三宝木内酯AD,其药物组合物,制备方法和应用.pdf

三宝木内酯 A-D， 其药物组合物， 制备方法和应用
    技术领域 ：
     本发明属于药物技术领域， 具体地， 涉及三宝木内酯 A-D， 其为药物活性成分的药 物组合物， 其制备方法， 其在制备抗艾滋病药物中的应用。
     背景技术 ： 三宝木属 (Trigonostemon) 我国有 6 种， 主要分布于我国华南和西南地 区。迄今为止， 现有技术中未见有三宝木内酯 A-D 化合物及其活性的报道。 发明内容 ：
     本发明的目的在于提供结构式 (I) 所示的三宝木内酯 A-D， 其为药物活性成分组 成的抗艾滋病药物组合物和药物， 其制备方法， 以及该类化合物及其药物组合物在制备治 疗艾滋病药物中的应用。
     本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的 ：
     式 (I) 化合物的制备方法， 取孟仑三宝木， 用 95％乙醇加热回流提取三次， 每次 4 小时， 合并提取液， 减压回收乙醇， 得浸膏， 将其用水捏溶、 过滤， 分别用石油醚， 乙酸乙酯萃 取三次， 得乙酸乙酯萃取部分， 用石油醚 - 丙酮梯度洗脱得 Fr1、 Fr2、 Fr3、 Fr4 四部分， 其中 石油醚∶丙酮 7 ∶ 3 洗脱部分 Fr3 用 Sephadex LH-20 甲醇洗脱得含有三宝木内酯 A-D 的 组分 ； 该组分再用硅胶柱层析氯仿∶甲醇 8 ∶ 1 洗脱， 然后用 HPLC 乙腈∶水 65 ∶ 35 纯化 得化合物三宝木内酯 A、 B、 C 和 D。
     本 发 明 提 供 结 构 式 (I) 所 示 的 三 宝 木 内 酯 A-D 化 合 物 即 Trigonolactone A-D(1-4)，
     Trigonosteliimone A(1)R1 ＝ Cl Trigonosteliimone B(2)R1 ＝ H Trigonosteliimone C(3)R1 ＝ ClR2 ＝ H R2 ＝ H
     Trigonosteliimone D(4)R1 ＝ H抗 HIV 药物组合物， 含有治疗有效量的权利要求 1 式 (I) 所示的化合物和药学上 可接受的载体。
     式 (I) 化合物在制备抗艾滋病药物中的应用。
     含有治疗有效量的式 (I) 化合物和药学上可接受的载体组成的药物组合物在制 备抗艾滋病药物中的应用。
     本发明化合物用作药物时， 可以直接使用， 或者以药物组合物的形式使用。 该药物 组合物含有 0.1-99％， 优选为 0.5-90％的本发明化合物， 其余为药物学上可接受的， 对人 和动物无毒和惰性的可药用载体和 / 或赋形剂。
     所 述 的 药 用 载 体 或 赋 形 剂 是 一 种 或 多 种 固 体、 半 固 体 和 液 体 稀 释 剂、 填料 以 及 药 物 制 品 辅 剂。 将 本 发 明 的 药 物 组 合 物 以 单 位 体 重 服 用 量 的 形 式 使 用。 苔 黑 酚 -1- 氧 -β-D- 葡萄糖吡喃苷、 苔黑酚及其衍生物的组合物采用制药和食品领域公认的方 法制备成各种剂型、 如液体制剂 ( 注射剂、 混悬剂、 乳剂、 溶液剂、 糖浆剂等 )、 固体制剂 ( 片
     剂、 胶囊剂、 颗粒剂， 冲剂等 )、 喷剂、 气雾剂等。本发明的药物可经注射 ( 静脉注射、 静脉滴 注、 肌肉注射、 腹腔注射、 皮下注射 ) 和口服、 舌下给药、 粘膜透析等给药途径进行抗艾滋病 的治疗。 具体实施方式 ：
     下面用本发明实施例来进一步说明本发明的实质性内容， 但并不以此来限定本发 明。
     实施例 1 ：
     孟仑三宝木 (Trigonostemon lii Y.T.Chang) 全株 20kg， 用 95％乙醇加热回流提 取三次 (3×4h)， 合并提取液， 减压回收乙醇， 得浸膏 2kg。将其用水捏溶、 过滤， 分别用石 油醚， 乙酸乙酯萃取三次， 得到乙酸乙酯萃取部分 200g ； 用石油醚 - 丙酮梯度洗脱得 Fr1、 Fr2、 Fr3、 Fr4 四部分， 其中石油醚∶丙酮 7 ∶ 3 洗脱部分 Fr3 用 SephadexLH-20 甲醇洗脱 得含有三宝木内酯 A-D 的组分 ； 该组分再用硅胶柱层析氯仿∶甲醇 8 ∶ 1 洗脱， 然后用 HPLC 乙腈∶水 65 ∶ 35 纯化得化合物三宝木内酯 A(Trigonosteliimone A)(1)(50.4mg)、 B(2) (12.0mg)、 C(3)(35.5mg) 和 D(4)(45.8mg)。
     分离得到的 4 个化合物 Trigonosteliimone A(1))、 B(2)、 C(3) 和 D(4) 的结构分 析数据如下 ：
     三宝木内酯 A(Trigonosteliimone A)(1) ： white amorphous powder ； C38H49O11 Cl ； (c 0.20 CHCl3) ； UV(CHCl3)λmax 257.6nm(ε17474) ； IR(KBr)vmax3455， 2931， 1713 and 1618cm-1 ； ESIMSm/z 739[M+Na]+ ； HRESIMS m/z739.2866[M+Na]+(calcd forC38H49O11NaCl， 739.2861).1H NMR(CDCl3， 400 MHz)δ ： 6.48(1H， s， H-1)， 5.38(1H， s， H-3)， 3.93(1H， s， H-5)， 3.41(1H， s， H-7)， 4.74(1H， s， H-8)， 2.74(1H， q， J ＝ 8.8Hz， H-11)， 4.29(1H， s， H-12)， 4.39(1H， s， H-14)， 1.47(1H， m， H-16α)， 1.73(1H， m， H-16β)， 1.39(3H，s， H-17)， 1.23(3H， d， J ＝ 8.5Hz， H-18)， 6.07(1H， s， H-19)， 3.83(2H， br s， H-20)， 2.41(1H， m， H-2′ )， 1.70(1H， m， H-3α′ )， 1.36(1H， m， H-3β′ )， 1.35(1H， m， H-4α′ )， 1.09(1H， m， H-4β′ )， 1.31(2H， m， H-5′ )， 1.41(2H， m， H-6′ )， 1.48(1H， m， H-7α′ )， 1.18(1H， m， H-7β′ )， 1.23(1H， m， H-8α′ )， 1.40(1H， m， H-8β′ )， 1.59(1H， m， H-9′ )， 1.04(3H， d， J ＝ 8.0Hz， H-10′ )， 1.20(3H， d， J ＝ 9.0Hz， H-11′ )， 7.76(1H， m， H-3″ )， 7.43(1H， 13 m， H-4″ )， 7.41(1H， m， H-5″ )， 7.43(1H， m， H-6″ )， 7.76(1H， m， H-7″ ). C NMR(CDCl3， 100.6MHz)δ ： 125.7(C-1， d)， 139.7(C-2， s)， 78.6(C-3， d)， 83.4(C-4， s)， 7 1.6(C-5， d)， 60.5(C-6， s)， 62.3(C-7， d)， 34.6(C-8， d)， 74.6(C-9， s)， 149.2(C-10， s)， 34.7(C-11， d)， 79.6(C-12， d)， 72.1(C-13， s)， 79.2(C-14， d)， 75.5(C-15， s)， 38.3(C-16， t)， 23.7(C-17， q)， 13.9(C-18， q)， 114.5(C-19， d)， 63.6(C-20， t)， 178.7(C-1 ′， s)， 42.3(C-2 ′， d)， 34.9(C-3 ′， t)， 31.4(C-4 ′， t)， 27.0(C-5 ′， t)， 28.2(C-6 ′， t)， 27.8(C-7 ′， t)， 37.8(C-8 ′， t)， 25.1(C-9 ′， d)， 24.9(C-10 ′， q)， 18.6(C-11 ′， q)， 108.4(C-1 ″， s)， 138.2(C-2″， s)， 125.2(C-3″， d)， 128.2(C-4″， d)， 129.5(C-5″， d)， 128.2(C-6″， d)， 125.2(C-7″， d)。
     三 宝 木 内 酯 B(Trigonosteliimone B)(2) ： white amorphous powder ； C38H50O11 ； (c 0.14 CHCl3) ； UV(CHCl3)λmax 246.6nm(ε15144) ； IR(KBr)vmax 3442， 2924， 1710 and 1639cm-1 ； ESIMS m/z683[M+H]+ ； HRESIMS m/z683.3441[M+H]+(calcd for C38H51O11， 683.3431). 1H NMR(CDCl 3， 400 MHz)δ ： 6.30(1H， s， H-1)， 5.38(1H， s， H-3)， 3.87(1H， s， H-5)， 3.49(1H， s， H-7)， 4.79(1H， s， H-8)， 2.77(1H， q， J ＝ 9.0Hz， H-11)， 4.29(1H， s， H-12)， 4.39(1H， s， H-14)， 1.43(1H， m， H-16α)， 1.71(1H， m， H-16β)， 1.37(3H， s， H-17)， 1.23(3H， d， J ＝ 8.5Hz， H-18)， 5.17(1H， s， H-19a)， 5.07(1H， s， H-19b)， 3.75(1H， d， J ＝ 15.0Hz， H-20α)， 3.91(1H， d， J ＝ 15.0Hz， H-20β)， 2.35(1H， m， H-2′ )， 1.69(1H， m， H-3α′ )， 1.30(1H， m， H-3β′ )， 1.30(1H， m， H-4α′ )， 1.06(1H， m， H-4β′ )， 1.30(2H， m， H-5′ )， 1.43(2H， m， H-6′ )， 1.48(1H， m， H-7 α′ )， 1.15(1H， m， H-7β′ )， 1.21(1H， m， H-8α′ )， 1.36(1H， m， H-8β′ )， 1.55(1H， m， H-9′ )， 1.04(3H， d， J ＝ 8.0Hz， H-10′ )， 1.19(3H， d， J ＝ 9.5 Hz， H-11′ )， 7.76(1H， m， H-3″ )， 7.41(1H， m， H-4″ )， 7.41(1H， m， 13 H-5″ )， 7.41(1H， m， H-6″ )， 7.76(1H， m， H-7″ ). C NMR(CDCl3， 100.6 MHz)δ ： 130.2(C-1， d)， 145.6(C-2， s)， 80.0(C-3， d)， 83.5(C-4， s)， 71.8(C-5， d)， 60.0(C-6， s)， 62.0(C-7， d)， 34.5(C-8， d)， 74.5(C-9， s)， 147.5(C-10， s)， 34.6(C-11， d)， 79.7(C-12， d)， 72.1(C-13， s)， 79.4(C-14， d)， 75.3(C-15， s)， 37.9(C-16， t)， 23.8(C-17， q)， 13.9(C-18， q)， 111.2(C-19， t)， 62.4(C-20， t)， 179.7(C-1 ′， s)， 42.8(C-2 ′， d)， 35.1(C-3 ′， t)， 31.6(C-4 ′， t)， 27.8(C-5 ′， t)， 28.3(C-6 ′， t)， 27.2(C-7 ′， t)， 37.5(C-8 ′， t)， 24.9(C-9 ′， d)， 25.0(C-10′， q)， 18.8(C-11′， q)， 108.4(C-1″， s)， 138.5(C-2″， s)， 125.2(C-3″， d)， 128.2(C-4″， d)， 129.5(C-5″， d)， 128.2(C-6″， d)， 125.2(C-7″， d).
     三宝木内酯 C(Trigonosteliimone C)(3) ： white amorphous powder ； C45H53O14Cl ； (c 0.67 CHCl3) ； UV(CHCl3)λmax 248.4nm(ε20467) ； IR(KBr)vmax 3444， 2925 ， 1710 and 1677cm-1 ； ESIMSm/z 853[M+H]+ ； HRESIMS m/z853.3245[M+H]+(calcd forC45H54O14Cl， 853.3202).1H NMR(CDCl3， 400MHz)δ ： 6.42(1H， s， H-1)， 5.32(1H， s， H-3)，3.78(1H， s， H-5)， 2.99(1H， s， H-7)， 4.45(1H， s， H-8)， 2.71(1H， q， J ＝ 8.5Hz， H-11)， 4.31(1H， s， H-12)， 4.48(1H， s， H-14)， 1.84(1H， d， J ＝ 18.0Hz， H-16α)， 1.56(1H， dd， J＝ 7.5， 18.0Hz， H-16β)， 4.80(1H， d， J ＝ 15.0Hz， H-17α)， 4.57(1H， d， J ＝ 15.0Hz， H-17β)， 1.24(3H， d， J ＝ 9.0Hz， H-18)， 6.00(1H， s， H-19)， 3.59(1H， d， J ＝ 15.5Hz， H-20α)， 3.48(1H， d， J ＝ 15.5Hz， H-20β)， 2.31(1H， m， H-2′ )， 1.67(1H， m， H-3α′ )， 1.30(1H， m， H-3β′ )， 1.31(1H， m， H-4α′ )， 1.12(1H， m， H-4β′ )， 1.55(2H， m， H-5′ )， 1.13(2H， m， H-6′ )， 1.54(1H， m， H-7α′ )， 1.16(1H， m， H-7β′ )， 1.40(1H， m， H-8α′ )， 1.30(1H， m， H-8β′ )， 1.76(1H， m， H-9′ )， 1.09(3H， d， J ＝ 8.0Hz， H-10′ )， 1.17(3H， d， J ＝ 9.0Hz， H-11′ )， 7.76(1H， m， H-3″ )， 7.43(1H， m， H-4″ )， 7.41(1H， m， H-5″ )， 7.43(1H， m， H-6″ )， 7.76(1H， m， H-7″ )， 7.18(1H， d， J ＝ 10.0Hz， H-4″′ )， 7.49(1H， t， J ＝ 10.0Hz， H-5″′ )， 13 6.92(1H， t， J ＝ 10.0Hz， H-6″′ )， 7.70(1H， dd， J ＝ 1.5， 10.0Hz， H-7″′ ). C NMR(CDCl3， 100.6MHz)δ ： 125.7(C-1， d)， 139.6(C-2， s)， 78.6(C-3， d)， 83.8(C-4， s)， 71.0(C-5， d)， 60.3(C-6， s)， 61.8(C-7， d)， 34.6(C-8， d)， 74.6(C-9， s)， 149.0(C-10， s)， 34.7(C-11， d)， 79.2(C-12， d)， 72.3(C-13， s)， 79.2(C-14， d)， 76.0(C-15， s)， 37.1(C-16， t)， 67.8(C-17， t)， 13.9(C-18， q)， 114.5(C-19， d)， 63.4(C-20， t)， 178.8(C-1 ′， s)， 42.5(C-2 ′， d)， 34.7(C-3 ′， t)， 31.0(C-4 ′， t)， 28.0(C-5 ′， t)， 28.4(C-6 ′， t)， 27.1(C-7 ′， t)， 37.9(C-8 ′， t)， 25.6(C-9 ′， d)， 24.2(C-10 ′， q)， 18.8(C-11 ′， q)， 108.4(C-1 ″， s)， 138.4(C-2 ″， s)， 125.2(C-3 ″， d)， 128.2(C-4 ″， d)， 129.5(C-5 ″， d)， 128.2(C-6 ″， d)， 125.2(C-7 ″， d)， 170.2(C-1 ″ ′， s)， 112.2(C-2 ″ ′， s)， 161.7(C-3 ″ ′， s)， 118.2(C-4″′， d)， 136.1(C-5″′， d)， 119.0(C-6″′， d)， 129.5(C-7″′， d).
     三 宝 木 内 酯 D(Trigonosteliimone D)(4) ： white amorphous powder ； C45H54O14 ； (c 0.63 CHCl3) ； UV(CHCl3)λmax 244.2nm(ε28282) ； IR(KBr)vmax 3443， 2925， 1704 and 1678cm-1 ； ESIMS m/z841[M+Na]+ ； HRESIMS m/z 841.3407[M+Na]+(calcd forC45H54O14Na， 841.3411).1H NMR(CDCl3， 400 MHz)δ ： 6.12(1H， s， H-1)， 5.35(1H， s， H-3)， 3.78(1H， s， H-5)， 3.01(1H， s， H-7)， 4.46(1H， s， H-8)， 2.68(1H， q， J ＝ 7.2 Hz， H-11)， 4.29(1H， s， H-12)， 4.43(1H， s， H-14)， 1.87(1H， d， J ＝ 18.0 Hz， H-16α)， 1.56(1H， dd， J ＝ 7.5， 18.0Hz， H-16β)， 4.78(1H， d， J ＝ 11.6Hz， H-17α)， 4.54(1H， d， J ＝ 11.6Hz， H-17β)， 1.24(3H， d， J ＝ 9.0Hz， H-18)， 5.11(1H， s， H-19a)， 6.01(1H， s， H-19b)， 3.56(1H， br s， H-20α)， 3.42(1H， br s， H-20β)， 2.31(1H， m， H-2 ′ )， 1.67(1H， m， H-3α ′ )， 1.28(1H， m， H-3β′ )， 1.31(1H， m， H-4α′ )， 1.11(1H， m， H-4β′ )， 1.52(2H， m， H-5′ )， 1.15(2H， m， H-6′ )， 1.52(1H， m， H-7α′ )， 1.16(1H， m， H-7β′ )， 1.40(1H， m， H-8α′ )， 1.29(1H， m， H-8β′ )， 1.73(1H， m， H-9 ′ )， 1.07(3H， d， J ＝ 7.5Hz， H-10 ′ )， 1.18(3H， d， J ＝ 9.0Hz， H-11 ′ )， 7.76(1H， m， H-3 ″ )， 7.43(1H， m， H-4 ″ )， 7.41(1H， m， H-5 ″ )， 7.43(1H， m， H-6″ )， 7.76(1H， m， H-7″ )， 7.18(1H， d， J ＝ 10.0 Hz， H-4″′ )， 7.49(1H， t， J ＝ 10.0Hz， H-5 ″ ′ )， 6.92(1H， t， J ＝ 10.0Hz， H-6 ″ ′ )， 7.70(1H， dd， J ＝ 1.5， 13 10.0Hz， H-7″′ ). C NMR(CDCl3， 100.6MHz)δ ： 130.2(C-1， d)， 145.6(C-2， s)， 79.2(C-3， d)， 83.2(C-4， s)， 71.2(C-5， d)， 60.1(C-6， s)， 61.8(C-7， d)， 34.2(C-8， d)， 74.5(C-9， s) ， 147.2(C-10 ， s) ， 34.6(C-11 ， d) ， 79.9(C-12 ， d) ， 72.4(C-13 ， s) ， 79.3(C-14 ， d) ， 75.8(C-15， s)， 37.2(C-16， t)， 67.8(C-17， t)， 13.9(C-18， q)， 111.3(C-19， t)， 62.8(C-20，t)， 179.2(C-1 ′， s)， 42.5(C-2 ′， d)， 34.9(C-3 ′， t)， 31.3(C-4 ′， t)， 28.2(C-5 ′， t)， 28.3(C-6 ′， t)， 27.2(C-7 ′， t)， 37.9(C-8 ′， t)， 25.4(C-9 ′， d)， 24.1(C-10 ′， q)， 18.8(C-11′， q)， 108.4(C-1″， s)， 138.4(C-2″， s)， 125.2(C-3″， d)， 128.2(C-4″， d)， 129.5(C-5″， d)， 128.2(C-6″， d)， 125.2(C-7″， d)， 170.2(C-1″′， s)， 112.2(C-2″′， s)， 161.8(C-3 ″ ′， s)， 118.2(C-4 ″ ′， d)， 135.9(C-5 ″ ′， d)， 118.9(C-6 ″ ′， d)， 129.4(C-7″′， d).
     实施例 2 ：
     按实施例 1 的方法先制得三宝木内酯 A-D(1-4)， 按常规注射液所用辅剂， 分别加 注射用水， 精滤， 灌封灭菌制成注射液。
     实施例 3 ：
     按实施例 1 的方法先制得三宝木内酯 A-D(1-4)， 将其分别溶于无菌注射用水中， 搅拌使溶， 用无菌抽滤漏斗过滤， 再无菌精滤， 分装于 2 安瓿中， 低温冷冻干燥后无菌熔封 得粉针剂。
     实施例 4 ：
     将所分离得到的三宝木内酯 A-D(1-4) 分别与赋形剂重量比为 9 ∶ 1 的比例加入 赋形剂， 制成粉剂。 实施例 5 ：
     按实施例 1 的方法先制得三宝木内酯 A-D(1-4)， 分别按其与赋形剂重量比为 1 ∶ 5-1 ∶ 10 的比例加入赋形剂， 制粒压片。
     实施例 6 ：
     按实施例 1 的方法先制得三宝木内酯 A-D(1-4)， 分别按常规口服液制法制成口服 液。
     实施例 7 ：
     按实施例 1 的方法先制得三宝木内酯 A-D(1-4)， 分别按其与赋形剂重量比为 5 ∶ 1 的比例加入赋形剂， 制成胶囊或颗粒剂或冲剂。
     实施例 8 ：
     按实施例 1 的方法先制得三宝木内酯 A-D(1-4)， 分别按其与赋形剂重量比为 3 ∶ 1 的比例加入赋形剂， 制成胶囊或颗粒剂或冲剂。
     本发明从产自云南西双版纳的孟仑三宝木 (Trigonostemon.liiY.T.Chang) 中分 离鉴定的上述 4 个化学结构新颖的大环二萜内酯
     (1-4)， 经抗 HIV 活性筛选， 发现该类化合物具有显著的 HIV-1 诱导 C8166 细胞形 成合胞体抑制活性， 参考其对 C8166 的细胞毒性， 治疗指数 (TI) 在 1848-13484 范围， 是一 种具有较强抗 HIV 活性药物。
     下面用本发明的试验例来说明本发明化合物的药理试验结果， 用于证明本发明化 合物对艾滋病具有较强活性。
     试验例 1 ：
     三宝木内酯 A-D(1-4) 抗 HIV 药理作用实验结果 ：
     I 材料和方法
     一、 测定药物和化合物
     待测样品为由本发明提供的式 (I)4 个化合物 A-D(1-4)。待测样品溶解于 DMSO 中， 4℃保存， 贮存浓度为 25.0mg/ml ；
     二、 试剂和溶液
     (1) 试剂
     HEPES(N-2(2-Hydroxyothyl)piperazine-N ′ -(2-ethanesufonicacid)、 MTT(3， (4， 5-dimethylthiazol-2-yl)-2， 5-diphenyl tetrazoliumbromide)、 DMF(N， N’ -Dimethyl formamine)、 青 霉 素 (Penicillin)、 硫 酸 链 霉 素 (Streptomycin sulfate)、 谷氨酰胺 (Glutamine) 均购自 Sigma 公司 ； 2- 巯基乙醇 (2-ME， 2-Mercaptoethanol) 为 Bio-Rad 公司 产品。RPMI-1640 和新生小牛血清为 Gibco 公司产品。
     (2) 培养基
     RPMI-1640 完全培养基， 含有 10％新生小牛血清， 2mM L- 谷氨酰胺， 10mM HEPES， 50μM 2- 巯基乙醇， 100,000IU 青霉素， 100μg/ml 链霉素。
     三、 细胞和病毒
     人 T 淋 巴 细 胞 系 C8166、 MT-4 以 及 HIV-1 实 验 株 HIV-1IIIB 均 由 英 国 Medical Research Council， AIDS Reagent Project 惠赠。所有细胞和病毒均以含 10％小牛血清的 RPMI-1640 完全培养基进行培养。按常规方法制备 HIV-1IIIB， 滴定并计算出病毒的 TCID50。 病毒贮存液分装后， 置 -70℃保存。细胞和病毒按常规方法冻存和复苏。
     四、 HIV-1 感染性滴定
     HIV-1IIIB 按 Johnson&Byington(1990) 所 述 方 法 改 良 进 行 滴 定， 简述如下 ： 将 HIV-1 贮存液在 96 孔板上作 4 倍稀释， 10 个梯度， 每梯度 6 个重复孔， 同时设置对照孔 6 孔。每孔加入 C8166 细胞 50μl， 每孔终体积为 200μl。37℃， 5％ CO2 培养。第 3 天补加 新鲜 RPMI-1640 完全培养基 100μl， 第 7 天在倒置显微镜下观察每孔中 HIV-1 诱导的细胞 病变效应 (Cytopathic Effect， CPE)， 以每孔是否有合胞体 (Syncytium) 的形成确定 ； 按 Reed&Muench 方法计算病毒的 TCID50(50％ Tissue Culture Infection Dose)。
     五、 对 C8166 细胞的毒性实验
     4×105/ml C8166 细 胞 悬 液 100μl 与 不 同 的 待 测 药 物 溶 液 混 合， 设 3 个重复 孔。同时设置不含药物的对照孔， 37℃， 5％ CO2 培养 3 天， 采用 MTT 比色法检测细胞毒性。 ELx800 酶标仪测定 OD 值， 测定波长为 595nm， 参考波长为 630nm。计算得到 CC50 值 (50 ％ CytotoxicConcentration)， 即对 50％的正常 T 淋巴细胞系 C8166 产生毒性时的药物浓度。
     六、 对 HIV-1IIIB 致细胞病变 (CPE) 的抑制实验
     将 8×105/ml C8166 细胞 50μl/ 孔接种到含有 100μl/ 孔梯度倍比稀释药物的 96 孔细胞培养板上， 然后加入 50μl 的 HIV-1IIIB 稀释上清， 1300TCID50/ 孔。设 3 个重复 孔。同时设置不含药物的正常细胞对照孔。AZT 为阳性药物对照。37℃， 5％ CO2 培养 3 天， 倒置显微镜下 (100×) 计数合胞体的形成。EC50(50％ Effective Concentration) 为抑制 合胞体形成 50％时的药物浓度。
     七、 对 HIV-1IIIB 感染 MT-4 细胞死亡的保护实验
     在 96 孔细胞培养板上， 对每种药物进行 5 倍倍比稀释， 每个稀释度设 4 孔， 共6个 稀释度。 每孔 100μl。 同时设置不含药物的未感染或感染 HIV-1IIIB 的细胞对照组。 AZT 作为 阳性对照药物。每个稀释度中的 2 孔分别滴加 MT-4 细胞悬液和 HIV-1IIIB 上清各 50μl( 感染复数为 0.3)。另 2 孔滴加 MT-4 细胞悬液 100μl。每孔终体积为 200μl。置 37℃， 5％ CO2 培养箱中培养。感染后第 3 天补加 100μl 新鲜培养基。第 5 天用 MTT 方法用 ELx800 酶标仪测定 OD595/630nm 值。计算药物对细胞生长的抑制率和对 HIV-1IIIB 感染细胞的保护率。 CC50 为对 50％的宿主细胞产生毒性的药物浓度 ； EC50 为保护 50％的 HIV-1IIIB 感染细胞存活 时的药物浓度。
     八、 计算公式
     根据实验结果绘制剂量反应曲线， 按 Reed&Muench 法计算出化合物抑制病毒的 50 ％有效浓度 (EC50)， 50 ％抑制细胞生长浓度 (CC50) 及抗 HIV-1 活性的治疗指数 TI 值 (Therapeutic index) 为 ： TI ＝ CC50/EC50。
     1、 细胞生长存活率 (％ ) ＝实验孔 OD 值 / 对照孔 OD 值 ×100
     2、 HIV-1 致细胞病变的抑制率 ( ％ ) ＝ (1- 实验孔合胞体数 / 对照孔合胞体 数 )×100
     九、 实验结果 ( 见表 1)。
     第一次活性实验结果显示药物与病毒先孵育 2h， 三宝木内酯 A(1)、 三宝木内酯 B(2)、 三宝木内酯 C(3)、 三宝木内酯 D(4) 的 EC50 分别为 1.62ng/ml、 6.46ng/ml、 ＜ 64ng/ml、 1.26ng/ml。
     第二次活性筛选结果显示药物与细胞先孵育 2h， 三宝木内酯 A(1)、 三宝木内酯 B(2)、 三宝木内酯 C(3)、 三宝木内酯 D(4) 的 EC50 分别为 3.99ng/ml、 7.60ng/ml、 ＜ 64ng/ml、 2.37ng/ml。
     实验结果表明 ： 上述化合物具有显著的抑制 HIV 与细胞形成合胞体的作用， 并且 具有较高的选择指数。
     表 1 本发明化合物抗 HIV 药理试验结果
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