溶解度，对皂甙的增溶不再起作用。
实施例7
按水xi＝0.15、正丁醇xi＝0.34、乙醇xi＝0.51配制水/正丁醇/乙醇混合溶液，固定AOT浓度为0.04mol/L，改变TX-10浓度，使AOT的摩尔分数yi分别为1、0.9、0.8、0.75、0.67、0.5，配制上述AOT/TX-10复合表面活性剂的水/正丁醇/乙醇混合溶液为助溶剂，按实施例3条件萃取，萃取结果如表6。
表6 AOT/TX-10复合表面活性剂对海星皂甙萃取的影响
AOT的摩尔分数 总提取物产率 海星皂甙的产率 总提取物中海星皂
yi (％) m(％) 甙的含量(％)
1 1.82 0.79 43.41
0.9 1.91 0.89 46.60
0.8 1.98 1.02 51.52
0.75 1.76 0.75 42.61
0.67 1.75 0.69 39.43
0.5 1.65 0.58 35.15
该实施例说明，AOT/TX-10的组成的阴离子/非离子复合表面活性剂，在正丁醇/乙醇多元醇的作用下，表现出协调增效作用，增溶较多的水量形成SC-CO2微乳或类似微乳体系，对海星皂甙在二次加溶。
实施例8
按(4∶1，mol/mol)比例配制AOT/TX-10复合表面活性剂，按(4∶1，mol/mol)比例配制AOT/TX-10复合表面活性剂，取适量溶于按一定比例正丁醇、乙醇、蒸馏水的混合溶液中，配制为一定浓度AOT/TX-10复合表面活性剂的多元助溶剂溶液。将配好的多元助溶剂按与海星原料液固比为1的比例(体积∶质量，mL/g)用计量泵泵入萃取器中，静态萃取30min，调节CO2流量在设定的温度压力下进行动态萃取。在1h、2h时分别再泵入液固比为0.5的多元助溶剂。采取一级萃取、二级分离的方法进行萃取，整个萃取流程0.5h。表面活性剂在混合醇中浓度为0.05～0.1mol/L，加入水的比例为0.15～0.25(占混合醇的体积分数)；萃取压力设定在较高的范围25～30MPa，萃取温度313～323K；按七因素三水平的正交表根据测定分离器1中总提取物产率、海星皂甙的产率，与胆甾醇在总提取物中的含量为指标，进行多指标的级差与方差分析，得到最优工艺条件，在此条件下，总提取物产率为2.26％、0.84％，总提取物中海星皂甙的含量为58.85％。
本实施例说明，采取二级分离的方式，表面活性剂与大部分溶剂在分离2析出，萃取物在分离1析出，减少了溶剂后处理量。同时使用该方法得到的海星皂甙的产率、纯度较溶剂法提高了2.4、1.87倍，说明超临界CO2/多元助溶剂萃取皂甙，利用形成的微乳或类似微乳体系对皂甙的专属性，提高了皂甙的选择性，为海星皂甙的进一步精制，提高回收率创造了条件。