1-(4- 脲基苯甲酰基 ) 哌嗪衍生物 本发明涉及 1-(4- 脲基苯甲酰基 ) 哌嗪衍生物、 含有它们的药物组合物和这些 1-(4- 脲基苯甲酰基 ) 哌嗪衍生物在治疗动脉粥样硬化中的应用。
肝 X 受体 (LXR) 是在天然存在的氧化固醇结合后被激活、 从而诱导靶基因转录的 核受体家族。已经鉴别出了 LXR 的两个亚型 (α 和 β)， 且它们的配体 - 和 DNA- 结合域都 表现出 77％同源性。 两个亚型在人类和啮齿动物之间是高度保守的， 但是， 它们的组织表达 模式显著不同。LXRα 的表达限于参与脂类代谢的组织， 在肝中最高表达 ； 在肾、 脾、 小肠和 脂肪组织中也存在显著的水平。LXRβ 的分布非常广泛， 事实上已经在检查的每个组织中 发现， 包括肝和脑。LXRα 和 LXRβ 都在巨噬细胞中表达。参见 Costet 等人， J.Biol.Chem 275 ： 28240-28245(2000)。
尚未完全理解 LXR 受体的作用， 但是， LXR 被公认为肝和周边组织中脂类代谢 的主要调节剂， 和 ATP- 结合盒运载体 A1(ABCA1) 基因的关键诱导物 (Venkateswaran 等 人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97 ： 12097-12102(2000))。在人群体中， ABCA1 基因的突变 会导致高度致动脉粥样化的脂蛋白轮廓 (Singaraja 等人， Arterioscler.Thromb.Vasc. Biol.23 ： 1322-1332(2003))， 它们在最严重的情况下， 会造成丹吉尔病和有关的过早动 脉 粥 样 硬 化 ( 参 见 Bodzioch 等 人， Nat.Genet.22 ： 347-351(1999) 和 Rust 等 人， Nat. Genet.22 ： 352-355(1999))。这种罕见的遗传性病症的特征在于非常低水平的高密度脂蛋 白 (HDL)、 胆固醇酯的巨噬细胞积累和显著增加的动脉粥样硬化病的风险 (Brooks-Wilson
等人， Nat.Genet.22 ： 336-345(1999))。
证据已经证实， 人巨噬细胞和小肠的肠细胞中 ABCA1 的上调， 由 LXR 活化来介导 (Costet 等人， 同上 )。此外， 还已经证实， LXR 激动剂会促进胆固醇流出。参见 Claudel 等 人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98 ： 2610-2615(2001)。因此， LXR 受体在巨噬细胞的胆固醇 体内稳态中起关键作用， 且晚期动脉粥样硬化斑块的局部环境内的抑制可能是该疾病的病 理学的关键特征。
在最近几年中， 已经在逐渐增加地报道了 LXR 激动剂在治疗动脉粥样硬化中的潜 在效用。参见例如 Levin 等人， Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.25 ： 135-142(2005)。动 脉粥样硬化是一种动脉疾病， 其可以不造成症状地存在许多年。 但是， 晚期动脉粥样硬化斑 块可以变得易于破裂， 促进急性血栓形成和诸如心肌梗死 (MI) 和中风等临床事件。在动脉 粥样硬化斑块破裂和随后的临床事件中涉及的主要细胞类型是巨噬细胞。
预期通过降低动脉的胆固醇负担 ( 通过 ABCA1 的上调 )， 以产生更稳定的损害并从 而减少临床事件， 发生 LXR 激动剂在动脉粥样硬化中的功效的主要机理。另外， 由于 ABCA1 在肝生成新生 HDL 中的作用， LXR 激动剂可以增加循环 HDL 水平。由于炎症的抑制 (Joseph 等人， Nat.Med.9 ： 213-219(2003)) 和对葡萄糖代谢的影响， LXR 激动剂存在其它抗 - 动脉粥 样硬化效应的潜力。参见 Latiffe 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100 ： 5419-24(2003)。
仍然需要作为有效的 LXR 调节剂的化合物。
为此目的， 本发明提供具有通式 I 的 1-(4- 脲基苯甲酰基 ) 哌嗪衍生物
其中
R1 为 (C1-8) 烷基， (C3-8) 环烷基或 (C3-8) 环烷基 (C1-3) 烷基， 其每一个可以被羟基， 氰基或卤素取代 ；
R2 表示 1 或 2 个任选的卤素 ；
R3 为 (C1-6) 烷基， (C3-6) 环烷基或 (C3-6) 环烷基 (C1-3) 烷基， 其每一个可以被一个 或多个卤素取代 ；
A 表示杂芳基环系统， 包括 1-3 选自 N， O 和 S 的杂原子， 该环系统 ： 当 X 为 C 时， 为 5- 或 6- 元的， 并且当 X 为 N 时为 5 元的 ； n为1或2； 或者其药学可接受的盐。
在式 I 的定义中使用的术语 (C1-8) 烷基是指具有 1-8 个碳原子的支链或直链烷基， 如辛基、 己基、 戊基、 异戊基、 丁基、 异丁基、 叔丁基、 丙基、 异丙基、 乙基和甲基。
在式 I 的定义中使用的术语 (C1-6) 烷基是指具有 1-6 个碳原子的支链或直链烷基， 如己基、 戊基、 丁基、 异丁基、 叔丁基、 丙基、 异丙基、 乙基和甲基。
同样地， 在式 I 的定义中使用的术语 (C1-3) 烷基是指具有 1-3 个碳原子的支链或 直链烷基， 如丙基、 异丙基、 乙基和甲基。
术语 (C3-8) 环烷基是指具有 3-8 个碳原子的环烷基， 如环庚基、 环己基、 环戊基、 环 丁基和环丙基。
术语 (C3-8) 环烷基 (C1-3) 烷基是指被具有如上定义的 (C3-8) 环烷基取代的具有如 上定义的 (C1-3) 烷基基团。实例是环丙基甲基， 环丁基甲基， 2- 环丙基乙基， 2- 环丁基乙基 等等。优选的 (C3-8) 环烷基 (C1-3) 烷基是环丙基甲基。
术语 5- 或 6- 元包括 1-3 个选自 N， O 和 S 的杂原子的杂芳基环系统 A， 意味着衍
生自杂芳香环的 1， 3- 二基亚杂芳基基团， 所述的杂芳香环例如可举出 杂芳基的例子是 4] 唑 2， 4- 二基， 异唑， 异唑， 二唑，噻二唑， 呋喃， 吡咯， 吡唑， 哌嗪， 吡啶， 嘧啶， 咪唑， 噻唑， 噻二唑， 噻吩等等。这样的 5- 元亚 唑 3， 5- 二基， 噻唑 -2， 4- 二基， 呋喃 -2， 5， - 二基， 噻 吩 -2， 5- 二基， 吡唑 -1， 3- 二基， 吡咯 -1， 3- 二基， 咪唑 -1， 4- 二基， 四唑 -2， 5- 二基， [1， 2， 二唑 -3， 5- 二基等等。6- 元亚杂芳基的例子是吡啶 -2， 4- 二基， 吡啶 -2， 6- 二基， 嘧 啶 -2， 4- 二基， 哒嗪 -3， 5- 二基， 吡嗪 -2， 6- 二基等等。
术语卤素意味着 F， Cl， Br 或 I。优选 F 和 Cl。
优选式 I 的 1-(4- 脲基苯甲酰基 ) 哌嗪衍生物， 其中 A 表示呋喃 -2， 5， 二基或吡 啶 -2， 6- 二基。
进一步优选的是式 I 的 1-(4- 脲基苯甲酰基 ) 哌嗪衍生物， 其中另外 R2 表示 1 或 2 个选自 F 和 Cl 的卤素。
更优选的是式 I 的 1-(4- 脲基苯甲酰基 ) 哌嗪衍生物， 其中另外 R3 是叔丁基。
本发明特别的 1-(4- 脲基苯甲酰基 ) 哌嗪衍生物为 ：-N- 叔丁基 -5-((4-(4-(3- 环丁基脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋 喃 -2- 甲酰胺 ；
-N- 叔丁基 -5-((4-(3- 氟 -4-(3- 异丁基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺 ；
-N- 叔丁基 -5-((4-(4-(3-( 环丙基甲基 ) 脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺 ；
-N- 叔丁基 -5-((4-(3- 氟 -4-(3- 新戊基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺 ；
-N- 叔丁基 -5-((4-(3- 氟 -4-(3- 异戊基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺 ；
-N- 叔丁基 -5-((4-(4-(3- 丁基脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋 喃 -2- 甲酰胺盐酸盐 ；
-N- 叔丁基 -5-((4-(3- 氯 -4-(3- 新戊基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺 ；
-N- 叔丁基 -5-((4-(3- 氯 -4-(3- 异丁基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺 ； -N- 叔丁基 -5-((4-(3- 氯 -4-(3-( 环丙基甲基 ) 脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺 ；
-N- 叔丁基 -5-((4-(3- 氯 -4-(3- 环丁基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺 ；
-N- 叔丁基 -5-((4-(3- 氯 -4-(3- 异戊基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺 ；
-N- 叔丁基 -5-((4-(4-(3- 丁基脲基 )-3- 氯苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋 喃 -2- 甲酰胺 ；
-N- 叔 丁 基 -5-((4-(4-(3-( 环 丙 基 甲 基 ) 脲 基 )-2， 3- 二 氟 苯 甲 酰 基 ) 哌 嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺 ；
-N- 叔丁基 -5-((4-(2， 3- 二氟 -4-(3- 新戊基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲 基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺 ；
-N- 叔丁基 -5-((4-(2， 3- 二氟 -4-(3- 异丁基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲 基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺 ；
-N- 叔丁基 -5-((4-(4-(3- 环丁基脲基 )-2， 3- 二氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲 基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺 ；
-N- 叔丁基 -5-((4-(4-(3- 丁基脲基 )-2， 3- 二氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺 ；
-N- 叔丁基 -5-((4-(2， 3- 二氟 -4-(3- 异戊基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲 基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺 ；
-N- 叔丁基 -6-((4-(4-(3- 环丁基脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 吡 啶酰胺 ；
-N- 叔丁基 -6-((4-(3- 氟 -4-(3- 新戊基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 )
吡啶酰胺 ；
-N- 叔丁基 -6-((4-(3- 氟 -4-(3- 异戊基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 吡啶酰胺 ；
-N- 叔丁基 -6-((4-(4-(3-( 环丙基甲基 ) 脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 吡啶酰胺 ； 或其药学可接受的盐。
可以使用有机合成领域公知的一般合成方法制备本发明的 1-(4- 脲基苯甲酰基 ) 哌嗪衍生物。用于合成其中 X 是 C 的式 I 化合物的合成途径描述在反应路线 1 中， 且其中 X 是 N 的式 I 化合物的合成途径描述在反应路线 2 中。本领域技术人员了解反应路线 1 和 2 中式 2-13 的关键结构单元的添加次序可以改变并且仍然得到期望的式 1 产物。
按照反应路线 1 表示的途径， 用式 3 的杂芳基酯衍生物， 在溶剂例如二氯甲烷或乙 腈中， 在室温或升温、 使用有机碱例如三乙胺或无机碱例如碳酸钾使式 2 的哌嗪中间体烷 基化， 其中 Y 表示氨基保护基， 例如叔 - 丁氧羰基 (t-Boc)， 其中烷基 (alkyl) 表示低级烷 基， 优选甲基， 且其中 L 表示离去基， 例如氯、 溴或 OSO2Me， 得到式 4 的中间体氨基酯衍生物。
在溶剂例如二氯甲烷中， 使用偶合试剂例如 N-(3- 二甲基氨基丙基 )-N’ - 乙基碳 二亚胺盐酸盐或 1- 丙烷膦酸环酐使用例如于甲醇 / 水的氢氧化钠使式 4 的中间体进行酯 水解得到酸或酸的钠盐， 其可以与式 H2NR3 的胺偶合， 其中 R3 具有如上述所定义的含义， 得 到式 5 的酰胺衍生物。例如使用于二氯甲烷中的三氟乙酸使式 5 中间体中的 Boc- 保护的 哌嗪氨基官能团脱保护， 得到式 6 的中间体哌嗪衍生物， 然后在溶剂例如二氯甲烷中使用 偶合试剂例如 N-(3- 二甲基氨基丙基 )-N’ - 乙基碳二亚胺盐酸盐或 1- 丙烷膦酸环酐与式 7 的苯甲酸衍生物偶合， 其中 R2 具有如上述所定义的含义， 得到式 8 的苯胺中间体。通过与 4- 硝基苯基氯甲酸酯或碳酸 ( 双 ( 三氯甲基 ) 酯 ( 三光气 ) 在溶剂例如二氯甲烷中、 在室 温或升温下反应活化这种苯胺中间体， 然后在碱例如三乙胺或 N， N- 二异丙基乙胺的存在 下与式 R1NH2 的胺反应， 其中 R1 具有如上述所定义的含义， 得到本发明式 I 的 1-(4- 脲基苯 甲酰基 ) 哌嗪衍生物。
反应路线 1
按照反应路线 2 表示的途径， 在溶剂例如二氯甲烷中在室温或升温下使式 9 的甲 基化杂芳基衍生物与式 R3-NCO 的异氰酸酯反应， 其中 R3 具有如上述所定义的含义， 得到式 10 的脲衍生物。 通过使用 N- 溴琥珀酰亚胺和过氧化苯甲酰在四氯化碳中、 在室温或室温下 溴化活化芳香甲基取代基， 得到式 11 的中间体脲衍生物， 其中离去基 L 是溴。
用式 11 的脲衍生物在溶剂例如二氯甲烷或乙腈中在室温或升温下、 使用有机碱 例如三乙胺或无机碱例如碳酸钾使式 2 的哌嗪衍生物烷基化， 其中 Y 是 N- 保护基， 例如 叔 - 丁氧羰基 (t-Boc)， 然后使用三氟乙酸和二氯甲烷使 Boc- 基团脱保护， 得到式 12 的哌 嗪衍生物。
反应路线 2
使式 12 的哌嗪衍生物与式 7 的苯甲酸衍生物， 其中 R2 具有如上述所定义的含义， 在溶剂例如二氯甲烷中借助于偶合试剂例如 N-(3- 二甲基氨基丙基 )-N’ - 乙基碳二亚胺盐 酸盐或 1- 丙烷膦酸环酐反应， 得到式 13 的苯胺中间体。可以通过与 4- 硝基苯基氯甲酸酯 或 ( 碳酸双 ( 三氯甲基 ) 酯 ( 三光气 ) 在溶剂例如二氯甲烷、 在室温或升温下反应由式 13 的中间体制备本发明式 I 的 1-(4- 脲基苯甲酰基 ) 哌嗪衍生物， 其中 X 是 N， 然后在碱例如 三乙胺或 N， N- 二异丙基乙胺的存在下添加期望的式 R1NH2 的胺， 其中 R1 具有如上述所定义 的含义。
可以使用本领域众所周知的方法由商购中间体制备式 2 的哌嗪衍生物、 式 3 的酯 衍生物、 式 7 的 4- 氨基苯甲酸衍生物和式 9 的甲基化杂芳基衍生物。
上面使用的术语 N- 保护基是指常用于保护氨基基团的基团， 像禾草灭羰基 (alloxycarbonyl)(Alloc) 基团， 叔丁氧羰基 (Boc) 基团， 苄氧羰基 (Z) 基团或者 9- 芴基甲 氧基羰基 (Fmoc) 基团。根据保护基的性质， 可以以不同方式去除这些和其它保护基。关于 保护基和它们的去除方法的综述， 参见 T.W.Greene 和 P.G.M.Wuts， “ProtectiveGroups in Organic Synthesis” ， 第 2 版， 1991， John Wiley & Sons， Inc.。
式 I 的 1-(4- 脲基苯甲酰基 ) 哌嗪衍生物和它们的盐可以含有至少一个手性中 心， 且因此可以作为立体异构体存在， 包括对映异构体和非对映异构体。 本发明包括在它的 范围内的前述立体异构体， 和式 I 化合物的每种单独的 R 和 S 对映异构体和它们的盐， 其基 本上不含有、 即含有小于 5％、 优选小于 2％、 尤其小于 1％的其它对映异构体， 和这样的对 映异构体的任意比例的混合物， 包括含有基本上等量的两种对映异构体的外消旋混合物。 用于得到纯立体异构体的不对称合成方法是本领域熟知的， 例如手性诱导合成或从手性中 间体开始合成， 对映选择性的酶转化， 使用手性介质上的色谱法分离立体异构体或对映异 构体。这样的方法描述在例如， Chirality in Industry(A.N.Collins 编， G.N.Sheldrake 和 J.Crosby， 1992 ； John Wiley)。
在本发明的另一个方面中， 式 I 的 1-(4- 脲基苯甲酰基 ) 哌嗪衍生物和它们的盐
在任何结构位置可以包括一个或者多个非天然同位素。 本发明的这些同位素标记的化合物 可以例如用于关于它们的吸收、 分布、 代谢和排泄 (ADME) 的体内研究。同位素包括放射性 14 13 18 同位素， 例如氚或者 C。可选择地， 化合物也可以用稳定的同位素例如氚， C， O 或 15N 富 集。11C 和 18F 是要掺混到本发明化合物中的优选的同位素， 用于作为 PET( 正电子成象术 ) 示踪剂。
通过用无机酸 ( 诸如氢氯酸、 氢溴酸、 磷酸和硫酸 ) 或有机酸 ( 诸如例如抗坏血 酸、 柠檬酸、 酒石酸、 乳酸、 马来酸、 丙二酸、 延胡索酸、 羟乙酸、 琥珀酸、 丙酸、 醋酸、 甲磺酸 等 ) 处理式 I 的 1-(4- 脲基苯甲酰基 ) 哌嗪衍生物的游离碱， 可以得到药学上可接受的盐。
本发明的化合物可以以未溶剂化形式以及与药学上可接受的溶剂 ( 诸如水、 乙醇 等 ) 的溶剂化形式存在。一般而言， 对于本发明的目的， 认为溶剂化形式与未溶剂化形式等 效。
本发明另外提供了药物组合物， 其包含与药学上可接受的辅剂混合的具有通式 I 的 1-(4- 脲基苯甲酰基 ) 哌嗪衍生物或其药学上可接受的盐和任选的其它治疗剂。术语 “可接受的” 是指与组合物的其它成分相容， 且对其受体无害。组合物包括例如适合口服、 舌 下、 皮下、 静脉内、 硬膜外、 鞘内、 肌肉内、 透皮、 肺、 局部或直肠给药等的那些， 都是单位给药 剂型。 对于口服给药， 活性成分可以作为离散单位存在， 诸如片剂、 胶囊剂、 散剂、 颗粒 剂、 溶液、 悬浮液等。
对于肠胃外给药， 本发明的药物组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中， 例 如预定量的注射液， 例如在密闭瓶和安瓿中， 且也可以储存在冷冻干燥 ( 低压冻干 ) 条件 下， 只需要在使用前加入无菌液体载体， 例如水。
与这样的药学上可接受的辅剂相混合， 例如如标准参考文献 Gennaro， A.R. 等人， Remington ： The Science and Practice ofPharmacy( 第 20 版， Lippincott Williams & Wilkins， 2000， 具体参见第 5 部分 ： Pharmaceutical Manufacturing) 所述， 可以将活性剂 压制成固体剂量单位， 诸如丸剂、 片剂， 或加工成胶囊剂、 栓剂或贴剂。 借助于药学上可接受 的液体， 可以将活性剂制成液体组合物， 例如注射制剂， 其形式为溶液、 悬浮液、 乳状液， 或 喷雾剂， 例如喷鼻剂。
为了制备固体剂量单位， 预见到诸如填充剂、 着色剂、 聚合粘合剂等常规添加剂的 使用。一般而言， 可以使用不干扰活性化合物的功能的任意药学上可接受的添加剂。适用 于将本发明的活性剂制成固体组合物的载体包括以适当量使用的乳糖、 淀粉、 纤维素衍生 物等或其混合物。对于肠胃外给药， 可以使用水混悬液、 等渗盐水溶液和无菌注射溶液， 其 含有药学上可接受的分散剂和 / 或润湿剂， 诸如丙二醇或丁二醇。
本发明另外包括上文所述的药物组合物， 其与适合所述组合物的包装材料相组 合， 所述包装材料包括关于将所述组合物用于上文所述用途的说明书。
发现本发明的 1-(4- 脲基苯甲酰基 ) 哌嗪衍生物是 LXRα 和 / 或 LXRβ 的调节剂， 具体地具有对它们的激动剂活性， 因而可以用于预防和减少动脉粥样硬化和与胆固醇和胆 汁酸运输和代谢有关的相关病症的风险， 所述病症例如高胆固醇血症 ( 例如冠心病 )、 胆固 醇胆石、 脂质积累病、 糖尿病和肥胖症。
本发明的化合物也潜在地可用于其它适应症， 例如 ：
炎性疾病 ：
已经证实， LXR 的配体活化会抑制许多炎性途径， 例如白介素 1-β、 白介素 -6、 环 氧化酶 -2， 且最近证实会直接抑制 C- 反应性蛋白表达。 参见 Blaschke 等人， Circ.Res.99 ： 88-99.(2006)。本发明的化合物可能在炎性疾病的炎症抑制中具有治疗效用， 所述炎性疾 病例如 ： 接触性皮炎 ( 参见 Fowler 等人， J.Invest.Dermatol.120 ： 246-55.(2003) ； 神经炎 症性疾病诸如多发性硬化 (Zhang-Gandhi 和 Drew.J.Neuroimmunol.183 ： 50-59.(2007)) 和 自身免疫脑脊髓炎。参见 Hindinger 等人， J.Neurosci.Res.84 ： 1225-1234(2006)。
增生性血管疾病 ：
已经证实， 在体外和体内泡沫化损伤之后， LXR 配体 T0901317 会抑制血管平滑肌 细胞增殖和新内膜形成。 因此， 本发明的化合物可能在增生性血管疾病中具有治疗效用。 参 见 Blaschke 等人， Circ.Res.95 ： 110-123(2004)。
糖尿病 / 代谢综合征 ：
近期的文献已经证实了 LXR 激动剂在胰岛素耐受性和糖尿病动物模型中的功效， 因此， 本发明的化合物可能在糖尿病和代谢综合征的治疗中具有潜在治疗效用 ( 参见 Liu 等人， Endocrinology.147 ： 5061-5068(2006) ； Fernandez-Veledo 等人， Diabetologia.49 ： 3038-3048(2006))。 癌症 ：
在前列腺癌动物模型中， LXR 激动剂 T0901317 延迟了肿瘤的进展。本发明的化合 物可能潜在地用于治疗前列腺癌。参见 Chuu 等人， Cancer.Res.66 ： 6482-6486(2006)。
神经变性疾病 ：
通过细胞胆固醇水平的调节， LXR 激动剂可以减少 β- 淀粉样蛋白在脑中的沉积。 另外， 已经证实， T0901317 会降低 β- 淀粉样蛋白的沉积， 并且提高记忆力。参见 Riddell 等人， Mol.Cell.Neurosci.34 ： 621-628(2007)。 因此， 本发明的激动剂衍生物可能在诸如阿 尔茨海默病等神经变性疾病中具有治疗效用。
联合治疗 ：
本发明的化合物可以与另一种治疗剂相组合， 所述另一种治疗剂用于治疗其它代 谢病症， 例如 ： 高血压、 高血脂、 血脂异常、 糖尿病、 慢性炎性病症、 肥胖症， 和其中胆固醇逆 行转运的增强和 / 或 LDL ∶ HDL 比的提高是潜在地临床上有益的任意病症。这样的治疗的 实例是 ： 3- 羟基 -3- 甲基 - 戊二酰 -CoA 还原酶 (HMG CoA 还原酶 ) 的抑制剂 ( 例如阿托伐 他汀、 普伐他汀、 辛伐他汀、 洛伐他汀、 罗舒伐他汀和其它 )， 胆固醇吸收抑制剂 ( 例如依折 麦布 )， 胆汁多价螯合剂 ( 例如考来烯胺 )， 微粒体甘油三酯转移蛋白 (MTP) 抑制剂， 过氧化 物酶体增殖子 - 激活的受体调节剂 ( 例如莫格列他、 罗格列酮、 贝特类和其它 )， 胆固醇酯 转移蛋白抑制剂， 烟酸衍生物 ( 例如 Niaspan 等 )， 酰基辅酶 A ： 胆固醇酰基转移酶 (ACAT) 抑制剂 ( 例如 eflucimibe)， 法尼酯 X 受体调节剂， 用于治疗代谢综合征或 II 型糖尿病的治 疗， 例如二甲双胍。本发明的化合物可以与抗炎治疗 ( 例如 aspirin) 和神经变性疾病的治
疗 ( 例如 Aricept
ExelonReminyl和 Ebixa) 相组合。本发明的化合物可以以足够的量施用给人足够的时间， 以缓解症状。 对于人而言， 例证性的日剂量水平可以在 0.001-50mg/kg 体重的范围内， 优选 0.01-20mg/kg 体重的日剂 量。下面的实施例例证了本发明。
一般实验
高效液相色谱法 (HPLC)
HPLC 纯化用于该实验部分中， 且是指高效液相色谱法。可以用于纯化化合物的一 般方法的一些实例是 ： 使用 5％乙腈 /95％水至 100％乙腈的标准梯度的酸性反相 HPLC( 水 / 乙腈 /0.1％三氟醋酸 )， 或使用 10％乙腈 /90％水至 100％乙腈的标准梯度的碱性反相 HPLC( 水 / 乙腈 /0.1％氨溶液 )。紫外检测例如 254nM 用于收集 HPLC 级分。该描述提供了 一般方法， 且设备类型、 柱、 流动相、 检测波长、 溶剂梯度和运行时间的变体也可以用于纯化 化合物。
游离碱和盐
通过酸性 HPLC 纯化后， 通过常见的一般方法， 可以将碱性产物分离为三氟醋酸 盐， 或释放为游离碱， 所述方法例如 ： 强阳离子交换色谱法 ( 使用 2M 在甲醇中的氨洗脱 )， 或二氧化硅碳酸酯柱色谱法， 或在有机溶剂 ( 例如醋酸乙酯 ) 和水性基质 ( 例如碳酸氢钠 ) 之间分配， 分离有机层， 用无机固体 ( 例如硫酸镁 ) 干燥， 过滤， 并在减压下浓缩。
通过标准的方法， 也可以将产物的游离碱转化成盐酸盐， 所述方法例如 ： 将游离碱 溶于二氯甲烷中， 并加入 2M 在醚中的氢氯酸， 在减压下浓缩， 得到盐酸化物盐。 缩写 ：
Boc ： 叔丁氧基羰基 ； CDCl3 ： 氯仿 -d ； CD3OD ： 甲醇 -d4 ； (CD3)2SO ： 二甲基亚砜 -d6 ； HPLC ： 高效液相色谱法 ； HATU ： O-(7- 氮杂苯并三唑 -1- 基 )-N， N， N， N- 四甲基脲六氟磷酸 盐； SCX ： 强阳离子交换 ； 三光气 ： 二 ( 三氯甲基 ) 碳酸酯。
实施例 1
N- 叔 丁 基 -2-((4-(4-(3- 环 丁 基 脲 基 ) 苯 甲 酰 基 ) 哌 嗪 -1- 基 ) 甲 基 )唑 -4- 甲酰胺 2， 2， 2- 三氟乙酸酯
A： 甲基 2-( 哌嗪 -1- 基甲基 )唑 -4 甲酸酯 2， 2， 2- 三氟乙酸酯
在室温下用甲基 (2- 氯甲基 )唑 -4 甲酸酯 (1.0g， 5.70mmol ； 分部分加入 ) 处理叔丁基 -1- 哌嗪甲酸酯 (1.06g， 5.70mmol) 和 N， N- 二异丙基乙胺 (2.98mL， 17.1mmol) 的 二甲基亚砜 (10mL) 溶液并且搅拌过夜。混合物用乙酸乙酯稀释并且用饱和氯化钠水溶液 洗涤。在硫酸镁上干燥有机层， 过滤并且浓缩得到中间体叔丁基 4-((4-( 甲氧基羰基 ) 唑 2- 基 ) 甲基 ) 哌嗪 -1- 甲酸酯 (MS(ESI)m/z 325.7[M+H]+)。在室温下将中间体溶于二 氯甲烷 (15mL) 并且用三氟乙酸 (5mL) 逐滴处理。搅拌混合物 4 小时然后在真空下浓缩获得标题化合物 (1.60g)。MS(ESI)m/z226.1[M+H]+。
B： 乙基 4-(3- 环丁基脲基 ) 苯甲酸酯
将环丁基胺 (27.91g， 392.4mmol， 33.5mL) 逐滴加入 4- 异氰酸苯甲酸乙酯 (25g， 130.8mmol) 于二氯甲烷中的搅拌溶液。 搅拌 40 分钟后， 将已经形成的固体沉淀物滤除并且 干燥以得到标题化合物 (30.28g)。MS(ESI)m/z 263.1[M+H]+
C： 4-(3- 环丁基脲基 ) 苯甲酸
将 4-(3- 环丁基脲基 ) 苯甲酸乙酯 (49.9mmol， 13.1g) 混悬在乙醇 (400ml) 中， 并 且用 4M 氢氧化钠 (300mmol， 74.9ml) 处理。然后将混合物在回流下搅拌 18 小时。使反应 体系冷却， 用甲苯 (100mL) 稀释并且在真空下浓缩。用 5M 盐酸水溶液酸化到 pH 3 产生白 色固体。 该固体通过真空过滤收集， 用冷乙醇洗涤并且真空下干燥， 获得标题化合物作为白 色粉末 (11.0g)。 1
H NMR(CD3OD， 400MHz) ： δ1.73(2H， m)， 1.92(2H， m)， 2.32(2H， m)， 4.22(1H， m)， 7.45(2H， d)， 7.90(2H， d)
D： 甲基 2-((4-(4-(3- 环丁基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 )唑 -4 甲酸酯
向 甲 基 2-( 哌 嗪 -1- 基 甲 基 )唑 -4- 甲 酸 酯 2， 2， 2- 三 氟 乙 酸 酯 (174mg，513μmol) 和 于 N， N- 二 甲 基 甲 酰 胺 (5mL) 中 的 4-(3- 环 丁 基 脲 基 ) 苯 甲 酸 (120mg， 513μmol) 的 N， N- 二 甲 基 甲 酰 胺 (3mL) 溶 液 中 加 入 N， N- 二 异 丙 基 乙 胺 (357μL， 2.05mmol)， 然后加入 O-(7- 氮杂苯并三唑 -1- 基 )-N， N， N， N- 四甲基脲六氟磷酸盐 (293mg， 770μmol ； HATU)。将混合物在室温下搅拌 22 小时然后在真空下浓缩。该残余物溶解在乙 酸乙酯中用饱和氯化铵水溶液和盐水洗涤。有机相在硫酸镁上干燥， 过滤并且在真空下浓 缩。粗残余物应用到硅胶柱上并且用于正己烷中的 25％乙酸乙酯洗脱， 获得标题化合物 + (34mg)。MS(ESI)m/z 442.1[M+H]
E： 2-((4-(4-(3- 环丁基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 )唑 -4- 甲酸 2，2， 2- 三氟乙酸酯
在室温下将甲基 2-((4-(4-(3- 环丁基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 )唑 -4 甲酸酯 (30mg， 68μmol) 溶于甲醇 / 水 (5 ∶ 1 ； 3mL) 的混合物。加入氢氧化锂 (20mg， 477μmol ； 单水合物 )， 并且搅拌混合物 1 小时。将混合物浓缩至接近干燥， 用水 (2mL) 稀 释并且通过加入浓盐酸使其到 pH 2-3。通过酸性反相 HPLC 纯化粗溶液， 得到标题化合物 + (32mg)。MS(ESI)m/z 428.1[M+H]F： 1-(4-(1-((4-( 叔丁基氨基甲酰基 )唑 2- 基 ) 甲基 ) 哌嗪 -4- 羰基 ) 苯 唑 -4- 甲酸 2，基 )-3- 环丁基脲 2， 2， 2- 三氟乙酸酯
向 2-((4-(4-(3- 环丁基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 )2， 2- 三氟乙酸酯 (8mg， 15μmol) 于 N， N- 二甲基乙酰胺 (1mL) 的溶液中加入 O-(7- 氮杂苯并 三唑 -1- 基 )-N， N， N， N- 四甲基脲六氟磷酸盐 (5.7mg， 15μmol ； HATU)， 叔丁基胺 (1.6μL， 15μmol) 和 N， N- 二异丙基乙胺 (3.9μL， 23μmol)。将反应混合物在室温下搅拌 20 小时 然后在真空下浓缩。通过酸性反相 HPLC 纯化粗残余物， 得到标题化合物 (5.6mg)。MS(ESI) + m/z 483.1[M+H]
按照类似方式制备下列化合物 ：
1B ： N- 环丁基 -2-((4-(4-(3- 环丁基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 )唑 -4- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 481.1[M+H]+
1C ： N- 仲 - 丁基 -2-((4-(4-(3- 环丁基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) MS(ESI)m/z 483.1[M+H]+。 1D ： 2-((4-(4-(3- 环丁基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 )-N- 环戊基 -唑 -4- 甲酰胺 2， 2， 2- 三氟乙酸酯， 外消旋体
唑 -4- 甲酰胺 2， 2， 2- 三氟乙酸酯
MS(ESI)m/z 495.1[M+H]+。
实施例 2
N- 叔丁基 -2-((4-(4-(3-( 环丙基甲基 ) 脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲 基 ) 噻唑 -4- 甲酰胺
A： 2-((4-( 叔丁氧羰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 噻唑 -4- 甲酸乙酯合并 1- 哌嗪甲酸叔丁酯 (1.811g， 9.72mmol)， 2- 氯甲基噻唑 -4- 甲酸乙酯 (2g， 9.72mmol)， 碳酸钾 (2.69g， 19.45mmol) 和碘化钠 (0.292g， 1.945mmol)， 在乙腈中在回流下 搅拌 2 小时。减压浓缩该反应体系， 将残余物溶于二氯甲烷， 过滤。减压浓缩滤液， 得到标 题化合物 (4.38g)。
MS(ESI)m/z 356.5[M+H]+
B： 2-((4-( 叔丁氧羰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 噻唑 -4- 甲酸钠
合并 2-((4-( 叔丁氧羰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 噻唑 -4- 甲酸乙酯 (4.3871g， 12.34mmol) 和氢氧化钠 (0.494g， 12.34mmol)， 在乙醇中在回流状态下搅拌 3 小时。减压浓 缩该反应体系， 得到标题化合物 (3.56g)。MS(ESI)m/z 328.3[M+H]+
C： 4-((4-( 叔丁基氨基甲酰基 ) 噻唑 -2- 基 ) 甲基 ) 哌嗪 -1- 甲酸叔丁酯
向 2-((4-( 叔 丁 氧 羰 基 ) 哌 嗪 -1- 基 ) 甲 基 ) 噻 唑 -4- 甲 酸 钠 (3.596g， 10.29mmol)、 叔丁基胺 (0.753g， 10.29mmol， 1.082mL) 和三乙胺 (3.12g， 30.9mmol， 4.29mL) 在二氯甲烷 (50mL) 中的溶液中加入 1- 丙烷膦酸环酐 (13.10g， 20.58mmol， 12.25mL， 50％的 乙酸乙酯溶液 )。 减压浓缩该反应体系， 将残余物溶于乙酸乙酯， 用碳酸氢钠 (x3) 和盐水洗 涤。减压浓缩有机相， 得到标题化合物 (2.10g)。MS(ESI)m/z 283.5[M+H]+
D： N- 叔丁基 -2-( 哌嗪 -1- 基甲基 ) 噻唑 -4- 甲酰胺
将 4-((4-( 叔丁基氨基甲酰基 ) 噻唑 -2- 基 ) 甲基 ) 哌嗪 -1- 甲酸叔丁酯 (2.1g， 5.49mmol) 溶于二氯甲烷 (20mL)。加入 2， 2， 2- 三氟乙酸 (20mL)， 将该反应混合物搅拌 2 小 时。减压浓缩该反应体系， 通过 SCX 柱色谱法纯化， 得到标题化合物 (1.28g)。MS(ESI)m/z + 283.4[M+H]
E： 2-((4-(4- 氨基 -3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 )-N- 叔 - 丁基噻唑 -4- 甲 酰胺
向 4- 氨基 -3- 氟苯甲酸 (0.703g， 4.53mmol)、 N- 叔丁基 -2-( 哌嗪 -1- 基甲基 ) 噻唑 -4- 甲酰胺 (1.28g， 4.53mmol) 和三乙胺 (0.459g， 4.53mmol， 0.630mL) 在二氯甲烷中 的溶液中加入 1- 丙烷膦酸环酐 (2.88g， 4.53mmol， 2.70mL， 50％的乙酸乙酯溶液 )。减压浓 缩该反应体系， 将残余物溶于乙酸乙酯， 用碳酸氢钠 (x3) 和盐水洗涤。减压浓缩有机相， 得 到标题化合物 (0.87g)。MS(ESI)m/z 420.3[M+H]+
F： N- 叔丁基 -2-((4-(4-(3-( 环丙基甲基 ) 脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 噻唑 -4- 甲酰胺
合并 2-((4-(4- 氨基 -3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 )-N- 叔 - 丁基噻唑 -4- 甲 酰胺 (100mg， 0.238mmol) 和氯甲酸 4- 硝基苯酚酯 (48mg， 0.238mmol)， 在室温在二氯甲烷中 搅拌 1 小时。加入环丙基甲基胺 (50.9mg， 0.715mmol， 62μl)， 将该反应体系搅拌 30 分钟。 用水稀释该反应混合物， 流过疏水玻璃料。真空浓缩有机相， 通过酸性反相 HPLC 纯化， 得到
标题化合物 (5mg)。MS(ESI)m/z 517.3[M+H]+
按照类似方式制备下列化合物 ：
2B ： N- 叔丁基 -2-((4-(4-(3- 环丁基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 )- 噻 唑 -4- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 517.5[M+H]+
2C ： N- 叔丁基 -2-((4-(4-(3- 异戊基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 噻 唑 -4- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 533.5[M+H]+
实施例 3
N- 叔丁基 -5-((4-(4-(3- 环丁基脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋 喃 -2- 甲酰胺
A： 4-((5-( 甲氧羰基 ) 呋喃 -2- 基 ) 甲基 ) 哌嗪 -1- 甲酸叔丁酯合并 1- 哌嗪甲酸叔丁酯 (2.134g， 11.46mmol)、 5-( 氯甲基 )-2- 糠酸甲酯 (2g， 11.46mmol)、 碳酸钾 (3.17g， 22.91mmol) 和碘化钠 (0.343g， 2.291mmol)， 在乙腈中在回流 下搅拌 2 小时。减压浓缩该反应体系， 将残余物溶于二氯甲烷， 过滤。减压浓缩滤液， 得到 + 标题化合物 (4.99g)。MS(ESI)m/z 325.3[M+H]
B： 5-((4-( 叔丁氧羰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酸钠
合 并 4-((5-( 甲 氧 羰 基 ) 呋 喃 -2- 基 ) 甲 基 ) 哌 嗪 -1- 甲 酸 叔 丁 酯 (4.99g， 15.39mmol) 和氢氧化钠 (0.616g， 15.39mmol)， 在回流状态下搅拌 3 小时。减压浓缩该反应 体系， 得到标题化合物 (4.59g)。MS(ESI)m/z 311.4[M+H]+
C： 4-((5-( 叔丁基氨基甲酰基 ) 呋喃 -2- 基 ) 甲基 ) 哌嗪 -1- 甲酸叔丁酯
向 5-((4-( 叔 丁 氧 羰 基 ) 哌 嗪 -1- 基 ) 甲 基 ) 呋 喃 -2- 甲 酸 钠 (4.558g， 13.72mmol)、 2- 甲基丙 -2- 胺 (1.003g， 13.72mmol， 1.441mL) 和三乙胺 (4.16g， 41.1mmol， 5.72mL) 在二氯甲烷中的溶液中加入 1- 丙烷膦酸环酐 (17.46g， 27.4mmol， 16.33mL， 50％的 乙酸乙酯溶液 )。将该反应体系搅拌 2 小时， 然后减压浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯， 用碳 酸氢钠、 水和盐水洗涤。 减压浓缩有机相， 得到标题化合物 (2.4g)。 MS(ESI)m/z366.3[M+H]+
D： N- 叔丁基 -5-( 哌嗪 -1- 基甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺将 4-((5-( 叔 丁 基 氨 基 甲 酰 基 ) 呋 喃 -2- 基 ) 甲 基 ) 哌 嗪 -1- 甲 酸 叔 丁 酯 (6.57mmol， 2.4g) 溶于二氯甲烷 (20mL)。 加入 2， 2， 2- 三氟乙酸 (20mL)， 将该反应混合物搅 拌 2 小时。减压浓缩该反应体系， 通过 SCX 色谱法纯化， 得到标题化合物 (1.51g)。MS(ESI) + m/z 266.4[M+H]
E： 5-((4-(4- 氨基 -3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 )-N- 叔 - 丁基呋喃 -2- 甲 酰胺
向 4- 氨基 -3- 氟苯甲酸 (0.883g， 5.69mmol)、 N- 叔丁基 -5-( 哌嗪 -1- 基甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺 (1.51g， 5.69mmol) 和三乙胺 (0.576g， 5.69mmol， 0.791mL) 在二氯甲烷中 的溶液中加入 1- 丙烷膦酸环酐 (3.62g， 5.69mmol， 3.39mL， 50％的乙酸乙酯溶液 )。将该反 应体系搅拌 2 小时， 然后减压浓缩。 将残余物溶于乙酸乙酯， 用碳酸氢钠、 水和盐水洗涤。 减 + 压浓缩有机相， 得到标题化合物 (0.93g)。MS(ESI)m/z 403.6[M+H]
F： N- 叔丁基 -5-((4-(4-(3- 环丁基脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
合并 5-((4-(4- 氨基 -3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 )-N- 叔 - 丁基呋喃 -2- 甲 酰胺 (113mg， 0.280mmol) 和氯甲酸 4- 硝基苯酚酯 (56mg， 0.238mmol)， 在二氯甲烷中在室 温搅拌 1 小时。加入环丁基胺 (59.6mg， 0.839mmol， 71.6μl)， 将该反应体系搅拌 30 分钟。 用水稀释该反应混合物， 流过疏水玻璃料。真空浓缩有机相， 通过酸性反相 HPLC 纯化， 得到 + 标题化合物 (10mg)。MS(ESI)m/z 500.3[M+H]
按照类似方式制备下列化合物 ：
3B ： N- 叔丁基 -5-((4-(3- 氟 -4-(3- 异戊基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 516.5[M+H]+
实施例 4
N- 叔丁基 -5-((4-(3- 氟 -4-(3- 异丁基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋 喃 -2- 甲酰胺
将 5-((4-(4- 氨基 -3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 )-N- 叔 - 丁基呋喃 -2- 甲酰 胺 ( 实施例 3 ； 0.05g， 0.124mmol) 和 N， N- 二异丙基乙胺 (0.028mL) 溶于二氯甲烷 (5mL)。 滴 加双 ( 三氯甲基 ) 碳酸酯 (0.014g， 0.046mmol)， 将该反应体系保持搅拌 30 分钟。向该反应 体系中加入 N， N- 二异丙基乙胺 (0.094mL)， 然后加入 2- 甲基丙 -1- 胺 (0.018g， 0.248mmol， 0.025mL)， 将该反应体系再搅拌 2 小时。用水稀释该反应混合物， 流过疏水玻璃料。真空浓 缩有机相， 通过碱性反相 HPLC 纯化， 得到标题化合物 (5mg)。 +
MS(ESI)m/z 502.5[M+H]
按照类似方式制备下列化合物 ：
4B ： N- 叔丁基 -5-((4-(4-(3-( 环丙基甲基 ) 脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 500.5[M+H]+
4C ： N- 叔丁基 -5-((4-(3- 氟 -4-(3- 新戊基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 516.3[M+H]+
实施例 5
使用与实施例 1-4 中描述的类似的方法制备下列化合物 ：
5A ： N- 叔丁基 -5-((4-(4-(3- 丁基脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋 喃 -2- 甲酰胺盐酸盐
MS(ESI)m/z 502.5[M+H]+
5B ： N- 环丁基 -5-((4-(4-(3- 环丁基脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 498.5[M+H]+
5C ： N- 环丁基 -5-((4-(3- 氟 -4-(3- 异丁基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 500.4[M+H]+
5D ： (R)-N- 仲 - 丁基 -5-((4-(4-(3-( 环丙基甲基 ) 脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 482.4[M+H]+
5E ： 5-((4-(4-(3-( 环 丙 基 甲 基 ) 脲 基 )-3- 氟 苯 甲 酰 基 ) 哌 嗪 -1- 基 ) 甲 基 )-N-(1- 甲基环丙基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 498.5[M+H]+
5F ： 5-((4-(4-(3-( 环 丙 基 甲 基 ) 脲 基 )-3- 氟 苯 甲 酰 基 ) 哌 嗪 -1- 基 ) 甲 基 )-N-(3， 3- 二氟环丁基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 534.3[M+H]+
5G ： N- 叔丁基 -5-((4-(3- 氯 -4-(3- 新戊基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 532.5[M+H]+
5H ： N- 叔丁基 -5-((4-(3- 氯 -4-(3- 异丁基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 518.8[M+H]+
5I ： N- 叔丁基 -5-((4-(3- 氯 -4-(3-( 环丙基甲基 ) 脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 516.5[M+H]+
5J ： N- 叔丁基 -5-((4-(3- 氦 -4-(3- 异戊基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 532.3[M+H]+
5K ： N- 叔丁基 -5-((4-(4-(3- 丁基脲基 )-3- 氯苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋 喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 518.5[M+H]+
5L ： N- 叔丁基 -5-((4-(3- 氯 -4-(3- 环丁基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 516.5[M+H]+
5M ： N- 叔丁基 -5-((4-(3- 氯 -4-(3-(2- 羟基 -2- 甲基丙基 ) 脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌 嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 534.5[M+H]+
5N ： N- 叔丁基 -5-((4-(3- 氯 -4-(3-((1- 羟基环丙基 ) 甲基 ) 脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 532.3[M+H]+
5O ： N- 叔丁基 -5-((4-(3- 氯 -4-(3-((1- 异氰基环丙基 ) 甲基 ) 脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 541.5[M+H]+ 如下制备合成中需要的 1-( 氨基甲基 ) 环丙烷腈 ： 步骤 1 ： 向 1- 氰基环丙烷羧酸乙酯 (35.9mmol， 5g)、 二甲氧基乙烷 (100mL) 和甲醇(10mL) 的混合物中缓慢加入硼氢化钠 (287mmol， 10.87g)， 将该混合物在室温搅拌 18 小时。 用饱和碳酸氢钠缓慢稀释该溶液， 然后用 10％甲醇 / 二氯甲烷 (x3) 萃取。合并有机层， 用 硫酸钠干燥， 真空浓缩， 得到中间体 1-( 羟基甲基 ) 环丙烷腈 (2.36g)。 1
H NMR(CDCl3， 400MHz) ： δ0.99(2H， m)， 1.28(2H， m)， 2.5(1H， br s)， 3.62(2H， s)
步骤 2 ： 用三乙胺 (48.6mmol， 6.83mL， 4.92g) 且分部份地用甲磺酰氯 (31.6mmol， 2.445mL， 3.62g) 处理 1-( 羟基甲基 ) 环丙烷腈 (24.30mmol， 2.36g) 在二氯甲烷 (30mL) 中 的搅拌混合物， 保持该反应混合物在 0℃。 将该溶液搅拌 1 小时， 然后用饱和碳酸氢钠稀释， 用 10％甲醇 / 二氯甲烷 (x3) 萃取。合并有机层， 减压浓缩， 得到中间体甲磺酸 (1- 氰基环 丙基 ) 甲酯 (3.77g)。 1
H NMR(CDCl3， 400MHz) ： δ1.18(2H， m)， 1.46(2H， m)， 3.14(3H， s)， 4.18(2H， s)
步骤 3： 将 甲 磺 酸 (1- 氰 基 环 丙 基 ) 甲 酯 (21.52mmol， 3.77g) 和 叠 氮 化 钠 (43.0mmol， 2.80g) 在 N， N- 二甲基甲酰胺 (40mL) 中的搅拌混合物加热至 120℃～ 18 小时。 将该混合物冷却， 用水和乙酸乙酯稀释。分离有机层， 用硫酸钠干燥， 减压浓缩， 得到油状 物。将该油状物溶于乙醚， 用水洗涤， 干燥， 减压浓缩， 得到中间体 1-( 叠氮基甲基 ) 环丙烷 腈 (1.8g)， 为油状物。 1
H NMR(CDCl3， 400MHz) ： δ1.02(2H， m)， 1.36(2H， m)， 3.38(2H， s)
步骤 4 ： 向 1-( 叠氮基甲基 ) 环丙烷腈 (14.74mmol， 1.8g) 在甲醇中 (20mL) 中的 溶液中加入包含水 (200μL) 的 10％钯 / 碳 (14.74mmol， 200mg)。将该混合物在 3 巴的氢 气气氛中在室温搅拌过夜。通过过滤除去催化剂， 减压浓缩滤液， 得到标题化合物 (1.3g)。 1
H NMR(CDCl3， 400MHz) ： δ0.87(2H， m)， 1.23(2H， m)， 2.76(2H， s)
5P ： N- 叔 丁 基 -5-((4-(4-(3-( 环 丙 基 甲 基 ) 脲 基 )-2， 3- 二 氟 苯 甲 酰 基 ) 哌 嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 518.5[M+H]+
5Q ： N- 叔丁基 -5-((4-(2， 3- 二氟 -4-(3- 新戊基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 534.5[M+H]+
5R ： N- 叔丁基 -5-((4-(4-(3- 丁基脲基 )-2， 3- 二氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲 基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 520.3[M+H]+
5S ： N- 叔丁基 -5-((4-(2， 3- 二氟 -4-(3- 异丁基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 520.7[M+H]+
5T ： N- 叔丁基 -5-((4-(2， 3- 二氟 -4-(3- 异戊基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 534.3[M+H]+
5U ： N- 叔丁基 -5-((4-(4-(3- 环丁基脲基 )-2， 3- 二氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲 基 ) 呋喃 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 518.5[M+H]+
实施例 65-((4-(4-(3-( 环丙基甲基 ) 脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 )-N- 叔 - 戊基 噻吩 -2- 甲酰胺
A： 4-(3-( 环丙基甲基 ) 脲基 ) 苯甲酸乙酯向在二氯甲烷 (40mL) 中的环丙基甲胺 (57.5mmol， 4.99ml， 4.09g) 加入在二氯甲 烷 (45mL) 中的 4- 异氰酸苯甲酸乙酯 (52.3mmol， 10g)， 将该反应体系搅拌过夜。然后减压 浓缩该反应体系， 得到标题化合物 (14.7g)。 1
H NMR(CDCl3， 400MHz) ： δ0.2(2H， m)0.5， (2H， m)0.95(1H， m)1.4(3H， t)， 3.1(2H， m)4.35(2H， q)， 5.15(1H， br s)， 7.0， 1H， 7.4(2H， d)8.0(2H， d)
B： 4-(3-( 环丙基甲基 ) 脲基 ) 苯甲酸
将 4-(3-( 环 丙 基 甲 基 ) 脲 基 ) 苯 甲 酸 乙 酯 (55.3mmol， 14.5g) 混 悬 于 乙 醇 (400ml)， 加入 4M 氢氧化钠 (332mmol， 83mL)。然后回流该反应体系， 直到皂化完成为止。通 过蒸发除去乙醇， 用浓盐酸中和反应体系。收集白色沉淀， 用水洗涤。真空干燥该物质， 得 到标题化合物 (12.1g)。 1
H NMR((CD 3) 2SO ， 400MHz) ： δ 0.2(2H ， m)0.5 ， (2H ， m)0.95(1H ， m) ， 3.0(2H ， m)6.35(1H， br s)7.4(2H， d)7.8(2H， d)8.9(1H， brs)
C： 4-(4-(3-( 环丙基甲基 ) 脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 甲酸叔丁酯将哌嗪 -1- 甲酸叔丁酯 (45.8mmol， 8.53g) 和 4-(3-( 环丙基甲基 ) 脲基 ) 苯甲酸 (45.8mmol， 10.73g) 在二氯甲烷 (200mL) 中混合， 加入三乙胺 (103mmol， 14.36ml， 10.43g)， 然后加入 1- 丙烷膦酸环酐 (68.7mmol， 40.7mL， 43.7g， 50％的乙酸乙酯溶液 )。将该反应体 系搅拌 1 小时， 然后倾入饱和碳酸氢钠溶液， 用二氯甲烷萃取。干燥有机相 ( 硫酸镁 )， 过 滤， 减压浓缩得到标题化合物 (17.13g)。
MS(ESI)m/z 403.5[M+H]+ D： 1-( 环丙基甲基 )-3-(4-( 哌嗪 -1- 羰基 ) 苯基 ) 脲将 4-(4-(3-( 环丙基甲基 ) 脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 甲酸叔丁酯 (46.7mmol， 18.78g) 溶于二氯甲烷 (30mL)， 加入三氟乙酸 (233mmol， 17.33ml， 26.6g)。将该反应体系 搅拌 1 小时， 然后减压浓缩。将粗物质与乙醚一起研磨， 高度真空干燥后得到白色粉末。将 该白色粉末溶于水， 用碳酸钠谨慎达到 pH 10。然后用二氯甲烷萃取水相， 干燥合并的有机 相， 过滤， 减压浓缩得到标题化合物 (13.4g)。 1
H NMR(CDCl3， 400MHz) ： δ0.2(2H， m)0.5， (2H， m)0.95(1H， m)2.2(2H， s， br)， 2.8(4H， br s)， 3.6(4H， br s)， 5.8(1H， m)7.2(4H， m)
E： 5-((4-(4-(3-( 环丙基甲基 ) 脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 噻吩 -2- 甲 酸甲酯
将 1-( 环丙基甲基 )-3-(4-( 哌嗪 -1- 羰基 ) 苯基 ) 脲 (4.25mmol， 1.286g)、 5-( 溴 甲基 ) 噻吩 -2- 甲酸甲酯 (4.25mmol， 1g) 和碳酸钾 (12.76mmol， 1.764g) 在室温在乙腈 (20mL) 中搅拌 18 小时。 减压浓缩该反应混合物， 将得到的残余物溶于二氯甲烷， 用水洗涤， + 用硫酸钠干燥， 真空浓缩， 得到标题化合物 (1.764g)。MS(ESI)m/z 457.5[M+H]
F： 5-((4-(4-(3-( 环丙基甲基 ) 脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 噻吩 -2- 甲 酸
合 并 5-((4-(4-(3-( 环 丙 基 甲 基 ) 脲 基 ) 苯 甲 酰 基 ) 哌 嗪 -1- 基 ) 甲 基 ) 噻 吩 -2- 甲酸甲酯 (3.86mmol， 1.764g) 和氢氧化钠 (3.86mmol， 0.155g)， 在甲醇中加热至回 流 18 小时。减压浓缩该反应混合物， 通过 SCX 柱色谱法纯化得到的残余物， 得到标题化合 物 (1.00g)。
MS(ESI)m/z 443.3[M+H]+
G： 5-((4-(4-(3-( 环丙基甲基 ) 脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 )-N- 叔 - 戊 基噻吩 -2- 甲酰胺
合 并 5-((4-(4-(3-( 环 丙 基 甲 基 ) 脲 基 ) 苯 甲 酰 基 ) 哌 嗪 -1- 基 ) 甲 基 ) 噻 吩 -2- 甲酸 (100mg， 0.226mmol)、 N， N- 二异丙基乙胺 (99mg， 0.127mL， 0.452mmol) 和叔 - 戊 基 胺 (39mg， 0.452mmol)， 在 二 氯 甲 烷 中 搅 拌。 加 入 1- 丙 烷 膦 酸 环 酐 (216mg， 0.202mL， 0.339mmol， 50％的乙酸乙酯溶液 )， 将该反应体系在室温搅拌 1 小时。 用饱和碳酸氢钠溶液 洗涤该反应混合物， 用硫酸钠干燥， 真空浓缩， 通过反相酸性制备型 HPLC 纯化， 得到标题化 + 合物 (5mg)。MS(ESI)m/z 512.8[M+H]
按照类似方式制备下列化合物 ：
6B ： N- 叔丁基 -5-((4-(4-(3-( 环丙基甲基 ) 脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲 基 ) 噻吩 -2- 甲酰胺
MS(ESI)m/z 498.5[M+H]+
实施例 7
N- 叔 丁 基 -3-((4-(4-(3- 环 丁 基 脲 基 )-3- 氟 苯 甲 酰 基 ) 哌 嗪 -1- 基 ) 甲 基 )-1H- 吡唑 -1- 甲酰胺
A： N- 叔丁基 -3- 甲基 -1H- 吡唑 -1- 甲酰胺向 在 二 氯 甲 烷 (30mL) 中 的 异 氰 酸 叔 丁 酯 (1.57mL， 1.34g， 13.70mmol) 中 加 入 3- 甲基 -1H- 吡唑 (0.98mL， 1g， 12.18mmol)。将该混合物在室温搅拌过夜， 然后真空浓缩。 通过硅胶色谱法纯化粗物质 ( 用二氯甲烷洗脱 ) 得到标题化合物 (2.1g)。 1
H NMR(CD3OD， 400MHz) ： δ1.46(9H， s)， 2.28(3H， s)， 6.14(2H， d)， 7.02(1H， br s)， 8.08(1H， d)
B： 3-( 溴甲基 )-N- 叔丁基 -1H- 吡唑 -1- 甲酰胺
在 四 氯 化 碳 (12mL) 中 的 N- 叔 丁 基 -3- 甲 基 -1H- 吡 唑 -1- 甲 酰 胺 (609mg， 3.36mmol) 中 加 入 N- 溴 琥 珀 酰 亚 胺 (849mg， 4.77mmol) 和 过 氧 化 苯 甲 酰 (114mg， 0.470mmol)。将该混合物加热至回流过夜， 然后用水和乙酸乙酯稀释。分离有机层， 干燥， 减压浓缩。通过硅胶色谱法纯化粗物质 ( 用于庚烷中的 10％乙酸乙酯洗脱 )， 得到标题化 合物 (280mg)。
H NMR(CDCl3， 400MHz) ： δ1.47(9H， s)， 4.43(2H， d)， 6.42(1H， d)， 6.99(1H， br s)， 8.14(1H， d)
C： 4-(4- 氨基 -3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 甲酸叔丁酯
1向搅拌的 4- 氨基 -3- 氟苯甲酸 (4.97g， 32.04mmol)、 哌嗪 -1- 甲酸叔丁酯 (5.97g， 32.04mmol) 和三乙胺 (10mL) 在二氯甲烷 (100mL) 中的溶液中加入 1- 丙烷膦酸环酐 (20mL， 50 ％的乙酸乙酯溶液， 滴加 )。将该反应混合物搅拌 1 小时， 然后用乙酸乙酯稀释， 用碳 酸钾 ( 水溶液 ) 洗涤， 干燥 ( 硫酸镁 )， 减压浓缩得到标题化合物 (9.5g)。MS(ESI)m/z ： + 324.5[M+H] 。
D： 4-(4-(3- 环丁基脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 甲酸叔丁酯
将 4-(4- 氨基 -3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 甲酸叔丁酯 (9.5g， 29.41mmol) 溶于二 氯甲烷 (100mL)， 加入 4- 硝基苯基氯甲酸酯 (5.93g， 29.41mmol)。将该反应混合物搅拌 20 小时， 加入环丁基胺 (7.5mL， 88.2mmol)。2 小时后， 对该反应混合物进行硅胶色谱 ( 用二氯 甲烷至二氯甲烷 / 乙酸乙酯洗脱 )， 得到标题化合物 (2.8g)。MS(ESI)m/z ： 421.0[M+H]+
E： 1- 环丁基 -3-(2- 氟 -4-( 哌嗪 -1- 羰基 ) 苯基 ) 脲
将 4-(4-(3- 环 丁 基 脲 基 )-3- 氟 苯 甲 酰 基 ) 哌 嗪 -1- 甲 酸 叔 丁 酯 (2.8g， 66.67mmol)、 三氟乙酸和二氯甲烷搅拌 20 小时， 然后减压浓缩。将残余物溶于二氯甲烷 / 甲醇， 上强阳离子交换柱， 用二氯甲烷 / 甲醇洗涤。用于甲醇中的 2M 氨洗脱柱， 得到标题化 + 合物 (1.6g)。MS(ESI)m/z ： 321.4[M+H]
F： N- 叔 丁 基 -3-((4-(4-(3- 环 丁 基 脲 基 )-3- 氟 苯 甲 酰 基 ) 哌 嗪 -1- 基 ) 甲 基 )-1H- 吡唑 -1- 甲酰胺
向在乙腈 (3.9mL) 中的 3-( 溴甲基 )-N- 叔丁基 -1H- 吡唑 -1- 甲酰胺 (102mg， 0.392mmol) 中加入 1- 环丁基 -3-(2- 氟 -4-( 哌嗪 -1- 羰基 ) 苯基 ) 脲 (126mg， 0.392mmol) 和三乙胺 (109μl， 79mg， 0.782mmol)。向该混合物中加入匙尖碘化钠。将该混合物加热至 回流过夜， 然后用水和乙酸乙酯稀释。分离有机层， 干燥， 减压浓缩。通过硅胶色谱法纯化 残余物， 用于二氯甲烷中的 2％甲醇洗脱。将残余物溶于二氯甲烷 / 甲醇， 上强阳离子交换 柱， 用二氯甲烷 / 甲醇洗脱。用于甲醇中的 2M 氨洗脱柱， 得到标题化合物 (44mg)。
MS(ESI)m/z 500.3[M+H]+ 实施例 8 N- 叔丁基 -4-((4-(4-(3- 环丁基脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 吡啶酰胺
A： N- 叔丁基 -4- 甲基吡啶酰胺合并 4- 甲基吡啶 -2- 甲酸 (500mg， 3.65mmol)、 三乙胺 (1.27g， 12.5mmol， 1.75mL) 和 叔 - 丁 基 胺 (267mg， 3.65mmol)， 在 二 氯 甲 烷 (10mL) 中 搅 拌。 滴 加 1- 丙 烷 膦 酸 环 酐 (4.82g， 7.5mmol， 4.5mL， 50％的乙酸乙酯溶液 )， 将该反应体系在室温搅拌 1 小时。减压浓 缩该反应混合物， 将得到的残余物溶于乙酸乙酯， 用饱和碳酸氢钠溶液洗涤， 用硫酸钠干燥 + 有机相， 真空浓缩， 得到标题化合物 (376mg)。MS(ESI)m/z 193.4[M+H]
B： 4-( 溴甲基 )-N- 叔 - 丁基吡啶酰胺
在氯苯 (5mL) 中合并 N- 叔丁基 -4- 甲基吡啶酰胺 (100mg， 0.52mmol) 和 N- 溴琥 珀酰亚胺 (46mg， 0.52mmol)， 在日光灯下搅拌 1 小时。减压浓缩该反应混合物。将得到的残 余物溶于二氯甲烷， 用水洗涤。用硫酸钠干燥有机相， 真空浓缩， 得到标题化合物 (120mg)。 + MS(ESI)m/z 271.5[M+H]
C： N- 叔丁基 -4-((4-(4-(3- 环丁基脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 吡啶酰胺
合 并 4-( 溴 甲 基 )-N- 叔 - 丁 基 吡 啶 酰 胺 (70mg， 0258mmol)、 1-( 环 丁 基 甲 基 )-3-(2- 氟 -4-( 哌 嗪 -1- 羰 基 ) 苯 基 ) 脲 (83mg， 0.258mmol) 和 碳 酸 钾 (106mg， 0.744mmol)， 在乙腈中加热至回流 1 小时。减压浓缩该反应混合物， 通过反相酸性制备型 HPLC 纯化得到的残余物， 得到标题化合物 (41mg)。MS(ESI)m/z 511.6[M+H]+
实施例 9
N- 叔丁基 -6-((4-(4-(3- 环丁基脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 吡 啶酰胺
A： 6-(( 甲基磺酰氧基 ) 甲基 ) 吡啶甲酸甲酯合 并 6-( 羟 基 甲 基 ) 吡 啶 甲 酸 酯 (200mg， 1.196mmol) 和 三 乙 胺 (363mg， 3.588mmol， 0.5mL)， 在 0℃在二氯甲烷 (2mL) 中搅拌。加入甲磺酰氯 (206mg， 1.794mmol)， 将该反应体系在 1 小时内温至室温。用水洗涤该反应体系， 用硫酸钠干燥， 真空浓缩， 得到 + 标题化合物 (293mg)。MS(ESI)m/z 246.3[M+H]
B： 6-((4-(4-(3- 环丁基脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 吡啶甲酸甲 酯
合 并 6-(( 甲 基 磺 酰 氧 基 ) 甲 基 ) 吡 啶 甲 酸 甲 酯 (300mg， 1.22mmol)、 1-( 环 丁 基甲基 )-3-(2- 氟 -4-( 哌嗪 -1- 羰基 ) 苯基 ) 脲 (391mg， 1.22mmol) 和碳酸钾 (505mg， 3.66mmol)， 在乙腈中搅拌 18 小时。减压浓缩该反应混合物。将得到的残余物溶于二氯甲 烷， 用水洗涤， 用硫酸钠干燥， 真空浓缩， 得到标题化合物 (407mg)。 +
MS(ESI)m/z 470.5[M+H]
C： 6-((4-(4-(3- 环丁基脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 吡啶甲酸钠
合并 6-((4-(4-(3- 环丁基脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 吡啶甲酸 甲酯 (400mg， 0.852mmol) 和氢氧化钠 (35mg， 0.852mmol)， 在甲醇中加热至回流 18 小时。 减 压浓缩该反应混合物， 得到标题化合物 (323mg)。
MS(ESI)m/z 456.5[M+H]+
D： N- 叔丁基 -6-((4-(4-(3- 环丁基脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 吡啶酰胺
合并 6-((4-(4-(3- 环丁基脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 吡啶甲酸钠 (100mg， 0.209mmol)、 三乙胺 (66mg， 0.693mmol， 0.091mL) 和叔 - 丁基胺 (32mg， 0.435mmol)， 在室温在二氯甲烷中搅拌。 滴加 1- 丙烷膦酸环酐 (208mg， 0.326mmol， 0.194mL， 50％的乙酸 乙酯溶液 )， 将该反应体系搅拌 1 小时。减压浓缩该反应混合物， 将得到的残余物溶于乙酸 乙酯， 用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。 用硫酸钠干燥有机相， 真空浓缩， 得到标题化合物 (24mg)。 + MS(ESI)m/z 511.6[M+H]
使用类似方法制备下列化合物 ：
9B ： N- 叔丁基 -6-((4-(3- 氟 -4-(3- 新戊基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 吡啶酰胺
MS(ESI)m/z 527.0[M+H]+
9C ： N- 叔丁基 -6-((4-(3- 氟 -4-(3- 异戊基脲基 ) 苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 吡啶酰胺
MS(ESI)m/z 527.0[M+H]+
9D ： N- 叔丁基 -6-((4-(4-(3-( 环丙基甲基 ) 脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 吡啶酰胺
MS(ESI)m/z 511.3[M+H]+
实施例 10
N- 叔丁基 -2-((4-(4-(3- 环丁基脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 异 烟酰胺
A： 2-(( 甲基磺酰氧基 ) 甲基 ) 异烟酸甲酯
将 2-( 羟基甲基 ) 异烟酸甲酯 (3.17mmol， 0.530g) 和三乙胺 (9.51mmol， 1.322mL， 0.963g) 在二氯甲烷 (20mL) 中在 0℃搅拌。 滴加甲磺酰氯 (4.76mmol， 0.368mL， 0.545g)， 将 该反应体系在室温搅拌 1 小时。用水洗涤该反应混合物， 用硫酸钠干燥， 真空浓缩， 得到标 题化合物 (686mg)。MS(ESI)m/z 246.4[M+H]+
B： 2-((4-(4-(3- 环丁基脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 异烟酸甲酯
合 并 2-( 甲 基 磺 酰 基 基 ) 异 烟 酸 甲 酯 (2.99mmol， 0.686g)、 1- 环 丁 基 -3-(2- 氟 -4-( 哌 嗪 -1- 羰 基 ) 苯 基 ) 脲 (2.99mmol， 0.959g) 和 碳 酸 钾 (8.98mmol， 1.241g)， 在乙腈 (20mL) 中加热至 40℃ 2 小时。 减压浓缩该反应混合物， 将残余物溶于二氯 甲烷。用硫酸钠干燥有机相， 真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化残余物 ( 用二氯甲烷至 6％甲 醇 / 二氯甲烷的溶剂梯度洗脱 )， 得到标题化合物 (822mg)。MS(ESI)m/z 470.5[M+H]+
C： 2-((4-(4-(3- 环丁基脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 异烟酸钠
将 2-((4-(4-(3- 环丁基脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 异烟酸甲酯 (1.746mmol， 0.82g) 和氢氧化钠 (1.746mmol， 0.070g) 在甲醇中 (20mL) 加热至回流 18 小 时。减压浓缩该反应混合物， 得到标题化合物 (798mg)。
MS(ESI)m/z 456.5[M+H]+
D： N- 叔丁基 -2-((4-(4-(3- 环丁基脲基 )-3- 氟苯甲酰基 ) 哌嗪 -1- 基 ) 甲基 ) 异烟酰胺
将 2-((4-(4-(3- 环 丁 基 脲 基 )-3- 氟 苯 甲 酰 基 ) 哌 嗪 -1- 基 ) 甲 基 ) 异 烟 酸 钠 (0.209mmol， 0.1g)、 叔 - 丁基胺 (0.419mmol， 0.088mL， 0.061g) 和三乙胺 (0.628mmol， 0.087mL， 0.064g) 在二氯甲烷 (10mL) 中搅拌。 加入 1- 丙烷膦酸环酐 (0.209mmol， 0.062mL， 0.067g， 50 ％的乙酸乙酯溶液 )， 将该反应体系在室温搅拌 1 小时。减压浓缩该反应混合 物。将残余物溶于乙酸乙酯， 用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。用硫酸钠干燥有机相， 真空浓 缩。通过反相酸性制备型 HPLC 纯化得到的残余物， 得到标题化合物 (35mg)。MS(ESI)m/z 511.6[M+H]+
实施例 11
使用重组人 LXRα 或 LXRβ 蛋白的放射性配体竞争结合闪烁迫近测定法 (SpA)
这些测定用它们与激动剂放射性配体 [3H]T0901317 的结合竞争的能力来评 价化合物的效力。这些测定使用与谷胱甘肽 -S- 转移酶 (GST) 标记的蛋白融合的肝 X 受 体 α(LXRα) 或 肝 X 受 体 β(LXRβ) 的 纯 化 的 配 体 结 合 域 (LBD)(LXRα-LBD-GST 和 LXRβ-LBD-GST) 和闪烁迫近测定法 (SpA) 技术， 以测定化合物在人核激素受体 LXRα 或 LXRβ 的配体结合域 (LBD) 处的结合亲和力 (pKi)。
重组人 LXRα 和 LXRβ 的制备
在大肠杆菌中将人 LXRα 和 LXRβ 表达为 GST- 融合蛋白。通过 PCR， 扩增 LXRα 或 LXRβ 的 LBD， 并亚克隆进原核表达载体 pGEX-4T-1(GEHealthcare)。来自 pGEX-4T-1 质 粒的 LXRα 或 LXRβ 在大肠杆菌中的表达， 导致重组谷胱甘肽 -S- 转移酶 (GST)LXRα-LBD 或 LXRβ-LBD 融合蛋白的产生。
培养含有 LXRα 或 LXRβ pGEX-4T-1 质粒的大肠杆菌， 诱导， 并通过离心进行收 获。将细菌沉淀物重新悬浮于裂解缓冲液中， 所述缓冲液含有 50mM 三 ( 羟甲基 ) 氨基甲 烷 (TRIS)-pH 8.0、 100mM 氯化钠 (NaCl)、 1mM 乙二胺四乙酸 (EDTA) 和 1 片完整的蛋白酶抑 制剂混合剂 / 不含 EDTA(Roche)( 每 50ml 缓冲液 )。用 Branson 超声波仪， 在冰上超声处 理混合物。将悬浮液离心， 并将二硫苏糖醇 (DTT) 加入上清液， 以得到 25mM 的终浓度。通 过 glutathione-Sepharose Fast flow(Amersham) 上的亲和色谱法， 从得到的上清液纯化 重组人 LXRα-LBD-GST 或 LXRβ-LBD-GST 蛋白， 并用含有谷胱甘肽的缓冲液 (50mMtris pH 8.0， 2mM DTT， 10mM 谷胱甘肽 ) 洗脱蛋白。在 -80℃在 20mMN-2- 羟乙基哌嗪 -N′ -2- 乙磺 酸 (HEPES)、 含有 10％甘油的 2mM DTT 中储存蛋白。
与 LXRα 或 LXRβ LBD 结合
对于 LXRα 或 LXRβ 测定， 将重组人 LXRα-LBD-GST 或 LXRβ-LBD-GST 蛋白的等分 部分稀释至 0.5μg/mL， 并在终体积为 100μL 的 SpA 缓冲液 (10mM 无水磷酸氢钾 [K2HPO4]、 10mM 磷酸二氢钾 [KH2PO4]、 2mM EDTA pH 7.1、 50mM NaCl、 1mM DTT、 2mM 3-[(3- 胆酰胺基丙 基 ) 二甲铵基 ]-1- 丙烷磺酸盐 (CHAPS)) 中温育， 所述 SpA 缓冲液含有终浓度为 1mg/mL 的 蛋白 -A 偶联的闪烁剂填充的 YtSi SpA 珠子 (GEHealthcare) 和终浓度为 5μg/ml 的山羊 抗 -GST 抗体 (GEHealthcare)。在每个测定中， 使用 T0901317(Kd ＝ 10nM) 作为参照。向测 3 定混合物中， 加入 50nM[ H]T0901317(50Ci/mmol)± 实验化合物， 并在平板振荡器上在 15℃ 温育混合物 2 小时。温育后， 在 PackardTopCount 上读出测定平板。在 LXRα 和 LXRβ 结 合测定中的 T0901317pKi 值是 ： pKi ＝ 8.4±0.2。浓度为 5μM 的 T0901317 用作最大结合 对照。在这些测定中， 活性化合物对 LXRα 和 / 或 LXRβ 表现出 pKi 值＞ 5.5， 且优选的化 合物对 LXRα 和 / 或 LXRβ 表现出 pKi 值＞ 7。
LXRα 和 LXRβ 反式激活测定
使用重组中国仓鼠卵巢 K1(CHO.K1) 细胞， 体外测量了对 LXRα 和 LXRβ 的细胞内 激动剂活性， 所述细胞稳定地表达含有天然雌激素效应元件 (ERE) 的萤光素酶报道基因构 建体和人雌激素受体 α(ERα)/LXRα 或 ERα/LXRβ 嵌合受体蛋白， 它们分别来自真核表 达构建体。ERα/LXRα 和 ERα/LXRβ 嵌合受体蛋白含有与人 ERα 受体 DNA 结合域 (DBD) 融合的人 LXRα 或人 LXRβ 受体 LBD。在这些测定中， 可以结合人 LXRα 或 LXRβ 受体的 LBD 的化合物能细胞内地激活嵌合受体蛋白。 在活化后， 通过在大鼠催产素启动子萤光素酶 构建体 (pROLUC) 中存在的天然 ERE， ERα DBD 可以诱导 ERE- 介导的萤光素酶表达。使用该系统， 产生了 LXRα 和 LXRβ 激动剂 - 诱导的萤光素酶测定， 使用 T0901317 作为激动剂 对照。
构建体
如下制备表达构建体 ： 通过将人 LXRα 或人 LXRβ cDNA 的配体结合域 (LBD) 插 入到人 ERα 转录因子 DNA 结合域 (DBD) 附近， 建立 pNGV1.ERαDBD-LXRαLBD 和 pNGV1. ERαDBD-LXRβLBD。pNGV1 哺乳动物表达构建体 (EMBL 核苷酸序列数据库文件 ASPNGV1， 登记号 X99274) 携带新霉素 (G418) 选择标记。使用大鼠催产素启动子 (RO) 的 ERα 效 应元件， 产生启动子构建体 pROLUC， 其含有置于萤光素酶报告基因附近的 ERα 效应元 件 (ERE) 的几个拷贝。启动子构建体的构建是基于 RO 启动子区 ( 位置 -363/+16)， 将其 作为 HindIII/MboI 限制性酶片段切离， 并连接到编码萤火虫萤光素酶的序列上 ( 参见 Ivell 和 Richter.， ProcNatl Acad Sci USA.7 ： 2006-2010(1984))。在转染并使用新霉 素选择阳性表达克隆后， 制备表达与 pROLUC 组合的 pNGV1.ERαDBD-LXRαLBD 或 pNGV1. ERαDBD-LXRβLBD 的稳定 CHO.K1 细胞系。基于响应 3μM T0901317 的激动剂窗和高达 20 代的响应稳定性， 选择最好的细胞系 (CHO.K1 LXRα 和 CHO.K1 LXRβ)。
实验化合物在 LXRα 和 LXRβ 反式激活测定中的激动剂活性
对 于 LXRα 和 LXRβ 反 式 激 活 测 定， 分 别 将 CHO.K1LXRα 或 CHO.K1LXRβ 细 胞 以 25000 细胞 / 孔的密度接种到在 37 ℃在 5 ％ CO2 控湿气氛下的 96 孔平板内的 200μl Dulbecco 氏改良的伊格尔培养基 ( 不含酚红 ) 中， 所述培养基含有 5％炭处理过的小牛血 清。接种后 6 小时， 通过在一定的浓度范围内温育细胞 16 小时， 表征化合物。在每个测定 中， 将浓度为 3μM 的 T0901317 用作最大激动剂对照。使用萤光素酶测定试剂盒 (Perkin Elmer)， 测定萤光素酶活性。 通过将裂解缓冲液加入每个孔中， 并使用 Packard Topcount 读 数器测量光发射， 开始萤光素酶活性的测定。T0901317 在 LXRα 和 LXRβ 反式激活测定中 的 pEC50 值分别是 ： pEC50 ＝ 7.3±0.2 和 7.4±0.2。 将实验化合物的激动剂活性与最大激动 剂对照进行对比。使用这些测定方法证实了本发明的优选化合物具有 LXRα 和 / 或 LXRβ 激动剂活性。29