用作瘦蛋白受体调节剂的哌嗪衍生物及其用途 发明领域 本发明涉及新的哌嗪衍生物、包含这些化合物的药物组合物、其制备方法以及 这些化合物作为瘦蛋白 (leptin) 受体调节剂模拟物在制备针对与体重增加有关的病症、 II 型糖尿病和异常脂血症的药物中的用途。
背景技术 在工业化社会中肥胖普遍增多。 通常，一线治疗为给予患者饮食和生活方式的 建议，如减少其饮食中脂肪含量并增加其体力活动。 但是，一些患者可能还需要进行药 物治疗来维持采取前述饮食和生活方式改变而得到的有益结果。
瘦蛋白为一种在脂肪细胞中合成的激素，其被认为是作用于下丘脑来减少食物 摄取和减轻体重 ( 参见例如 Bryson，J.M.(2000)Diabetes，Obesity and Metabolism( 肥胖和 新陈代谢 )，2 ：83-89)。
已表明，肥胖人群的脑脊液中瘦蛋白与循环瘦蛋白的比例减少 (Koistinen 等， (1998)Eur.J.Clin.Invest.28 ：894-897)。 这表明在肥胖状态下瘦蛋白转运至脑的能力不 足。 事实上，在肥胖症动物模型 (NZO 小鼠和 Koletsky 大鼠 ) 中，已表明瘦蛋白转运 的缺陷导致脑中瘦蛋白的量减少 (Kastin， A.J.(1999)Peptides 20 ：1449-1453 ；Banks， W.A. 等， (2002)Brain Res.950 ：130-136)。 在涉及饮食诱导性肥胖的啮齿类动物 ( 啮 齿 类 模 型 被 认 为 是 更 接 近 人 类 肥 胖 症 的 模 型， 参 见 例 如 VanHeek 等 (1997)， J.Clin. Invest.99 ：385-390) 的研究中，外周给予的过量瘦蛋白表现出不能有效地减少食物摄取 和体重，然而将瘦蛋白直接注射进脑内能有效地减少食物摄取和体重。 还表明在具有过 量循环瘦蛋白的肥胖人群中，信号转导系统对瘦蛋白受体的连续刺激脱敏 (Mantzoros， C.S.(1999)Ann.Intern.Med.130 ：671-680)。
Amgen 已经进行了重组甲硫氨酰人瘦蛋白的临床试验。 这些试验的结果混杂， 这是因为即使在高瘦蛋白血浆浓度存在下体重减轻也是变化的，在受试的同组患者中平 均体重减轻相对较少 (ObesityStrategic Perspective， Datamonitor，2001)。
自从发现瘦蛋白基因编码序列后，已报导了数个寻找活性片段的尝试。 一个实 例为 Samson 等 (1996)Endocrinol.137 ：5182-5185，其描述了在 N- 末端 (22 至 56) 的活 性片段。 当脑室内 (ICV) 注射时，该序列表现出减少食物摄取，然而在 C- 末端取得的 序列未表现出具有任何作用。 瘦蛋白片段还公开在国际专利申请 WO 97/46585 中。
关注该序列 C- 末端部分的其他报告报道，116-130 片段可能刺激促黄体激素的 产生 (Gonzalez 等，(1999)Neuroendocrinology 70 ：213-220) 并在给予 GHRH 后对 GH 产 生起作用 ( 片段 126-140)(Hanew(2003)Eur.J.Endocrin.149 ：407-412)。
最近瘦蛋白被认为与炎症有关。 据报导，在细菌感染期间和炎症期间，循环 瘦蛋白水平增加 ( 参见 Otero， M 等， (2005)FEBS Lett.579 ：295-301 以及文中参考文 献 )。 瘦蛋白还能通过增强来自炎性细胞的促炎细胞因子 TNF 和 IL-6 的释放来增加炎 性 (Zarkesh-Esfahani， H 等， (2001)J.Immunol.167 ：4593-4599)。 这些作用剂继而通
过降低胰岛素受体信号转导的效能造成肥胖患者中常见的胰岛素抵抗 (Lyon， C.J. 等， (2003)Endocrinol.44 ：2195-2200)。 持续的轻度炎症被认为与肥胖症有关 ( 在存在或不存 在胰岛素抵抗和 II 型糖尿病的情况下 )(Browning 等， (2004)Metabolism 53 ：899-903， Inflammatorymarkers elevated in blood of obese women( 在肥胖女性血液中炎性标记升高 ) ； Mangge 等， (2004)Exp.Clin.Endocrinol.Diabetes 112 ：378-382， Juvenile obesity correlates with serum inflammatory marker C-reactiveprotein( 青少年肥胖症与血清炎性标记 C- 反应 性蛋白有关 ) ；Maachi 等， (2004)Int.J.Obes.Relat.Metab.Disord.28 ：993-997， Systemic lowgrade inflammation in obese people( 肥胖人群中全身性轻度炎症 ))。 瘦蛋白还通过促进 脂质摄取至巨噬细胞和促进内皮功能障碍而涉及动脉粥样硬化形成的过程，从而促进动 脉粥样硬化斑块的形成 ( 见 Lyon， C.J. 等， (2003)Endocrinol.144 ：2195-2200)。
瘦蛋白还表现出促进新血管形成 ( 血管生成 )，该过程涉及脂肪组织的生长 (Bouloumie A，等， (1998)Circ.Res.83 ：1059-1066)。 血管生成还涉及糖尿病性视网膜 病 (Suganami， E. 等， (2004)Diabetes.53 ：2443-2448)。
血管生成也被认为是与供应异常肿瘤细胞的新血管的生长有关。 升高的瘦蛋白 水平与许多癌症，特别是人类的乳腺癌、前列腺癌和胃肠道癌有关 (Somasundar P. 等， (2004)J.Surg.Res.116 ：337-349)。 瘦蛋白受体激动剂还可在促进伤口愈合的药物的制备中使用 (Gorden， P. 和 Gavrilova， O.(2003)Current Opinion in Pharmacology 3 ：655-659)。
此外，已表明，脑中升高的瘦蛋白信号可能代表一种用于治疗抑郁性疾病的方 法 (Lu， Xin-Yun 等， (2006)PNAS 103 ：1593-1598)。
发明公开
意外地发现，式 (I) 化合物在减轻啮齿类动物体重和食物摄取方面有效。 虽然 不希望受理论的约束，但提出式 I 化合物调节瘦蛋白受体信号转导途径。
在一些实施方案中，具有瘦蛋白受体激动样性质的化合物可用于治疗与瘦蛋白 信号转导有关的疾病以及与体重增加有关的病症 ( 如肥胖 )。 本发明假定小分子 CNS 渗 透剂瘦蛋白模拟物将能够绕过限制性摄取系统而进入脑。 此外，发明人假设该情形反映 了人类肥胖状态，认为具有相对较长作用时间的有 CNS 活性的类瘦蛋白 (leptinoid) 将成 为对肥胖状态及其伴随的并发症 ( 特别是 ( 但不限于 ) 糖尿病 )) 的有效治疗。
在其他实施方案中，具有瘦蛋白受体拮抗样性质的化合物可用于治疗炎症、动 脉粥样硬化、糖尿病性视网膜病和肾病。
在第一方面，本发明涉及式 (I) 化合物，
或其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物、几何异构体、互变异构体、光学 异构体或 N- 氧化物，其中 ：
X1 和 X2 各自独立选自 N 和 CH ；
R1 选自氢、 C1-6- 烷基 ( 未被取代或被一个或多个独立选自卤素、羟基、氰基和 C1-6- 烷氧基的取代基任选取代 ) 和 C1-6- 酰基 ( 未被取代或被一个或多个独立选自卤素、 羟基和 C1-6- 烷氧基的取代基任选取代 ) ；
R2 和 R3 独立选自氢、卤素、羟基、C1-6- 烷基 ( 未被取代或被一个或多个独立选 自卤素、羟基和 C1-6- 烷氧基的取代基任选取代 ) 和 C1-6- 烷氧基 ( 未被取代或被一个或多 个独立选自卤素、羟基和 C1-6- 烷氧基的取代基任选取代 ) ；
R4 独立选自氢、卤素、羟基、氰基、硝基、 CF3、 C1-6- 烷基和 C1-6- 烷氧基 ；
Y 为 O、 C(R5A)(R5B) 或 N(R6) ；
R5A 和 R5B 各自独立为 C1-4- 烷基或与其连接的碳原子一起形成 3- 至 6- 元环烷基 环；
R6 为氢或 C1-4- 烷基 ；
a、 b 和 c 各自独立为 1、2 或 3 ；
d 和 e 各自独立为 0、1 或 2 ；
f 为 0、1、2 或 3 ；和
g 为 0、1 或 2 ；
前提是所述化合物不选自 ：
1.4-(2，4- 二甲基苯基 )-N-(1- 甲基 -4- 哌啶基 )-1- 哌嗪甲酰胺 ；
2.N-(1- 甲基 -4- 哌啶基 )-4-( 苯基甲基 )-1- 哌啶甲酰胺 ；
3.4- 苄基 -N-[2-(4- 甲基 -1- 哌嗪基 ) 乙基 ]-1- 哌啶甲酰胺 ；
4.4-(3- 甲基苯基 )-N-(1- 甲基 -4- 哌啶基 )-1- 哌嗪甲酰胺 ；
5.4-(4- 氯苯基 )-N-(1- 甲基 -4- 哌啶基 )-1- 哌嗪甲酰胺 ；
6.N-[2-(4- 甲基 -1- 哌嗪基 ) 乙基 ]-4- 苯基 -1- 哌嗪甲酰胺 ；
7.4-(3，4- 二甲基苯基 )-N-(1- 甲基 -4- 哌啶基 )-1- 哌嗪甲酰胺 ；
8.4-(2- 甲氧基苯基 )-N-(1- 甲基 -4- 哌啶基 )-1- 哌嗪甲酰胺 ；
9.4-(2- 氯苯基 )-N-(1- 甲基 -4- 哌啶基 )-1- 哌嗪甲酰胺 ；
10.N-[3-(4- 甲基 -1- 哌嗪基 ) 丙基 ]-4- 苯基 -1- 哌嗪甲酰胺 ；
11.4-(2- 羟基苯基 )-N-(1- 甲基 -4- 哌啶基 )-1- 哌嗪甲酰胺 ；
12.N-(1- 甲基 -4- 哌啶基 )-4-(4- 硝基苯基 )-1- 哌嗪甲酰胺 ；
13.4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 哌啶基 ) 乙酯 ；和
14.3- 甲基 -4-(3- 甲基苯基 )-N-(1- 甲基 -4- 哌啶基 )-1- 哌嗪 - 甲酰胺。
Y 优选为 O 或 C(R5A)(R5B)。
X2 优选为 N。
R1 优选选自氢、 C1-4- 烷基和 C1-4- 烷氧基 -C1-4- 烷基。
在一个最优选的实施方案中， R1 为氢、甲基、乙基或甲氧基乙基。
R2 和 R3 优选独立选自氢和 C1-4- 烷基。
在一个最优选的实施方案中， R2 和 R3 为氢。
R4 优选独立选自氢、卤素、 CF3、 C1-4- 烷基和 C1-4- 烷氧基。
在一个最优选实施方案中， R4 独立选自氢、氟、氯、 CF3、甲基和甲氧基。
R5A 和 R5B 均优选为甲基，或与它们连接的碳原子一起形成环戊基环。d 和 e 优选为 1。 f 优选为 1 或 2。 g 优选为 0 或 1。 特别优选的式 (I) 化合物为式 (I′ ) 化合物
其中 X1、 R1、 R4、 c、 f 和 g 如式 (I) 中定义。 具体的优选的式 (I) 化合物为选自以下的化合物 ： 1.4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯 ； 2.4-(4- 氯苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯 ； 3.4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸哌啶 -4- 基甲酯 ； 4.4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯 ； 5.4-(3- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯 ； 6.4-(4- 氟苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯 ； 7.4-(4- 甲氧基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯 ； 8.4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 [1-(2- 甲氧基乙基 ) 哌啶 -4- 基 ] 甲酯 ； 9.4-(4- 氟苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 [1-(2- 甲氧基乙基 ) 哌啶 -4- 基 ] 甲酯 ； 10.4-(4- 氯苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 [1-(2- 甲氧基乙基 ) 哌啶 -4- 基 ] 甲酯 ； 11.4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 [1-(2- 甲氧基乙基 ) 哌啶 -4- 基 ] 甲酯 ； 12.4-(4- 甲氧基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 [1-(2- 甲氧基乙基 ) 哌啶 -4- 基 ] 甲酯 ； 13.4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 乙酯 ； 14.4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 1- 甲基哌啶 -4- 基酯 ； 15.4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 [(3S)-1- 甲基吡咯烷 -3- 基 ] 酯 ； 16.4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 ； 17.4-(4- 氯苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 ； 18.4-(3- 三氟甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 ； 19.4-(3- 氟苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 ； 20.4-(2- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 ； 21.4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 ； 22.4-(2，5- 二甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 ； 23.4-(3，4- 二氯苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 ； 24.4-(2，4- 二氟苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 ； 25.4-(4- 甲氧基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 ； 26.3- 甲基 -4-(3- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 ； 27.4- 苄基哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 ； 28.4- 苯基哌啶 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 ；29.3- 苯基吡咯烷 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 ； 30.4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 2- 哌嗪 -1- 基乙酯 ； 31.4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 2-(4-(2- 甲氧基乙基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 ； 32.4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 乙基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 ； 33.4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基 -1，4- 二氮杂环庚烷 -1- 基 ) 乙 34.4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 3-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 丙酯 ； 35.1-[2，2- 二甲基 -3-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 丙酰基 ]-4- 苯基哌嗪 ； 36.1-{2，2- 二甲基 -3-[4-(4- 氯苯基 ) 哌嗪 -1- 基 ]-3- 氧代丙基 }-4- 甲基哌 37.1-{2，2- 二甲基 -3-[4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 基 ]-3- 氧代丙基 }-4- 甲基哌 38.1-{2，2- 二甲基 -3-[4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 基 ]-3- 氧代丙基 }-4- 乙基哌 39.1-[2，2- 二甲基 -3-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 丙酰基 ]-4-(4- 氟苯基 ) 哌嗪 ； 40.1- 甲基 -4-[(1-{[4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 基 ] 羰基 } 环戊基 ) 甲基 ] 哌嗪 ； 41.4-(4- 氟苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 ； 42.4-(4- 氟苄基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 ； 43.4-(4- 氯苄基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 ；和 44.4-[2-(4- 氯苯基 ) 乙基 ] 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯。 本发明的另一方面是用于治疗的式 (I) 化合物。 在再一个方面，本发明涉及用于治疗或预防本文所述任何疾病或病症的式 (I) 化酯；
嗪；
嗪；
嗪；
合物。 在又一个方面，本发明涉及式 (I) 化合物在制备用于治疗或预防本文所述任何疾 病或病症的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述化合物可用于制备用于治疗或预防通过选择性作用于 瘦蛋白受体可预防、治疗或改善的病症的药物。
在一些实施方案中，所述化合物可用于制备用于治疗或预防与体重增加有关的 病症 ( 特别是代谢性病症 ) 的药物。所述与体重增加有关的病症包括 ：肥胖或超重受治疗 者中发病率增加的疾病、障碍或其他病症。 实例包括 ：脂肪营养不良、 HIV 脂肪营养不 良、 II 型糖尿病、胰岛素抵抗、代谢综合征、高血糖症、高胰岛素血症、异常脂血症、 脂肪肝、饮食过量、高血压、高甘油三酯血症、不育症、与体重增加有关的皮肤病、黄 斑变性。 在一些实施方案中，所述化合物也可用于制备用于维持受治疗者体重减轻的药 物。
在一些实施方案中，为瘦蛋白受体激动剂模拟物的式 (I) 化合物也可用于制备促 进伤口愈合的药物。
在一些实施方案中，作为瘦蛋白受体激动剂模拟物的式 (I) 化合物也可用于制 备用于治疗或预防引起循环瘦蛋白浓度降低的病症、和免疫和生殖系统随之而来的机能 障碍的药物。 这些病症和机能障碍的实例包括 ：严重体重减轻、痛经、闭经、女性不育
症、免疫缺陷和与睾酮水平低相关的病症。
在一些实施方案中，为瘦蛋白受体激动剂模拟物的式 (I) 化合物也可用于制备用 于治疗或预防由瘦蛋白缺乏、或瘦蛋白或瘦蛋白受体突变引起的病症的药物。
在另一些实施方案中，为瘦蛋白受体拮抗剂模拟物的式 (I) 化合物可用于治疗或 预防炎性病症或疾病、与肥胖症和过量血浆瘦蛋白有关的轻度炎症，用于减轻其他与肥 胖有关的并发症，例如动脉粥样硬化，和用于校正代谢综合征和糖尿病中常见的胰岛素 抵抗。
在一些实施方案中，为瘦蛋白受体拮抗剂模拟物的式 (I) 化合物可用于治疗或 预防由以下疾病引起或与以下疾病相关的炎症 ：癌症 ( 例如白血病、淋巴瘤、癌、结 肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、肝细胞癌、肾癌、黑素瘤，肝脏、肺、乳房和前列腺 转移等等 ) ；自身免疫病 ( 例如器官移植排斥、红斑狼疮、移植物抗宿主排斥、同种移 植物排斥、多发性硬化、风湿性关节炎、 I 型糖尿病 ( 包括胰岛破坏引起的糖尿病和糖 尿病的炎性后果 )) ；自身免疫缺损 ( 包括多发性硬化、姬兰巴利综合征 (Guillam Barre Syndrome)、重症肌无力 ) ；与组织灌注差有关的心血管疾病和炎症 ( 例如粥样斑、动脉 粥样硬化、中风、缺血再灌注损伤、跛行、脊髓损伤、充血性心力衰竭、脉管炎、出血 性休克、蛛网膜下腔出血后的血管痉挛、脑血管意外后的血管痉挛、胸膜炎、心包炎、 糖尿病的心血管并发症 ) ；缺血再灌注损伤、缺血和相关的炎症、血管成形术和炎性动 脉瘤后的再狭窄 ；癫痫、神经变性 ( 包括阿尔茨海默氏病 (Alzheimer’s Disease))、关节 炎 ( 例如类风湿性关节炎、骨关节炎、类风湿性脊椎炎、痛风性关节炎 )、纤维化 ( 例如 肺纤维化、皮肤纤维化和肝纤维化 )、多发性硬化、脓毒病、败血症性休克、脑炎、传染 性关节炎、雅里施 - 赫克斯海默氏反应 (Jarisch-Herxheimerreaction)、带状疱疹、中毒性 休克、脑型疟、莱姆病 (Lyme’ s disease)、内毒素性休克、革兰氏阴性休克、出血性休 克、肝炎 ( 起因于组织损伤或病毒感染的肝炎 )、深静脉血栓形成、痛风 ；与呼吸困难有 关的病症 ( 例如慢性阻塞性肺病、气道障碍和阻塞、支气管狭窄、肺血管收缩、呼吸障 碍、慢性肺部炎性疾病、硅沉着病、肺肉瘤病、囊性纤维化、肺部高血压、肺部血管收 缩、肺气肿、支气管变态反应和 / 或炎症、哮喘、花粉热、鼻炎、春季结膜炎和成人型 呼吸窘迫综合征 ) ；与皮肤炎症有关的病症 ( 包括牛皮癣、湿疹、溃疡、接触性皮炎 ) ； 与肠炎症相关的病症 ( 包括克罗恩病 (Crohn’ s disease)、溃疡性结肠炎和发热、肠易 激综合征、炎性肠病 ) ；HIV( 特别是 HIV 感染 )、脑型疟、细菌性脑膜炎、骨质疏松症 和其他骨吸收疾病、骨关节炎、源于子宫内膜异位的不育症、由于感染导致的发热和肌 痛，和由过度抗炎细胞 ( 包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和 T 细胞 ) 活性介 导的其他病症。
在一些实施方案中，为瘦蛋白受体拮抗剂模拟物的式 (I) 化合物可用于治疗或预 防 I 或 II 型糖尿病的大血管或小血管并发症、视网膜病、肾病、植物神经病变、或由局部 缺血或动脉粥样硬化导致的血管损伤。
在一些实施方案中，为瘦蛋白受体拮抗剂模拟物的式 (I) 化合物可用于抑制血管 生成。 抑制血管生成的本发明化合物可用于治疗或预防肥胖或与肥胖有关的并发症。 抑 制血管生成的本发明化合物可用于治疗或预防与炎性糖尿病性视网膜病相关的并发症、 或肿瘤生长，特别是乳腺癌、前列腺癌或胃肠癌中的肿瘤生长。在另一方面，本发明涉及治疗或预防本文在此描述的任何疾病或病症的方法， 其包括给予受治疗者 ( 例如需要治疗的受治疗者，例如哺乳动物 ) 有效量的式 I 化合物。
在此描述的方法包括其中将受治疗者鉴定为需要具体所述治疗的受治疗者的方 法。 鉴定需要该治疗的受治疗者可经过受治疗者或卫生保健专家判断，可以是主观的 ( 例如意见 ) 或客观的 ( 例如通过试验或诊断方法测定 )。
在其他方面，在此的方法包括进一步包括监测受治疗者对治疗给药的反应的方 法。 这些监测可包括对作为治疗方案的标记或指标的受治疗者的组织、流体、样本、细 胞、蛋白质、化学标记、遗传物质等等进行定期取样。 在其他方法中，通过对该治疗适 合性的有关标记或指标进行评估来将受治疗者预筛选或鉴定为需要该治疗。
在一种实施方案中，本发明提供监测治疗进展的方法。 该方法包括在患有或易 患在此描述的疾病或症状的患者中测定诊断标记 ( 标记 ) 水平 ( 例如，在此描述的任何 靶点或细胞类型被在此的化合物调节 ) 或确定诊断测定 ( 例如筛选，分析 ) 的步骤，其 中所述受治疗者已经给予了足够治疗疾病或症状的治疗量的本文化合物。 可以将该方法 中所测定的标记水平与健康正常对照物中或在其他受折磨患者中的已知的标记水平进行 比较，来确立受治疗者的疾病状态。 在优选的实施方案中，在比确定第一水平的时间点 晚的时间点测定受治疗者中标记的第二水平，并且将两个水平进行比较来监测疾病的过 程或治疗的功效。 在某些优选实施方案中，在开始按照本发明治疗之前，测定受治疗者 中标记的治疗前水平 ；然后将标记的治疗前水平与治疗开始后受治疗者中的标记水平比 较，来确定治疗功效。
在某些方法实施方案中，受治疗者中标记的水平或标记活性至少测定一次。 将 标记水平与例如之前或之后从同一患者、另一患者或正常受治疗者得到的标记水平进行 比较，可以用于确定依照本发明的治疗是否具有所需的效应，并因而允许适当调整剂量 水平。 标记水平可通过使用本领域已知的或本文描述的任何适当的取样 / 表达测定方法 来进行测定。 优选首先从受治疗者中取出组织或流体样本。 合适样品的实例包括血液、 尿液、组织、口或颊细胞、和包含发根的头发样品。 其他合适的样品将会被本领域技术 人员所熟悉。 样品中蛋白质水平和 / 或 mRNA 水平 ( 例如标记水平 ) 的测定可使用本领 域已知的任何合适的技术来进行，所述技术包括 ( 但不限于 ) 酶免疫测定、ELISA、放射 性标记 / 测定技术、印迹分析 / 化学发光法、实时 PCR 等等。
在一些实施方案中，如果式 (I) 化合物能够透过中枢神经系统则可能是有利的。 在其他实施方案中，如果式 (I) 化合物不能够透过 CNS 则可能是有利的。 一般而言，我 们预计，为瘦蛋白受体激动剂模拟物的化合物如果能透过 CNS，则尤其可用于治疗或预 防肥胖、胰岛素抵抗或糖尿病 ( 特别是葡萄糖不耐受 )。 本领域普通技术人员能很容易确 定所述化合物是否能透过 CNS。 可使用的适当方法在生物学方法部分中描述。
瘦蛋白受体的反应可以任何适当的方式测定。 在体外，这可通过测定瘦蛋白受 体信号转导来完成。 例如，可以测定 ：Akt、 STAT3、 STAT5、 MAPK、 shp2 或瘦蛋白 受体响应瘦蛋白的结合、或响应本发明化合物与瘦蛋白受体结合而发生的磷酸化。 Akt、 STAT3、 STAT5、 MAPK、 shp2 或瘦蛋白受体磷酸化的程度可例如通过蛋白质印迹法或 ELISA 来测定。 或者，可以使用 STAT 报告分子测定，例如 STAT 驱动的荧光素酶表达。 表达瘦蛋白受体的细胞系可用于这些测定。 在体内，瘦蛋白受体的反应可通过给予瘦蛋白或本发明化合物之后，测定食物摄取量的减少和体重的减轻来测定。
下面的生物学方法描述了可用于确定本发明的化合物是瘦蛋白受体激动剂模拟 物还是瘦蛋白受体拮抗剂模拟物的测定和方法。
式 (I) 化合物可与其他治疗剂一起或不与其他治疗剂一起给药。 例如，如果需要 减轻炎症，则所述化合物可与抗炎剂 ( 例如病情改善抗风湿药，例如甲氨蝶呤、柳氮磺 吡啶和细胞因子钝化剂、甾体、 NSAID、大麻素、速激肽调节剂、或缓激肽调节剂 ) 一 起给药。 如果需要提供抗肿瘤效应，则式 (I) 化合物可与细胞毒性剂 ( 例如甲氨蝶呤、 环磷酰胺 ) 或其他抗肿瘤药一起给药。
式 (I) 化合物可用放射性同位素 ( 例如用氚或放射性碘 ) 标记，以供体外或体内 应用，例如受体取代研究或受体成像。
本发明的另一方面涉及制备如上定义的式 (I) 化合物的方法。 在一个实施方案 中，所述方法包括 ：
(a) 使式 (II) 化合物 ：
其中 X1、 R1、 R2、 a、 d 和 f 如式 (I) 中定义，
与氯甲酸 4- 硝基苯酯或碳酸二 (4- 硝基苯酯 ) 在合适碱 ( 如 DIPEA 或 NMM) 的存在下、在合适的溶剂 ( 如 DCM) 中、在 -10 至 40℃下反应，形成式 (III) 化合物 ：
(b) 使式 (III) 化合物与式 (IV) 化合物其中 X2、 R3、 R4、 b、 c、 e 和 g 如式 (I) 中定义，
在合适的碱 ( 如 DIPEA) 存在下、在合适的溶剂 ( 如 DMF) 中、在 -10 至 40℃ 下反应，得到式 (I) 化合物 ；且
(c) 任选在一个或数个步骤中将式 (I) 化合物转化成另一式 (I) 化合物。
在另一实施方案中，所述方法包括 ：
(a) 使式 (IV) 化合物 ：
其中 X2、 R3、 R4、 b、 c、 e 和 g 如式 (I) 中定义， 与式 (V) 化合物 ：
其中 R5A、 R5B 和 f 如式 (I) 中定义，在合适的碱 ( 如 DIPEA) 存在下、在合适的溶剂 ( 如 DCM) 中、在 -10 至 40℃ 下反应，得到式 (VI) 化合物 ：
(b) 使式 (VI) 化合物与式 (VII) 化合物 ：其中 R1、 R2、 a 和 d 如式 (I) 中定义，
在合适的溶剂 ( 如 N- 甲基吡咯烷酮 ) 中、在升高的温度下反应，得到式 (I) 化 合物 ；且
(c) 任选在一个或数个步骤中将式 (I) 化合物转化成另一式 (I) 化合物。
定义
以下定义将应用于整个说明书和附加权利要求中。
除非另作说明或表示，术语 “C1-6- 烷基” 指具有 1-6 个碳原子的直链或支链烷 基。 所述 C1-6- 烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁 基、叔丁基、和直链与支链的戊基和己基。 “C1-6- 烷基”范围的多个部分涵盖了其所有 的亚组，例如 C1-5- 烷基、 C1-4- 烷基、 C1-3- 烷基、 C1-2- 烷基、 C2-6- 烷基、 C2-5- 烷基、
C2-4- 烷基、 C2-3- 烷基、 C3-6- 烷基、 C4-5- 烷基等等。
除非另作说明或表示，术语 “C1-6- 酰基” 指通过其碳原子连接到氢原子 ( 即甲 酰基 ) 上或连接到直链或支链的 C1-5- 烷基上的羰基，其中该烷基如上文所定义。 所述 C1-6- 酰基的实例包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、正丁酰基、2- 甲基丙酰基和正戊酰基。 “C1-6- 酰基”范围的多个部分涵盖了其所有的亚组，例如 C1-5- 酰基、C1-4- 酰基，C1-3- 酰 基、 C1-2- 酰基、 C2-6- 酰基、 C2-5- 酰基、 C2-4- 酰基、 C2-3- 酰基、 C3-6- 酰基、 C4-5- 酰基 等等。 如果 C1-6- 酰基被独立地选自卤素、羟基和 C1-6- 烷氧基的一个或更多个取代基任 选取代，则所述取代基不能连接到羰基碳原子上。
除非另作说明或表示，术语 “C1-6- 烷氧基” 指具有 1-6 个碳原子的直链或支链 的烷氧基。 所述 C1-6- 烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁 氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、和直链与支链的戊氧基和己氧基。 “C1-6- 烷氧 基” 范围的多个部分涵盖了其所有的亚组，例如 C1-5- 烷氧基、 C1-4- 烷氧基、 C1-3- 烷氧 基、 C1-2- 烷氧基、 C2-6- 烷氧基、 C2-5- 烷氧基、 C2-4- 烷氧基、 C2-3- 烷氧基、 C3-6- 烷氧 基、 C4-5- 烷氧基等等。
“卤素” 是指氟、氯、溴或碘。 “羟基” 是指 -OH 基。
“硝基” 是指 -NO2 基。
“氰基” 是指 -CN 基。
“任选的” 或 “任选” 意味着后来描述的事件或情形可能但不必出现，并且该 描述包括了出现其事件或情形的情况和所述事件或情形不出现的情况。
术语 “哺乳动物” 包括生物体，其包括小鼠、大鼠、奶牛、绵羊、猪、兔、山 羊和马、猴、狗、猫，且优选人类。 受治疗者可以是人类受治疗者或非人类动物，特别 是被驯养的动物，例如狗。
“药学上可接受” 表示可用于在制备药物组合物，该药物组合物通常是安全 的、无毒的，且既不是生物学上不合要求，也不是其他方面不合要求的，且包括可用于 兽医应用以及人类药物使用。
本文使用的 “治疗” 包括所述疾病或病症的预防，或疾病确立后疾病的改善或 消除。
“有效量”是指对受治疗者产生治疗效果 ( 例如治疗、控制、改善、预防、延缓 发病，或降低疾病、障碍或病症或其症状产生的风险 ) 的化合物的量。 治疗效果可以是 客观的 ( 即，可经某些试验或标记来测定 ) 或主观的 ( 即，受治疗者给出了效果的指征或 感觉 )。
“前药”是指可在生理学条件下或经溶剂分解作用转化为生物学活性的式 (I) 化 合物的化合物。 当向需要治疗的受治疗者给药时，该前药是无活性的，但在体内转化为 活性的式 (I) 化合物。 通常前药在体内迅速转化，得到母体化合物，例如，经血液中水解 而转化。 前药化合物通常在哺乳动物生物体中提供以下优势 ：溶解度、组织相容性或延 迟释放 ( 参见 Silverman， R.B.， The organic Chemistry of Drug Designand Drug Action，2nd Ed.，Elsevier Academic Press(2004)，pp.498-549)。 可如下制备前药 ：修饰式 (I) 化合物 中存在的官能团，例如羟基、氨基或巯基，其修饰方式使得所述修饰或按常规操作，或
在体内被裂解，得到母体化合物。 前药的实例包括 ( 但不限于 ) 羟基官能团的乙酸酯、 甲酸酯和琥珀酸酯衍生物、或氨基官能团的苯基氨基甲酸酯衍生物。
在整个说明书和附加的权利要求书中，指定的化学式或化学名称也将包括其所 有的盐、水合物、溶剂合物、N- 氧化物及前药形式。 此外，指定的化学式或化学名称将 包括其所有的互变异构体形式及立体异构体形式。 立体异构体包括对映异构体和非对映 异构体。 对映异构体可以其纯的形式存在，或作为两种对映异构体的外消旋混合物 ( 等 量的 ) 或非等量混合物存在。 非对映异构体可以其纯的形式存在，或以非对映异构体的 混合物存在。 非对映异构体还包括几何异构体，其可以其纯的顺式或反式存在，或作为 它们的混合物存在。
式 (I) 化合物可以原样使用，或者如果合适，可作为其药学上可接受的盐 ( 酸 或碱的加成盐 ) 使用。 下述药学上可接受的加成盐意欲包含所述化合物能够形成的治疗 活性的无毒酸和碱的加成盐形式。 具有碱性质的化合物通过用适当的酸处理碱形式，可 被转化成其药学上可接受的酸加成盐。 示例性的酸包括无机酸，例如盐酸、氢溴酸、氢 碘酸、硫酸、磷酸 ；和有机酸，例如甲酸、乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、乙 醇酸、马来酸、丙二酸、草酸、苯磺酸、甲苯磺酸、甲磺酸、三氟乙酸、富马酸、琥珀 酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、水杨酸、对氨基水杨酸、双羟萘酸、苯甲酸、抗坏血酸 及其类似酸。 示例性的碱加成盐形式为钠盐、钾盐、钙盐、和与药学上可接受胺形成的 盐，所述胺诸如，例如氨水、烷基胺、苄星和氨基酸，诸如，例如精氨酸和赖氨酸。 本 文使用的术语加成盐还包括溶剂合物，它是所述化合物及其盐所能够形成的溶剂合物， 诸如，例如水合物、醇化物等等。
组合物
对于临床应用，本发明的化合物可被制成用于各种给药方式的药物制剂。 人们 会认识到，所述组合物可与生理学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂一起给药。 所述 药物组合物可经任何适当的途径给药，优选经口服、直肠、鼻腔、局部 ( 包括含化和舌 下 )、舌下、经皮、鞘内、经粘膜或胃肠外 ( 包括皮下、肌内、静脉内和皮内 ) 给药。
其他制剂可合宜地以单位剂型 ( 例如片剂和缓释胶囊 ) 存在，和以脂质体形式 存在，可用药学领域内众所周知的方法制备。 药物制剂通常通过将活性物质或其药学上 可接受的盐与常规药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起混合而制备。 赋形剂的实 例为水、明胶、阿拉伯树胶、乳糖、微晶纤维素、淀粉、羟基乙酸淀粉钠、磷酸氢钙、 硬脂酸镁、滑石粉、胶体二氧化硅等等。 这些制剂还可包含其他药学活性剂和常规添加 剂，例如稳定剂、润湿剂、乳化剂、调味剂、缓冲剂等等。 通常，活性化合物的量在制 剂重量的 0.1-95％之间，对于胃肠外应用的制剂优选 0.2-20％重量之间，对于口服给药 的制剂更优选 1-50％重量之间。
所述制剂还可经已知的方法，例如制粒、压片、微囊化、喷雾包衣等等制备。 所述制剂可以片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、糖浆剂、混悬剂、栓剂或注射剂剂型通过常 规方法制备。 液体制剂可通过将活性物质溶解或悬浮在水或其他适当的溶媒中制备。 片 剂和颗粒剂可以常规方式包衣。 为了更长时间维持治疗有效的血浆浓度，本发明的化合 物可被加入缓释制剂中。
具体化合物的剂量水平和给药频率将随多种因素而变化，这些因素包括所采用的具体化合物的功效、该化合物的代谢稳定性和作用时间、患者年龄、体重、全身健康 状况、性别、饮食、给药方式和时间、排泄速度、联合用药、需要治疗的疾病的严重 性、和患者经历的治疗。 例如，每日剂量可从每千克体重约 0.001 毫克至约 100 毫克变 化，给予单剂或多剂，剂量例如为每剂约 0.01 毫克至约 25 毫克。 通常，这样的剂量可口 服给药，但也可选择胃肠外给药。
本发明化合物的制备
以上式 (I) 化合物可通过常规方法或类似常规方法的方法制备。 中枢氨基甲酸酯 连接基的形成为制备式 (I) 氨基甲酸酯化合物中的关键合成步骤。 大量的活性试剂可用 于形成氨基甲酸酯连接基，例如光气用于形成醇的氯甲酸酯，或用羰基二咪唑 (CDI) 形 成咪唑甲酸酯。 通常利用氯甲酸 4- 硝基苯酯或碳酸二 (4- 硝基苯酯 ) 作为活化剂合成结 合至式 (I) 化合物中的氨基甲酸酯连接基。 本发明实施例的中间体和化合物的制备可特 别地由以下流程 1 和 2 阐明。 在本文流程中结构内变量的定义与在此描述的结构式中相 应的位置的变量相称。
通常，通过活化醇部分进行式 (I) 氨基甲酸酯化合物的合成。 在碱 ( 如 DIPEA 或 NMM) 存在下用氯甲酸 4- 硝基苯酯或碳酸二 (4- 硝基苯酯 ) 处理醇 (II)，得到相应的 碳酸 4- 硝基苯酯衍生物 (III)。 在随后的步骤中，活化的碳酸酯 (III) 在碱 ( 如 DIPEA) 的存在下用合适的哌啶或哌嗪衍生物 (IV) 处理，结果形成所需的式 (I) 化合物。 该合成 通常如以下流程 1 中所述。
或者，哌啶或哌嗪衍生物 (IV) 可在碱存在下通过用氯甲酸 4- 硝基苯酯或碳酸二 (4- 硝基苯酯 ) 处理活化以形成相应的氨基甲酸酯衍生物。 随后在碱存在下氨基甲酸酯中 间体用适合的醇部分 (II) 处理，得到式 (I) 化合物。
氨基甲酸酯的形成通常为两步法，但其也可通过原位形成活性中间体以一锅法 反应进行。
流程 1. 式 (I) 的氨基甲酸酯衍生物的通用制备方法
其中 X1、 X2、 R1-R4 和 a-g 如式 1 中定义。
式 (I) 的酰胺化合物的合成一般通过式 (IV) 的哌啶或哌嗪衍生物的酰化用合适 的式 (V) 的 ω- 卤代链烷酰氯在碱 ( 如 DIPEA) 的存在下进行，得到式 (VI) 的酰胺。 随 后式 (VI) 化合物用合适的哌嗪衍生物 (VII) 在合适的溶剂 ( 如 N- 甲基吡咯烷酮 ) 中处 理，得到所需的式 (I) 化合物。 该合成通常如以下流程 2 中所述。
如果必要，式 (I) 化合物可在一个或数个额外步骤中转化成另一式 (I) 化合物。
流程 2. 式 (I) 的酰胺衍生物的通用制备方法
其中 X2、 R1-R4 和 a-g 如式 1 中定义。
制备式 (I) 化合物的必需的原料为市售或可通过本领域已知的方法制备。
可进行以下实验部分中所述的方法，得到以游离碱或作为酸加成盐形式的化合 物。 药学上可接受的酸加成盐可通过按照用于从碱化合物制备酸加成盐的常规方法，在 适当的有机溶剂中溶解游离碱并用酸处理溶液而获得。 形成加成盐的酸实例如下所述。
式 (I) 化合物可具有一个或更多个手性碳原子，它们因而可以光学异构体的形式 获得，例如作为纯的对映异构体、或作为对映异构体的混合物 ( 外消旋体 ) 或作为包含非 对映异构体的混合物而获得。 分离光学异构体的混合物以获得纯的对映异构体在本领域 内众所周知，可以例如通过对与旋光 ( 手性 ) 酸形成的盐分级结晶而获得，或通过在手性 柱上进行色谱法分离而获得。
本文描述的合成路线中所使用的化学药品可包括例如溶剂、试剂、催化剂、保 护基试剂和脱保护基试剂。 保护基的实例为叔丁氧基羰基 (Boc)、苯甲基和三苯甲基 ( 三 苯基甲基 )。 上述方法还可另外在本文具体描述的步骤之前或之后包括用以加入或脱除 合适的保护基的步骤，以最终允许合成所述化合物。 另外，各种各样的合成步骤可以交 替的顺序或次序进行，以得到所需的化合物。 在合成适当的化合物中可使用的合成化学 转化和保护基方法学 ( 保护和脱保护 ) 为本领域所已知，包括例如描述于以下的方法 ： R.Larock，Comprehensive organicTransformations( 高等有机转化 )，VCH 出版社 (1989) ； T.W.Greene 和 P.G.M.Wuts，Protective Groups in organic Synthesis( 有机合成中的保护基 )， 第 3 版，John Wiley and Sons(1999) ；L.Fieser 和 M.Fieser，Fieser and Fieser′ s Reagents for
organic Synthesis( 有机合成中的 Fieserand Fieser′ s 试剂 )， John Wiley and Sons(1994) ； 和 L.Paquette 编辑， Encyclopedia of Reagents for organic Synthesis( 有机合成试剂百科全 书 )， John Wiley and Sons(1995) 及其随后的版本。
使用下列缩写 ：
Boc 叔丁氧羰基
DCM 二氯甲烷
DIPEA N， N- 二异丙基乙胺
DMAP N， N- 二甲基氨基吡啶
DMF N， N- 二甲基甲酰胺
ES+ 电喷雾
Et2O 乙醚
EtOAc 乙酸乙酯
HIV 人类免疫缺陷病毒
HPLC 高效液相色谱法
ICV 脑室内
LCMS 液相色谱质谱法
M 摩尔浓度 +
[MH] 质子化的分子离子
NEt3 三乙胺
NMM N- 甲基吗啉
RP 反相
tert 叔
TFA 三氟乙酸
THF 氢呋喃
在下列实施例中参考附图描述了本发明的实施方案，在附图中 ：
图 1 显示了用高碳水化合物饮食喂养的动物之间体重分离的实例。 误差条代表 平均值 +/-SEM。
图 2 显示对于实施例 6 而言在 DIO 大鼠的 4 天研究中观察到的累计体重变化 (％ )。
图 3 显示对于实施例 16 而言在 DIO 大鼠的 3 天研究中观察到的累计体重变化 (％ )。
图 4 显示对于实施例 18 而言在 DIO 大鼠的 4 天研究中观察到的累计体重变化 (％ )。
图 5 显示对于实施例 36 而言在 DIO 大鼠的 3 天研究中观察到的累计体重变化 (％ )。
图 6 显示 JEG-3 细胞掺入 [3H]- 胸苷方面对瘦蛋白的浓度依赖性增加。
在此处任何变量的定义中化学基团列出的记载包括该变量定义中作为任何单个 基团或作为所列基团组合的定义。 本文实施方案的记载包括该实施方案作为任何单一实 施方案或与任何其他实施方案或其组成部分结合的实施方案。现在将通过下列非限制性实施例来进一步阐明本发明。 下面的具体实施例应解 释为是说明性的，不会以任何方式限制本申请公开内容的其余部分。 相信即使在没有进 一步阐述的情况下，本领域技术人员也能在本文描述的基础上最大程度地利用本发明。 所有本文引用的参考文献和出版物将在此以其整体引入作为参考。
实施例和中间体化合物
实验方法
除非另有说明，否则所有试剂都是商品级，且所有试剂无需进一步纯化即可原 样使用。 市售的无水溶剂用于在惰性环境下进行的反应。 试剂等级溶剂用于所有其他情 况，除非另有说明。 甲基异氰酸酯树脂由 NovaBiochem(Cat.No.01-64-0169) 提供。 分 析型 LCMS 在与 Agilent 1100HPLC 系统连接的 Waters ZQ 质谱仪上进行。 分析型 HPLC 在 Agilent 1100 系统上进行。 高分辨率质谱 (HRMS) 在与 Agilent1100HPLC 系统连接 的 Agilent MSD-TOF 上获得。 在分析期间，校准通过两种物质检查，且当需要时自动校 正。 光谱用正电喷雾模式获得。 获得的质量范围为 m/z 100-1100。 使用质量峰的概况 (profile) 检测。 快速色谱法在配备有 Strata SI-1 二氧化硅 gigatube 的 Flash MasterPersonal 系 统 上 进 行。 反 相 色 谱 法 在 Gilson 系 统 上 进 行， 该 系 统 配 备 有 Merck RP-18(40-63μm)460x 26mm 柱，30mL/min，甲醇 / 水梯度洗脱。制备型 HPLC 在 Gilson 系统上进行，该系统配备有 Phenomenex Hydro RP 150x 20mm，20mL/min，乙腈 / 水梯度 洗脱。 化合物使用 ACD 6.0 或 8.0 自动命名。
用以下条件得到分析 HPLC 和 LCMS 数据 ：
系 统 A ：Phenomenex Synergi Hydro RP， (150x 4.6mm，4μm)， 用 在 H2O(+0.1％ TFA) 中的 5-100％ CH3CN(+0.085％ TFA) 梯度洗脱，1.5mL/ 分钟，梯度洗 脱时间 7 分钟，200-300nm，30℃。
还用以下条件得到分析 LCMS 数据 ：
系统 B ：Phenomenex Synergi Hydro RP(150x 4.6mm，4μm)，用在 H2O(+0.1％ HCO2H) 中的 0-20％ CH3CN(+0.1％ HCO2H) 梯度洗脱，1mL/ 分钟，梯度洗脱时间 8 分 钟，25℃ ；
系 统 C ：Phenomenex Synergi Hydro RP(30x 4.6mm，4μm)， 用 在 H2O(+0.1 ％ TFA) 中的 5-100％ CH3CN(+0.085％ TFA) 梯度洗脱，1.5mL/ 分钟，梯度洗脱时间 1.75 分 钟，30℃ ；或
系统 D ：Phenomenex Synergi Hydro RP(30x 4.6mm，4μm)，用在 H2O(+0.1 ％ HCO2H) 中的 5-100％ CH3CN(0.1％ HCO2H) 梯度洗脱，1.5mL/ 分钟，梯度洗脱时间 1.75 分钟，30℃。
中间体 1
碳酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯 4- 硝基苯酯
将 4- 哌 啶 甲 醇 (10.0g，86.8mmol) 溶 解 在 DCM(200mL) 中。 加 入 DIPEA(15.0mL，86.6mmol)，随后分批加入二碳酸二叔丁酯 (18.95g，86.8mmol)。 在室 温下将反应混合物搅拌 19 小时。 反应混合物用 2MHCl 水溶液 (150mL) 和 1M Na2CO3 水 溶液 (150mL) 洗涤，随后干燥 (MgSO4)。 将得到的有机相真空浓缩，得到 4-( 羟甲基 ) 哌啶 -1- 甲酸叔丁酯 (16.1g，87％ )，其为白色固体。
LCMS 分析 ：( 系统 D， RT ＝ 1.8 分钟 )， ES+ ：216.3[MH]+。
在氩气下往 1M LiAlH4 在 THF(13.5mL，13.5mmol) 中的溶液中滴加 4-( 羟甲基 ) 哌啶 -1- 甲酸叔丁酯 (1.94g，9.0mmol) 在 THF(15.0mL) 中的溶液。 在室温下将反应混 合物搅拌 17 小时，随后冷却至 0℃。 滴加 THF 和水的混合物 ( 比例为 1 ∶ 1，1.5mL)。 形成凝胶状的白色固体。 滴加 4M NaOH 水溶液 (0.6mL)。 加入水 (2mL) 并在室温下将 得到的混合物搅拌 2 小时。 通过过滤除去白色固体。 将滤液负载至 Isolute HM-N 液 - 液 萃取柱上，随后用 EtOAc(200mL) 洗脱。 将得到的有机相真空浓缩，得到黄色油状物的 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲醇 (1.02g，88％ )。
LCMS 分析 ：纯度为约 90％ ( 系统 B， RT ＝ 1.88 分钟 )， ES+ ：129.8[MH]+。
往 碳 酸 二 (4- 硝 基 苯 酯 )(7.06g，23.2mmol) 在 DCM(100mL) 中 的 溶 液 中 加 入 在 DCM(50mL) 中 的 (1- 甲 基 哌 啶 -4- 基 ) 甲 醇 (2.50g，19.3mmol)， 随 后 加 入 NMM(1.70mL，15.5mmol)。 将反应混合物搅拌 90 小时，随后依次用等份的 1M Na2CO3 水溶液洗涤，直至水层无色。 将有机层干燥 (MgSO4) 并真空浓缩，得到黄色固体状的碳 酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯 4- 硝基苯酯 (4.18g，73％ )。
LCMS 分析 ：( 系统 D， RT ＝ 1.59 分钟 )， ES+ ：295.1[MH]+。
中间体 2
碳酸 (1-( 叔丁氧基羰基 ) 哌啶 -4- 基 ) 甲酯 4- 硝基苯酯
在 0 ℃ 下， 往 4-( 羟 甲 基 ) 哌 啶 -1- 甲 酸 叔 丁 酯 (36.1g，168mmol) 和 NMM(20mL，182mmol) 在 DCM(500mL) 中的溶液中加入氯甲酸对硝基苯酯 (33.9g， 168mmol)。 在室温下将反应混合物搅拌过夜，随后依次用 1M HCl 水溶液 (500mL)、饱 和 NaHCO3 水溶液 (3x 500mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩，得到黄色固体状的碳酸 (1-( 叔丁氧基 - 羰基 ) 哌啶 -4- 基 ) 甲酯 4- 硝基苯酯 (61.2g，96％ )。
LCMS 分 析 ：( 系 统 C， RT ＝ 2.46 分 钟 )， ES+ ：307.4[M-OtBu]+，281.4[M+ H-Boc]+。
中间体 3
碳酸 (1-(2- 甲氧基乙基 ) 哌啶 -4- 基 ) 甲酯 4- 硝基苯酯
在 0℃下，以每份 0.5mL 往哌啶 -4- 基 - 甲醇 (3.13g，27.2mmol)、DMAP(50mg) 和 NEt3(7.0mL，50.6mmol) 在 DCM 中 的 溶 液 中 加 入 甲 氧 基 - 乙 酰 氯 (5.0mL， 54.8mmol)。 将反应混合物搅拌 2 小时，随后用 DCM(70mL) 稀释并依次用 1M HCl 水溶 液 (100mL) 和 1M Na2CO3 水溶液 (100mL) 洗涤。 将有机相干燥 (MgSO4)，过滤并真空 浓缩，得到黄色油状的 2- 甲氧基乙酸 (1-(2- 甲氧基乙酰基 ) 哌啶 -4- 基 ) 甲酯 (6.5g， 92％ )。
LCMS 分析 ：( 系统 D， RT ＝ 1.53 分钟 )， ES+ ：260.3[MH]+。
在氩气下往 1M LiAlH4 在 THF 中的溶液 (55.0mL，55.0mmol) 中滴加得自前一 步骤的 2- 甲氧基乙酸 (1-(2- 甲氧基乙酰基 ) 哌啶 -4- 基 ) 甲酯 (6.5g，25.1mmol) 在 THF(10mL) 中的溶液。 在室温下将反应混合物搅拌 2 天，随后冷却至 0 ℃。 滴加水 (2.0mL)。 形成凝胶状的白色固体。 滴加 0.2M NaOH 水溶液 (2.0mL)。 加入水 (5.0mL) 并在室温下将得到的混合物搅拌 3 小时。 通过过滤除去白色固体。 将滤液真空浓缩并在 Isolute HM-N 柱 ( 用 EtOAc 洗脱 ) 上干燥。 将得到的有机溶液真空干燥，得到黄色油状 的 (1-(2- 甲氧基乙基 ) 哌啶 -4- 基 ) 甲醇 (3.65mg，84％ )。
LCMS 分析 ：( 系统 D， RT ＝ 0.35 分钟 )， ES+ ：174.2[MH]+。
在 0 ℃ 下 往 (1-(2- 甲 氧 基 乙 基 ) 哌 啶 -4- 基 ) 甲 醇 (3.65g，21.1mmol) 和 NMM(2.5mL，22.8mmol) 在 DCM(100mL) 中的溶液中加入氯甲酸对硝基苯酯。 在室 温下将反应混合物搅拌过夜，随后依次用 NaHCO3 饱和水溶液 (5x 100mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 得到的橙色油状物用 EtOAc 和庚烷重结晶，得到橙色固体状的碳 酸 (1-(2- 甲氧基乙基 ) 哌啶 -4- 基 ) 甲酯 4- 硝基苯酯 (3.65g，51％ )。
LCMS 分析 ：( 系统 D， RT ＝ 1.59 分钟 )， ES+ ：339.2[MH]+。
中间体 4
碳酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 4- 硝基苯酯
往搅拌的 1-(2- 羟基乙基 ) 哌嗪 (26.0g，0.2mol) 在 DMF(200mL) 中的溶液中 加入甲酸 (752mL，0.2mol) 和甲醛 (16.2g，0.2mol，37 ％水溶液 )。 在 100 ℃下将反应 混合物小心加热 2 小时，随后在室温下搅拌过夜。 将溶剂真空除去。 将该步骤再重复三 次，得到约 100g 产物。 在约 74℃下将粗品合并并真空蒸馏，得到无色液体状的 2-(4- 甲 基哌嗪 -1- 基 ) 乙醇 (51g，44％ )。 LCMS 分析 ：( 系统 C， RT ＝ 0.70 分钟 )， ES+ ： 145.1[MH]+。
将氯甲酸 4- 硝基苯酯 (9.85g，49mmol) 溶解在 DCM(200mL) 中，随后冷却至 0℃。 加入 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙醇 (7.2g，50mmol) 和 NMM(6mL)，并经 16 小时 让反应混合物逐渐升至室温。 反应混合物用 1M Na2CO3 水溶液洗涤，直至萃取至水层的
黄色消失。 将有机相干燥 (MgSO4)，过滤并真空浓缩，得到黄色油状物的碳酸 2-(4- 甲 基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 4- 硝基苯酯 (10.7g，71％ )，将其静置固化。
LCMS 分析 ：纯度为约 80％ ( 系统 C， RT ＝ 1.70 分钟 )， ES+ ：310.4[MH]+。
实施例 1
4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯 · 甲酸盐
将碳酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯 4- 硝基苯酯 ( 中间体 1 ；5.70g，19.4mmol) 溶 解 在 DMF(40mL) 中。 加 入 DIPEA(6.75mL，38.7mmol) 和 1- 苯 基 哌 嗪 (2.96mL， 19.4mmol)。 在室温下将反应混合物搅拌 6 小时，随后真空浓缩。 将残余物溶解在 EtOAc(300mL) 中并依次用饱和 NaHCO3 水溶液 (6x 200mL)、盐水 (50mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 残余物经正相色谱柱纯化 ( 用 DCM 洗脱，随后用 98 ∶ 1 ∶ 1 的 DCM ∶ MeOH ∶ DIPEA 的混合物洗脱 )，随后经反相色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度 洗脱，在各溶剂中含 1％甲酸，0-80％ )，得到 4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯 · 甲酸盐 (0.63g，10.3％ )，其为粘稠状黄色油。
HPLC 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 3.64 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A， RT ＝ 4.55 分钟 )， ES+ ：318.5[MH]+ ；C18H27N3O2 ：HRMS 计算值 317.2103， 实测值 317.2109。
实施例 2
4-(4- 氯苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯
将碳酸 (1-( 叔丁氧基羰基 ) 哌啶 -4- 基 ) 甲酯 4- 硝基苯酯 ( 中间体 2 ；10.0g， 26.3mmol) 溶解在 DMF(50mL) 中。 加入 DIPEA(16.0mL，92.0mmol) 和 4-(4- 氯苯基 ) 哌嗪 · 二盐酸盐 (7.09g，26.3mmol) 并在室温下将反应混合物搅拌 24 小时，随后将反 应混合物真空浓缩。 将得到的残余物溶解在 EtOAc(300mL) 中并用 1M Na2CO3 水溶液 (6x200mL)、10％柠檬酸溶液 (50mL)、盐水 (50mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 将残余物溶解在 DCM(100mL) 和 TFA(20mL) 的混合物中，搅拌 4 小时，随后真空浓缩。 将残余物溶解在 1M Na2CO3 水溶液 (220mL) 中，用 DCM(3x 200mL) 萃取。 合并的有机 层用盐水 (50mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 残余物用 EtOAc 重结晶，得到乳白 色固体状的 4-(4- 氯苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 (1- 哌啶 -4- 基 ) 甲酯 (4.07g，45.7％ )。
LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 C， RT ＝ 1.94 分钟 )， ES+ ：338.4[MH]+。
将 4-(4- 氯苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 (1- 哌啶 -4- 基 ) 甲酯 (4.07g，12.0mmol) 溶解
在甲酸 (20mL) 和 35％甲醛水溶液 (20mL) 中。 在 95℃下将反应混合物加热 90 分钟， 随后冷却至室温。 通过将其缓慢倾至 1M Na2CO3 水溶液 (200mL) 上使反应混合物猝灭， 用 1M KOH 水溶液 (30mL) 碱化至 pH 10 并用 DCM(3x 100mL) 萃取。 合并的有机层用 盐水 (50mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 残余物经正相柱色谱纯化 ( 用 DCM 洗 脱，随后用 DCM ∶ MeOH ∶ DIPEA 的 97 ∶ 2 ∶ 1 混合物洗脱 )，随后经反相柱色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，0-80％ )，得到白色固体状的 4-(4- 氯苯基 ) 哌嗪 -1- 甲 酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯 (1.30g，30.7％ )。
HPLC 分 析 ：纯 度 99.8 ％ ( 系 统 A， RT ＝ 4.75 分 钟 ) ；LCMS 分 析 ：纯 度 100 ％ ( 系统 A， RT ＝ 6.43 分钟 )， ES+ ：352.4[MH]+ ；C18H26ClN3O2 ：HRMS 计算值 ： 351.1714，实测值 351.1729。
实施例 3
4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸哌啶 -4- 基甲酯
将 碳 酸 ( 叔 丁 氧 基 羰 基 ) 哌 啶 -4- 基 甲 酯 4- 硝 基 苯 酯 ( 中 间 体 2 ；3.80g， 10.0mmol) 溶解在 DMF(100mL) 中。 加入 DIPEA(6.10mL，35.0mmol) 和 4-(4- 甲基苯 基 ) 哌嗪 · 二盐酸盐 (2.49g，10.0mmol)。 在室温下将反应混合物搅拌 4 小时，随后真 空浓缩。 将得到的残余物溶解在 EtOAc(300mL) 中并用 1M Na2CO3 水溶液 (6x 200mL)、 10％柠檬酸溶液 (50mL)、盐水 (50mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 将残余物溶 解在 DCM(100mL) 和 TFA(25mL) 的混合物中，搅拌 48 小时，随后真空浓缩。 残余物 经反相柱色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1％甲酸，0-30％ )。 将得 到的残余物溶解在 DCM(70mL) 中并与固体 K2CO3 搅拌 20 分钟，过滤并真空浓缩，得到 浅黄色固体状的 4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸哌啶 -4- 基甲酯 (1.60g，44.6％ )。
HPLC 分析 ：纯度 99.8％ ( 系统 A，RT ＝ 3.71 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A， RT ＝ 4.32 分钟 )， ES+ ：318.2[MH]+ ；C18H27N3O2 ：HRMS 计算值 317.2103， 实测值 317.2106。
实施例 4
4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯
将 4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 (1- 哌啶 -4- 基 ) 甲酯 ( 实施例 3 ；9.75g， 30.7mmol) 溶解在甲酸 (3mL)、35％甲醛水溶液 (3mL) 和水 (20mL) 中。 在 95℃下将反 应混合物加热 45 分钟，随后冷却至室温。 通过将反应混合物缓慢倾至 1M Na2CO3 水溶液
(400mL) 上使其猝灭并用 EtOAc(4x 150mL) 萃取。 合并的有机层用盐水 (75mL) 洗涤， 干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 残余物用庚烷重结晶，随后经反相柱色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1％甲酸，0-30％ )。 将得到的残余物溶解在 DCM(70mL) 中并与固体 K2CO3 搅拌 20 分钟，过滤并真空浓缩。 残余物用庚烷重结晶，得到白色固体 状的 4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯 (4.38g，43.0％ )。
HPLC 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 3.67 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A， RT ＝ 5.37 分钟 )， ES+ ：332.5[MH]+ ；C19H29N3O2 ：HRMS 计算值 331.2260， 实测值 331.2274。
实施例 5
4-(3- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯
将碳酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯 4- 硝基苯酯 ( 中间体 1 ；4.30g，14.6mmol) 溶 解在 DMF(50mL) 中。 加入 DIPEA(8.91mL，51.1mmol) 和 4-(3- 甲基苯基 ) 哌嗪 · 二 盐酸盐 (3.64g，14.6mmol)。 在室温下将反应混合物搅拌 4 小时，随后真空浓缩。 将残 余物溶解在 EtOAc(500mL) 中，随后依次用 1M NaOH 水溶液 (6x 200mL)、盐水 (50mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 将残余物溶解在 DCM(150mL) 中并加入甲基异氰酸
酯树脂 (1.0g)，将反应混合物振摇 14 小时，过滤，随后真空浓缩。 残余物经反相色谱纯 化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1％甲酸，0-30％ )。 将得到的残余物溶 解在 DCM(70mL) 中并与固体 K2CO3 搅拌 20 分钟，过滤并真空浓缩，得到浅黄色油状的 4-(3- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯 (0.65g，13.3％ )。
HPLC 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 3.84 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A， RT ＝ 5.63 分钟 )， ES+ ：332.4[MH]+ ；C19H29N3O2 ：HRMS 计算值 331.2260， 实测值 331.2272。
实施例 6
4-(4- 氟苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯
将碳酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯 4- 硝基苯酯 ( 中间体 1 ；4.99g，16.9mmol) 溶 解 在 DMF(40mL) 中。 加 入 DIPEA(5.90mL，33.9mmol) 和 4-(4- 氟 苯 基 ) 哌 嗪 (3.21g，17.8mmol)。 在室温下将反应混合物搅拌 3 小时，随后真空浓缩。 将残余物 溶解在 EtOAc(400mL) 中，随后依次用 1M NaOH 水溶液 (6x 150mL)、盐水 (50mL) 洗 涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 将残余物溶解在 DCM(100mL) 中并加入甲基异氰酸酯树脂 (1.0g)。 将反应混合物振摇 14 小时，过滤，随后真空浓缩。 残余物经反相色谱纯 化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1％甲酸，0-30％ )。 将得到的残余物溶 解在 DCM(70mL) 中并与固体 K2CO3 搅拌 20 分钟，过滤并真空浓缩，得到浅黄色油状的 4-(4- 氟苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯 (0.67g，11.8％ )。
HPLC 分析 ：纯度 98.9％ ( 系统 A，RT ＝ 4.09 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 97.0％ ( 系统 A，RT ＝ 4.65 分钟 )，ES+ ：336.1[MH]+ ；C18H26FN3O2 ：HRMS 计算值 335.2009， 实测值 335.2022。
实施例 7
4-(4- 甲氧基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯
将 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲醇 (1.00g，7.74mmol) 溶解在 DCM(20mL) 中并冷 却至 0℃。 加入 NMM(0.94mL，8.51mmol) 和氯甲酸 4- 硝基苯酯 (1.56g，7.74mmol)。 在 0℃下将反应混合物搅拌 20 分钟，随后将其加入至 4-(4- 甲氧基苯基 ) 哌嗪 (1.64g， 8.51mmol) 和 DIPEA(2.02mL，11.01mmol) 在 DMF(30mL) 中 的 溶 液 中。 在 室 温 下 将 反应混合物搅拌 4 小时，随后真空浓缩。 将残余物溶解在 EtOAc(200mL) 中并依次用 1MNaOH 水溶液 (5x 100mL)、盐水 (100mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 残余物 经反相色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1％甲酸，0-30％ )。 将得 到的残余物溶解在 DCM(70mL) 中并与固体 K2CO3 搅拌 20 分钟，过滤并真空浓缩，得到 灰白色固体状的 4-(4- 甲氧基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 (1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 甲酯 (0.277g， 10.3％ )。
HPLC 分析 ：纯度 99.2％ ( 系统 A，RT ＝ 3.51 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 97.3％ ( 系统 A， RT ＝ 4.09 分钟 )， ES+ ：348.5[MH]+ ；C19H29N3O3 ：HRMS 计算值 347.2209， 实测值 347.2222。
实施例 8
4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 [1-(2- 甲氧基乙基 ) 哌啶 -4- 基 ] 甲酯
将碳酸 (1-( 叔丁氧基羰基 ) 哌啶 -4- 基 ) 甲酯 4- 硝基苯酯 ( 中间体 2 ；5.0g， 13.1mmol) 溶 解 在 DMF(30mL) 中。 加 入 DIPEA(4.58mL，26.3mmol) 和 1- 苯 基 哌 嗪 (2.01mL，13.1mmol)。 在室温下将反应混合物搅拌 18 小时，随后真空浓缩。 将残余 物溶解在 EtOAc(300mL) 中，随后依次用 NaHCO3 饱和水溶液 (6x 200mL)、10 ％柠檬 酸溶液 (50mL) 和盐水 (50mL) 洗涤。 将溶液干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 将残余物溶解在 DCM(20mL) 中并加入 TFA(10mL)。 在室温下将反应混合物搅拌 3 小时，随后真 空浓缩。 将残余物溶解在水 (20mL) 中，加入饱和 NaHCO3 水溶液 (100mL)，水层用 DCM(3x 200mL) 萃取。 随后合并的有机层用盐水 (50mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并将溶 液真空浓缩，得到黄色固体状的 4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 ( 哌啶 -4- 基 ) 甲酯 (3.825g，产率 为 95.9％ )。
LCMS 分析 ：( 系统 C， RT ＝ 1.64 分钟 )， ES+ ：304.4[MH]+。
将得自上一步骤的 4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 ( 哌啶 -4- 基 ) 甲酯 (2.15g，7.10mmol)、 2- 溴乙基甲基醚 (0.67mL，7.10mmol) 和 DIPEA(1.36mL，7.81mmol) 溶解在 DMF(30mL) 中并在 70℃下搅拌过夜，随后真空浓缩。 将残余物溶解在 DCM(300mL) 中，随后依次 用饱和 NaHCO3 水溶液 (2x 100mL)、盐水 (50mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 残 余物经正相柱色谱纯化 ( 用 DCM 洗脱，随后用 98 ∶ 1 ∶ 1 的 DCM ∶ MeOH ∶ DIPEA 的混合物洗脱 )，随后经反相色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，0-100％ )，得到 标题化合物 4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 [1-(2- 甲氧基乙基 ) 哌啶 -4- 基 ] 甲酯 (0.798g，产率为 31.1％ )，其为粘稠状黄色油。
HPLC 分析 ：纯度 99.9％ ( 系统 A，RT ＝ 3.83 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A， RT ＝ 4.59 分钟 )， ES+ ：362.5[MH]+ ；C20H31N3O3 ：HRMS 计算值 361.2365， 实测值 361.2382。
实施例 9
4-(4- 氟苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 [1-(2- 甲氧基乙基 ) 哌啶 -4- 基 ] 甲酯 · 二盐酸 盐
将碳酸 (1-(2- 甲氧基乙基 ) 哌啶 -4- 基 ) 甲酯 4- 硝基苯酯 ( 中间体 3 ；1.01g， 3.0mmol) 溶解在 DMF(10mL) 中。 加入 DIPEA(0.87mL，5.0mmol) 和 4-(4- 氟苯基 ) 哌 嗪 (541mg，3.0mmol) 并在室温下将反应混合物搅拌 14 小时，随后将反应混合物真空浓 缩。 将得到的残余物溶解在 EtOAc(50mL) 中并用 1M Na2CO3 水溶液 (5x 30mL) 洗涤， 干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 残余物经正相柱色谱纯化 ( 用 DCM 洗脱，随后用 96 ∶ 4 的 DCM ∶ MeOH 的混合物洗脱 )，随后经反相柱色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱， 0-100％ )。 将残余物溶解在 DCM(10mL) 中并加入 2M 在 Et2O 中的 HCl(3mL)。 随后 将反应混合物真空浓缩，得到白色固体状的 4-(4- 氟苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 [1-(2- 甲氧基 乙基 ) 哌啶 -4- 基 ] 甲酯 · 二盐酸盐 (90mg，7.9％ )。
HPLC 分析 ：纯度 99.3％ ( 系统 A，RT ＝ 4.25 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 5.80 分钟 )，ES+ ：380.5[MH]+ ；C20H30FN3O3 ：HRMS 计算值 379.2271， 实测值 379.2281。
实施例 10
4-(4- 氯苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 [1-(2- 甲氧基乙基 ) 哌啶 -4- 基 ] 甲酯 · 二盐酸
盐
将碳酸 (1-(2- 甲氧基乙基 ) 哌啶 -4- 基 ) 甲酯 4- 硝基苯酯 ( 中间体 3 ；1.01g， 3.0mmol) 溶解在 DMF(10mL) 中。 加入 DIPEA(1.74mL，5.0mmol) 和 4-(4- 氯苯基 ) 哌 嗪 · 二盐酸盐 (808mg，3.0mmol) 并在室温下将反应混合物搅拌 14 小时，随后将反应 混合物真空浓缩。 将得到的残余物溶解在 EtOAc(50mL) 中并用 1M Na2CO3 水溶液 (5x 30mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 残余物经正相柱色谱纯化 ( 用 DCM 洗脱， 随后用 96 ∶ 4 的 DCM ∶ MeOH 的混合物洗脱 )，随后经反相柱色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，0-100％ )。 将残余物溶解在 DCM 中 (10mL) 并加入 2M 在 Et2O 中的 HCl(3mL)。 随后将反应混合物真空浓缩，得到白色固体状的 4-(4- 氯苯基 ) 哌嗪 -1- 甲 酸 [1-(2- 甲氧基乙基 ) 哌啶 -4- 基 ] 甲酯 · 二盐酸盐 (468mg，39.5％ )。
HPLC 分析 ：纯度 99.6％ ( 系统 A，RT ＝ 5.04 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 6.73 分钟 )，ES+ ：396.5[MH]+ ；C20H30ClN3O2 ：HRMS 计算值 395.1976， 实测值 395.1994。
实施例 11
4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 [1-(2- 甲氧基乙基 ) 哌啶 -4- 基 ] 甲酯
将 (1-(2- 甲氧基乙基 ) 哌啶 -4- 基 ) 甲醇 ( 中间体 3，步骤 2 ；1.73g，10.0mmol) 溶解在 DCM(50mL) 中并冷却至 0 ℃。 加入 NMM(1.21mL，11.0mmol) 和氯甲酸 4- 硝 基 苯 酯 (2.02g，10.0mmol)。 在 0 ℃ 下 将 反 应 混 合 物 搅 拌 15 分 钟， 随 后 将 其 加 入 至 4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 · 二盐酸盐 (2.62g，10.5mmol) 和 DIPEA(6.10mL，35.0mmol) 在 DMF(75mL) 中的溶液中。 在室温下将反应混合物搅拌 4 小时，随后真空浓缩。 将残余 物溶解在 EtOAc(300mL) 中，随后依次用 1M NaOH 水溶液 (6x100mL)、盐水 (100mL) 洗涤，随后干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 残余物经反相色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度 洗脱，各溶剂中含 1％甲酸，0-30％ )。 将得到的残余物溶解在 DCM(70mL) 中并与固体 K2CO3 搅拌 20 分钟，过滤并真空浓缩，得到浅黄色油状的 4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲 酸 [1-(2- 甲氧基乙基 ) 哌啶 -4- 基 ] 甲酯 (0.95g，25.4％ )。
HPLC 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 4.08 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A， RT ＝ 4.70 分钟 )， ES+ ：376.5[MH]+ ；C21H33N3O3 ：HRMS 计算值 375.2522， 实测值 375.2534。
实施例 12 4-(4- 甲氧基苯基 )- 哌嗪 -1- 甲酸 [1-(2- 甲氧基乙基 ) 哌啶 -4- 基 ] 甲酯将 (1-(2- 甲氧基乙基 ) 哌啶 -4- 基 ) 甲醇 ( 中间体 3，步骤 2 ；1.34g，7.74mmol) 溶解在 DCM(20mL) 中并冷却至 0℃。 加入 NMM(0.94mL，8.51mmol) 和氯甲酸 4- 硝基 苯酯 (1.56g，7.74mmol)。 在 0℃下将反应混合物搅拌 20 分钟，随后将其加入至 4-(4- 甲 氧 基 苯 基 ) 哌 嗪 (1.64g，8.51mmol) 和 DIPEA(6.10mL，35.0mmol) 在 DMF(30mL) 中 的溶液中。 在室温下将反应混合物搅拌 4 小时，随后真空浓缩。 将残余物溶解在 EtOAc(300mL) 中，随后依次用 1M NaOH 水溶液 (5x125mL)、盐水 (100mL) 洗涤，随后 干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 残余物经反相色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶 剂中含 1％甲酸，0-30％ )。 将得到的残余物溶解在 DCM(70mL) 中并与固体 K2CO3 搅拌 20 分钟，过滤并真空浓缩，得到浅黄色油状的标题化合物 4-(4- 甲氧基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲 酸 [1-(2- 甲氧基乙基 ) 哌啶 -4- 基 ] 甲酯 (0.637g，21.6％ )。
HPLC 分析 ：纯度 99.9％ ( 系统 A，RT ＝ 4.87 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A， RT ＝ 4.18 分钟 )， ES+ ：392.1[MH]+ ；C21H33N3O4 ：HRMS 计算值 391.2471， 实测值 391.2471。
实施例 13
4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 乙酯
将 2- 哌啶 -4- 基 - 乙醇 (2.37g，18.3mmol) 溶解在甲酸 (2.1mL，55.7mmol)、 35％甲醛水溶液 (4.5mL，55.4mmol) 和水 (20mL) 中。 在 95℃下将反应混合物加热 2 小 时，随后冷却至室温。 通过缓慢将反应混合物倾至饱和 NaHCO3 溶液 (200mL) 上使其猝
灭并真空浓缩。 将残余物悬浮在 MeOH(100mL) 中并搅拌 2 小时，过滤，随后将滤液真 空浓缩，得到无色油状的 2-(1- 甲基 - 哌啶 -4- 基 )- 乙醇 (3.38g，129％ )，其无需进一 步纯化即可使用。
LCMS 分析 ：( 系统 C， RT ＝ 0.50 分钟 )， ES+ ：144.1[MH]+。
在氩气气氛下将 NaH(60％在矿物油中的分散体，0.81g，42.2mmol) 悬浮在庚烷 (10mL) 中。 将庚烷倾析，往烧瓶中装入 THF(20mL) 并冷却至 0℃。 滴加 2-(1- 甲基 - 哌 啶 -4- 基 )- 乙醇 (1.01g，7.03mmol) 在 THF(20mL) 中的溶液，随后加入 4-(4- 甲基苯 基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 4- 硝基苯酯 (2.89g，8.46mmol) 在 THF(20mL) 中的溶液。 让反应混合物升至室温并搅拌 48 小时。 随后将反应混合物冷却至 0℃并通过滴加 NaHCO3 饱和水 溶液猝灭并真空浓缩。 将残余物溶解在 EtOAc(200mL) 中，用 NaHCO3 溶液 (4x50mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 残余物经正相柱色谱纯化 ( 用 DCM 洗脱，随后用 90 ∶ 10 的 DCM ∶ MeOH 的混合物洗脱 )，随后经反相色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯 度洗脱，各溶剂中含 1％甲酸，0-20％ )。 将得到的残余物溶解在 DCM(50mL) 中并与固 体 K2CO3 搅拌 20 分钟，过滤并真空浓缩，得到乳白色固体状的标题化合物 4-(4- 甲基苯 基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(1- 甲基哌啶 -4- 基 ) 乙酯 (0.21g，7％ )。
HPLC 分析 ：纯度 99.6％ ( 系统 A，RT ＝ 4.02 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A， RT ＝ 4.48 分钟 )， ES+ ：346.5[MH]+ ；C20H31N3O2 ：HRMS 计算值 345.2416， 实测值 345.2427。
实施例 14
4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 1- 甲基哌啶 -4- 基酯
在 0℃下往 4- 羟基 -1- 甲基哌啶 (3.00g，26.1mmol) 和 NMM(3.0mL，27.3mmol) 在 DCM(50mL) 中的溶液中加入氯甲酸对硝基苯酯 (5.51g，27.4mmol)。 在室温下将反应 混合物搅拌 4 小时，逐渐形成乳膏状沉淀。 将反应混合物过滤，残余物用 DCM(50mL) 洗涤，得到乳白色固体状的碳酸 1- 甲基哌啶 -4- 基酯 4- 硝基苯酯 (7.24g，99％ )。
LCMS 分析 ：( 系统 C， RT ＝ 2.02 分钟 )， ES+ ：281.4[MH]+。
往碳酸 1- 甲基哌啶 -4- 基酯 4- 硝基苯酯 (1.81g，6.44mmol) 和 DIPEA(0.76mL， 4.4mmol) 在 DMF(20mL) 中的溶液中加入 4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 (1.53g，6.14mmol)。 在室温下将反应混合物搅拌 3 小时，随后将反应混合物真空浓缩。 将得到的残余物溶解 在 EtOAc(250mL) 中并用 1M Na2CO3 水溶液 (5x 150mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓 缩。 残余物经正相柱色谱纯化 ( 用 DCM 洗脱，随后用 90 ∶ 10 的 DCM ∶ MeOH 的混 合物洗脱 )，得到乳白色固体状的 4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 1- 甲基 - 哌啶 -4- 基酯 (1.54g，79％ )。
HPLC 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 3.73 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A， RT ＝ 4.90 分钟 )， ES+ ：318.5[MH]+ ；C18H27N3O2 ：HRMS 计算值 317.2103， 实测值 317.2117。
实施例 15
4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 [(3S)-1- 甲基吡咯烷 -3- 基 ] 酯
将 (S)-(+)-3- 羟 基 -N- 甲 基 吡 咯 烷 (1.51g，14.9mmol) 溶 解 在 DCM(20mL) 中 并 冷 却 至 0 ℃。 加 入 NMM(1.70mL，15.5mmol) 和 氯 甲 酸 4- 硝 基 苯 酯 (3.16g， 15.7mmol)。 在 0℃下将反应混合物搅拌 30 分钟，随后加入 4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 · 二 盐酸盐 (3.71g，14.9mmol) 和 DIPEA(7.40mL，44.7mmol) 在 DMF(20mL) 中的溶液。 在 室温下将反应混合物搅拌 3 小时，随后真空浓缩。 将残余物溶解在 EtOAc(300mL) 中， 随后用 1M Na2CO3 水溶液 (5x 200mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 将残余物溶 解在 DCM(100mL) 中并加入甲基异氰酸酯树脂 (2.0g)，将反应混合物振摇 14 小时，过 滤，随后真空浓缩。 残余物经反相色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1％甲酸，0-30％ )。 将得到的残余物溶解在 DCM(70mL) 中并与固体 K2CO3 搅拌 20 分 钟，过滤并真空浓缩。 得到的残余物经正相柱色谱纯化 ( 用 DCM 洗脱，随后用 90 ∶ 10 的 DCM ∶ MeOH 的混合物洗脱 )，得到黄色油状的 4-(4- 甲基苯基 )- 哌嗪 -1- 甲酸 [(3S)-1- 甲基吡咯烷 -3- 基 ] 酯 (606mg，13.0％ )。
HPLC 分析 ：纯度 99.1％ ( 系统 A，RT ＝ 3.71 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A， RT ＝ 4.42 分钟 )， ES+ ：304.1[MH]+ ；C17H25N3O2 ：HRMS 计算值 303.1947， 实测值 303.1957。
实施例 16
4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 · 甲酸盐
将碳酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 4- 硝基苯酯 ( 中间体 4 ；1.58g，5.1mmol) 溶 解 在 DMF(25mL) 中。 加 入 DIPEA(0.87mL，5.0mmol) 和 4- 苯 基 - 哌 嗪 (807mg， 0.76mL，5.0mmol) 并在室温下将反应混合物搅拌 14 小时。 随后将反应混合物真空浓 缩。 残余物经反相柱色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1 ％甲酸， 0-100％ )，得到黄色油状的 4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基 - 哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 ·甲酸 盐 (113mg，6.7％ )。
HPLC 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 3.40 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 99.2％ ( 系统 A，RT ＝ 5.08 分钟 )，ES+ ：333.5[MH]+ ；C18H28N4O2 ：HR S 计算值 332.2212，实 测值 332.2225
实施例 17
4-(4- 氯苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯
将碳酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 4- 硝基苯酯 ( 中间体 4 ；740mg，2.4mmol) 溶解在 DMF(20mL) 中。 加入 NEt3(1.2mL，8.6mmol) 和 4-(4- 氯苯基 ) 哌嗪 · 二盐酸 盐 (691mg，2.6mmol) 并在室温下将反应混合物搅拌 24 小时，随后将反应混合物真空浓 缩。 将得到的残余物溶解在 EtOAc(50mL) 中并用 1M Na2CO3 水溶液 (5x 50mL) 洗涤，干 燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 残余物经正相柱色谱纯化 ( 用 DCM 洗脱，随后用 100 ∶ 8 ∶ 1 的 DCM ∶ EtOH ∶ NH3 的混合物洗脱 )，得到无色油状的 4-(4- 氯苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 (696mg，79％ )，将其静置结晶，得到白色固体。
HPLC 分析 ：纯度 99.8％ ( 系统 A，RT ＝ 4.16 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 5.89 分钟 )，ES+ ：367.5[MH]+ ；C19H27ClN4O2 ：HRMS 计算值 366.1823， 实测值 366.1836。
实施例 18
4-(3- 三氟甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯
将碳酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 4- 硝基苯酯 ( 中间体 4 ；761mg，2.5mmol) 溶 解 在 DMF(20mL) 中。 加 入 NEt3(0.4mL，2.9mmol) 和 4-(3- 三 氟 甲 基 苯 基 ) 哌 嗪 (583mg，2.5mmol) 并在室温下将反应混合物搅拌 24 小时，随后将反应混合物真空浓缩。 将得到的残余物溶解在 EtOAc(50mL) 中并用 1M Na2CO3 水溶液 (5x 50mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 残余物经正相柱色谱纯化 ( 用 DCM 洗脱，随后用 100 ∶ 8 ∶ 1 的 DCM ∶ EtOH ∶ NH3 的混合物洗脱 )，得到无色油状的 4-(3- 三氟甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲 酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 (631mg，64％ )。
HPLC 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 4.55 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A， RT ＝ 6.19 分钟 )， ES+ ：401.5[MH]+ ；C19H27F3N4O2 ：HR S 计算值 400.2086， 实测值 400.2100。
实施例 19
4-(3- 氟苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 · 三盐酸盐
将碳酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 4- 硝基苯酯 ( 中间体 4 ；2.3g，6.0mmol) 溶 解在 DMF(20mL) 中。 加入 DIPEA(0.76mL，4.4mmol) 和 4-(3- 氟苯基 ) 哌嗪 (790mg， 4.4mmol) 并在室温下将反应混合物搅拌 24 小时，随后将反应混合物真空浓缩。 残余物经 正相柱色谱纯化 ( 用 DCM 洗脱，随后用 95 ∶ 5 的 DCM ∶ MeOH 的混合物洗脱 )，随后 经反相柱色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1％甲酸，0-50％ )。 将得 到的残余物溶解在 EtOAc(70mL) 中并用 1M Na2CO3 水溶液 (8x20mL) 洗涤并真空浓缩。 将残余物溶解在 DCM(10mL) 中并加入 2M 在 Et2O 中的 HCl(3mL)。 随后将反应混合物 真空浓缩，得到灰白色固体状的 4-(3- 氟苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙 酯 · 三盐酸盐 (106mg，6％ )。
HPLC 分析 ：纯度 99.4％ ( 系统 A，RT ＝ 4.08 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 5.65 分钟 )，ES+ ：351.5[MH]+ ；C18H27FN4O2 ：HRMS 计算值 350.2118， 实测值 350.2128。
实施例 20
4-(2- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯
将碳酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 4- 硝基苯酯 ( 中间体 4 ；866mg，2.8mmol) 溶解在 DMF(20mL) 中。 加入 NEt3(1.5mL，10.8mmol) 和 4-(2- 甲基苯基 ) 哌嗪 ·二盐酸 盐 (704mg，2.8mmol) 并在室温下将反应混合物搅拌 24 小时，随后将反应混合物真空浓 缩。 将得到的残余物溶解在 EtOAc(50mL) 中并用 1M Na2CO3 水溶液 (5x 50mL) 洗涤，干 燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 残余物经正相柱色谱纯化 ( 用 DCM 洗脱，随后用 200 ∶ 8 ∶ 1 的 DCM ∶ EtOH ∶ NH3 的混合物洗脱 )，得到黄色油状的 4-(2- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲
酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 (308mg，32％ )。
HPLC 分析 ：纯度 99.7％ ( 系统 A，RT ＝ 4.01 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A， RT ＝ 5.72 分钟 )， ES+ ：347.5[MH]+ ；C19H30N4O2 ：HRMS 计算值 346.2369， 实测值 346.2380。
实施例 21
4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯
将碳酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 4- 硝基苯酯 ( 中间体 4 ；866mg，2.8mmol) 溶解在 DMF(25mL) 中。 加入 NEt3(1.5mL，10.8mmol) 和 4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 ·二盐酸 盐 (724mg，2.9mmol) 并在室温下将反应混合物搅拌 24 小时，随后将反应混合物真空浓 缩。 将得到的残余物溶解在 EtOAc(50mL) 中并用 1M Na2CO3 水溶液 (5x 50mL) 洗涤，干 燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 残余物经正相柱色谱纯化 ( 用 DCM 洗脱，随后用 200 ∶ 8 ∶ 1 的 DCM ∶ EtOH ∶ NH3 的混合物洗脱 )，得到黄色油状的 4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲 酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 (293mg，30％ )。
HPLC 分析 ：纯度 99.8％ ( 系统 A，RT ＝ 3.46 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A， RT ＝ 5.15 分钟 )， ES+ ：347.6[MH]+ ；C19H30N4O2 ：HRMS 计算值 346.2369， 实测值 346.2381。
实施例 22 4-(2，5- 二甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯将碳酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 4- 硝基苯酯 ( 中间体 4 ；866mg，2.8mmol) 溶解在 DMF(25mL) 中。 加入 NEt3(0.5mL，3.6mmol) 和 4-(2，5- 二甲基苯基 ) 哌嗪 (580mg，3.1mmol) 并在室温下将反应混合物搅拌 24 小时，随后将反应混合物真空浓缩。 将得到的残余物溶解在 EtOAc(50mL) 中并用 1M Na2CO3 水溶液 (5x 50mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 残余物经正相柱色谱纯化 ( 用 DCM 洗脱，随后用 200 ∶ 8 ∶ 1 的 DCM ∶ EtOH ∶ NH3 的混合物洗脱 )，得到黄色油状的 4-(2，5- 二甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲 酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 (274mg，27％ )。
HPLC 分析 ：纯度 99.4％ ( 系统 A，RT ＝ 4.19 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 99.5％ ( 系统 A， RT ＝ 5.89 分钟 )， ES+ ：361.6[MH]+ ；C20H32N4O2 ：HRMS 计算值 360.2525， 实测值 360.2543。
实施例 23
4-(3，4- 二氯苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 · 三盐酸盐
将碳酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 4- 硝基苯酯 ( 中间体 4 ；680mg，2.2mmol) 溶解在 DMF(20mL) 中。 加入 DIPEA(0.76mL，4.4mmol) 和 4-(3，4- 二氯苯基 ) 哌嗪 (508mg，2.2mmol) 并在室温下将反应混合物搅拌 24 小时，随后将反应混合物真空浓缩。 残余物经正相柱色谱纯化 ( 用 DCM 洗脱，随后用 400 ∶ 8 ∶ 1 的 DCM ∶ EtOH ∶ NH3 的 混合物洗脱，接着用 200 ∶ 8 ∶ 1 的 DCM ∶ EtOH ∶ NH3 的混合物洗脱 )，随后经反相柱 色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1％甲酸，0-100％ )。 将残余物溶 解在 DCM(10mL) 中并加入 2M 在 Et2O 中的 HCl(3mL)。 随后将反应混合物真空浓缩， 得到白色固体状的 4-(3，4- 二氯苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 · 三 盐酸盐 (182mg，17％ )。
HPLC 分析 ：纯度 99.6％ ( 系统 A，RT ＝ 4.66 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 6.34 分钟 )，ES+ ：401.5[MH]+ ；C18H26Cl2N4O2 ：HRMS 计算值 400.1433， 实测值 400.1449。
实施例 24
4-(2，4- 二氟苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 · 三盐酸盐
将碳酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 4- 硝基苯酯 ( 中间体 4 ；680mg，2.2mmol) 溶解在 DMF(20mL) 中。 加入 DIPEA(0.76mL，4.4mmol) 和 4-(2，4- 二氟苯基 ) 哌嗪 (508mg，2.2mmol) 并在室温下将反应混合物搅拌 24 小时，随后将反应混合物真空浓缩。 残余物经正相柱色谱纯化 ( 用 DCM 洗脱，随后用 200 ∶ 8 ∶ 1 的 DCM ∶ EtOH ∶ NH3 的 混合物洗脱 )，随后经反相柱色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1％甲 酸，0-100％ )。将残余物溶解在 DCM(10mL) 中并加入 2M 在 Et2O 中的 HCl(3mL)。随后 将反应混合物真空浓缩，得到白色固体状的标题化合物 4-(2，4- 二氟苯基 ) 哌嗪 -1- 甲 酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 · 三盐酸盐 (630mg，65％ )。
HPLC 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 4.02 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 5.76 分钟 )，ES+ ：369.5[MH]+ ；C18H26F2N4O2 ：HRMS 计算值 368.2024， 实测值 368.2038。
实施例 25
4-(4- 甲氧基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯
将碳酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 4- 硝基苯酯 ( 中间体 4 ；680mg，2.2mmol) 溶解在 DMF(20mL) 中。 加入 DIPEA(0.76mL，4.4mmol) 和 4-(4- 甲氧基苯基 ) 哌嗪 (422mg，2.2mmol) 并在室温下将反应混合物搅拌 24 小时，随后将反应混合物真空浓缩。 残余物经正相柱色谱纯化 ( 用 DCM 洗脱，随后用 500 ∶ 8 ∶ 1 的 DCM ∶ EtOH ∶ NH3 的 混合物洗脱，接着用 50 ∶ 8 ∶ 1 的 DCM ∶ EtOH ∶ NH3 的混合物洗脱 )。残余物用 EtOAc 重结晶，得到白色固体状的 4-(4- 甲氧基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙 酯 (137mg，17％ )。
HPLC 分析 ：纯度 99.2％ ( 系统 A，RT ＝ 3.20 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 99.1％ ( 系统 A， RT ＝ 4.87 分钟 )， ES+ ：363.6[MH]+ ；C19H30N4O3 ：HRMS 计算值 362.2318， 实测值 362.2330。
实施例 26 3- 甲基 -4-(3- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯将碳酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 4- 硝基苯酯 ( 中间体 4 ；2.56g，8.28mmol) 溶解在 DMF(20mL) 中。 加入 DIPEA(1.40mL，8.45mmol) 和 2- 甲基 -4-(3- 甲基苯基 ) 哌嗪 (1.50g，7.87mmol) 并在室温下将反应混合物搅拌 24 小时，随后将反应混合物真空 浓缩。 将得到的残余物溶解在 EtOAc(200mL) 中并用 1M Na2CO3 水溶液 (6x 100mL) 洗 涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 残余物经反相色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱， 各溶剂中含 1％甲酸，0-30％ )。 将得到的残余物溶解在 DCM(50mL) 中并与固体 K2CO3 搅拌 20 分钟，过滤并真空浓缩，得到浅黄色油状的 3- 甲基 -4-(3- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲 酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 (1.97g，69％ )。
HPLC 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 3.29 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A， RT ＝ 4.91 分钟 )， ES+ ：361.6[MH]+ ；C20H32N4O2 ：HRMS 计算值 360.2525， 实测值 360.2543。
实施例 27
4- 苄基哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯
将碳酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 4- 硝基苯酯 ( 中间体 4 ；567mg，1.8mmol) 溶解在 DMF(15mL) 中。 加入 DIPEA(0.52mL，3，0mmol) 和 4- 苄基哌嗪 (0.296mL， 1.7mmol)。 在室温下将反应混合物搅拌 24 小时，随后真空浓缩。 将残余物溶解在 EtOAc(40mL) 中并用 1M Na2CO3 水溶液 (6x 50mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 粗品经反相色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，0-100％ )，得到无色油状的 4- 苄基 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 (352mg，产率为 60％ )。
HPLC 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A， RT ＝ 2.92/3.00 分钟，分裂峰 ) ；LCMS 分 析 ：纯度 100％ ( 系统 A， RT ＝ 4.61 分钟 )， ES+ ：347.6[MH]+ ；C19H30N4O2 ：HRMS 计 算值 346.2369，实测值 346.2383。
实施例 28
4- 苯基哌啶 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 · 甲酸盐
将碳酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 4- 硝基苯酯 ( 中间体 4 ；680mg，2.2mmol) 溶 解 在 DMF(20mL) 中。 加 入 DIPEA(0.52mL，3.0mmol) 和 4- 苯 基 哌 啶 (322mg， 2.0mmol) 并在室温下将反应混合物搅拌 65 小时，随后真空浓缩。 将残余物溶解在 EtOAc(40mL) 中并用 1M Na2CO3 水溶液 (6x 50mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 粗品经反相柱色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1％甲酸，0-30％ )， 得到黄色油状的 4- 苯基哌啶 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 · 甲酸盐 (330mg， 42％ )。
HPLC 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 4.18 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A， RT ＝ 5.87 分钟 )， ES+ ：332.5[MH]+ ；C19H29N3O2 ：HRMS 计算值 331.2260， 实测值 331.2271。
实施例 29
3- 苯基吡咯烷 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯
将碳酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 4- 硝基苯酯 ( 中间体 4 ；2.10g，6.79mmol) 溶解在 DMF(30mL) 中。 加入 DIPEA(2.37mL，13.59mmol) 和 3- 苯基吡咯烷 (1.00g， 6.79mmol) 并在室温下将反应混合物搅拌 4 小时，随后将反应混合物真空浓缩。 将得到
的残余物溶解在 EtOAc(300mL) 中并用 1M Na2CO3 水溶液 (6x 200mL)、盐水 (50mL) 洗 涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 将残余物溶解在 DCM(100mL) 中并加入甲基异氰酸酯 树脂 (2.0g)，将反应混合物振摇 14 小时，过滤，随后真空浓缩。 残余物经反相色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1％甲酸，0-30％ )。 将得到的残余物溶解在 DCM(60mL) 中并与固体 K2CO3 搅拌 20 分钟，过滤并真空浓缩，得到浅黄色油状的 3- 苯 基吡咯烷 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 (1.03g，48.0％ )。
HPLC 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 3.85 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A， RT ＝ 5.04 分钟 )， ES+ ：318.5[MH]+ ；C18H27N3O2 ：HRMS 计算值 317.2103， 实测值 317.2114。
实施例 30
4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 2- 哌嗪 -1- 基乙酯 · 三盐酸盐
往 1-(2- 羟基乙基 ) 哌嗪 (51.7g，398mmol) 在 DCM(500mL) 中的溶液中加入 NEt3(70.0mL，526mmol) 和二碳酸二叔丁酯 (80.0g，367mmol)。 在室温下将反应混合物 搅拌过夜，随后用 1M Na2CO3 水溶液 (2x 300mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩，得 到无色油状的 4-(2- 羟基乙基 ) 哌嗪 -1- 甲酸叔丁酯 (66.0g，72％ )。
LCMS 分析 ：( 系统 D， RT ＝ 1.54 分钟 )， ES+ ：231.4[MH]+。
将碳酸二 ( 对硝基苯酯 )(1.52g，5.0mmol) 溶解在 DCM(20mL) 中。 加入得自 上一步骤的 4-(2- 羟基乙基 ) 哌嗪 -1- 甲酸叔丁酯 (1.15g，5.0mmol) 和 NMM(0.55mL， 5.0mmol) 并在室温下将反应混合物搅拌 16 小时。 反应混合物用 DCM(40mL) 稀释并用 饱和 NaHCO3 水溶液 (5x50mL) 洗涤，干燥 (Na2SO4) 并真空浓缩，得到黄色油状物。 该 油状物用 EtOAc 和庚烷重结晶来纯化，得到橙色固体状的碳酸 2-(4-( 叔丁氧基羰基 ) 哌 嗪 -1- 基 ) 乙酯 4- 硝基苯酯 (1.208g，61％ )。
LCMS 分析 ：( 系统 C， RT ＝ 1.90 分钟 )， ES+ ：396.5[MH]+。
将碳酸 2-(4-( 叔丁氧基羰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 4- 硝基苯酯 (7.01g，17.7mmol) 溶解在 DMF(150mL) 中。 加入苯基哌嗪 (2.8mL，18.3mmol) 和 NEt3(3.0mL，21.5mmol) 并在室温下将反应混合物搅拌 18 小时。 将反应混合物真空浓缩，溶解在 EtOAc(250mL) 中，用 1M Na2CO3 水溶液 (5x 250mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 残余物经反相 色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，0-100％ )，得到黄色油状的 4- 苯基哌嗪 -1- 甲 酸 2-(4-( 叔丁氧基羰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 (5.68g，77 ％ )。 将 4- 苯基哌嗪 -1- 甲 酸 2-(4-( 叔 丁 氧 基 羰 基 ) 哌 嗪 -1- 基 ) 乙 酯 (0.45g，1.07mmol) 溶 解 在 DCM(30mL) 和 2M HCl 在 Et2O 中的混合物 (4mL，8mmol) 中并搅拌过夜。 将上清液弃去。 残余物 用 DCM(3x 15mL) 洗涤并真空干燥，得到浅褐色玻璃状的 4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 2-( 哌 嗪 -1- 基 ) 乙酯 · 三盐酸盐 (0.42g，98％ )。
HPLC 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 3.42 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％
( 系统 A， RT ＝ 3.92 分钟 )， ES+ ：319.1[MH]+。
实施例 31
4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 2-(4-(2- 甲氧基乙基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 乙酯
将 4- 苯 基 哌 嗪 -1- 甲 酸 2-( 哌 嗪 -1- 基 ) 乙 酯 ( 实 施 例 30 的 非 HCl 盐 ； 311mg，0.98mmol) 溶解在 DMF(2mL) 中。 加入 2- 溴乙基甲基醚 (92μl，0.98mmol) 和 DIPEA(0.3mL，1.72mmol) 并在 170℃下在 Biotage Initiator 微波中在高吸收下将反应混 合物加热 15 分钟。 将反应混合物真空浓缩，溶解在 1M Na2CO3 水溶液 (25mL) 中并用 DCM(3x25mL) 萃取，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 残余物经正相柱色谱纯化 ( 用 DCM 洗 脱，随后用 200 ∶ 8 ∶ 1 的 DCM ∶ EtOH ∶ NH3 的混合物洗脱 )，得到黄色油状的 4- 苯 基哌嗪 -1- 甲酸 2-(4-(2- 甲氧基乙基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 (163mg，44％ )。
HPLC 分析 ：纯度 98.6％ ( 系统 A，RT ＝ 3.48 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 98.1％ ( 系统 A， RT ＝ 5.20 分钟 )， ES+ ：377.6[MH]+ ；C20H32N4O3 ：HRMS 计算值 376.2474， 实测值 376.2493。
实施例 32
4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 乙基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 · 三盐酸盐
将 4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 2-( 哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 ( 实施例 30 的非 HCl 盐 ；291mg， 0.91mmol) 溶解在 DMF(2mL) 中。 加入碘乙烷 (74μl，2.31mmol) 和 DIPEA(0.3mL， 1.72mmol) 并在 170 ℃下在 Biotage Initiator 微波中在高吸收下将反应混合物加热 15 分 钟，随后真空浓缩。 将残余物溶解在 1M Na2CO3 水溶液 (25mL) 中并用 DCM(3x 25mL) 萃取，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 粗品经正相柱色谱纯化 ( 用 DCM 洗脱，随后用 200 ∶ 8 ∶ 1 的 DCM ∶ EtOH ∶ NH3 的混合物洗脱 )，随后经反相色谱纯化 ( 用在水中 的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1％甲酸，0-100％ )，得到无色油状物。 将该油状物溶 解在 DCM 中，用过量的 2M 在 Et2O 中的 HCl 处理并真空浓缩，得到白色固体状的 4- 苯 基哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 乙基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 · 三盐酸盐 (197mg，52％ )。
HPLC 分析 ：纯度 99.8％ ( 系统 A，RT ＝ 3.41 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 98.9％ ( 系统 A， RT ＝ 5.28 分钟 )， ES+ ：347.6[MH]+ ；C19H30N4O2 ：HRMS 计算值 346.2369， 实测值 346.2379。
实施例 33
4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基 -1，4- 二氮杂环庚烷 -1- 基 ) 乙酯将 1- 甲 基 高 哌 嗪 (2.00g，17.5mmol) 和 DIPEA(3.0mL，18.4mmol) 溶 解 在 DMF(25mL) 中。 经 5 分 钟 缓 慢 加 入 2- 溴 甲 醇 (1.3mL，18.4mmol)。 在 100 ℃ 下 将 反应混合物搅拌 2 小时，随后在室温下搅拌 48 小时，随后真空浓缩。 将残余物溶解在 EtOAc(300mL) 中，随后依次用 1M Na2CO3 水溶液 (5x 200mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真 空浓缩，得到褐色油状的 2-(4- 甲基高哌嗪 -1- 基 ) 乙醇 (2.77g，100％ )，其无需进一步 纯化即可使用。
LCMS 分析 ：( 系统 C， RT ＝ 0.33 分钟 )， ES+ ：159.2[MH]+。
将得自上一步骤的 2-(4- 甲基高哌嗪 -1- 基 ) 乙醇 (2.77g，17.5mmol) 溶解在 DCM(25mL) 中并冷却至 0 ℃。 加入 NMM(2.00mL，18.4mmol) 和氯甲酸对硝基苯酯 (3.71g，18.4mmol)。 在 0℃下将反应混合物搅拌 30 分钟，随后在室温下搅拌 2 小时。
随 后 加 入 4-(4- 甲 基 苯 基 ) 哌 嗪 · 二 盐 酸 盐 (2.84g，11.4mmol) 和 DIPEA(5.50mL， 33.3mmol) 在 DMF(40mL) 中的溶液。 在室温下将反应混合物搅拌 3 小时，随后真空 浓缩。 将残余物溶解在 EtOAc(300mL) 中，随后依次用 1M Na2CO3 水溶液 (5x200mL) 洗 涤， 干 燥 (MgSO4) 并 真 空 浓 缩。 残 余 物 经 正 相 柱 色 谱 纯 化 ( 用 DCM 洗 脱， 随 后 用 85 ∶ 15 的 DCM ∶ MeOH 的 混 合 物 洗 脱 )， 随 后 经 反 相 HPLC 纯 化 (Advanced Chromatography Technologies ACE-122-1030RP silica 100x 30mm 柱， 装 填 有 Ace 5C8(5μm)，粒径 30mL/ 分钟，用在水中的乙腈梯度洗脱，在各溶剂中含 0.1％三 氟乙酸，8-38 ％ )。 将得到的残余物溶解在 DCM(50mL) 中并与固体 K2CO3 搅拌 20 分 钟，过滤并真空浓缩，得到浅黄色油状的 4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基 -1， 4- 二氮杂环庚烷 -1- 基 ) 乙酯 (184mg，3.0％ )。
HPLC 分析 ：纯度 98.1％ ( 系统 A，RT ＝ 3.50 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 95.8％ ( 系统 A， RT ＝ 3.96 分钟 )， ES+ ：361.2[MH]+ ；C20H32N4O2 ：HRMS 计算值 360.2525， 实测值 360.2542。
实施例 34 4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 3-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 丙酯将 1-(3- 羟基丙基 )-4- 哌嗪 (0.63g，4.0mmol) 溶解在 DCM(30mL) 中并冷却至 0℃。 加入 DIPEA(1.39mL，8.0mmol) 和氯甲酸对硝基苯酯 (0.80g，4.0mmol)。 在室温下
将反应混合物搅拌 2 小时，随后加入苯基哌嗪 (0.61mL，4.0mmol)。在室温下将反应混合 物搅拌 16 小时，随后真空浓缩。 将残余物溶解在 EtOAc(100mL) 中并依次用 1MNa2CO3 水溶液 (4x 100mL) 洗涤，随后真空浓缩。 残余物经反相色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯 度洗脱，各溶剂中含 1％甲酸，0-30％ )。 将得到的残余物溶解在 DCM(30mL) 中并与固 体 Na2CO3 搅拌 20 分钟，过滤并真空浓缩。 得到的残余物经反相 HPLC 纯化 ( 用在水中的 乙腈梯度洗脱，5-45％ )，得到无色油状的 4- 苯基哌嗪 -1- 甲酸 3-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 丙酯 (148mg，11％ )。
HPLC 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 3.51 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A， RT ＝ 3.99 分钟 )， ES+ ：347.2[MH]+ ；C19H30N4O2 ：HRMS 计算值 346.2369， 实测值 346.2386。
实施例 35
1-[2，2- 二甲基 -3-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 丙酰基 ]-4- 苯基哌嗪
将 3- 溴 -2，2- 二甲基丙酸 (2.07g，11.4mmol) 溶解在 DCM(12mL) 中。 经 10 分钟缓慢加入草酰氯 (1.50mL，17.2mmol)。 在室温下将反应混合物搅拌 3.5 小时，随 后真空浓缩。 将残余物溶解在 DCM(10mL) 中并在 0℃下将其加至苯基哌嗪 (1.74mL， 11.4mmol) 和 DIPEA(3.0mL，17.2mmol) 在 DCM(20mL) 中的溶液中。 经 1 小时让反应 混合物升至室温，随后在室温下搅拌 16 小时。 反应混合物用 10％柠檬酸溶液 (2x50mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 得到的残余物经正相柱色谱纯化 ( 用庚烷洗脱，随后 用 1 ∶ 1 的 EtOAc ∶庚烷的混合物洗脱 )，得到黄色油状的 3- 溴 -1-(4- 苯基 ) 哌嗪 -2， 2- 二甲基丙 -1- 酮 (1.36g，37％ )。
LCMS 分析 ：纯度约 80％ ( 系统 C， RT ＝ 2.14 分钟 )， ES+ ：326.2[MH]+。
将 3- 溴 -1-(4- 苯基 ) 哌嗪 -2，2- 二甲基丙 -1- 酮 (1.36g，4.2mmol) 溶解在 N- 甲基吡咯烷酮 (3mL) 中。 加入 N- 甲基哌嗪 (0.93mL，8.36mmol) 并在 200℃下、在 Biotage Initiator 微波中在正常吸收下将反应混合物加热 15 分钟。 反应混合物经反相柱色 谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1％甲酸，0-30％ )。 将得到的残余物 溶解在 DCM(100mL) 中并与固体 K2CO3 搅拌 20 分钟，过滤并真空浓缩，得到黄色油状 的 1-[2，2- 二甲基 -3-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 丙酰基 ]-4- 苯基哌嗪 (547mg，38％ )。
HPLC 分析 ：纯度 99.9％ ( 系统 A，RT ＝ 3.46 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 99.3％ ( 系统 A， RT ＝ 4.64 分钟 )， ES+ ：345.6[MH]+ ；C20H32N4O ：HRMS 计算值 344.2576， 实测值 344.2588。
实施例 36
1-{2，2- 二甲基 -3-[4-(4- 氯苯基 ) 哌嗪 -1- 基 ]-3- 氧代丙基 }-4- 甲基哌嗪
将 3- 溴 -2，2- 二 甲 基 丙 酸 (1.50g，8.29mmol) 溶 解 在 亚 硫 酰 氯 (10mL) 和 DMF(0.1mL) 中。 在回流下将反应混合物加热 1.5 小时，随后真空浓缩。 将残余物溶解 在 DCM(10mL) 中并在 0℃下将其加入至 4- 氯苯基哌嗪 · 二盐酸盐 (2.35g，8.70mmol) 和 DIPEA(5.05mL，29.0mmol) 在 DCM(20mL) 的溶液中。 在 0℃下将反应混合物搅拌 2 小时，随后真空浓缩。 将残余物溶解在 DCM(100mL) 中并用 10％柠檬酸溶液 (50mL)、 饱和 NaHCO3 水溶液 (50mL)、盐水 (50mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 得到的 残余物经正相柱色谱纯化 ( 用庚烷洗脱，随后用 1 ∶ 1 的 EtOAc ∶庚烷的混合物洗脱 )， 得到黄色固体状的 3- 溴 -1-(4- 氯苯基 ) 哌嗪 -2，2- 二甲基丙 -1- 酮 (0.87g，29.3％ )。
LCMS 分析 ：纯度约 75％ ( 系统 C， RT ＝ 2.40 分钟 )， ES+ ：361.3[MH]+。
将 3- 溴 -1-(4- 氯苯基 ) 哌嗪 -2，2- 二甲基丙 -1- 酮 (0.87g，2.43mmol) 溶解 在 N- 甲基吡咯烷酮 (3mL) 中。 加入 N- 甲基哌嗪 (0.54mL，4.85mmol) 并在 200℃下、 在 Biotage Initiator 微波中在正常吸收下将反应混合物加热 15 分钟。 反应混合物经反相柱 色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1％甲酸，0-30％ )。 将得到的残 余物溶解在 DCM(100mL) 中并与固体 K2CO3 搅拌 20 分钟，过滤并真空浓缩，得到浅褐
色油状物，其用庚烷重结晶，得到白色固体状的 1-{2，2- 二甲基 -3-[4-(4- 氯苯基 ) 哌 嗪 -1- 基 ]-3- 氧代丙基 }-4- 甲基哌嗪 (335mg，36.4％ )。
HPLC 分析 ：纯度 99.8％ ( 系统 A，RT ＝ 4.36 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 6.34 分钟 )，ES+ ：379.4[MH]+ ；C20H31ClN4O ：HRMS 计算值 378.2186， 实测值 378.2196。
实施例 37
1-{2，2- 二甲基 -3-[4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 基 ]-3- 氧代丙基 }-4- 甲基哌嗪
将 3- 溴 -2，2- 二甲基丙酸 (10.0g，55.3mmol) 溶解在 DCM(60mL) 中。 经 10 分钟缓慢加入草酰氯 (7.20mL，82.9mmol)。在室温下将反应混合物搅拌 18 小时，随后真 空浓缩。 将残余物溶解在 DCM(40mL) 中并在 0℃下将其加入至 4- 甲基苯基哌嗪 ·二盐 酸盐 (13.76g，55.3mmol) 和 DIPEA(33.0mL，193.4mmol) 在 DCM(100mL) 中的溶液中。 经 1 小时让反应混合物升至室温，随后在室温下搅拌 16 小时。 反应混合物用 10％柠檬酸 溶液 (2x 100mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩，得到白色固体状的 3- 溴 -1-(4- 甲基 苯基 ) 哌嗪 -2，2- 二甲基丙 -1- 酮 (9.62g，52％ )，其无需进一步纯化即可使用。
LCMS 分析 ：纯度约 70％ ( 系统 C， RT ＝ 2.34 分钟 )， ES+ ：339.3[MH]+。
将 3- 溴 -1-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -2，2- 二甲基丙 -1- 酮 (6.00g，17.68mmol) 溶 解在 N- 甲基吡咯烷酮 (12mL) 中。 加入 N- 甲基哌嗪 (4.12mL，37.94mmol)。 将反应混 合物分为四批并每批在 200℃、Biotage Initiator 微波中在高吸收下加热 15 分钟。将反应混 合物合并并溶解在 DCM(300mL) 中，随后用 0.5M KOH 水溶液 (100mL)，水 (100mL)、 盐水 (100mL) 洗涤，随后干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 将残余物溶解在 DCM(100mL) 中并加入甲基异氰酸酯树脂 (2.0g)，随后将反应混合物振摇 48 小时，过滤，随后真空浓 缩。 得到的残余物经反相色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1％甲酸， 0-30％ )。 将得到的残余物溶解在 DCM(100mL) 中并与固体 K2CO3 搅拌 20 分钟，过滤 并真空浓缩，得到浅褐色油状物，其用庚烷重结晶，得到白色固体状的 1-{2，2-- 二甲 基 -3-[4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 基 ]-3- 氧代丙基 }-4- 甲基哌嗪 (1.47g，23.2％ )。
HPLC 分析 ：纯度 99.7％ ( 系统 A，RT ＝ 3.54 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A， RT ＝ 4.81 分钟 )， ES+ ：359.5[MH]+。
实施例 38
1-{2，2- 二甲基 -3-[4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 基 ]-3- 氧代丙基 }-4- 乙基哌嗪
3- 溴 -1-(4- 甲 基 苯 基 ) 哌 嗪 -2，2- 二 甲 基 丙 -1- 酮 ( 实 施 例 37， 步 骤 1 ； 2.00g，5.92mmol) 将溶解在 N- 甲基吡咯烷酮 (10mL) 中。 加入 N- 乙基哌嗪 (1.50mL， 11.8mmol)。将反应混合物分为四批并在 200℃、BiotageInitiator 微波中在高吸收下将各批 加热 15 分钟。 将反应混合物合并并溶解在 DCM(300mL) 中，随后用水 (2x 80mL)、盐水 (100mL) 洗涤，干燥 (MgSO4)，随后真空浓缩。 残余物经反相柱色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1％甲酸，0-30％ )。 将得到的残余物溶解在 DCM(100mL) 中并与固体 K2CO3 搅拌 20 分钟，过滤并真空浓缩，得到无色油状物，将其用庚烷重结 晶，得到白色固体状的 1-{2，2- 二甲基 -3-[4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 基 ]-3- 氧代丙 基 }-4- 乙基哌嗪 (1.19g，48％ )。
HPLC 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 3.59 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A， RT ＝ 5.52 分钟 )， ES+ ：373.6[MH]+ ；C22H36N4O ：HRMS 计算值 372.2889，
实测值 372.2904。
实施例 39
1-[2，2- 二甲基 -3-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 丙酰基 ]-4-(4- 氟苯基 ) 哌嗪
将 3- 溴 -2，2- 二 甲 基 丙 酸 (5.03g，27.8mmol) 溶 解 在 DCM(60mL) 中。 经 10 分钟缓慢加入草酰氯 (3.64mL，41.67mmol)。 在室温下将反应混合物搅拌 18 小时， 随后真空浓缩。 将残余物溶解在 DCM(40mL) 中并在 0 ℃下将其加入至 4- 氟苯基哌嗪 (5.00g，27.8mmol) 和 DIPEA(7.24mL，41.67mmol) 在 DCM(30mL) 中的溶液中。 经 1 小时让反应混合物升至室温，随后在室温下搅拌 16 小时。 反应混合物用 10％柠檬酸溶液 (2x 100mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩，得到黄色固体状的 3- 溴 -1-(4- 氟苯基 ) 哌嗪 -2，2- 二甲基丙 -1- 酮 (8.04g，84％ )，其无需进一步纯化即可使用。
LCMS 分析 ：纯度约 90％ ( 系统 C， RT ＝ 2.54 分钟 )， ES+ ：343.3[MH]+。
将 3- 溴 -1-(4- 氟苯基 ) 哌嗪 -2，2- 二甲基丙 -1- 酮 (2.00g，5.83mmol) 溶解在 N- 甲基吡咯烷酮 (10mL) 中。 加入 N- 甲基哌嗪 (1.30mL，11.7mmol)。 将反应混合物 分为四批并将各批在 200℃、 Biotage Initiator 微波中在高吸收加热 15 分钟。 将反应混合 物合并并溶解在 DCM(100mL) 中，并用水 (2x 80mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 得到的残余物经反相柱色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1％甲酸， 0-30％ )。 将得到的残余物溶解在 DCM(100mL) 中并与固体 Na2CO3 搅拌 20 分钟，过滤 并真空浓缩，得到黄色油状的 1-[2，2- 二甲基 -3-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 丙酰基 ]-4-(4- 氟 苯基 ) 哌嗪 (451mg，21％ )。
HPLC 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 3.68 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 98.2％ ( 系统 A， RT ＝ 5.52 分钟 )， ES+ ：363.5[MH]+ ；C20H31FN4O ：HRMS 计算值 362.2482， 实测值 362.2499。
实施例 40
1- 甲基 -4-[(1-{[4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 基 ] 羰基 } 环戊基 )- 甲基 ] 哌嗪
在 0 ℃下将 4- 甲基苯基哌嗪 · 二盐酸盐 (4.20g，16.9mmol) 和 NEt3(7.0mL， 50.2mmol) 溶 解 在 DCM(125mL) 中。 加 入 环 戊 烷 甲 酰 氯 (2.0mL，16.5mmol) 并 经 16 小时让反应混合物升至室温。 反应混合物用 1M Na2CO3 水溶液 (3x 100mL) 洗涤，干 燥 (MgSO4) 并真空浓缩，得到浅褐色油状的环戊烷羰基 4-( 甲基 ) 苯基哌嗪 (4.42g，
98％ )，其无需进一步纯化即可使用。
LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 C， RT ＝ 2.10 分钟 )， ES+ ：273.4[MH]+。
在 0 ℃、氩气下往二异丙基胺 (4.0mL，28.6mmol) 在 THF(100mL) 中的溶液中 滴加 1.6M 正丁基锂在 THF 中的溶液 (15mL，24mmol)。 在 0 ℃下将反应混合物搅拌 30 分钟，随后冷却至 -78 ℃并经 10 分钟加入环戊烷羰基 4-( 甲基 ) 苯基哌嗪 (2.97g， 10.9mmol) 在 THF(10mL) 中的溶液。 在 -78℃下将反应混合物搅拌 5 小时，随后加入多 聚甲醛 (0.90g，30mmol) 在 THF(10mL) 中的悬浮液。 经 1 小时让反应混合物升至室温， 随后在室温下搅拌 16 小时。 反应混合物用饱和 NH4Cl 水溶液 (10mL) 猝灭，随后倾至 1M Na2CO3 水溶液 (500mL) 上并用 EtOAc(2x 500mL) 萃取。 将有机层合并，干燥 (MgSO4)并真空浓缩，得到黄色油状物，将其用庚烷 /EtOAc 重结晶，得到浅黄色固体状的 (1- 羟 甲基 - 环戊基 )-(4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 基 )- 甲酮 (2.11g，64％ )。
LCMS 分析 ：纯度约 90％ ( 系统 C， RT ＝ 1.77 分钟 )， ES+ ：303.5[MH]+。
将得自上一步骤的 (1- 羟甲基 - 环戊基 )-(4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 基 )- 甲 酮 (1.57g，5.22mmol) 溶解在 DCM(40mL) 中。 加入 Dess-Martin 氧化剂 (periodinane) (3.06g，7.22mmol) 并在室温下将反应混合物搅拌 3.5 小时。 反应混合物用 Et2O(100mL) 稀释并加入 1M NaOH 水溶液 (50mL)。 将反应混合物搅拌 20 分钟，随后将有机层分离 并用 1M NaOH 水溶液 (50mL)、水 (50mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩，得到褐色 油状的 1-(4-(4- 甲基苯基 )- 哌嗪 -1- 羰基 )- 环戊烷甲醛 (1.64g，105％ )，其无需进一 步纯化即可使用。
LCMS 分析 ：纯度约 80％ ( 系统 C， RT ＝ 2.02 分钟 )， ES+ ：301.5[MH]+。
将 1-(4-(4- 甲基苯基 )- 哌嗪 -1- 羰基 )- 环戊烷甲醛 (1.64g，5.73mmol) 溶解在 DCM(50mL) 中。 加入粉末化的分子筛 (2.0g) 和乙酸 (0.1mL) 并在室温下将反应混合物 搅拌 1.5 小时，随后加入三乙酰氧基硼氢化钠 (2.44g，11.51mmol)。 在室温下将反应混合 物搅拌 16 小时，随后用 1M Na2CO3 水溶液 (50mL) 猝灭。 将反应混合物搅拌 15 分钟， 随后将水层分离并用 DCM(50mL) 萃取，将有机层合并，干燥 (MgSO4) 并真空浓缩。 残 余物经正相柱色谱纯化 ( 用 DCM 洗脱，随后用 95 ∶ 4 ∶ 1 的 DCM ∶ EtOH ∶ NH3 的 混合物洗脱 )，随后经反相柱色谱纯化 ( 用在水中的 MeOH 梯度洗脱，各溶剂中含 1％甲 酸，0-100％ )。将残余物溶解在 MeOH(5mL) 中并将其加入至 1M Na2CO3 水溶液 (50mL) 中，水层用 DCM(3x 50mL) 萃取。 将合并的有机层干燥 (MgSO4) 并真空浓缩，得到浅 黄色固体状的 1- 甲基 -4-[(1-{[4-(4- 甲基苯基 ) 哌嗪 -1- 基 ] 羰基 } 环戊基 ) 甲基 ] 哌 嗪 (520mg，26％ )。
HPLC 分析 ：纯度 99.7％ ( 系统 A，RT ＝ 4.25 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 99.3％ ( 系统 A， RT ＝ 4.77 分钟 )， ES+ ：385.6[MH]+ ；C23H36N4O ：HRMS 计算值 384.2889， 实测值 384.2908。
实施例 41
4-(4- 氟苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯
将 2-(4- 甲基 - 哌嗪 -1- 基 )- 乙醇 (1.44g，10mmol) 溶解在无水 THF(50mL) 中 并将反应混合物冷却至 0℃。 加入 NaH(60％在油中的分散体 ；0.40g，10mmol) 并搅拌 10 分钟，随后加入 4-(4- 氟苯基 )- 哌嗪 -1- 甲酸 4- 硝基苯酯 (3.45g，10mmol)。 在室 温下将反应混合物搅拌过夜。 通过滴加水 (1mL)/THF(10mL) 的混合物小心地使反应混 合物猝灭。 将 THF 真空除去并将残余物在饱和 Na2CO3 水溶液 (50mL) 和 EtOAc(200mL) 间分配。 有机层用饱和 Na2CO3 水溶液 (5x 50mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并将溶剂真空除
去。 起 初 残 余 物 经 反 相 柱 色 谱 纯 化 (LiChroprep RP-18，40-63μm，460x 26mm(100g)，30mL/ 分钟，0％至 60％ ( 经 60 分钟 )MeOH/ 水梯度洗脱 )。 分两批经反 相柱色谱进一步纯化 (LiChroprep RP-18，40-63μm，460x 26mm(100g)，30mL/ 分钟， 含 1％甲酸的 0％至 20％ ( 经 70 分钟 ) 至 100％ ( 经 5 分钟 )MeOH/ 水梯度洗脱 )，得到 4-(4- 氟苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 · 甲酸盐。
使 用 在 DCM 中 的 K2CO3 除 去 甲 酸， 随 后 真 空 干 燥 过 夜， 得 到 无 色 胶 状 的 4-(4- 氟苯基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 (0.60g，17％ )。
HPLC 分析 ：纯度 99.5％ ( 系统 A，RT ＝ 3.70 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 4.08 分钟 )，ES+ ：351.1[MH]+ ；C18H27FN4O2 ：HRMS 计算值 350.2118， 实测值 350.2133。
实施例 42
4-(4- 氟苄基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯
将 2-(4- 甲基 - 哌嗪 -1- 基 )- 乙醇 (0.86g，6mmol) 和 NMM(0.58mL，6mmol) 溶 解在 DCM(8mL) 中并将反应混合物冷却至 0℃。加入氯甲酸 4- 硝基苯酯 (1.29g，6mmol) 并将反应混合物搅拌 1 小时。往反应混合物中加入 1-(4- 氟 - 苄基 )- 哌嗪 (0.97g，5mmol) 和 DIPEA(6.0mL，过量 ) 在 DMF(20mL) 中的溶液。 在室温下将反应混合物搅拌过夜， 随后真空浓缩。 将残余物溶解在 EtOAc(150mL) 中，用饱和 Na2CO3 水溶液 (6x100mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并将溶剂真空除去。
起初残余物经柱色谱纯化 ( 正相，20g， Strata SI-1，二氧化硅 gigatube，20mL/ 分钟，用 0％至 15％ MeOH/DCM 梯度洗脱 )，随后经反相柱色谱进一步纯化 (LiChroprep RP-18，40-63μm，460x 26mm(100g)，30mL/ 分钟，用含 1％甲酸的 0％至 30％ ( 经 40 分钟 )MeOH/ 水梯度洗脱 )。
将 残 余 物 在 DCM(10mL) 中 与 K2CO3( 约 0.20g) 搅 拌 2 小 时， 过 滤， 随 后 在 真空干燥箱中干燥过夜，得到浅黄色油状的 4-(4- 氟苄基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌 嗪 -1- 基 ) 乙酯 (0.39g，21％ )。
HPLC 分析 ：纯度 99.7％ ( 系统 A，RT ＝ 3.09 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 3.55 分钟 )，ES+ ：365.6[MH]+ ；C19H29FN4O2 ：HRMS 计算值 364.2275， 实测值 364.2292。
实施例 43
4-(4- 氯苄基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯
将 2-(4- 甲基 - 哌嗪 -1- 基 )- 乙醇 (0.86g，6mmol) 和 NMM(0.58mL，6mmol) 溶解在 DCM(8mL) 中并将反应混合物冷却至 0 ℃。 加入氯甲酸 4- 硝基苯酯 (1.29g， 6mmol) 并搅拌 1 小时。 往反应混合物中加入 1-(4- 氯 - 苄基 )- 哌嗪 (1.05g，5mmol) 和 DIPEA(6.0mL，过量 ) 在 DMF(20mL) 中的溶液。 在室温下将反应混合物搅拌过夜，随 后真空浓缩。 将残余物溶解在 EtOAc(150mL) 中，用饱和 Na2CO3 水溶液 (6x 100mL) 洗 涤，干燥 (MgSO4) 并真空干燥。
起初残余物经柱色谱纯化 ( 正相，20g， Strata SI-1，二氧化硅 gigatube，20mL/ 分钟，用 0％至 15％ MeOH/DCM 梯度洗脱 )，随后经反相柱色谱进一步纯化 (LiChroprep RP-18，40-63μm，460x 26mm(100g)，30mL/ 分钟，用含 1％甲酸的 0％至 30％ ( 经 40 分钟 )MeOH/ 水梯度洗脱 )。
将 残 余 物 在 DCM(10mL) 中 与 K2CO3( 约 0.20g) 搅 拌 2 小 时， 过 滤， 随 后 在 真空干燥箱中干燥过夜，得到浅黄色油状的 4-(4- 氯苄基 ) 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌 嗪 -1- 基 ) 乙酯 (0.51g，28％ )。
HPLC 分析 ：纯度 99.7％ ( 系统 A，RT ＝ 3.39 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 3.83 分钟 )，ES+ ：381.5[MH]+ ；C19H29ClN4O2 ：HRMS 计算值 380.1979， 实测值 380.1996。
实施例 44
4-[2-(4- 氯苯基 ) 乙基 ] 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基哌嗪 -1- 基 ) 乙酯
将哌嗪 -1- 甲酸叔丁酯 (1.0g，5.4mmol) 和 DIPEA(1.9mL，10.8mmol) 溶解在 DMF(20mL) 中，随后加入 1-(2- 溴 - 乙基 )-4- 氯 - 苯 (1.0g，4.6mmol)。 在环境温度 下将反应混合物搅拌 0.5 小时，随后真空浓缩。 将残余物溶解在 EtOAc(50mL) 中，用盐 水 (2x 50mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并将溶剂真空除去。 将残余物溶解在 DCM(10mL) 和
TFA(3mL) 中过夜，随后真空浓缩。 将粗制 1-[2-(4- 氯 - 苯基 )- 乙基 ]- 哌嗪二 - 三氟 乙酸无需进一步纯化用于下一步骤。
将 2-(4- 甲 基 - 哌 嗪 -1- 基 )- 乙 醇 (663mg，4.6mmol) 和 NMM(0.48mL， 4.6mmol) 溶解在 DCM(7mL) 中并将反应混合物冷却至 0 ℃。 加入氯甲酸 4- 硝基苯酯 (927mg，4.6mmol) 并将反应混合物搅拌 1 小时。 往反应混合物中加入 1-[2-(4- 氯 - 苯 基 )- 乙 基 ]- 哌 嗪 二 - 三 氟 乙 酸 ( 步 骤 1 ；4.6mmol) 和 DIPEA(6.0mL， 过 量 ) 在 DMF(20mL) 中的溶液。 在室温下将反应混合物搅拌过夜，随后真空浓缩。 将残余物溶 解在 EtOAc(150mL) 中，用饱和 Na2CO3 水溶液 (6x 100mL) 洗涤，干燥 (MgSO4) 并将溶剂真空除去。
起初残余物经柱色谱纯化 ( 正相，20g， Strata SI-1，二氧化硅 gigatube，20mL/ 分钟，用 0％至 20％ MeOH/DCM 梯度洗脱 )，随后经反相柱色谱进一步纯化 (LiChroprep RP-18，40-63μm，460x 26mm(100g)，30mL/ 分钟，用含 1％甲酸的 0％至 30％ ( 经 40 分钟 )MeOH/ 水梯度洗脱 )。
将残余物在 DCM(10mL) 中与 K2CO3( 约 0.20g) 搅拌 2 小时，过滤，随后在真空 干燥箱中干燥过夜，得到浅黄色油状的 4-[2-(4- 氯苯基 ) 乙基 ] 哌嗪 -1- 甲酸 2-(4- 甲基 哌嗪 -1- 基 ) 乙酯 (116mg，6.4％ )。
HPLC 分析 ：纯度 97.1％ ( 系统 A，RT ＝ 3.64 分钟 ) ；LCMS 分析 ：纯度 100％ ( 系统 A，RT ＝ 5.15 分钟 )，ES+ ：395.5[MH]+ ；C20H31ClN4O2 ：HRMS 计算值 394.2136， 实测值 394.2147。
生物学试验
人类肥胖症的动物模型 ( 饮食诱发的肥胖性大鼠 )
肥胖症的啮齿类动物模型为用于研究导致人类肥胖状态发生和持续的潜在因素 的有用工具。 啮齿类动物的饮食诱发性肥胖症 (DIO) 模型特别适合该项任务，原因在于 DIO 大鼠与人类肥胖有许多共同特征。
这些包括多基因遗传、胰岛素抵抗、高瘦蛋白血症、减少的生长激素分泌、碳 水化合物较脂肪优先氧化的倾向、以及当卡路里受限制时降低代谢速率、在卡路里受限 后体重恢复的能力。 在喂食高能量饮食的远系繁殖大鼠中，约二分之一发展成 DIO，虽 然剩余的大鼠对肥胖有抵抗力，与食物喂养 (chow-fed) 的对照大鼠 ( 饮食抵抗， DR) 相 比体重没有增加。 饮食诱发性肥胖 (DIO) 模型在能量动态平衡调节方面尤其令人感兴 趣。 当喂食适度高脂肪、糖和含能量饮食 (HE 饮食 ) 时，约二分之一的大鼠较其他大鼠 实质上增加更多体重 (DIO 与 DR 相比 )。
倾向于形成 DIO 的大鼠将以与喂食低能量 ( 食物 ) 饮食的大鼠类似的速率增加体 重，除非喂以 HE 饮食，否则不会变得肥胖。 但是，一旦用 HE 饮食建立 DIO 和 DR 表 型，则产生的体重增加和身体组成的变化就会持续，即使当动物转为正常食物饮食也如 此。 在 DIO 和 DR 表型的发展和持续期间发生的体重和组成的改变与脑功能中可引起这 些调节的几种改变有关。
DIO 方案
采用 Widdowson， P.S. 等 (Diabetes(1997)46 ：1782-1785) 所述的饮食诱发肥胖 症的方案选择有肥胖倾向的动物。
给予 Wistar 雄性大鼠 ( 在改变的饮食干预开始时体重为约 200-250g) 高碳水化 合物 (HE) 饮食 8-10 周。 饮食的组成为 33％ (w/v) 粉末状食物 (RM1)、33％ (w/v) 浓 缩乳 (Nestle)、7％ (w/v)Castor 糖 (Tate&Lyle) 和 27％ (w/v) 水。 记录体重并在 8 周时 间后，根据它们的体重将动物分成 2 组。 在任何远系繁殖动物 ( 啮齿类、灵长类 ) 品系 中，将动物群自然地分为两组 ：倾向于肥胖的个体 ( 增重较多 ) 或抗肥胖的个体 ( 增重较 少 )。 在 6 周后肥胖动物重达多于 60g。 具有肥胖倾向的动物用于进行式 (I) 化合物对 体重和食物摄取作用的研究。 图 1 表明喂食高度可口饮食 ( 高碳水化合物 ) 的动物体重 分离的实例。所述化合物对体重影响的体内实验
将有肥胖倾向的动物用式 (I) 化合物处理并测定其对它们体重的影响。 以 10mg/ kg 一天两次经口 (PO) 给予所述化合物，用 1mL/kg 剂量或用等量的溶媒剂量 ( 盐水 ) 作 为对照。 这些剂量在早晨 (09:00) 和下午 (16:00) 给予并在早晨给药前测定体重。 通常 每组 8 只动物。 图 2 至 5 表明对于实施例 6、16、18 和 36 而言在 DIO 大鼠 4 天研究中分 别观察到的累计体重变化 (％ )。
非重组体系统中瘦蛋白测定
虽然在重组体系统 ( 例如 ObRb 转染的 HEK293 细胞 ) 中已有很好的表征，其中 瘦蛋白导致 STAT3 磷酸化非常显著地增加，但是这些系统通常不能为测试化合物提供对 于瘦蛋白受体的活性的精确测定。 似乎所述受体的过度表达 ( 以及不同药物作用于瘦蛋 白与其受体结合所引发的信号通路的不同部分的可能性 ) 在多数情况下导致试验药物活 性缺乏。
在非重组体系统中瘦蛋白受体的表达经常波动且鉴别在试验中保持信号稳定性 的系统必须小心。 使用该系统，瘦蛋白受体拮抗剂模拟物可通过评价它们与瘦蛋白的作 用来鉴别 ( 见下 )。
瘦蛋白主要在脂肪细胞中产生，但在人体中，编码瘦蛋白的 mRNA 也存在于胎 盘中。 此处，瘦蛋白可能在微脉管系统中起重要的增殖作用。 评价了在天然细胞系中应 用该假说的可能性。
JEG-3 方案
在 JEG-3 细胞 ( 绒毛膜上皮癌细胞系 ) 中，瘦蛋白能刺激增殖多达 3 倍 (Biol. Reprod.(2007)76 ：203-10)。 瘦蛋白还引起 JEG-3 细胞中 [3H]- 胸苷掺入的浓度依赖性增 长 ( 图 6，最大效应在 100nM(EC50 ＝ 2.1nM))。 细胞掺入的放射活性为其增殖活性的指 示且用液体闪烁 β 计数器以次 / 分钟 (CPM) 计数。
该发现可用于测定化合物是否能再现瘦蛋白对细胞增殖的作用 ( 瘦蛋白受体激 动剂模拟物 )( 即，所给化合物将引起细胞掺入的 [3H]- 胸苷增加 ) 或通过防止瘦蛋白 - 介 导的 [3H]- 胸苷掺入增加来抑制瘦蛋白的作用 ( 拮抗作用 )。
该方法具有使用非重组体系统的优点并具有合理的再现性和稳定性。
脑穿透测定
给予受试物种 ( 啮齿类动物 ) 大剂量 (a bolus dose) 的所研究底物，通常经过静 脉内 (IV) 或口服 (PO) 途径给予。 在适当的时间点，采集血液样品并提取得到的血浆 并分析底物浓度，且在适当的时候，分析代谢物的浓度。 在类似时间点，处死另一组动 物，将脑分离并清洁脑表面。 随后将脑样品匀浆，提取并分析底物浓度，且在适当的时 候分析代谢物浓度。 或者，将微透析探针植入试验物种的一个或多个脑区域中，在适当 的时间点收集样品并供随后分析。 该方法的优点在于仅测定细胞外底物浓度。 随后比较 血浆浓度和脑浓度，并通过比较各时间点的平均浓度或通过计算浓度 - 时间曲线下面积 (AUC) 来计算比例。