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用于制备基本上立体异构纯的稠合二环脯氨酸化合物的生 物催化方法
     1. 技术领域 本公开内容涉及基本上立体异构纯的结构式 II 至 VII 的稠合二环脯氨酸化合物：
     其中 A、 M、 M’ 和 R5 如本文所描述的 ； 涉及用于它们制备的生物催化方法 ； 并且涉 及那些方法中使用的生物催化酶。
     2. 序列表、 表格或计算机程序的引用
     根 据 37C.F.R.§1.821 以 计 算 机 可 读 形 式 (CRF) 同 时 电 子 提 交 的 文 件 名 为 CX2-020WO01.txt 的 “序列表” 通过引用并入本文。序列表的电子副本是在 2009 年 6 月 23 日创建的， 文件大小为 110 千字节。
     3. 背景
     二 环 脯 氨 酸 类 似 物 用 于 拟 肽 药 物 (peptidomimetic drug) 的 发 现 和 开 发。(A.Trabocchi 等 人 (2008)Amino Acids(2008)34 ： 1-24)。 丙 型 肝 炎 病 毒 蛋 白 酶 抑 制 剂 boceprevir(SCH 505034 ； ((1R， 2S， 5S)-N-(4- 氨 基 -1- 环 丁 基 -3， 4- 二 氧 代 丁 -2- 基 )-3-((S)-2-(3- 叔 丁 基 脲 基 )-3， 3- 二 甲 基 丁 酰 基 )-6， 6- 二 甲 基 -3- 氮 杂 二 环 [3.1.0] 己 烷 -2- 甲 酰 胺 )(Malcolm 等 人 (2006)Antimicrob.Agents Chemother.50(3) ： 101320)， 和 telaprevir(VX 950 ； N-((S)-1- 环 己 基 -2-((S)-1-((1S， 3aR， 6aS)-1-((R)-3-(2-( 环 丙 氨 基 )-2- 氧 代 乙 酰 基 ) 己 酰 基 ) 六 氢 环 戊 [c] 吡 咯 -2(1H)- 基 )-3， 3- 二甲基 -1- 氧代丁 -2- 基氨基 )-2- 氧代乙基 ) 吡嗪 -2- 甲酰胺 ) (Perni 等人 (2006)Antimicrob.Agents Chemother.50(3) ： 899909)。
     Boceprevir 和 telaprevir 分别是由下面所显示的顺 - 稠合二环 L- 脯氨酸类似物 (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 羧酸和 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸的酯制备的 ：
     WO 2000/20824 和 WO 2000/218369 描述了包括对应于结构式 VI 的各种稠合二环 L- 脯氨酸类似物的大量其他丙型肝炎蛋白酶抑制剂。
     尽管已经报道了使用有机化学的方法和工具合成这种复杂分子的方法， 但是那些 合成通常是多步的、 复杂的、 昂贵的、 低效的、 总产率低的方法。
     Wu 等人 (WO 2007/075790) 公开了由相应的结构式 (1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮 杂二环 [3.1.0] 己烷的对称 ( 非手性 ) 二环胺制备二环脯氨酸类似物 (1R， 2S， 5S)-6， 6- 甲 基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 羧酸的甲基酯， 由所述二环胺氧化为相应的如下结构式 的外消旋亚胺开始 ：
     随后外消旋亚胺与氰化物反应得到如下结构式的外消旋氨基腈 ：
     然后该外消旋氨基腈与酸和甲醇反应得到如下结构式的外消旋氨基酸甲酯 ：最后， 通过非对映体盐拆分来分离这些 (1R， 2S， 5S)( 不期望的 ) 和 (1S， 2R， 5R) ( 期望的 ) 立体异构的甲基酯， 形成具有前一对映体的二 - 对甲苯基 -D- 酒石酸盐或具有后 一对映体的二 - 对甲苯基 -L- 酒石酸酒石酸盐。
     Tanoury 等人 (WO 2007/022459) 公开了如下从相应的对称 ( 非手性 ) 二环胺合成 外消旋 ( 叔丁氧基羰基 ) 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸 ： 制备 N-Boc 衍生物， 并使其在存在多 于化学计量的大量二胺螯合物存在下与引火剂仲丁基锂反应， 然后与二氧化碳反应以制备 如下所描绘的外消旋 N-Boc 氨基酸， 所述反应全部都在低于 -70℃下进行 ：
     然后使用诸如 S-1- 氨基四氢萘的单对映体手性碱通过非对映体盐拆分分离这些 外消旋 Boc- 酸的 (1R， 2S， 5S)( 不期望的 ) 和 (1S， 2R， 5R)( 期望的 ) 立体异构体。
     尽管通过这些方法获得了氨基酸衍生物的期望立体异构体， 但是这些二环脯氨酸 类似物的对映体混合物的拆分固有地包括了用于制备外消旋混合物的所有材料 ( 例如， 原 料、 试剂、 溶剂、 催化剂 ) 中至少一半的浪费。
     还已经报道了氨基酸 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸及其酯的化学 合成的其他方法， 所述方法包括 (i)N- 乙酰基 -3- 氮杂二环 [3.3.0] 辛烷的阳极氧化 (EA 00090362) 和 (ii) 噻唑内鎓盐方法 (Letters in Drug Design &Discovery(2005)2(7) ： 497502) ； J.Org.Chem.1994， 59， 2773-8)。
     由结构式 I((1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 ) 的相应的对称 ( 非 手性 ) 二环胺不对称地制备结构式 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸及其结构式 V 的酯的氨基酸的方法避免了形成外消旋混合物和随后分离对映体的需要， 该方法与上面 所描述的基于拆分的方法相比可能更有效、 浪费更少并且更加有成本效率。
     已经使用单胺氧化酶经由用氧将一种对映体立体特异性地氧化为相应的亚胺而 拆分和去外消旋化 (deracemize) 外消旋手性胺。 已经报道了黑曲霉 (Aspergillus niger)
     的 黄 素 依 赖 性 单 胺 氧 化 酶 的 衍 生 物 (MAO N)(Shilling 等 人 (1995)Biochim.Biophys. Acta.1243 ： 52937) 可与非特异性化学还原剂组合用于去外消旋化 (d/l)α 甲基苄胺以提 供对映体纯的 (93 ％ ee)(d)α 甲基苄胺 (Alexeeva 等人 (2002)Angew.Chem.Int.Ed.41 ： 3177-3180)。黑曲霉的黄素依赖性单胺氧化酶的衍生物还用于去外消旋化 (R/S)-2- 苯基 吡咯烷以提供对映体纯的 (98％ ee)(R)-2- 苯基吡咯烷 (Carr 等人 (2005)， ChemBioChem 6： 63739 ； Gotor 等 人 “EnantioselectiveEnzymatic Desymmetrization in Organic Synthesis( 有机合成中的对映体选择性酶促去对称化 )， ” Chem.Rev.(2005)105 ： 313-54)。
     因此， 期望的是不仅提供基本上对映体纯的手性化合物， 尤其是可用作合成中间 体的手性胺化合物， 而且还提供用于它们的不对称合成的有效的、 可放大的生物催化方法。 因此， 还期望的是提供可用于那些生物催化方法中的酶。
     4. 概述
     本公开内容提供基本上立体异构纯的结构式 II(a) 的二环亚胺化合物 ( 及其结构 式 II(b) 的二聚体 )， 该化合物尤其可用作合成立体异构性被限定的治疗剂的新颖中间体 ：
     包括其盐和水合物， 其中 A 是 O、 CR1R2、 -C ＝ C- 或 -CH2-CH2-， 其中 R1 和 R2 各自独 立地选自 -H、 -COOH、 -X、 -NH2、 -CH2NHC(NH)NH2、 -CX3、 -CH3、 -CH2CH3， 并且其中 X 选自 F、 Cl 和 Br。M 和 M’ 二者可以都存在或者可以都不存在， 并且当 M 和 M’ 二者都存在时， M 和 M’ 是相 同的并且选自 O 和 CR3R4， 其中 R3 和 R4 是 H， 或者 M 的 R3 或 R4 和 M’ 的 R3 或 R4 形成亚甲基 桥接， 条件是 ： (a) 当 M 和 M’ 是 O 时， A 不是 O ； 并且当 A 是 O 时， M 和 M’ 不是 O ； (b) 当 M 和 M’ 是 CR3R4 时， A 可以是 -CH ＝ CH- 或 -CH2-CH2- ； 并且 (c) 当 M 和 M’ 是 CR3R4 并且具有一个 或多个立体中心时， M 和 M’ 的立体中心具有相反的立体化学性。
     本公开内容还提供基本上对映体纯的根据结构式 III(a) 和结构式 III(b) 的氨基 磺酸盐化合物， 其尤其可用作合成对映体异构性被限定的治疗剂的新颖中间体 ：
     包括其盐和水合物， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。
     此外， 本公开内容提供了基本上对映体纯的结构式 IV(a) 的氨基腈化合物， 该化 合物可用作合成立体异构性被限定的治疗剂的新颖中间体。基本上对映体纯的结构式
     IV(a) 的反式氨基腈化合物还可以提供为包含基本上对映体纯的结构式 IV(b) 的顺式氨基 腈化合物的混合物，
     包括其盐和水合物， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。
     本公开内容提供任选被保护的基本上对映体纯的结构式 V 的化合物， 该化合物尤 其可用作合成对映体异构性被限定的治疗剂的中间体 ：
     包括其盐和水合物， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述， 并且其中 R5 选自由下列组成 的组 ： 保护基团 ( 例如， 苄基或三甲基甲硅烷基以及类似基团 )、 -(C1-C2) 烷基、 -(C1-C3) 烷 5 基、 -(C1-C4) 烷基和 -(C1-C6) 烷基。在某些非限制性实施方案中， R 是甲基、 乙基或叔丁基。
     本公开内容还提供任选被保护的基本上对映体纯的结构式 V(b) 的化合物 ( 对应 于结构式 V 的化合物的顺式对映体 ) ：
     包括其盐和水合物， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述， 并且其中 R5 选自由下列组成 的组 ： 保护基团 ( 例如， 苄基或三甲基甲硅烷基以及类似基团 )、 -(C1-C2) 烷基、 -(C1-C3) 烷 5 基、 -(C1-C4) 烷基和 -(C1-C6) 烷基。在某些非限制性实施方案中， R 是甲基、 乙基或叔丁基。
     本公开内容还提供基本上对映体纯的羧基取代的结构式 VI 的化合物， 该化合物 尤其可用作合成对映体异构性被限定的治疗剂的中间体 ：
     包括其盐和水合物， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。 本公开内容还提供任选被保护的基本上对映体纯的结构式 VI(b) 的化合物 ( 对应于结构式 VI 的化合物的顺式对映体 ) ：
     包括其盐和水合物， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。
     此外， 本公开内容还提供基本上对映体纯的结构式 VII 的化合物， 该化合物尤其 可用作合成对映体异构性被限定的治疗剂的中间体 ：
     包括其盐和水合物， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。
     本公开内容还提供任选被保护的基本上对映体纯的结构式 VII(b) 的化合物 ( 对 应于结构式 VII 的化合物的顺式对映体 ) ：
     包括其盐和水合物， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。
     因此， 在具体的实施方案中， 本公开内容提供可用作合成一种或多种治疗剂的中 间体的下列稠合二环脯氨酸化合物， 以及用于合成至少下列稠合二环脯氨酸化合物的生物 催化方法 ：
     本公开内容提供可用作合成一种或多种治疗剂的中间体的下列稠合二环脯氨酸化合物， 以及用于合成至少下列稠合二环脯氨酸化合物的生物催化方法 ：
     在其他具体实施方案中， 本公开内容提供可用作合成一种或多种治疗剂的中间体 的下列化合物， 以及用于合成这些化合物的生物催化方法 ：
     因此， 本公开内容提供可用作合成一种或多种治疗剂的中间体的稠合二环脯氨酸 化合物， 以及用于合成这些稠合二环脯氨酸化合物的生物催化方法 ：
     本公开内容还提供用于生物催化合成基本上立体异构纯的结构式 II 至 VII 的化 合物的方法。在一个实施方案中， 本公开内容提供制备基本上立体异构纯的根据结构式 II 的亚胺化合物的方法， 所述化合物包括其盐， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述的。所述方法包 括使根据结构式 I 的对称 ( 非手性 ) 二环胺化合物
     其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述， 在辅因子的存在下在其中单胺氧化酶将结构式 I 的 胺化合物氧化为相应的结构式 II(a) 的亚胺化合物、 其式 II(b) 的二聚体和它们的混合物 的条件下与氧和单胺氧化酶接触。在某些实施方案中， 辅因子选自由下列组成的组 ： FAD、 FMN、 NADP 和 NAD。在具体的实施方案中， 辅因子是 FAD。在某些实施方案中， 反应混合物还 包含可用于促进将单胺氧化酶催化的反应的过氧化氢副产物歧化为分子氧和水的组分， 如 在方案 2( 下文 ) 中描绘的。在某些实施方案中， 该组分选自例如但不限于 Pd 和 Fe 以及类 似物的化学剂中， 而在其他实施方案中， 该组分是酶， 例如酶过氧化氢酶。在具体的实施方 案中， 反应混合物还包含酶过氧化氢酶， 所述过氧化氢酶催化方案 2 中所描绘的将过氧化 氢 (H2O2) 分解为分子氧和水的歧化反应。
     在某些实施方案中， 能够将结构式 I 的胺化合物氧化为相应的结构式 II(a) 的亚 胺化合物的单胺氧化酶由曲霉属 (Aspergillus) 的物种获得。在具体的实施方案中， 单 胺氧化酶是黑曲霉单胺氧化酶， 而在其他实施方案中， 单胺氧化酶是米曲霉 (Aspergillus oryzae) 单胺氧化酶。 在任一情况下， 单胺氧化酶可以从相应的曲霉属物种纯化或者可以作 为在异源宿主中表达的重组蛋白分离， 所述异源宿主例如但不限于大肠杆菌 (E.coli.)。
     在另一实施方案中， 能够将结构式 I 的胺化合物氧化为相应的结构式 II(a) 的亚 胺化合物的单胺氧化酶包含多于一种单胺氧化酶的部分， 例如包含黑曲霉单胺氧化酶的氨 基端部分和米曲霉单胺氧化酶的羧基端部分的融合蛋白或杂合蛋白。在具体的实施方案 中， 单胺氧化酶是 495 个氨基酸的蛋白 (SEQ ID NO ： 6)， 其中氨基端的 314 个氨基酸对应于 黑曲霉的氨基端的 314 个氨基酸 (SEQ ID NO ： 2)， 并且羧基端的 181 个氨基酸对应于米曲 霉的羧基端的 181 个氨基酸 (SEQ ID NO ： 32)。在其他具体实施方案中， 单胺氧化酶是选自 下列的 SEQ ID NO ： 6 的 495 个氨基酸的蛋白的衍生物 ： SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ IDNO ： 18、 SEQ ID NO ： 20 和 SEQ ID NO ： 36， 它们的每一个携 带与 SEQ IDNO ： 6 的氨基酸序列相比的至少一个氨基酸取代。
     在某些实施方案中， 能够将结构式 I 的胺化合物氧化为相应的结构式 II(a) 的亚 胺化合物的单胺氧化酶衍生自 SEQ ID NO ： 2 的曲霉属单胺氧化酶并且与 SEQ ID NO ： 2 的黑 曲霉单胺氧化酶的氨基酸序列相比具有两个或更多个氨基酸取代。在具体的实施方案中， 能够将结构式 I 的胺化合物氧化为相应的结构式 II 的亚胺化合物的单胺氧化酶包含 SEQ ID NO ： 4 或 SEQID NO ： 8 的氨基酸序列。
     在其他实施方案中， 能够将结构式 I 的胺化合物氧化为相应的结构式 II(a) 的亚 胺化合物的单胺氧化酶是融合蛋白， 其中氨基端氨基酸序列衍生自第一曲霉单胺氧化酶， 而羧基端氨基酸序列衍生自另一曲霉单胺氧化酶的氨基酸序列。在某些非限制性实施方 案中， 这种融合蛋白的氨基端和羧基端部分二者可以独立地选自由下列组成的组之中 ： SEQ ID NO ： 22、 SEQID NO ： 24、 SEQ ID NO ： 26、 SEQ ID NO ： 28、 SEQ ID NO ： 30、 SEQ ID NO ： 32 和 SEQ ID NO ： 34。在具体的实施方案中， 融合蛋白的氨基端部分衍生自 SEQ ID NO ： 32 的蛋
     白， 而融合蛋白的羧基端部分衍生自 SEQ ID NO ： 2 的蛋白。
     在某些实施方案中， 本公开内容提供制备根据结构式 III(a) 或 III(b) 的氨基磺 酸盐化合物的方法， 所述化合物包括其盐和水合物， A、 M 和 M’ 如上文所描述的。这些方法 包括使根据结构式 I 的对称二环胺化合物在产生氨基磺酸盐 ( 亚胺 - 亚硫酸氢盐加成物 ) 化合物的条件下与氧、 单胺氧化酶和亚硫酸氢盐接触， A、 M 和 M’ 如上文所述。在具体的实 施方案中， 氧化反应混合物还包含酶过氧化氢酶。
     本公开内容还提供制备基本上立体异构纯的根据结构式 IV(a) 的氨基腈化合物 的方法， 所述化合物包括其盐和水合物， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。该方法包括使根据 结构式 I 的对称二环胺化合物与氧、 单胺氧化酶和亚硫酸氢盐接触， 随后在产生氨基腈化 合物的条件下与氰化物接触， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所述。在具体的实施方案中， 氧化反应 混合物还包含酶过氧化氢酶。
     本公开内容提供制备基本上立体异构纯的根据结构式 IV 的氨基腈化合物的方 法， 所述化合物包括其盐， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。该方法包括使根据结构式 I 的对 称二环胺化合物与氧、 单胺氧化酶接触形成结构式 II(a) 的亚胺、 其结构式 II(b) 的二聚体 或它们的混合物， 随后在产生氨基腈化合物的条件下与氰化物接触， 其中 A、 M 和 M’ 如上文 所述。在具体的实施方案中， 氧化反应混合物还包含酶过氧化氢酶。
     本公开内容还提供制备基本上立体异构纯的根据结构式 VI 的氨基酸化合物的方 法， 所述化合物包括其盐， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述， 所述方法是由结构式 II(a) 的化合 物 ( 或结构式 II(b) 的化合物 ) 开始的， 或者由结构式 IV(a) 氨基腈化合物开始。所述方 法包括在其中氨基腈化合物转化为结构式 VI 的氨基酸化合物的条件下使基本上立体异构 纯的根据结构式 IV 的氨基腈化合物与酸和水接触， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。
     本公开内容还提供制备基本上立体异构纯的根据结构式 VI 的氨基酸化合物的方 法， 所述化合物包括其盐和共晶 ( 例如， NH4Cl)， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。该方法包括 使根据结构式 I 的对称 ( 非手性 ) 胺化合物与氧、 单胺氧化酶接触， 随后在适于产生基本上 立体异构纯的根据结构式 IV 的氨基腈化合物的条件下与氰化物接触， 其中 A、 M 和 M’ 如上 文所述。在某些实施方案中， 氧化反应混合物还包含酶过氧化氢酶。在氨基腈化合物转化 为结构式 VI 的氨基酸化合物的条件下使如此形成的氨基腈化合物与酸和水接触。
     本公开内容还提供制备基本上立体异构纯的根据结构式 VI 的氨基酸化合物的方 法， 所述化合物包括其盐和共晶 ( 例如， NH4Cl)， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。该方法包括 使根据结构式 I 的对称 ( 非手性 ) 胺化合物与氧、 单胺氧化酶和亚硫酸氢盐接触， 随后在适 于产生基本上对映体纯的根据结构式 IV 的氨基腈化合物的条件下与氰化物接触， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所述。在某些实施方案中， 氧化反应混合物还包含酶过氧化氢酶。在其中氨基 腈化合物转化为结构式 VI 的氨基酸化合物的条件下使如此形成的氨基腈化合物与酸和水 接触。在其他实施方案中， 在氨基腈化合物转化为结构式 V 的氨基酯化合物的条件下使如 此形成的氨基腈化合物与酸和醇接触。
     此外， 本公开内容提供使用本文所公开的新颖的化合物和新颖的方法制备基本上 立体异构纯的被保护的根据结构式 V 的氨基酸化合物的方法， 所述化合物包括其盐， 其中 5 A、 M、 M’ 和 R 如上文所描述， 所述新颖的方法包括生物催化方法。所述方法包括在其中氨 基腈化合物转化为结构式 V 的氨基酸酯化合物的条件下使基本上立体异构纯的根据结构式 IV 的氨基腈化合物与酸和醇接触， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。
     本公开内容还提供使用本文所公开的新颖的化合物和新颖的方法制备基本上对 映体纯的根据结构式 VI 的氨基酸化合物的方法， 所述化合物包括其盐， 其中 A、 M、 M’ 如上文 所描述， 所述新颖的方法包括生物催化方法。所述方法包括在其中氨基腈化合物转化为结 构式 VI 的氨基酸化合物的条件下使基本上对映体纯的根据结构式 IV 的氨基腈化合物与酸 ( 例如， HCl) 接触， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。
     本公开内容还提供制备基本上对映体纯的根据结构式 VI 的氨基酸化合物的方 法， 所述化合物包括其盐和共晶 ( 例如， NH4Cl)， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。该方法包括 使根据结构式 I 的胺化合物与氧和单胺氧化酶以及 NaHSO3 接触， 随后在适于产生基本上对 映体纯的根据结构式 IV 的氨基腈化合物的条件下与氰化物接触， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所 述。在某些实施方案中， 反应混合物还包含酶过氧化氢酶。在其中氨基腈化合物转化为结 构式 VI 的氨基酸化合物的条件下使如此形成的氨基腈化合物与 HCl 接触。
     此外， 本公开内容提供使用本文所公开的新颖的化合物和新颖的方法制备基本上 对映体纯的根据结构式 V 的氨基酸酯化合物的方法， 所述化合物包括其盐， 其中 A、 M、 M’ 和 5 R 如上文所描述， 所述新颖的方法包括生物催化方法。所述方法包括在其中氨基腈化合物 转化为结构式 V 的氨基酯化合物的条件下使基本上对映体纯的根据结构式 IV 的氨基腈化 合物与酸 ( 例如， HCl) 和醇接触， 其中 A、 M、 M’ 如上文所描述。
     本公开内容还提供制备基本上对映体纯的根据结构式 VII 的氨基酰胺化合物的 方法， 所述化合物包括其盐， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。所述方法包括使根据结构式 I 的胺化合物与氧和单胺氧化酶和任选的过氧化氢酶和亚硫酸氢盐接触， 随后在适于产生基 本上对映体纯的根据结构式 IV 的氨基腈化合物的条件下与氰化物接触， 其中结构式 I 中的 A、 M、 M’ 如上文所描述， 结构式 IV 中的 A、 M、 M’ 如上文所描述， 并然后在氨基腈化合物可以 转化成结构式 VII 的氨基酸酰胺化合物的条件下使所述氨基腈化合物与 HCl 和水接触。
     能够将结构式 I 的胺化合物氧化为相应的结构式 II 的亚胺化合物的本公开内容 的单胺氧化酶与 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 32 和 SEQ ID NO ： 6 的氨基酸序列相比具有一个 或多个氨基酸取代。这种氨基酸取代为单胺氧化酶提供了一种或多种改良的特性， 包括酶 活性增加、 立体选择性增加、 热稳定性增加、 溶剂稳定性增加、 产物抑制降低、 底物抑制降低 或对反应副产物的敏感性降低。 这种氨基酸取代还可以改善单胺氧化酶在宿主细胞中的溶 解性、 稳定性和表达水平， 例如作为在异源宿主细胞中重组表达的蛋白， 所述异源宿主细胞 例如但不限于大肠杆菌宿主细胞。
     本公开内容还提供编码这种单胺氧化酶的多核苷酸和在所公开的生物催化方法 中使用多肽的方法。
     在一些实施方案中， 本说明书中公开的单胺氧化酶与 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 32 或 SEQ ID NO ： 6 的酶相比在它们的酶活性速率， 即将结构式 I 的胺化合物转化为相应的结 构式 II 的亚胺化合物的速率方面是有所改善的。在一些实施方案中， 所公开的单胺氧化酶 能够以下列速率将底物转化为产物 ： SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 32 或 SEQ ID NO ： 6 的单胺氧 化酶所表现的速率的至少 1.5- 倍、 2- 倍、 3- 倍、 4- 倍、 5- 倍、 10- 倍、 25- 倍、 50- 倍、 100- 倍、 或大于 100- 倍。具有这种特性的示例性多肽包括但不限于包含对应于 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 SEQID NO ： 20 和 SEQ IDNO ： 36 的氨基酸序列的多肽。
     在一些实施方案中， 本文公开的单胺氧化酶能够将结构式 I 的胺化合物转化为相 应的结构式 II 的亚胺化合物， 其中对映体过量百分比为至少约 95％。 具有这种特性的示例 性多肽包括但不限于包含对应于 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ IDNO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ ID NO ： 20 和 SEQ ID NO ： 36 的氨基 酸序列的多肽。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶基于 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ IDNO ： 16、 SEQ ID NO ： 18 和 SEQ ID NO ： 20 的序列式， 并且可以包含与所述序列式至少约 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 或 99％相同的氨基酸序列。 这些差异可以是 一个或多个氨基酸插入、 缺失、 取代或这些改变的任何组合。在一些实施方案中， 氨基酸序 列差异可以包含非保守的、 保守的以及非保守的和保守的氨基酸取代的组合。本文描述了 可以进行这些改变的各种氨基酸残基位置。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO.6 的残基 99 和 SEQ ID NO ： 32 的残基 97 的氨基酸谷氨酰胺被酸性氨基酸 即天冬氨酸或谷氨酸取代的氨基酸序列。在具体的实施方案中， 该谷氨酰胺残基被谷氨酸 残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO.6 的残基 365 和 SEQ ID NO ： 32 的残基 363 的氨基酸酪氨酸被不同的芳族 氨基酸即苯丙氨酸或色氨酸氨酸保守地取代的氨基酸序列。在具体的实施方案中， 该酪氨 酸残基被色氨酸残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO.6 的残基 382 和 SEQ ID NO ： 32 的残基 380 的氨基酸苯丙氨酸被非极性氨 基酸即缬氨酸、 异亮氨酸、 丙氨酸、 甘氨酸、 蛋氨酸或亮氨酸取代的氨基酸序列。 在具体的实 施方案中， 该苯丙氨酸残基被亮氨酸残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO.6 的残基 465 和 SEQ ID NO ： 32 的残基 463 的氨基酸丝氨酸被非极性氨基 酸即缬氨酸、 异亮氨酸、 丙氨酸、 蛋氨酸、 亮氨酸或甘氨酸取代的氨基酸序列。 在具体的实施 方案中， 该丝氨酸残基被甘氨酸残基取代。
     在其他实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO.6 的残基 135 的氨基酸苏氨酸被另一极性氨基酸即丝氨酸、 谷氨酰胺或天冬 酰胺保守地取代的氨基酸序列。 在具体的实施方案中， 该苏氨酸残基被谷氨酰胺残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO.6 的残基 284 的氨基酸天冬酰胺被酸性氨基酸即天冬氨酸或谷氨酸取代的 氨基酸序列。在具体的实施方案中， 该天冬酰胺残基被谷氨酸残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 的残基 289 的氨基酸被另一非极性氨基酸即甘氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸或蛋氨酸 保守取代的氨基酸序列。在具体的实施方案中， 该丙氨酸残基被缬氨酸残基取代。
     在其他实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ：2 的残基 384 的氨基酸赖氨酸被另一极性氨基酸即丝氨酸、 苏氨酸或谷氨酰胺保守地取代 的氨基酸序列。在具体的实施方案中， 该赖氨酸残基被谷氨酰胺残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶是如下的单胺氧化酶 ： 其为 黑曲霉单胺氧化酶 (SEQ ID NO ： 2) 的同源物或米曲霉单胺氧化酶 (SEQ ID NO ： 44) 的同源 物并且携带对应于本文所公开的那些氨基酸取代的一个或多个氨基酸取代。 示例性同源物 包括单胺氧化酶 SEQ IDNO ： 22、 SEQ ID NO ： 24、 SEQ ID NO ： 26、 SEQ ID NO ： 28、 SEQ ID NO ： 30、 SEQ ID NO ： 32 和 SEQ ID NO ： 34。在其他实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶 是选自下列序列的酶并且携带对应于本文所公开的那些氨基酸取代的一个或多个氨基酸 取代的单胺氧化酶 ： SEQ ID NO ： 22、 SEQ IDNO ： 24、 SEQ ID NO ： 26、 SEQ ID NO ： 28、 SEQ ID NO ： 30、 SEQ ID NO ： 32 和 SEQ ID NO ： 34。
     在另一方面， 本公开内容提供编码本文所述的工程化单胺氧化酶的多核苷酸或在 高度严格条件下与这种多核苷酸杂交的多核苷酸。 所述多核苷酸可以包含启动子和可用于 表达编码的工程化单胺氧化酶的其他调节元件， 并且所述多核苷酸可以利用被优化用于特 定的期望表达系统的密码子。示例性多核苷酸包括但不限于 SEQ ID NO ： 1、 SEQ ID NO ： 5、 SEQ IDNO ： 7、 SEQ ID NO ： 9、 SEQ ID NO ： 11、 SEQ ID NO ： 13、 SEQ ID NO ： 15、 SEQ ID NO ： 17、 SEQ ID NO ： 19、 SEQ ID NO ： 31 和 SEQ ID NO ： 35。 在另一方面， 本公开内容提供包含本文所述的多核苷酸和 / 表达载体的宿主细 胞。所述宿主细胞可以是曲霉属的细胞， 例如黑曲霉、 米曲霉或构巢曲霉 (Aspergillus nidulans)， 或者它们可以是不同的生物体， 例如大肠杆菌或酿酒酵母 (S.cerevisiae)。宿 主细胞可用于表达和分离本文所描述的工程化单胺氧化酶， 或者可选地， 它们可直接用于 将底物转化为立体异构的产物。
     无论是用全细胞、 细胞提取物还是纯化的单胺氧化酶进行方法， 均可以使用单一 的单胺氧化酶， 或者可选择地， 可以使用两种或更多种单胺氧化酶的混合物。
     本文所述的单胺氧化酶能够催化结构式 I 的化合物氧化为结构式 II(a) 的化合 物：
     在 具 体 的 实 施 方 案 中， 本 文 所 述 的 单 胺 氧 化 酶 能 够 催 化 (1R， 5S)-6， 6- 二 甲 基 -3- 氮 杂 二 环 [3.1.0] 己 烷， 化 合 物 (1) 氧 化 为 (1R， 5S)-6， 6- 二 甲 基 -3- 氮 杂 二 环 [3.1.0] 己 -2- 烯， 化合物 (2) ：
     在另一具体实施方案中， 本文所述的单胺氧化酶能够催化 (3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (3) 氧化为 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (4) ：在将结构式 I 的化合物氧化为结构式 II(a) 的化合物的方法的一些实施方案中， 底物被氧化为大于约 99％立体异构体过量的产物， 其中单胺氧化酶包含对应于 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 6、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ IDNO ： 20、 或 SEQ ID NO ： 36 的序列。
     在将结构式 I 的化合物氧化为结构式 II(a) 的化合物的这种方法的一些实施方案 中， 用约 1-10g/L 的多肽， 在小于约 24 小时内至少约 10-20％的 1-100g/L 底物被转化为产 物， 其中所述多肽包含对应于 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 6、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ IDNO ： 14、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ ID NO ： 20、 或 SEQ ID NO ： 36 的氨基酸序列。
     在将底物还原为产物的这种方法的一些实施方案中， 在用大于约 25-50g/L 的底 物和小于约 1-5g/L 的多肽进行时， 在小于约 24 小时内至少约 95％的底物被转化为产物， 其 中所述多肽包含对应于 SEQ ID NO ： 4、 SEQ IDNO ： 6、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ ID NO ： 20、 或 SEQ ID NO ： 36 的氨 基酸序列。
     5. 详述
     5.1 本公开内容的稠合二环脯氨酸化合物
     5.1.1 式 II(a) 和式 II(b) 的稠合二环脯氨酸化合物
     本公开内容提供基本上对映体纯的结构式 II(a) 的稠合二环脯氨酸化合物和其 二聚体结构式 II(b) 的化合物以及它们的混合物 ：
     包括它们盐和水合物， 其中 A 是 O、 CR1R2、 -C ＝ C- 或 -CH2-CH2-， 其中 R1 和 R2 各自 独立地选自 -H、 -COOH、 -X、 -NH2、 -CH2NHC(NH)NH2、 -CX3、 -CH3、 -CH2CH3， 并且其中 X 选自 F、 Cl 和 Br。M 和 M’ 二者可以都存在或者可以都不存在， 并且当 M 和 M’ 二者都存在时， M 和 M’ 是 3 4 3 4 3 4 3 4 相同的并且选自 O 和 CR R ， 其中 R 和 R 是 H， 或者 M 的 R 或 R 和 M’ 的 R 或 R 形成亚甲 基桥接， 条件是 ： (a) 当 M 和 M’ 是 O 时， A 不是 O ； 并且当 A 是 O 时， M 和 M’ 不是 O ； (b) 当 M 3 4 3 4 和 M’ 是 CR R 时， A 可以是 -CH ＝ CH- 或 -CH2-CH2- ； 并且 (c) 当 M 和 M’ 是 CR R 并且具有 一个或多个立体中心时， M 和 M’ 的立体中心具有相反的立体化学性。
     在一个实施方案中， A 是 -CH2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH3)
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH3)2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH2CH3)-。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)2。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)(CH3)-。
     在一个实施方案中， M 和 M’ 不存在， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -CH(CH3)、 -CH(C2H5)-、 -C(CH3)2-、 -C(C2H5)2-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH)2-、 CH(NH2)- 和 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 不存在并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -C(CH3)2-、 -C(CH3)2- 和 -C(C2H5)2-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 是 -CH2-， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -O-、 -CH2-、 -C( CH3)2-、 -CH(CH3)-、 -C(C2H5)2-、 -CH(C2H5)-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH )2-、 -CH(NH2)- 和 -C(H2)NHC(NH)NH2-。
     在 又 一 实 施 方 案 中， M 和 M’ 是 -CH2-，并 且 A 选 自 由 下 列 组 成 的 组： -O-、 -CH2- 和 -C(CH3)2-。
     在再一实施方案中， M 和 M’ 是 -O-， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -CH(CH3)、 -CH(C2H5)-、 -C(CH3)2-、 -C(C2H5)2-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH)2-、 CH(NH2)- 和 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-。
     在 另 一 实 施 方 案 中， M 和 M’ 是 -O-，并 且 A 选 自 由 下 列 组 成 的 组： -CH2-、 -C(CH3)2- 和 -C(C2H5)2-。
     已知许多吡咯烷化合物 ( 例如， 3， 4- 二氢 -2H- 吡咯 ) 的亚胺由于环的张力除二聚 体以外形成热力学有利的三聚体， 或者形成热力学有利的三聚体而不形成二聚体。 因此， 在 某些实施方案中， 上述式 II(a) 化合物的任一种还可以以具有结构式 II(c) 的三聚体形式 存在
     在某些实施方案中， 本公开内容提供式 II(a) 的化合物的三聚体， 例如， 式 II(c) 的化合物， 和它们与式 II(a) 和 / 或式 II(b) 的化合物的混合物。
     5.1.2 结构式 III 的氨基磺酸盐
     本公开内容还提供基本上对映体纯的结构式 III(a) 和 III(b) 的氨基磺酸盐化合 物：
     包括其盐、 水合物和混合物， 其中 A 是 O、 CR1R2、 -C ＝ C- 或 -CH2-CH2-， 其中 R1 和 R2 各自独立地选自 -H、 -COOH、 -X、 -NH2、 -CH2NHC(NH)NH2、 -CX3、 -CH3、 -CH2CH3， 并且其中 X 选自 F、 Cl 和 Br。M 和 M’ 二者可以都存在或者可以都不存在， 并且当 M 和 M’ 二者都存在时， M和 3 4 3 4 3 4 3 4 M’ 是相同的并且选自 O 和 CR R ， 其中 R 和 R 是 H， 或者 M 的 R 或 R 和 M’ 的 R 或 R 形成 亚甲基桥接， 条件是 ： (a) 当 M 和 M’ 是 O 时， A 不是 O ； 并且当 A 是 O 时， M 和 M’ 不是 O ； (b) 3 4 3 4 当 M 和 M’ 是 CR R 时， A 可以是 -CH ＝ CH- 或 -CH2-CH2- ； 并且 (c) 当 M 和 M’ 是 CR R 并且 具有一个或多个立体中心时， M 和 M’ 的立体中心具有相反的立体化学性。
     在一个实施方案中， A 是 -CH2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH3)-。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH3)2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH2CH3)-。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)2。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)(CH3)-。
     在一个实施方案中， M 和 M’ 不存在， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -CH(CH3)、 -CH(C2H5)-、 -C(CH3)2-、 -C(C2H5)2-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH)2-、 CH(NH2)- 和 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 不存在， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -C(CH3)2、 -C(CH3)2- 和 -C(C2H5)2-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 是 -CH2-， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -O-、 -CH2-、 -C( CH3)2-、 -CH(CH3)-、 -C(C2H5)2-、 -CH(C2H5)-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH )2-、 -CH(NH2)- 和 -C(H2)NHC(NH)NH2
     在 又 一 实 施 方 案 中， M 和 M’ 是 -CH2-，并 且 A 选 自 由 下 列 组 成 的 组： -O-、 -CH2- 和 -C(CH3)2-。
     在再一实施方案中， M 和 M’ 是 -O-， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -CH(CH3)、 -CH(C2H5)-、 -C(CH3)2-、 -C(C2H5)2-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH)2-、 CH(NH2)- 和 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-。
     在 另 一 实 施 方 案 中， M 和 M’ 是 -O-，并 且 A 选 自 由 下 列 组 成 的 组： -CH2-、 -C(CH3)2- 和 -C(C2H5)2-。
     5.1.3 结构式 IV 的氨基腈化合物
     另外， 本公开内容还提供基本上对映体纯的结构式 IV(a) 和 IV(b) 的氨基腈化合物：包括其盐、 水合物和混合物， 其中 A 是 O、 CR1R2、 -C ＝ C- 或 -CH2-CH2-， 其中 R1 和 R2 各自独立地选自 -H、 -COOH、 -X、 -NH2、 -CH2NHC(NH)NH2、 -CX3、 -CH3、 -CH2CH3， 并且其中 X 选自 F、 Cl 和 Br。M 和 M’ 二者可以都存在或者可以都不存在并且当 M 和 M’ 二者都存在时， M和 3 4 3 4 3 4 3 4 M’ 是相同的并且选自 O 和 CR R ， 其中 R 和 R 是 H， 或者 M 的 R 或 R 和 M’ 的 R 或 R 形成 亚甲基桥接， 条件是 ： (a) 当 M 和 M’ 是 O 时， A 不是 O ； 并且当 A 是 O 时， M 和 M’ 不是 O ； (b) 3 4 3 4 当 M 和 M’ 是 CR R 时， A 可以是 -CH ＝ CH- 或 -CH2-CH2- ； 并且 (c) 当 M 和 M’ 是 CR R 并且 具有一个或多个立体中心时， M 和 M’ 的立体中心具有相反的立体化学性。
     在一个实施方案中， A 是 -CH2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH3)-。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH3)2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH2CH3)-。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)2。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)(CH3)-。
     在一个实施方案中， M 和 M’ 不存在， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -CH(CH3)、 -CH(C2H5)-、 -C(CH3)2-、 -C(C2H5)2-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH)2-、 CH(NH2)- 和 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 不存在， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -C(CH3)2、 -C(CH3)2- 和 -C(C2H5)2-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 是 -CH2-， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -O-、 -CH2-、 -C( CH3)2-、 -CH(CH3)-、 -C(C2H5)2-、 -CH(C2H5)-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH )2-、 -CH(NH2)- 和 -C(H2)NHC(NH)NH2-。
     在 又 一 实 施 方 案 中， M 和 M’ 是 -CH2-，并 且 A 选 自 由 下 列 组 成 的
     组： -O-、 -CH2- 和 -C(CH3)2-。
     5.1.4 结构式 V 的稠合二环脯氨酸化合物
     本公开内容提供结构式 V 的稠合二环脯氨酸化合物 ：
     包括其盐和水合物， 其中 A、 M 和 M’ ， 其中 R5 选自由下列组成的组 ： 保护基团 ( 例如， 苄基或三甲基甲硅烷基以及类似基团 )、 -(C1-C2) 烷基、 -(C1-C3) 烷基、 -(C1-C4) 5 烷 基 和 -(C1-C6) 烷 基。 在 某 些 非 限 制 性 实 施 方 案 中， R 是 甲 基、 乙 基 或 叔 丁 基， 包括 1 2 1 2 其 盐 和 水 合 物， 其 中 A 是 O、 CR R 、 -C ＝ C- 或 -CH2-CH2-， 其中 R 和 R 各自独立地选 自 -H、 -COOH、 -X、 -NH2、 -CH2NHC(NH)NH2、 -CX3、 -CH3、 -CH2CH3， 并且其中 X 选自 F、 Cl 和 Br。M 和 M’ 二者可以都存在或者可以都不存在， 并且当 M 和 M’ 二者都存在时， M 和 M’ 是相同的 3 4 3 4 3 4 3 4 并且选自 O 和 CR R ， 其中 R 和 R 是 H， 或者 M 的 R 或 R 和 M’ 的 R 或 R 形成亚甲基桥接， 条件是 ： (a) 当 M 和 M’ 是 O 时， A 不是 O ； 并且当 A 是 O 时， M 和 M’ 不是 O ； (b) 当 M 和 M’ 是 3 4 3 4 CR R 时， A 可以是 -CH ＝ CH- 或 -CH2-CH2- ； 并且 (c) 当 M 和 M’ 是 CR R 并且具有一个或多 个立体中心时， M 和 M’ 的立体中心具有相反的立体化学性。
     在一个实施方案中， A 是 -CH2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH3)-。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH3)2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH2CH3)
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)2。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)(CH3)-。
     在一个实施方案中， M 和 M’ 不存在， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -CH(CH3)、 -CH(C2H5)-、 -C(CH3)2-、 -C(C2H5)2-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH)2-、 CH(NH2)- 和 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 不存在并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -C(CH3)2-、 -C(CH3)2- 和 -C(C2H5)2-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 是 -CH2-， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -O-、 -CH2-、 -C( CH3)2-、 -CH(CH3)-、 -C(C2H5)2-、 -CH(C2H5)-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH )2-、 -CH(NH2)- 和 -C(H2)NHC(NH)NH2-。
     在 又 一 实 施 方 案 中， M 和 M’ 是 -CH2-，并 且 A 选 自 由 下 列 组 成 的 组： -O-、 -CH2- 和 -C(CH3)2-。
     在一个实施方案中， R5 是苄基。
     在一个实施方案中， R5 是三甲基甲硅烷基。
     在另一实施方案中， R5 是甲基。
     在又一实施方案中， R5 是乙基。
     在另一实施方案中， R5 是叔丁基。
     5.1.5 结构式 VI 的稠合二环脯氨酸化合物 本公开内容还提供基本上对映体纯的根据结构式 VI 的化合物 ：包括其盐和水合物， 其中 A 是 O、 CR1R2、 -C ＝ C- 或 -CH2-CH2-， 其中 R1 和 R2 各自独 立地选自 -H、 -COOH、 -X、 -NH2、 -CH2NHC(NH)NH2、 -CX3、 -CH3、 -CH2CH3， 并且其中 X 选自 F、 Cl 和 Br。M 和 M’ 二者可以都存在或者可以都不存在， 并且当 M 和 M’ 二者都存在时， M 和 M’ 是相 3 4 3 4 3 4 3 4 同的并且选自 O 和 CR R ， 其中 R 和 R 是 H， 或者 M 的 R 或 R 和 M’ 的 R 或 R 形成亚甲基 桥接， 条件是 ： (a) 当 M 和 M’ 是 O 时， A 不是 O ； 并且当 A 是 O 时， M 和 M’ 不是 O ； (b) 当 M 和 3 4 3 4 M’ 是 CR R 时， A 可以是 -CH ＝ CH- 或 -CH2-CH2- ； 并且 (c) 当 M 和 M’ 是 CR R 并且具有一个 或多个立体中心时， M 和 M’ 的立体中心具有相反的立体化学性。
     在一个实施方案中， A 是 -CH2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH3)-。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH3)2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH2CH3)-。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)2。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)(CH3)-。
     在一个实施方案中， M 和 M’ 不存在， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -CH(CH3)、 -CH(C2H5)-、 -C(CH3)2-、 -C(C2H5)2-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH)2-、 CH(NH2)- 和 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 不存在并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -C(CH3)2-、 -C(CH3)2- 和 -C(C2H5)2-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 是 -CH2-， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -O-、 -CH2-、 -C( CH3)2-、 -CH(CH3)-、 -C(C2H5)2-、 -CH(C2H5)-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH )2-、 -CH(NH2)- 和 -C(H2)NHC(NH)NH2-。
     在 又 一 实 施 方 案 中， M 和 M’ 是 -CH2-，并 且 A 选 自 由 下 列 组 成 的 组： -O-、 -CH2- 和 -C(CH3)2-。
     5.1.6 结构式 VII 的稠合二环脯氨酸化合物
     此外， 本公开内容提供基本上对映体纯的结构式 VII 的杂二环亚氨基酸化合物 ：
     包括其盐和水合物， 其中 A 是 O、 CR1R2、 -C ＝ C- 或 -CH2-CH2-， 其中 R1 和 R2 各自独 立地选自 -H、 -COOH、 -X、 -NH2、 -CH2NHC(NH)NH2、 -CX3、 -CH3、 -CH2CH3， 并且其中 X 选自 F、 Cl 和Br。M 和 M’ 二者可以都存在或者可以都不存在并且当 M 和 M’ 二者都存在时， M 和 M’ 是相 3 4 3 4 3 4 3 4 同的并且选自 O 和 CR R ， 其中 R 和 R 是 H， 或者 M 的 R 或 R 和 M’ 的 R 或 R 形成亚甲基 桥接， 条件是 ： (a) 当 M 和 M’ 是 O 时， A 不是 O ； 并且当 A 是 O 时， M 和 M’ 不是 O ； (b) 当 M 和 3 4 3 4 M’ 是 CR R 时， A 可以是 -CH ＝ CH- 或 -CH2-CH2- ； 并且 (c) 当 M 和 M’ 是 CR R 并且具有一个 或多个立体中心时， M 和 M’ 的立体中心具有相反的立体化学性。
     在一个实施方案中， R6 和 R7 均是氢。
     在一个实施方案中， A 是 -CH2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH3)
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH3)2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH2CH3)-。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)2。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)(CH3)-。
     在一个实施方案中， M 和 M’ 不存在， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -CH(CH3)、 -CH(C2H5)-、 -C(CH3)2-、 -C(C2H5)2-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH)2-、 CH(NH2)- 和 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 不存在并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -C(CH3)2-、 -C(CH3)2- 和 -C(C2H5)2-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 是 -CH2-， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -O-、 -CH2-、 -C( CH3)2-、 -CH(CH3)-、 -C(C2H5)2-、 -CH(C2H5)-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH )2-、 -CH(NH2)- 和 -C(H2)NHC(NH)NH2-。
     在 又 一 实 施 方 案 中， M 和 M’ 是 -CH2-，并 且 A 选 自 由 下 列 组 成 的 组： -O-、 -CH2- 和 -C(CH3)2-。
     5.2 本公开内容的单胺氧化酶
     能够将结构式 I 的胺化合物氧化为相应的结构式 II 的亚胺化合物的本公开内容 的单胺氧化酶与 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 6 和 SEQ ID NO ： 32 的氨基酸序列相比具有一个 或多个氨基酸取代。这种氨基酸取代为单胺氧化酶提供了一种或多种改善的特性， 包括酶 活性增加、 立体特异性增加、 热稳定性增加、 溶剂稳定性增加、 产物抑制降低、 底物抑制降低 或对反应副产物的敏感性降低。 这种氨基酸取代还可以改善单胺氧化酶在宿主细胞中的表 达水平、 溶解性和 / 或稳定性， 例如作为在异源宿主细胞中重组表达的蛋白， 所述异源宿主 细胞例如但不限于大肠杆菌宿主细胞。在一个实施方案中， 氨基酸取代 S465G 提供本公开 内容的单胺氧化酶在大肠杆菌中的表达水平、 溶解性和 / 或稳定性的明显增加。
     本公开内容还提供编码这种单胺氧化酶的多核苷酸和在所公开的生物催化方法 中使用多肽的方法。
     在一些实施方案中， 本说明书中公开的单胺氧化酶与 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 6 或 SEQ ID NO ： 32 的酶相比在它们的酶活性速率， 即将结构式 I 的胺化合物转化为相应的结 构式 II 的亚胺化合物的速率方面是有所改善的。在一些实施方案中， 所公开的单胺氧化酶 能够以下列速率将底物转化为产物 ： SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 6 和 SEQ ID NO ： 32 的单胺氧 化酶所表现的速率的至少 1.5- 倍、 2- 倍、 3- 倍、 4- 倍、 5- 倍、 10- 倍、 25- 倍、 50- 倍、 100- 倍、 或大于 100- 倍。具有这种特性的示例性多肽包括但不限于包含对应于 SEQ ID NO ： 4、 SEQID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ ID NO ： 20、 或 SEQ IDNO ： 36 的氨基酸序列的多肽。
     在一些实施方案中， 本文公开的单胺氧化酶能够将结构式 I 的胺化合物转化为相 应的结构式 II 的亚胺化合物， 其中非对映体过量百分比为至少约 95％。具有这种特性的 示例性多肽包括但不限于包含对应于 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ IDNO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ ID NO ： 20、 或 SEQ ID NO ： 36 的氨 基酸序列的多肽。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶基于 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ IDNO ： 16、 SEQ ID NO ： 18 或 SEQ ID NO ： 20 的序列式， 并且可以包含与所述序列式至少约 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是 氨基酸插入、 缺失、 取代或这些改变的任何组合。在一些实施方案中， 氨基酸序列差异可以 包含非保守的氨基酸取代、 保守的氨基酸取代以及非保守的氨基酸取代和保守的氨基酸取 代的组合。本文描述了可以进行这些改变的各种氨基酸残基位置。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 6 的残基 99 和 SEQ ID NO ： 32 的残基 97 的氨基酸谷氨酰胺被酸性氨基酸 即天冬氨酸或谷氨酸取代的氨基酸序列。在具体的实施方案中， 该谷氨酰胺残基被谷氨酸 残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 6 的残基 365 和 SEQ ID NO ： 32 的残基 363 的氨基酸酪氨酸被不同的芳族 氨基酸即苯丙氨酸或色氨酸氨酸保守地取代的氨基酸序列。在具体的实施方案中， 该酪氨 酸残基被色氨酸残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 6 的残基 382 和 SEQ ID NO ： 32 的残基 380 的氨基酸苯丙氨酸被非极性氨 基酸即缬氨酸、 异亮氨酸、 丙氨酸、 甘氨酸、 蛋氨酸或亮氨酸取代的氨基酸序列。 在具体的实 施方案中， 该苯丙氨酸残基被亮氨酸残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 6 的残基 465 和 SEQ ID NO ： 32 的残基 463 的氨基酸丝氨酸被非极性氨基 酸即缬氨酸、 异亮氨酸、 丙氨酸、 蛋氨酸、 亮氨酸或甘氨酸取代的氨基酸序列。 在具体的实施 方案中， 该丝氨酸残基被甘氨酸残基取代。
     在其他实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 6 的残基 135 的氨基酸苏氨酸被另一极性氨基酸即丝氨酸、 谷氨酰胺或天 冬酰胺保守地取代的氨基酸序列。在具体的实施方案中， 该苏氨酸残基被谷氨酰胺残基取 代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 6 的残基 284 的氨基酸天冬酰胺被酸性氨基酸即天冬氨酸或谷氨酸取代的 氨基酸序列。在具体的实施方案中， 该天冬酰胺残基被谷氨酸残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 6 的残基 289 的氨基酸丙氨酸被另一非极性氨基酸即甘氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸或蛋氨酸取代的氨基酸序列。 在具体的实施方案中， 该丙氨酸残基被缬氨酸残 基取代。
     在其他实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 的残基 384 的氨基酸赖氨酸被另一极性氨基酸即丝氨酸、 苏氨酸或谷氨酰胺保守地取代 的氨基酸序列。在具体的实施方案中， 该赖氨酸残基被谷氨酰胺残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶是如下的单胺氧化酶 ： 其为 黑曲霉单胺氧化酶 (SEQ ID NO ： 2) 的同源物或米曲霉单胺氧化酶 (SEQ ID NO ： 32) 的同源 物并且携带对应于本文所公开的那些氨基酸取代的一个或多个氨基酸取代。 示例性同源物 包括下列序列的单胺氧化酶 ： SEQ ID NO ： 22、 SEQ ID NO ： 24、 SEQ ID NO ： 26、 SEQ ID NO ： 28、 SEQ IDNO ： 30、 SEQ ID NO ： 32 和 SEQ ID NO ： 34。因此， 在某些实施方案中， 本公开内容的改 良的单胺氧化酶是选自下列序列的酶的携带对应于本文所公开的那些氨基酸取代的一个 或多个氨基酸取代的单胺氧化酶 ： SEQ IDNO ： 22、 SEQ ID NO ： 24、 SEQ ID NO ： 26、 SEQ ID NO ： 28、 SEQ ID NO ： 30、 SEQ ID NO ： 32 和 SEQ ID NO ： 34。
     5.3 定义
     如本文所用的下列术语旨在具有下列含义。
     “单胺氧化酶” 是指具有将上述结构式 I 的化合物氧化为相应的上述结构式 II 的 产物的酶能力的多肽。该多肽通常利用氧化的辅因子， 例如但不限于黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD)、 黄素腺嘌呤单核苷酸 (FMN)、 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 或烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸磷酸 (NADP)。在具体的实施方案中， 氧化的辅因子是 FAD。如本文所用的单胺氧化酶包 括天然存在的 ( 野生型 ) 单胺氧化酶以及通过人操作产生的非天然存在的工程化多肽。
     “编码序列” 是指编码蛋白的氨基酸序列的那部分核酸 ( 例如， 基因 )。
     “天然存在的” 或 “野生型” 是指天然发现的形式。例如， 天然存在的或野生型多肽 或多核苷酸序列是在生物体中存在的可以从天然来源分离的序列并且该序列没有通过人 操作被故意地修饰。
     当结合例如细胞、 核酸或多肽使用时， “重组” 是指已经以否则不会天然存在的方 式被修饰、 或者与材料的天然形式或固有形式相同但是产自或源于合成材料和 / 或通过使 用重组技术的操作产生或衍生的材料， 或相应于该材料的天然形式或固有形式的材料。非 限制性实例包括但不限于 ： 表达在固有 ( 非重组 ) 形式的细胞中不存在的基因或者表达否 则以不同的水平表达的固有基因的重组细胞。
     “序列同一性百分比” 和 “百分比同源性” 在本文中可互换使用， 是指多核苷酸和 多肽之间的比较， 并且是通过在比较窗口中比较两条最佳比对的序列来确定的， 其中多核 苷酸或多肽序列在比较窗口中的部分与两条序列最佳比对的参考序列 ( 其不包含添加或 缺失 ) 相比可以包含添加或缺失 ( 即， 缺口 )。百分比可以如下计算 ： 确定在两条序列中 出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数从而产生匹配位置数， 用匹配位置数除以比较窗 口中位置的总数并将结果乘以 100， 得出序列同一性的百分比。可选择地， 百分比可以如 下计算 ： 确定在两条序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数或者与缺口对齐的 核酸碱基或氨基酸残基的位置数从而得出匹配位置数， 用匹配位置数除以比较窗口中位置 的总数并将结果乘以 100， 得出序列同一性的百分比。本领域的技术人员了解存在许多已 确立的算法可用于比对两条序列。可以通过下列算法进行比较序列的最佳比对 ： 例如， 通过 Smith 和 Waterman， 1981， Adv.Appl.Math.2 ： 482 的局部同源性算法 ； 通过 Needleman 和 Wunsch， 1970， J.Mol.Biol.48 ： 443 的 同 源 比 对 算 法 ； 通 过 Pearson 和 Lipman， 1988， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 ： 2444 的相似性检索方法 ； 通过这些算法的计算机化执行 ( 在 GCG Wisconsin 软件包中的 GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 TFASTA) 或通过视觉检查 ( 大体参见， CurrentProtocols in Molecular Biology( 分子生物学最新实验方案 )， F.M.Ausubel 等 人， 编辑， Current Protocols， Greene Publishing Associates， Inc. 与 JohnWiley&Sons， Inc. 合资， (1995 补充材料 )(Ausubel))。适于确定百分比序列同一性和序列相似性的 算法的实例是 BLAST 和 BLAST 2.0 算法， 它们分别描述于 ： Altschul 等人， 1990， J.Mol. Biol.215 ： 403-410 和 Altschul 等人， 1977， Nucleic Acids Res.3389-3402 中。 进行 BLAST 分析的软件通过美国国家生物技术信息中心网站可公开获得。这种算法包括首先通过鉴 定在查询序列中长度为 W 的短字 (word) 来鉴定高评分序列对 (HSP)， 所述短字在与数据 库序列中相同长度的字比对时符合或满足一些正值阈值评分 T。T 是指相邻字评分阈值 (Altschul 等人， 如上 )。这些最初的相邻字匹配字串 (word hit) 充当启动寻找含有它们 的更长 HSP 的种子。然后字匹配字串沿着各序列在两个方向延伸， 只要累积比对评分可以 增加即可。 对于核苷酸序列， 累积评分使用参数 M( 匹配残基对的奖励评分 (rewardscore) ； 总是大于 0) 和 N( 错配残基的惩罚评分， 总是小于 0) 计算。对于氨基酸序列， 使用评分矩 阵来计算累积评分。在下列情况下停止各方向的字匹配字串延伸 ： 累积比对评分由其达 到的最大值降低了量 X ； 累积评分由于一个或多个负评分残基比对的累积而变为零或低于 零； 或到达任一序列的末端。BLAST 算法参数 W、 T 和 X 决定比对的灵敏度和速度。BLASTN 程序 ( 对于核苷酸序列 ) 使用下列作为缺省参数 ： 字长 (wordlength， W) 为 11， 期望值 (E) 为 10， M ＝ 5， N ＝ -4， 以及两条链的比较。对于氨基酸序列， BLASTP 程序使用下列缺省参 数： 字长 (W) 为 3， 期望值 (E) 为 10 以及 BLOSUM62 评分矩阵 ( 参见 Henikoff 和 Henikoff， 1989， Proc Natl Acad Sci USA 89 ： 10915)。示例性的序列比对和％序列同一性的确定可 以采用 GCG Wisconsin 软件包 (Accelrys， Madison WI) 中的 BESTFIT 或 GAP 程序， 使用所 提供的缺省参数。
     “参考序列” 是指用作序列比较的基础的确定序列。参考序列可以是较大序列的子 序列， 例如全长基因或多肽序列的区段。一般地， 参考序列是至少 20 个核苷酸或氨基酸残 基长、 至少 25 个残基长、 至少 50 个残基长或全长的核酸或多肽。由于两条多核苷酸或多肽 可以各自 (1) 包含两个序列之间相似的序列 ( 即， 完整序列的一部分 ) 并且 (2) 还可以包 含两个序列之间差异的序列， 所以两条 ( 或更多条 ) 多核苷酸或多肽之间的序列比较通常 通过在 “比较窗口” 内比较两条多核苷酸的序列而鉴定和比较局部区域的序列相似性来进 行。
     “比较窗口” 是指其中可以将序列与至少 20 个连续核苷酸或氨基酸的参考序列相 比较的至少约 20 个连续核苷酸位置或氨基酸残基的概念上的区段， 并且其中在比较窗口 中的序列部分与两条序列最佳比对的参考序列 ( 其不包含添加或缺失 ) 相比可以包含 20％ 或更少的添加或缺失 ( 即， 缺口 )。比较窗口可以长于 20 个连续残基并且任选包含 30 个连 续残基、 40 个连续残基、 50 个连续残基、 100 个连续残基或更长的窗口。
     “基本的同一性” 是指在至少 20 个残基位置的比较窗口内、 通常在至少 30-50 个残 基的窗口内， 与参考序列相比具有至少 80％序列同一性、 至少 85％同一性和 89％至 95％序列同一性， 更通常至少 99％序列同一性的多核苷酸或多肽序列， 其中序列同一性百分比是 通过在比较窗口内将参考序列与包含参考序列的总计 20％或更少的缺失或添加的序列相 比计算而来的。在应用于多肽的特定实施方案中， 术语 “基本的同一性” 意指在通过例如程 序 GAP 或 BESTFIT 使用缺省空位权重 (gap weihgt) 进行最佳比对时， 两条多肽序列具有至 少 80％序列同一性， 优选至少 89％序列同一性， 至少 95％序列同一性或更高的序列同一性 ( 例如， 99％序列同一性 )。优选地， 不相同的残基位置是由于保守的氨基酸取代而不同。
     当用于给定氨基酸或多核苷酸序列编号的下文中时， “对应于” 、 “关于” 或 “相对 于” 是指在给定的氨基酸或多核苷酸序列与指定的参考序列相比较时， 所述参考序列的残 基编号。换言之， 给定的聚合物的残基编号或残基位置是关于参考序列指定的而非通过给 定氨基酸或多核苷酸序列中的残基的实际数字位置指定。例如， 可以通过引入缺口以优化 两条序列之间的残基匹配， 将诸如工程化单胺氧化酶的氨基酸序列的给定氨基酸序列与参 考序列比对。 在这些情况下， 尽管存在缺口， 但给定氨基酸或多核苷酸序列中残基的编号是 关于其所比对的参考序列而指定的。
     “立体选择性” 是指在化学反应或酶促反应中， 一种立体异构体相对于另一立体异 构体优先形成。 立体选择性可以是部分的， 这时一种立体异构体的形成比另一种有利， 或者 立体选择性可以是完全的， 这时只形成一种立体异构体。 当立体异构体是对映体时， 立体选 择性是指对映体选择性， 即一种对映体在两种对映体总和中的分数 ( 通常报道为百分比 )。 其 ( 通常为百分比 ) 在本领域中通常可选地报道为根据如下公式由其计算的对映体过量 (e.e.) ： [ 主要对映体 - 次要对映体 ]/[ 主要对映体 + 次要对映体 ]。在立体异构体是非对 映异构体时， 立体选择性是指非对映体选择性， 即一种非对映体在两种非对映体混合物中 的分数 ( 通常报道为百分比 )， 通常可选地报道为非对映体过量 (d.e.)。对映体过量和非 对映体过量是立体异构体过量的类型。
     “高立体选择性” ： 是指能够将底物转化为具有至少约 99％立体异构体过量的相应 产物的单胺氧化酶多肽。
     “立体特异性” 是指在化学反应或酶促反应中， 一种立体异构体相对于另一立体异 构体优先转化。 立体特异性可以是部分的， 这时一种立体异构体的转化比另一种有利， 或者 立体特异性可以是完全的， 这时只转化一种立体异构体。
     “化学选择性” 是指在化学反应或酶促反应中， 一种产物相对于另一产物优先形 成。
     “改良的酶特性” 是指与参考单胺氧化酶相比表现出任何酶特性改良的单胺氧化 酶多肽。 对于本文所述的工程化单胺氧化酶多肽， 一般进行与野生型单胺氧化酶的比较， 尽 管在一些实施方案中， 参考单胺氧化酶可以是另一种改良的单胺氧化酶。期望改良的酶特 性包括但不限于 ： 酶活性 ( 其可以根据百分比底物转化表示 )、 热稳定性、 pH 活性谱、 辅因 子需求、 对抑制剂 ( 例如， 产物抑制 ) 的不应性、 立体特异性、 立体选择性 ( 包括对映体选择 性 )、 溶解性和稳定性以及在宿主细胞中的表达水平。
     “增加的酶活性” 是指工程化单胺氧化酶多肽的改良的特性， 它可以通过与参考 单胺氧化酶相比的比活性 ( 例如， 产生的产物 / 时间 / 重量蛋白 ) 的增加或底物转化为产 物的百分比转化 ( 例如， 使用指定量的单胺氧化酶时在指定的时间段中起始量的底物转化 为产物的转化百分比 ) 的增加代表。确定酶活性的示例性方法在实施例中提供。可以影响关于酶活性的任何特性， 包括经典的酶特性 Km、 Vmax 或 kcat， 它们的改变可以导致酶活性 增加。酶活性的改善可以为相应的野生型单胺氧化酶的酶活性的约 1.5 倍至多达天然存 在的单胺氧化酶或单胺氧化酶多肽来源的另一工程化单胺氧化酶的酶活性的 2 倍、 5 倍、 10 倍、 20 倍、 25 倍、 50 倍、 75 倍、 100 倍或更多倍。技术人员应理解任何酶的活性是扩散限 制的， 使得催化转换速率不会超过底物 ( 包括任何所需的辅因子 ) 的扩散速率。扩散限制 或 kcat/Km 的理论最大值一般是约 108 至 109(M-1s-1)。因此， 单胺氧化酶的酶活性的任何改 善将具有与该单胺氧化酶所作用的底物的扩散速率有关的上限。单胺氧化酶活性可以使 用已公布的测量单胺氧化酶的方法或其改造方法测量， 例如但不限于 Zhou 等人 (Zhou 等 人 “A One-StepFluorometric Method for the Continuous Measurement of Monoamine OxidaseActivity( 单胺氧化酶活性连续测量的一步式荧光法 )， ” 1997 Anal.Biochem.253 ： 169-74) 和 Szutowicz 等人 (Szutowicz 等人， “Colorimetric Assay forMonoamine Oxidase in Tissues Using Peroxidase and2， 2′ -Azino(3-ethtylbenzthaizoline-6-sulfonic Acid)as Chromogen( 使用过氧化物酶和 2， 2′ - 连氮基 (3- 乙基苯并噻唑啉 -6- 磺酸 ) 作 为色原进行的组织中单胺氧化酶的比色测定 )， ” 1984， Anal.Biochem.138 ： 86-94) 所公开 的那些方法。酶活性的比较是使用限定的酶制剂、 在设定条件下的限定的测定和一种或多 种限定的底物进行的， 如本文进一步详细描述的或者使用例如 Zhou 和 Szutowicz 的方法。 一般地， 当比较裂解物时， 确定测定的细胞数和测定的蛋白的量并且使用相同的表达系统 和相同的宿主细胞来将宿主细胞产生的酶和裂解物中存在的酶的量的差异最小化。
     “转化” ： 是指底物至相应产物的酶促氧化。 “百分比转化” 是指在指定条件下一段 时间内被氧化为产物的底物的百分比。因此， 单胺氧化酶多肽的 “酶活性” 或 “活性” 可以 表示为底物至产物的 “百分比转化” 。
     “热稳定的” 是指单胺氧化酶多肽在暴露于升高的温度 ( 例如 40-80℃ ) 一段时间 ( 例如， 0.5-24 小时 ) 后与未处理的酶相比保持相似的活性 ( 例如大于 60％至 80％ )。
     “溶剂稳定的” 是指是指单胺氧化酶多肽在暴露于不同浓度 ( 例如， 5％ -99％ ) 的 溶剂 ( 异丙醇、 四氢呋喃、 2- 甲基四氢呋喃、 丙酮、 甲苯、 乙酸丁酯、 甲基叔丁醚等 ) 一段时间 ( 例如， 0.5-24 小时 ) 后与未处理的酶相比保持相似的活性 ( 大于例如 60％至 80％ )。
     “pH 稳定的” 是指单胺氧化酶多肽在暴露于高或低 pH( 例如 4.5-6 或 8 至 12) 一段 时间 ( 例如， 0.5-24 小时 ) 后与未处理的酶相比保持相似的活性 ( 大于例如 60％至 80％ )。
     “热稳定和溶剂稳定的” 是指是热稳定和溶剂稳定的单胺氧化酶多肽。
     如本文在工程化单胺氧化酶上下文中所用的 “衍生自” 确定工程化所根据的起源 单胺氧化酶和 / 或编码这种单胺氧化酶的基因。例如， SEQ ID NO ： 8 的工程化单胺氧化酶 是通过在多代中人工进化编码 SEQ ID NO ： 2 的黑曲霉单胺氧化酶的基因获得的。因此， 这 种工程化的单胺氧化酶 “衍生自” SEQID NO ： 2 的野生型单胺氧化酶。
     “亲 水 氨 基 酸 或 残 基”是 指 具 有 表 现 出 根 据 Eisenberg 等 人， 1984， J.Mol. Biol.179 ： 125-142 的标准化的一致性疏水量表小于零的疏水性的侧链的氨基酸或残 基。遗传编码的亲水氨基酸包括 L-Thr(T)、 L-Ser(S)、 L-His(H)、 L-Glu(E)、 L-Asn(N)、 L-Gln(Q)、 L-Asp(D)、 L-Lys(K) 和 L-Arg(R)。
     “酸性氨基酸或残基” 是指当氨基酸包含在肽或多肽中时， 具有表现出小于约 6 的 pK 值的侧链的亲水氨基酸或残基。酸性氨基酸在生理 pH 下由于氢离子的丢失而通常具有带负电荷的侧链。遗传编码的酸性氨基酸包括 L-Glu(E) 和 L-Asp(D)。
     “碱性氨基酸或残基” 是指当氨基酸包含在肽或多肽中时， 具有表现出大于约 6 的 pK 值的侧链的亲水氨基酸或残基。碱性氨基酸在生理 pH 下由于与水合氢离子的缔合而通 常具有带正电荷的侧链。遗传编码的碱性氨基酸包括 L-Arg(R) 和 L-Lys(K)。
     “极性氨基酸或残基” 是指具有如下的侧链的亲水氨基酸或残基 ： 在生理 pH 下不 带电荷， 但是其具有其中两个原子所共同拥有的电子对被这两个原子之一更紧密地持有的 至少一个键。遗传编码的极性氨基酸包括 L-Asn(N)、 L-Gln(Q)、 L-Ser(S) 和 L-Thr(T)。
     “疏 水 氨 基 酸 或 残 基”是 指 具 有 表 现 出 根 据 Eisenberg 等 人， 1984， J.Mol. Biol.179 ： 125-142 的标准化的一致性疏水量表大于零的疏水性的侧链的氨基酸或残 基。遗传编码的疏水氨基酸包括 L-Pro(P)、 L-Ile(I)、 L-Phe(F)、 L-Val(V)、 L-Leu(L)、 L-Trp(W)、 L-Met(M)、 L-Ala(A) 和 L-Tyr(Y)。
     “芳族氨基酸或残基” 是指具有包含至少一个芳环或杂芳环的侧链的亲水性或疏 水性氨基酸或残基。遗传编码的芳族氨基酸包括 L-Phe(F)、 L-Tyr(Y) 和 L-Trp(W)。尽 管 L-His(H) 由于其杂环氮原子的 pKa 而有时被归类为碱性残基或者由于其侧链包含杂芳 环而被归类为芳族残基， 但在本文中组氨酸被归类为亲水残基或 “限制残基 (constrained residue)” ( 参见下文 )。
     “限制氨基酸或残基” 是指具有限制的几何性质的氨基酸或残基。本文中， 限制残 基包括 L-pro(P) 和 L-his(H)。 组氨酸由于其具有相对小的咪唑环而具有限制的几何性质。 脯氨酸由于其还具有五元环而具有限制的几何性质。
     “非极性氨基酸或残基” 是指具有如下的侧链的疏水氨基酸或残基 ： 在生理 pH 下 不带电荷并且具有其中两个原子所共同拥有的电子对一般被这两个原子的每一个同等程 度的持有的键 ( 即侧链不是极性的 )。遗传编码的非极性氨基酸包括 L-Gly(G)、 L-Leu(L)、 L-Val(V)、 L-Ile(I)、 L-Met(M) 和 L-Ala(A)。
     “脂肪族氨基酸或残基” 是指具有脂肪族烃侧链的疏水氨基酸或残基。遗传编码的 脂肪族氨基酸包括 L-Ala(A)、 L-Val(V)、 L-Leu(L) 和 L-Ile(I)。
     “半胱氨酸。 ” 氨基酸 L-Cys(C) 的不寻常之处在于其可以与其他 L-Cys(C) 氨基酸 或其他含硫烷基或巯基的氨基酸形成二硫键。 “半胱氨酸样残基” 包括半胱氨酸和含有可用 于形成二硫键的巯基部分的其他氨基酸。L-Cys(C)( 和具有含 -SH 侧链的其他氨基酸 ) 以 还原的游离 -SH 或氧化的二硫键形式存在于肽中的能力影响了 L-Cys(C) 是赋予肽净疏水 特征还是亲水特征。虽然 L-Cys(C) 表现出根据 Eisenberg(Eisenberg 等人， 1984， 如上 ) 的标准化的一致性量表 0.29 的疏水性， 但应了解， 为了本公开内容的目的， 将 L-Cys(C) 归 类为其自身的独特组中。
     “小氨基酸或残基” 是指具有由共三个或更少的碳和 / 或杂原子 ( 不包括 α- 碳 和氢 ) 构成的侧链的氨基酸或残基。小氨基酸或残基可以根据上述定义被进一步归类为脂 肪族的、 非极性的、 极性的或酸性的小氨基酸或残基。遗传编码的小氨基酸包括 L-Ala(A)、 L-Val(V)、 L-Cys(C)、 L-Asn(N)、 L-Ser(S)、 L-Thr(T) 和 L-Asp(D)。
     “含羟基氨基酸或残基” 是指含有羟基 (-OH) 部分的氨基酸。遗传编码的含羟基氨 基酸包括 L-Ser(S)、 L-Thr(T) 和 L-Tyr(Y)。
     “保守的” 氨基酸取代或突变是指具有相似侧链的残基的可互换性， 并且因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。然而， 如本文所 用， 如果保守的突变可以代替地为脂肪族至脂肪族、 非极性至非极性、 极性至极性、 酸性至 酸性、 碱性至碱性、 芳族至芳族、 或限制残基至限制残基的取代， 则保守的突变不包括亲水 至亲水、 疏水至疏水、 含羟基至含羟基或小残基至小残基的取代。此外， 如本文所用， A、 V、 L 或 I 可以保守地突变为另一脂肪族残基或另一非极性残基。下表 1 显示了示例性的保守取 代。.
     表1： 保守取代
     “非保守取代” 是指用具有显著不同的侧链特性的氨基酸进行的多肽中氨基酸的 取代或突变。非保守取代可以使用上面所列的定义组之间而不是之内的氨基酸。在一个实 施方案中， 非保守突变影响 (a) 取代区域中肽主链的结构 ( 例如， 脯氨酸取代甘氨酸 )、 (b) 电荷或疏水性、 或 (c) 侧链体积。
     “缺失” 是指通过从参考多肽移除一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。缺失可 以包括移除 1 个或多个氨基酸、 2 个或更多个氨基酸、 5 个或更多个氨基酸、 10 个或更多个 氨基酸、 15 个或更多个氨基酸、 或 20 个或更多个氨基酸、 多达构成参考酶的氨基酸总数的 10％或多达构成参考酶的氨基酸总数的 20％， 同时保留酶活性和 / 或保留工程化单胺氧化 酶的改良特性。缺失可以针对多肽的内部和 / 或端部。在多个实施方案中， 缺失可以包含 连续的区段或者可以是不连续的。
     “插入” 是指通过从参考多肽添加一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。在一些 实施方案中， 改良的工程化单胺氧化酶包括将一个或多个氨基酸插入天然存在的单胺氧化 酶中以及将一个或多个氨基酸插入其他改良的单胺氧化酶多肽中。 插入可以是在多肽的内 部， 或羧基端或氨基端。如本文所用的插入包括如本领域中已知的融合蛋白。插入可以是 连续氨基酸区段或者被天然存在的多肽中的一个或多个氨基酸分隔开。
     关于指定的参考序列的 “与 ...... 不同” 或 “不同于” 是指给定氨基酸或多核苷
     酸序列在与参考序列比对时的差异。一般地， 可以在两条序列最佳比对时确定差异。差异 包括与参考序列相比的氨基酸残基的插入、 缺失或取代。
     如本文所用的 “片段” 是指具有氨基端和 / 或羧基端缺失， 但是其中剩余的氨基酸 序列与序列的相应位置相同的多肽。片段可以是至少 14 个氨基酸长、 至少 20 个氨基酸长、 至少 50 个氨基酸长或更长以及多达全长单胺氧化酶多肽的 70％、 80％、 90％、 95％、 98％和 99％。
     “分离的多肽” 是指与其天然伴随的其他污染物如蛋白、 脂和多核苷酸基本上分离 的多肽。该术语涵盖由它们的天然存在的环境或表达系统 ( 例如， 宿主细胞或体外合成 ) 中移出或纯化的多肽。 改良的单胺氧化酶可以存在于细胞中、 存在于细胞培养基中， 或以各 种形式制备， 例如裂解物或分离的制剂。如此， 在一些实施方案中， 改良的单胺氧化酶可以 是分离的多肽。
     “基本上纯的多肽” 是指其中多肽物质是存在的主要物质 ( 即， 以摩尔或重量计， 其比组合物中的任何其他单独的大分子物质更丰富 ) 的组合物， 并且该组合物在主题物质 以摩尔或％重量计构成至少约 50％的存在的大分子物质时大体上是基本上纯化的组合物。 一般地， 基本上纯的单胺氧化酶组合物以摩尔数或％重量计占组合物中存在的全部大分子 物质的约 60％或更多、 约 70％或更多、 约 80％或更多、 约 90％或更多、 约 95％或更多和约 98％或更多。在一些实施方案中， 将主题物质纯化为基本上同质的 ( 即， 通过常规检测方法 在组合物中不能检测到污染物质 )， 其中组合物基本上由单一的大分子物质组成。溶剂物 质、 小分子 ( ＜ 500 道尔顿 ) 和元素铁物质不被认为是大分子物质。在一些实施方案中， 分 离的改良单胺氧化酶多肽是基本上纯的多肽组合物。
     如本文所用的 “严格杂交” 是指其中核酸杂交物 (hybrid) 稳定的条件。如本领 域的技术人员已知的， 杂交物的稳定性是以杂交物的熔解温度 (Tm) 反映的。一般地， 杂交 物的稳定性取决于离子强度、 温度、 G/C 含量、 以及离液剂的存在。多核苷酸的 Tm 值可以 使用预测熔解温度的已知方法计算 ( 参见， 例如 Baldino 等人， Methods Enzymology 168 ： 761-777 ； Bolton 等人， 1962， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48 ： 1390 ； Bresslauer 等人， 1986， Proc.Natl.Acad.Sci USA 83 ： 8893-8897 ； Freier 等 人， 1986， Proc.Natl.Acad.SciUSA 83 ： 9373-9377 ； Kierzek 等人， Biochemistry 25 ： 7840-7846 ； Rychlik 等人， 1990， Nucleic Acids Res 18 ： 6409-6412( 勘 误， 1991， Nucleic Acids Res19 ： 698) ； Sambrook 等 人， 如 上)； Suggs 等人， 1981， 在 Developmental BiologyUsing Purified Genes( 使用纯化基因 的发育生物学 )(Brown 等人， 编辑 )， 683-693 页中， Academic Press ； 以及 Wetmur， 1991， Crit Rev Biochem MolBiol 26 ： 227-259。所有出版物均通过引用并入本文 )。在一些实 施方案中， 多核苷酸编码本文所公开的多肽并且在限定的条件下与编码本公开内容的工程 化单胺氧化酶的序列的互补序列杂交， 所述限定的条件如中度严格或高度严格的条件。
     “杂交严格性” 指核酸的这种洗涤条件。一般地， 杂交反应在较低严格性的条件 下进行， 随后进行不同的但是较高严格性的洗涤。术语 “中度严格杂交” 是指容许靶 DNA 结合与靶 DNA 具有约 60％同一性， 优选约 75％同一性、 约 85％同一性 ； 与靶多核苷酸具有 大于约 90％同一性的互补核酸的条件。示例性的中度严格条件是等同于下列的条件 ： 在 42 ℃下在 50 ％甲酰胺、 5×Denhart ′ s 溶液、 5×SSPE、 0.2 ％ SDS 中杂交， 随后 42 ℃下在 0.2×SSPE、 0.2％ SDS 中洗涤。 “高度严格性杂交” 一般是指比在限定多核苷酸序列的溶液条件下确定的热熔解温度 Tm 低约 10℃或更少的条件。在一些实施方案中， 高度严格性条 件是指仅容许在 65℃下 0.018M NaCl 中形成稳定的杂交物的那些核酸序列杂交的条件。 ( 即， 如本文所预期的， 如果杂交物在 65℃下 0.018M NaCl 中不稳定， 则其在高度严格性条 件下将是不稳定的 )。高度严格性条件通过下列提供 ： 例如在等同于 42℃下在 50％甲酰 胺、 5×Denhart′ s 溶液、 5×SSPE、 0.2％ SDS 中的条件中杂交， 随后 65℃下在 0.1×SSPE 和 0.1％ SDS 中洗涤。其他高度严紧格杂交条件以及中度严格条件在上文所引用的参考文献 中描述。
     “异源的” 多核苷酸是指通过实验室技术被引入宿主细胞的多核苷酸， 并且包括从 宿主细胞中移除， 经受实验室操作， 然后被再次引入宿主细胞的多核苷酸。
     “密码子优化的” 是指将编码蛋白的多核苷酸密码子改变为在具体生物体中优先 使用以便使所编码的蛋白在感兴趣的生物体中有效地表达的那些密码子。 尽管由于大部分 氨基酸由几种密码子 ( 称为 “同义物” 或 “同义” 密码子 ) 代表而使遗传密码是简并的， 但 熟知的是特定生物体的密码子使用是非随机的并且偏爱特定的密码子三联体。 这种密码子 使用偏倚关于给定基因、 共同功能或祖先起源 (ancestra origin) 的基因、 相对于低拷贝数 蛋白的高表达蛋白和生物体基因组的聚集蛋白编码区可能是更高的。在一些实施方案中， 可以将编码单胺氧化酶的多核苷酸密码子优化以用于从被选择用于表达的宿主生物体中 最佳地制备。 “优选的、 最佳的、 高密码子使用偏倚密码子” 可互换地是指如下的密码子 ： 其与 编码相同氨基酸的密码子相比在蛋白编码区以更高的频率使用。优选的密码子可以就下 列方面而确定 ： 在单个基因中的密码子使用、 一组共同功能或起源的基因的密码子使用、 高表达的基因的密码子使用、 在整个生物体中聚集的蛋白编码区的密码子频率、 相关生物 体的聚集的蛋白编码区的密码子频率或它们的组合。频率随基因表达水平增加的密码子 通常是用于表达的最佳密码子。已知用于确定密码子频率 ( 例如， 密码子使用、 相对的同 义密码子使用 ) 和特定生物体中密码子偏好的多种方法， 包括多变量分析， 例如使用聚 类分析或相应分析和用于基因的有效密码子数 ( 参见 GCG CodonPreference， Genetics Computer Group WisconsinPackage ； CodonW， John Peden， University of Nottingham ； McInerney， J.O， 1998， Bioinformatics 14 ： 372-73 ； Stenico 等 人， 1994， Nucleic Acids Res.222437-46 ； Wright， F.， 1990， Gene 87 ： 23-29)。越来越多的生物体的密码子使用表 是可用的 ( 参见， 例如 Wada 等人， 1992， Nucleic Acids Res.20 ： 2111-2118 ； Nakamura 等 人， 2000， Nucl.Acids Res.28 ： 292 ； Duret， 等人， 如上 ； Henaut 和 Danchin， “Escherichia coli and Salmonella( 大肠杆菌和沙门氏菌 )， ” 1996， Neidhardt， 等人编辑， ASM Press， Washington D.C.， 第 2047-2066 页。获得密码子使用的数据来源可以依赖于能够编码蛋 白的任何可用的核苷酸序列。这些数据集包括实际上已知的编码表达的蛋白的核酸序列 ( 例如， 完整蛋白编码序列 -CDS)、 表达序列标签 (ESTS) 或基因组序列的预测编码区 ( 参 见， 例如， Mount， D.， Bioinformatics ： Sequence andGenome Analysis( 生物信息学 ： 序列 Cold Spring Harbor， 和基因组分析 )， 第 8 章， Cold SpringHarbor Laboratory Press， N.Y.， 2001 ； Uberbacher， E.C.， 1996， Methods Enzymol.266 ： 259-281 ； Tiwari 等人， 1997， Comput.Appl.Bioscl.13 ： 263-270)。
     “控制序列” 在本文中定义为包括对于表达本公开内容的多肽是必需的或有利的所有组分。每种控制序列对于编码多肽的核酸序列来说可以是固有的或外来的。这种控制 序列包括但不限于 ： 前导序列、 多聚腺苷酸化序列、 前肽序列、 启动子、 信号肽序列和转录终 止子。最低程度上， 控制序列包含启动子、 转录和翻译终止信号。控制序列可以为了引入促 进控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区连接的特定限制位点的目的而具有连接序列。
     “可操作地连接” 在本文中被定义为一种构造， 其中控制序列被适当地放置在相对 于 DNA 序列的编码序列的位置处以便使控制序列指导多核苷酸和 / 或多肽的表达。
     “启动子序列” 是宿主细胞所识别的用于表达编码区的核酸序列。控制序列可以包 含适当的启动子序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在选 择的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列， 包括突变的、 截短的和杂合的启动子， 并且 可以从编码对宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
     “-(C1-C10) 烷基” 意指具有 1 至 10 个碳原子的直链或支链的非环状烃。代表性 直链 -(C1-C10) 烷基包括 ： - 甲基、 - 乙基、 - 正丙基、 - 正丁基、 - 正戊基、 - 正己基、 - 正庚 基、 - 正辛基、 - 正壬基和 - 正癸基。 支链烷基意指诸如 - 甲基、 - 乙基或 - 丙基的一个或多个 直链 -(C1-C8) 烷基取代了直链烷基的 -CH2- 基团中的一个或两个氢。支链非环状烃意指诸 如 - 甲基、 - 乙基或 - 丙基的一个或多个直链 -(C1-C10) 烷基取代了直链非环状烃的 -CH2- 基 团中的一个或两个氢。 代表性的支链 -(C1-C10) 烷基包括异丙基、 仲丁基、 异丁基、 叔丁基、 异 戊基、 新戊基、 1- 甲基丁基、 2- 甲基丁基、 3- 甲基丁基、 1， 1- 二甲基丙基、 1， 2- 二甲基丙基、 1- 甲基戊基、 2- 甲基戊基、 3- 甲基戊基、 4- 甲基戊基、 1- 乙基丁基、 2- 乙基丁基、 3- 乙基丁 基、 1， 1- 二甲基丁基、 1， 2- 二甲基丁基、 1， 3- 二甲基丁基、 2， 2- 二甲基丁基、 2， 3- 二甲基丁 基、 3， 3- 二甲基丁基、 1- 甲基己基、 2- 甲基己基、 3- 甲基己基、 4- 甲基己基、 5- 甲基己基、 1， 2- 二甲基戊基、 1， 3- 二甲基戊基、 1， 2- 二甲基己基、 1， 3- 二甲基己基、 3， 3- 二甲基己基、 1， 2- 二甲基庚基、 1， 3- 二甲基庚基、 和 3， 3- 二甲基庚基。
     “-(C1-C6) 烷基” 意指具有 1 至 6 个碳原子的直链或支链非环状烃。代表性的直 链 -(C1-C6) 烷基包括 ： - 甲基、 - 乙基、 - 正丙基、 - 正丁基、 - 正戊基和 - 正己基。代表性的 支链 (C1-C6) 烷基包括异丙基、 - 仲丁基、 - 异丁基、 - 叔丁基、 - 异戊基、 - 新戊基、 1- 甲基丁 基、 2- 甲基丁基、 3- 甲基丁基、 1， 1- 二甲基丙基、 1， 2- 二甲基丙基、 1- 甲基戊基、 2- 甲基戊 基、 3- 甲基戊基、 4- 甲基戊基、 1- 乙基丁基、 2- 乙基丁基、 3- 乙基丁基、 1， 1- 二甲基丁基、 1， 2- 二甲基丁基、 1， 3- 二甲基丁基、 2， 2- 二甲基丁基、 2， 3- 二甲基丁基和 3， 3- 二甲基丁基。
     “-(C1-C4) 烷基” 意指具有 1 至 4 个碳原子的直链或支链非环状烃。代表性的直 链 -(C1-C4) 烷基包括 ： - 甲基、 - 乙基、 - 正丙基和 - 正丁基。代表性的支链 -(C1-C4) 烷基 包括 - 异丙基、 - 仲丁基、 - 异丁基和 - 叔丁基。
     “-(C1-C3) 烷基” 意指具有 1 至 3 个碳原子的直链或支链非环状烃。代表性的直链 (C1-C3) 烷基包括 - 甲基、 - 乙基和 - 正丙基。代表性的支链 -(C1-C3) 烷基包括 - 异丙基。
     “-(C1-C2) 烷 基”意 指 具 有 1 个 或 2 个 碳 原 子 的 直 链 非 环 状 烃。 代 表 性 的 直 链 -(C1-C2) 烷基包括 - 甲基和 - 乙基。
     “-(C2-C10) 烯基” 意指具有 2 至 10 个碳原子并且包含至少一个碳 - 碳双键的直链或 支链的非环状烃。 支链烯基意指诸如 - 甲基、 - 乙基或 - 丙基的一个或多个直链 -(C1-C8) 烷 基取代了直链烯基的 -CH2- 或 -CH ＝基团中的一个或两个氢。 代表性的直链和支链 (C2-C10) 烯基包括 ： - 乙烯基、 - 丙烯基、 1- 丁烯基、 -2- 丁烯基、 - 异丁烯基、 -1- 戊烯基、 -2- 戊烯基、 -3- 甲基 -1- 丁烯基、 2- 甲基 -2- 丁烯基、 -2， 3- 二甲基 -2- 丁烯基、 -1- 己烯基、 -2- 己 烯基、 -3- 己烯基、 -1- 庚烯基、 -2- 庚烯基、 -3- 庚烯基、 -1- 辛烯基、 -2- 辛烯基、 -3- 辛烯 基、 -1- 壬烯基、 -2- 壬烯基、 -3- 壬烯基、 -1- 癸烯基、 -2- 癸烯基、 -3- 癸烯基以及类似基 团。
     “-(C2-C6) 烯基” 意指具有 2 至 6 个碳原子并且包含至少一个碳 - 碳双键的直链或 支链的非环状烃。代表性的直链和支链 -(C2-C6) 烯基包括 ： - 乙烯基、 - 丙烯基、 -1- 丁烯 基、 -2- 丁烯基、 - 异丁烯基、 -1- 戊烯基、 -2- 戊烯基、 -3- 甲基 -1- 丁烯基、 -2- 甲基 -2- 丁 烯基、 -2， 3- 二甲基 -2- 丁烯基、 -1- 己烯基、 -2- 己烯基、 -3- 己烯基以及类似基团。
     “-(C2-C10) 炔基” 意指具有 2 至 10 个碳原子并且包含至少一个碳 - 碳三键的直链 或支链的非环状烃。支链炔基意指诸如 - 甲基、 - 乙基或 - 丙基的一个或多个直链 -(C1-C8) 烷基取代了直链炔基的 -CH2- 基团中的一个或两个氢。 代表性的直链和支链 -(C2-C10) 炔基 包括 - 乙炔基、 - 丙炔基、 -1- 丁炔基、 -2- 丁炔基、 -1- 戊炔基、 -2- 戊炔基、 -3- 甲基 -1- 丁 炔基、 -4- 戊炔基、 -1- 己炔基、 -2- 己炔基、 -5- 己炔基、 -1- 庚炔基、 -2- 庚炔基、 -6- 庚炔 基、 -1- 辛炔基、 -2- 辛炔基、 -7- 辛炔基、 -1- 壬炔基、 -2- 壬炔基、 -8- 壬炔基、 -1- 癸炔 基、 -2- 癸炔基、 -9- 癸炔基以及类似基团。
     “-(C2-C6) 炔基” 意指具有 2 至 6 个碳原子并且包含至少一个碳 - 碳三键的直链 或支链的非环状烃。代表性的直链和支链 (C2-C6) 炔基包括 ： - 乙炔基、 - 丙炔基、 -1- 丁炔 基、 -2- 丁炔基、 -1- 戊炔基、 -2- 戊炔基、 -3- 甲基 -1- 丁炔基、 -4- 戊炔基、 -1- 己炔基、 -2- 己 炔基、 -5- 己炔基以及类似基团。
     “-(C1-C6) 烷氧基” 意指具有 1 个或更多个醚基团和 1 至 6 个碳原子的直链或支 链非环状烃。代表性的直链和支链 (C1-C6) 烷氧基包括 - 甲氧基、 - 乙氧基、 - 甲氧基甲 基、 -2- 甲氧基乙基、 -5- 甲氧基戊基、 -3- 乙氧基丁基以及类似基团。
     “-(C3-C12) 环烷基” 意指具有 3 至 12 个碳原子的饱和的单环烃。代表性的 (C3-C12) 环烷基是 ： - 环丙基、 - 环丁基、 - 环戊基、 - 环己基、 - 环庚基、 - 环辛基、 - 环壬基、 - 环癸基 和 - 环十二烷基。
     “-(C4-C8) 环烷基” 或 “4 至 8 元环烷基环” 意指具有 4 至 8 个碳原子的饱和的单环 烃。代表性的 -(C4-C8) 环烷基是 - 环丁基、 - 环戊基、 - 环己基、 - 环庚基和 - 环辛基。
     “-(C3-C8) 环烷基” 意指具有 3 至 8 个碳原子的饱和的单环烃。代表性的 -(C3-C8) 环烷基包括 - 环丙基、 - 环丁基、 - 环戊基、 - 环己基、 - 环庚基和 - 环辛基。
     “-(C3-C7) 环烷基” 意指具有 3 至 7 个碳原子的饱和的单环烃。代表性的 (C3-C7) 环烷基包括 - 环丙基、 - 环丁基、 - 环戊基、 - 环己基和 - 环庚基。
     “(6 至 10 元 ) 杂二环” 或 “(6 至 10 元 ) 二环杂环”意指饱和的、 不饱和的非芳 族的或芳族的 6 至 10 元二环、 杂环。-(6- 至 10 元 ) 杂二环含有独立地选自下列的 1 至 4 个杂原子 ： 可以被季铵化的氮 ； 氧； 和硫， 包括亚砜和砜。-(6 至 10 元 ) 杂二环可以经由 氮和碳原子连接。代表性的 -(6 至 10 元 ) 杂二环包括 ： -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷、 -喹 啉基 (quinolinyl)、 - 异喹啉基 (isoquinolinyl)、 - 色酮基、 - 香豆素基、 - 吲哚基、 -吲 嗪 基、 苯 并 [b] 呋 喃 基、 苯 并 [b] 噻 吩 基、 - 吲 唑 基、 - 嘌 呤 基、 -4H- 喹 嗪 基、 异喹啉基 (isoquinolyl)、 - 喹啉基 (quinolyl)、 - 酞嗪基、 - 萘啶基、 - 咔唑基、 -β- 咔啉基、 - 二氢 吲哚基、 - 异二氢吲哚基、 -1， 2， 3， 4- 四氢喹啉基、 -1， 2， 3， 4- 四氢异喹啉基、 吡咯并吡咯基以及类似基团。
     “-CH2( 卤 )” 意指其中甲基的一个氢被卤素取代的甲基。代表性 -CH2( 卤 ) 基团 包括 -CH2F、 -CH2Cl、 -CH2Br 和 -CH2I。
     “-CH2( 卤 )2” 意指其中甲基的两个氢被卤素取代的甲基。代表性的 -CH( 卤 )2 基 团包括 -CHF2、 -CHCl2、 -CHBr2、 -CHBrCl、 -CHClI 和 -CHI2。
     “-C( 卤 )3” 意指其中甲基的每个氢都被卤素取代的甲基。代表性的 -C( 卤 )3 基 团包括 -CF3、 -CCl3、 -CBr3 和 -CI3。
     “- 卤素” 或 “- 卤” 意指 -F、 -Cl、 -Br 或 -I。
     本文所用的 “氧代” 、 “＝ O” 以及类似术语意指与碳或另一元素双键键合的氧原子。
     当第一基团被 “一个或多个第二基团取代” 时， 第一基团的一个或多个氢原子被相 应数目的第二基团取代。当第二基团的数目为两个或更多时， 各第二基团可以是相同的或 不同的。
     在一个实施方案中， 第一基团被最多三个第二基团取代。
     在另一实施方案中， 第一基团被一个或两个第二基团取代。
     在另一实施方案中， 第一基团仅被一个第二基团取代。
     如本文所用术语 “立体异构体” 、 “立体异构形式” 以及类似术语是用于单个分子的 所有异构体的一般术语， 它们仅在它们的原子在空间中的方向上不同。它包括对映体和具 有彼此不为镜像的多于一个的手性中心的化合物的异构体 (“非对映体” )。
     术语 “手性中心” 是指四个不同的基团所连接的碳原子。
     术语 “对映体” 或 “对映体的” 是指在其镜像上不可重叠并且因此是光学活性的 分子， 其中对映体使偏振光平面以一个方向旋转并且其镜像使偏振光平面以相反的方向旋 转。
     术语 “外消旋的” 是指光学上无活性的对映体的等份混合物。
     术语 “拆分” 是指分子的两种对映体形式之一的分离或浓缩或排除。
     如本文所用的 “基本上对映体纯” 意指化合物的指定对映体以比相同化合物的另 一对映体更高的程度或度存在。 因此， 在具体实施方案中， 基本上对映体纯的化合物以比相 同化合物的另一对映体 80％、 85％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％对映体过量存在。
     如本文所用的 “基本上立体异构纯” 意指化合物的指定对映体或非对映体以比相 同化合物的另一对映体或非对映体更高的程度或度存在。 如上文关于 “立体选择性” 所提到 的， 对映体过量和非对映体过量是立体异构体过量的类型。因此， 在具体实施方案中， 基本 上立体异构纯的化合物以比相同化合物的另一对映体或非对映体 80％、 85％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％立体异构体过量存在。
     5.4 制备本公开内容的杂二环化合物的方法
     本公开内容的杂二环化合物是使用下面所公开的生物催化方法， 利用本文所公开 的单胺氧化酶作为生物催化剂来装配的。
     方案 1
     方案 1 描绘由本公开内容的单胺氧化酶催化的反应， 通过该反应仲胺即根据结构 式 I 的杂二环化合物被氧化为相应的结构式 II(a) 的亚胺化合物。
     方案 2
     方案 2 描绘三个基础反应， 这三个基础反应在一起提供方案 1 中所描绘的总体净 反应。在方案 2 的第一个反应中， 通过本公开内容的单胺氧化酶 ( 其与黄素腺嘌呤核苷酸 辅因子 (FAD) 形成复合体 ) 将仲胺即根据结构式 I 的杂二环化合物立体选择性地氧化为 相应的结构式 II(a) 亚胺化合物以提供相应的基本上对映体纯的结构式 II 的亚胺和还原 的单胺氧化酶 FAD 复合体 ( 酶 -FAD-H2)。在第二步中， 通过分子氧将还原的单胺氧化酶 ( 酶 -FAD-H2 复合体 ) 重新氧化， 产生作为副产物的过氧化氢 (H2O2)。在第三个反应 ( 其不 通过单胺氧化酶催化 ) 中， 过氧化氢 (H2O2) 分解为水和氧。
     底物结构式 I 的仲胺是可商购获得的或者使用本领域中已知的方法和试剂或 者根据本公开内容容易地由本领域中已知的方法和试剂修改的方法和试剂容易地合成 的 ( 参见， 例如 Delalu 等人 (1999)J.HeterocyclicChem.36， 681 ； WO 2007/022459 ； 和 WO 2007/075790 ； 以及其中所引用的参考文献 )。
     过氧化氢是能够不可逆地灭活单胺氧化酶的强氧化剂。 因此， 在某些实施方案中， 可使用组分来促进上述方案 2 的步骤 3 中所描绘的歧化反应， 在该反应中， 过氧化氢 (H2O2) 被分解为分子氧和水。在某些实施方案中， 该组分选自化学剂， 例如但不限于 Pd、 Fe 以及类 似物， 而在其他实施方案中， 该组分是酶， 例如酶过氧化氢酶。 在具体的实施方案中， 反应混 合物还包含催化方案 2 的步骤 3 的歧化反应的过氧化氢酶， 在该反应中两分子的过氧化氢 被分解， 提供两分子的水和一个分子氧。 在具体的实施方案中， 过氧化氢酶是黑曲霉过氧化 氢酶， 它以约 0.01％至约 1％ (w/v)、 约 0.05％至约 0.5％ (w/v) 或约 0.1％至约 0.2％ (w/ v) 的浓度包括在反应中。
     在其中结构式 I 的化合物是挥发性液体的情况下， 为了利于处理， 可以将其作为 盐提供。在此实施方案的一个方面， 通过将 1 当量的乙酸添加到游离碱溶解于如庚烷中的 10％溶液中而将胺底物转化为乙酸盐。收集沉淀的盐， 用溶剂 ( 例如， 从其中沉淀盐的溶 剂， 如庚烷 ) 洗涤并在减压下在室温下 ( 约 21℃ ) 干燥。
     如在方案 1 中所指出的， 最终的氧化剂是分子氧。鉴于氧在水中的溶解度有限并
     且根据该溶解度随温度和含盐量 ( 溶质浓度 ) 增加而降低， 必须通过气液传质由气相补充 用于反应的溶液中的分子氧。通常， 为实际反应速率而提供的优选的单胺氧化酶的活性和 量足以使反应受气液传质的速率限制。如所熟知的， 气液传质的速率依赖于气体在液体 中的分压、 气体在液体中的溶解度和气液界面面积。因此， 可以通过提供强烈的气液混合 的工程化环境来增加受气液传质速率限制的反应的速率， 包括通过喷雾、 空心轴叶轮抽吸 (hollow shaft impeller aspiration)、 逆流气液循环、 垂直的蛇形管流以及类似方法。 此 外， 在任何工程化环境中， 可以通过增加氧分压来增加受氧气气液传质速率限制的反应的 速率， 所述增加氧分压通过增加总气压进行或者增加气体中的氧分数 ( 例如用纯化的氧富 集或代替空气 ) 进行或者通过两者进行。在具体的实施方案中， 连续监测溶氧浓度和 / 或 从气相耗氧的速率， 并调节进氧速率、 分压、 混合效率或它们的组合以提供有益的反应速率 或直到完成的总体反应时间。
     在某些实施方案中， 反应混合物还可以包含至少一种消泡剂。在具体的实施方案 中， 消泡剂是可商购获得的材料， 例如但不限于于 Antifoam-204 或 Antifoam Y-30(Sigma， St.Louis MO) 或类似物。 在其他实施方案中， 反应可以包含多于一种消泡剂。 消泡剂可以约 0.01％至约 1％ ( 若是固体为 w/v， 或者若是液体为 v/v)、 约 0.05％至约 0.5％、 或约 0.1％ 至约 0.2％的浓度包含在反应中。 在某些实施方案中， 可以从反应混合物分离氧化的结构式 II 的亚胺化合物， 将其 纯化并表征。在下文所述的其他实施方案中， 可以将结构式 II 的亚胺化合物转化为另一加 成物或中间体并且用于后续步骤而不分离或纯化。
     方案 3
     在某些实施方案中， 本公开内容的单胺氧化酶可能受到产物结构式 II 的亚胺的 抑制。因此， 在具体的实施方案中， 其中结构式 I 的化合物被氧化为结构式 II 的化合物的 反应还包含将与结构式 II 的亚胺化合物反应形成加成物的试剂， 所述加成物具有降低的 或消除的抑制本公开内容的单胺氧化酶的能力， 如方案 3 中所描绘的。在此实施方案的一 个方面， 在反应开始添加该试剂或间断地或连续地添加该试剂， 添加的量高至足以防止抑 制量的结构式 II 的亚胺化合物积累但又低至足以避免酶抑制量的该试剂的积累。在一个 实施方案中， 该试剂为亚硫酸氢钠， 其可以作为偏亚硫酸氢钠方便地提供， 偏亚硫酸氢钠在 水中水解为亚硫酸氢钠。亚硫酸氢盐与结构式 II 的亚胺化合物反应提供了结构式 III 的 亚硫酸盐加成物。在某些实施方案中， 将亚硫酸氢钠以使得这种试剂被 “瞬时” 消耗的速率 连续地添加至反应中， 并且可能的结构式 II 的抑制性亚胺产物被 “诱捕” 为较低抑制性或 无抑制性的结构式 III 的亚硫酸盐加成化合物。
     无论单胺氧化酶被亚胺产物抑制与否， 添加亚硫酸氢盐以使亚胺产物反应还提供 实际方法的工程化选择。 本发明的某些亚胺是高挥发性的， 并且在它们之中， 一些是恶臭的
     和 / 或有毒的。它们作为游离碱的限制需要封闭的反应、 没有气体流、 或化学诱捕的有效 凝聚 ( 例如通过亚硫酸氢盐溶液 )。生成它们的亚硫酸氢盐加成物 ( 氨基磺酸盐 ) 的原位 反应消除了这些工程化限制， 同时还提供了在同一反应容器中用氰化物进行后续反应的选 择。
     结构式 III 的亚硫酸氢盐加成化合物的形成在增加的 pH 下可以被逆转， 由此再产 生相应的结构式 II 的亚胺。因此， 在某些实施方案中， 通过添加碱如 10N NaOH 将 pH 升至 约 13 再产生结构式 II 的亚胺来猝灭方案 3 的反应， 所述结构式 II 的亚胺可以用例如甲基 叔丁醚 (“MBTE” ) 萃取， 并且在某些实施方案中通过蒸馏来分离， 得到为无色油的结构式 II 的亚胺。
     在某些实施方案中， 部分监测和控制添加结构式 I 的底物、 螯合剂 ( 例如， 亚硫酸 氢钠 ) 和 pH 控制剂 ( 例如， NaOH) 的速率以最小化或消除单胺氧化酶的底物抑制和产物抑 制， 该单胺氧化酶用作将结构式 I 的化合物转化为结构式 II 的化合物的生物催化剂。
     方案 4
     在另一实施方案中， 将 NaCN 添加至方案 3 的反应物中， 并容许 pH 升至约 pH 10， 由此将结构式 III 的亚硫酸盐加成物立体选择性地转化为结构式 IV(a) 的反式氨基腈化合 物， 如方案 4 中所描绘的。在此实施方案的方面中， 将约 1 至约 3 当量、 约 1 至约 2 当量、 约 1.05 至约 1.5 当量或约 1.1 至约 1.2 当量的 NaCN( 相对于结构式 II 的亚胺化合物 ) 添加 到反应中以将结构式 III 的亚硫酸盐加成物转化为结构式 IV(a) 的反式氨基腈化合物。此 外， 式 III 的化合物的反应产生结构式 IV(b) 的顺式氨基腈化合物。
     可以使用下列物质从反应混合物 ( 有机溶剂 ： 含水反应混合物为 1 ∶ 1) 中萃取结 构式 IV(a) 的反式氨基腈化合物 ： 例如， 2- 甲基四氢呋喃、 MTBE 或乙酸异丙酯。可以从有机 溶剂萃取物例如有机萃取物中回收反式氨基腈化合物， 任选的中间体的进一步澄清物可在 减压下浓缩， 得到结构式 IV 的氨基腈化合物。
     方案 5
     在某些实施方案中， 使结构式 II 的亚胺化合物反应形成方案 5 中所描绘的二聚体 结构 ( 参见， 例如， Int.J.Chem.Kinet.1998， 30(2)， 129-136)， 从而最小化或消除本公开内
     容的单胺氧化酶的产物抑制。无论单胺氧化酶被亚胺产物抑制与否， 二聚化都还可以提供 实际方法的工程化选择。二聚体的挥发性若存在的话也远远低于相应的亚胺， 大大减轻了 对工程化限制挥发性亚胺的需要。 此外， 二聚体通常可以通过过滤、 萃取或蒸气蒸馏而从反 应混合物容易地回收， 并且通常可以直接用于方法的后续步骤中。 可选择地， 通常可以将二 聚体溶解在酸性溶液中以提供单体亚胺盐溶液， 该单体亚胺盐溶液适合用于后续步骤来产 生期望的二环脯氨酸类似物和衍生物。
     方案 6
     已知在一些条件下， 吡咯烷单体化合物 ( 例如， 3， 4- 二氢 -2H- 吡咯 ) 的亚胺形成 二聚体， 然后形成热力学有利的三聚体结构。因此， 某些结构式 II(a) 的化合物不仅可以形 成二聚体， 而且随后继续完全形成三聚体 ( 例如， 式 II(c) 的化合物 ) ； 或者形成三聚体与 单体和二聚体化合物的某种混合物。
     形成这种三聚体的有利性可能依赖于取代基。然而， 预期结构式 II(c) 的这种三 聚体化合物在用于本公开内容的反应中时与二聚体相比表现出极小的反应性差异。因此， 不受机制的束缚， 预计进行结构式 II(c) 的三聚体形成的任何结构式 II(a) 的化合物将表 现出与二聚体形式等价的反应性。
     在萃取到溶剂如 MTBE 或甲苯中之后， 可以使根据方案 5 形成的二聚体与 NaCN 和 酸 ( 例如， 柠檬酸、 乙酸或盐酸 ) 接触或与 HCN 接触 ( 在 0℃ )， 得到结构式 IV(a) 的反式氨 基腈化合物和式 IV(b) 的顺式氨基腈化合物。
     方案 7
     可以使根据例如方案 4 或方案 6 制备的结构式 IV(a) 的反式氨基腈化合物与含水 酸 ( 例如， HCl 或 H2SO4) 接触， 以提供结构式 VI 的氨基酸。其中部分 R5 是叔丁基的结构式 V 的相应叔丁酯是通过使结构式 VI 的胺化合物与酸 ( 例如甲烷磺酸 ) 和异丁烯或叔丁酯 ( 例如， 乙酸叔丁酯 ) 接触制备的， 如方案 7 中所描绘。
     方案 8
     在另一实施方案中， 可以使根据例如方案 4 或方案 6 制备的结构式 IV(a) 的反式 氨基腈化合物在 Pinner 反应中与 HCl 和甲醇接触， 得到其中部分 R5 是 -CH3 的结构式 V 的 甲酯， 如方案 8 中所显示的。
     方案 9
     方案 9 描绘由结构式 I 的仲胺制备根据结构式 V 和 VI 的化合物的总过程， 其中结 构式 II 的亚胺产物在其转化为结构式 IV 的氨基腈的过程中作为结构式 III 的亚硫酸盐加 成物保持在水溶液中。
     方案 10
     方案 10 描绘由结构式 I 的仲胺制备根据结构式 V 和 VI 的化合物的总过程， 其中 结构式 II 的亚胺产物在其转化为结构式 IV 的氨基腈的过程中被二聚化为结构式 II(b) 的 化合物。
     方案 11
     方案 11 描绘由结构式 I 的仲胺制备根据结构式 VI 和结构式 V( 其中部分 R5 是叔 丁基 ) 的化合物的总过程， 该过程结合了方案 4 和 7 的反应。
     方案 12
     方案 12 描绘由结构式 I 的仲胺制备根据结构式 V( 其中部分 R5 是 -CH3) 的化合物的总过程， 该过程结合了方案 4 和 8 的反应。
     方案 13
     方案 13 描绘由结构式 I 的仲胺制备根据结构式 V( 其中部分 R5 是叔丁基 ) 的化 合物的总过程， 该过程结合了方案 6 和 7 的反应。
     方案 14
     方案 14 描绘由结构式 I 的仲胺制备根据结构式 V( 其中部分 R5 是 -CH3) 的化合物 的总过程， 该过程结合了方案 6 和 8 的反应。
     方案 15
     方案 15 描绘了由结构式 I 的仲胺制备根据结构式 VIII 的化合物的总过程， 该过 程包括了方案 4 的反应。
     方案 16
     方案 16 描绘了由结构式 I 的仲胺制备根据结构式 VII 的化合物的总过程， 该过程 包括了方案 6 的反应。
     在另一实施方案中， 涉及结构式 IV(a) 的反式氨基腈化合物的方案 7-16 的任何过 程可以用结构式 IV(b) 的顺式氨基腈化合物进行。当对应于方案 7-16 的反应使用结构式 IV(b) 的顺式氨基腈化合物进行时， 形成所得的结构式 V(b)、 VI(b) 和 VII(b) 的顺式氨基 酸和酰胺。
     不受机制的束缚， 认识到在形成方案 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15 和 16 的结构式 V、 VI、 VII 的化合物的反应期间形成了酰亚胺酯 (imidate) 中间体。 因此， 在另一实施方案中， 6 本公开内容提供结构式 VIII 的酰亚胺酯化合物， 其中 R 是 H 或烷基。
     因此， 在上述方法的一些实施方案中， 结构式 VIII 的酰亚胺酯化合物可用于制备 结构式 V、 VI 和 VII 的化合物。
     5.5 单胺氧化酶
     本公开内容提供了能够将底物结构式 I 的化合物立体选择性地氧化或转化为结 构式 II 的化合物的工程化单胺氧化酶。在具体的实施方案中， 本公开内容提供能够将底物 化合物 (1) 立体选择性地氧化或转化为化合物 (2) 的工程化单胺氧化酶。在其他实施方案 中， 本公开内容提供能够将底物化合物 (3) 立体选择性地氧化或转化为化合物 (4) 的工程 化单胺氧化酶。在两种情况下， 本公开内容的单胺氧化酶在与天然存在的野生型黑曲霉单 胺氧化酶 (SEQ ID NO ： 2) 或米曲霉单胺氧化酶 (SEQ ID NO ： 32) 或它们的杂交物 (SEQ ID NO ： 6) 相比时， 或与其他工程化单胺氧化酶 ( 例如， SEQ ID NO ： 8 的单胺氧化酶 ) 相比时， 还表现出改良的特性。期望改良的酶特性包括但不限于 ： 酶活性、 热稳定性、 pH 活性谱、 辅 因子需求、 对抑制剂 ( 例如产物抑制 ) 的不应性、 立体特异性、 立体选择性、 溶剂稳定性、 溶 解性和在宿主细胞中的稳定性和表达水平。 改良可以涉及单一的酶特性如酶活性或不同酶特性例如酶活性和立体选择性的组合。
     编码天然存在的黑曲霉和米曲霉的单胺氧化酶的多核苷酸序列以及由此相应氨 基酸序列对于黑曲霉可从 Genbank 登录号 L38858 获得并且对于米曲霉可从 Genbank 登录 号 XM_001822832 获得。
     在一些实施方案中， 本文所公开的单胺氧化酶可以具有对参考序列 ( 例如， 天然 存在的多肽或工程化多肽 ) 的大量修饰以产生改良的单胺氧化酶特性。在这种实施方案 中， 对氨基酸序列的修饰数可以包括一个或多个氨基酸、 2 个或更多个氨基酸、 3 个或更多 个氨基酸、 4 个或更多个氨基酸、 5 个或更多个氨基酸、 6 个或更多个氨基酸、 8 个或更多个氨 基酸、 10 个或更多个氨基酸、 15 个或更多个氨基酸、 或 20 个或更多个氨基酸、 多达参考酶序 列氨基酸总数的 10％、 多达参考酶序列氨基酸总数的 20％、 或多达参考酶序列氨基酸总数 的 30％。在一些实施方案中， 产生改良的单胺氧化酶特性的对天然存在的多肽或工程化多 肽的修饰数可以包括约 1-2、 1-3、 1-4、 1-5、 1-6、 1-7、 1-8、 1-9、 1-10、 1-15、 1-20、 1-21、 1-22、 1-23、 1-24、 1-25、 或约 1-30 个对参考序列的修饰。修饰可以包括插入、 缺失、 取代、 或它们 的组合。
     在一些实施方案中， 修饰包括对参考序列的氨基酸取代。可以产生改良的单胺氧 化酶特性的取代可以位于一个或多个氨基酸、 2 个或更多个氨基酸、 3 个或更多个氨基酸、 4 个或更多个氨基酸、 5 个或更多个氨基酸、 6 个或更多个氨基酸、 8 个或更多个氨基酸、 10 个或更多个氨基酸、 或 20 个或更多个氨基酸、 多达参考酶序列氨基酸总数的 10％、 多达参 考酶序列氨基酸总数的 20％、 或多达参考酶序列氨基酸总数的 30％。在一些实施方案中， 产生改良的单胺氧化酶特性的对天然存在的多肽或工程化多肽的取代数可以包括约 1-2、 1-3、 1-4、 1-5、 1-6、 1-7、 1-8、 1-9、 1-10、 1-15、 1-20、 1-21、 1-22、 1-23、 1-24、 1-25、 或 约 1-30 个对参考序列的氨基酸取代。
     在一些实施方案中， 与野生型或另一工程化多肽相比， 单胺氧化酶的改良特性是 关于其立体选择性增加， 即， 在本文中， 用于将结构式 I 的化合物氧化为结构式 II 的化合 物， 或在具体实施方案中将化合物 (1) 氧化或转化为化合物 (2) 或将化合物 (3) 氧化为化 合物 (4) 的产物的立体异构体过量的增加。在一些实施方案中， 单胺氧化酶的改良特性是 关于其将更高百分比的底物转化或还原为产物的能力增加。在一些实施方案中， 单胺氧化 酶的改良特性是关于其将底物转化为产物的速率增加。 这种酶活性的改良可以通过使用与 野生型或其他参考序列相比较少的改良单胺氧化酶来氧化或转化相同量的产物的能力来 证明。在一些实施方案中， 单胺氧化酶的改良特性是关于其稳定性或热稳定性。在一些实 施方案中， 单胺氧化酶具有多于一种的改良特性。
     在一些实施方案中， 本公开内容的单胺氧化酶能够将底物 (1R， 5S)-6， 6- 二甲 基 -3- 氮 杂 二 环 [3.1.0] 己 烷， 化 合 物 (1) 转 化 为 (1R， 5S)-6， 6- 二 甲 基 -3- 氮 杂 二 环 [3.1.0] 己 -2- 烯， 化合物 (2)， 其中立体异构体过量百分比为至少约 95％并且与具有 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 32 或 SEQ ID NO ： 6 的氨基酸序列的参考多肽相比速率有所改善。具 有这种特性的示例性多肽包括但不限于包含对应于 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 8 和 SEQ ID NO ： 10 的氨基酸序列的多肽。
     在一些实施方案中， 本公开内容的单胺氧化酶能够将底物 (3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (3) 转化为 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (4)，其中立体异构体过量百分比为至少约 95％并且与具有 SEQID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 32 或 SEQ ID NO ： 6 的氨基酸序列的参考多肽相比速率有所改善。具有这种特性的示例性多肽包括但 不限于包含对应于 SEQ IDNO ： 10、 14、 16、 18、 20 和 36 的氨基酸序列的多肽。
     下面的表 2 和 3 提供了本文所公开的 SEQ ID NO 列表及相关活性。 除非另外指明， 否则下面的序列基于野生型黑曲霉单胺氧化酶序列 (SEQ IDNO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2)。在下 面的表 2 和 3 中， 每行列出了两个 SEQ IDNO， 其中奇数序列是指编码偶数序列所提供的氨 基酸序列的核苷酸序列。列出突变 ( 即， 残基改变 ) 数目列是指与 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 的野生型黑曲霉单胺氧化酶氨基酸序列相比的氨基酸取代数目。每个表后是说明文 字， 指明各表中符号 “+” “++” “+++” 和 “++++” 的意义。
     表2： 序列表和关于将化合物 (1) 转化为化合物 (2) 方面的相应活性改良 ：
     表3： 序列表和关于将化合物 (3) 转化为化合物 (4) 方面的相应活性改良 ：
     在一些实施方案中， 本公开内容的单胺氧化酶包含与包含 SEQ IDNO ： 2 序列的参 考序列相比至少约 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％相同的氨基酸序列， 条件是多肽包含其中对应于残基位置 289 的氨基酸 残基是缬氨酸， 对应于残基位置 348 的氨基酸残基是谷氨酰胺， 对应于残基位置 382 的氨基 酸残基是亮氨酸， 并且对应于残基 465 的氨基酸是甘氨酸的氨基酸序列。在一些实施方案 中， 这些单胺氧化酶可以具有对 SEQ ID NO ： 12 的氨基酸序列的一个或多个修饰。 所述修饰 可以包括取代、 缺失和插入。 取代可以是非保守取代、 保守取代或非保守取代和保守取代的 组合。
     在一些实施方案中， 本公开内容的单胺氧化酶包含与包含 SEQ IDNO ： 2 序列的参 考序列相比至少约 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％相同的氨基酸序列， 条件是多肽包含其中对应于残基位置 289 的氨基酸 残基是缬氨酸， 对应于残基位置 348 的氨基酸残基是谷氨酰胺， 对应于残基位置 365 的氨基 酸残基是色氨酸， 并且对应于残基 465 的氨基酸是甘氨酸的氨基酸序列。在一些实施方案 中， 这些单胺氧化酶可以具有对 SEQ ID NO ： 14 的氨基酸序列的一个或多个修饰。 所述修饰 可以包括取代、 缺失和插入。 取代可以是非保守取代、 保守取代或非保守取代和保守取代的 组合。
     在一些实施方案中， 本公开内容的单胺氧化酶包含与包含 SEQ IDNO ： 2 序列的参 考序列相比至少约 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％相同的氨基酸序列， 条件是多肽包含其中对应于位置 99 的残基的氨基酸 残基是谷氨酸， 对应于残基 289 的残基是缬氨酸， 对应于残基位置 348 的氨基酸残基是谷氨 酰胺， 对应于残基位置 365 的氨基酸残基是色氨酸， 并且对应于残基位置 465 的氨基酸残基 是甘氨酸的氨基酸序列。 在一些实施方案中， 这些单胺氧化酶可以具有对 SEQ ID NO ： 16 的 氨基酸序列的一个或多个修饰。所述修饰可以包括取代、 缺失和插入。取代可以是非保守 取代、 保守取代或非保守取代和保守取代的组合。
     在一些实施方案中， 本公开内容的单胺氧化酶包含与包含 SEQ IDNO ： 2 序列的参 考序列相比至少约 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％相同的氨基酸序列， 条件是多肽包含其中对应于残基位置 99 的氨基酸残 基是谷氨酸， 对应于位置 135 的残基是谷氨酰胺， 对应于残基 289 的残基是缬氨酸， 对应于 残基位置 348 的氨基酸残基是谷氨酰胺， 对应于残基位置 365 的氨基酸残基是色氨酸， 并且 对应于残基位置 465 的氨基酸残基是甘氨酸的氨基酸序列。在一些实施方案中， 这些单胺 氧化酶可以具有对 SEQ ID NO ： 18 的氨基酸序列的一个或多个修饰。所述修饰可以包括取 代、 缺失和插入。取代可以是非保守取代、 保守取代或非保守取代和保守取代的组合。
     在一些实施方案中， 本公开内容的单胺氧化酶包含与包含 SEQ IDNO ： 2 序列的参 考序列相比至少约 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％相同的氨基酸序列， 条件是多肽包含其中对应于残基位置 99 的氨基酸残 基是谷氨酸， 对应于位置 135 的残基是谷氨酰胺， 对应于位置 284 的残基是天冬氨酸， 对应 于残基 289 的残基是缬氨酸， 对应于残基位置 348 的氨基酸残基是谷氨酰胺， 对应于位置 356 的氨基酸残基是缬氨酸， 对应于残基位置 365 的氨基酸残基是色氨酸， 并且对应于残基 位置 465 的氨基酸残基是甘氨酸的氨基酸序列。在一些实施方案中， 这些单胺氧化酶可以具有对 SEQ ID NO ： 20 的氨基酸序列的一个或多个修饰。 所述修饰可以包括取代、 缺失和插 入。取代可以是非保守取代、 保守取代或非保守取代和保守取代的组合。
     在一些实施方案中， 改良的单胺氧化酶包含与对应于如表 2 和 3 中所列的 SEQ ID NO ： 4、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20 或 36 的氨基酸序列至少约 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 或 99％相同的氨基酸序列， 其中所述改良的 单胺氧化酶氨基酸序列包括表 2 和 3 的氨基酸序列中所呈现的任一组特定的氨基酸取代 组合。在一些实施方案中， 这些单胺氧化酶可以在其他氨基酸残基处另外具有约 1-2、 1-3、 1-4、 1-5、 1-6、 1-7、 1-8、 1-9、 1-10 或 1-20 个突变。 突变可以包括插入、 缺失、 取代、 或它们的 组合。在一些实施方案中， 另外的突变包括保守取代。
     如熟悉的技术人员将了解的， 本文所述的多肽并不限于遗传编码的氨基酸。除遗 传编码的氨基酸外， 本文所述的多肽可以整体地或部分地包含天然存在的氨基酸和 / 或 合成的非编码氨基酸。本文所描述的单胺氧化酶可以包含的某些常遇到的非编码氨基酸 包括但不限于 ： 遗传编码的氨基酸的 D- 立体异构体 ； 2， 3- 二氨基丙酸 (Dpr) ； α- 氨基异 丁酸 (Aib) ； ε- 氨基己酸 (Aha) ； δ- 氨基戊酸 (Ava) ； N- 甲基甘氨酸或肌氨酸 (MeGly 或 Sar) ； 鸟氨酸 (Orn) ； 瓜氨酸 (Cit) ； 叔丁基丙氨酸 (Bua) ； 叔丁基甘氨酸 (Bug) ； N- 甲基异 亮氨酸 (MeIle) ； 苯基甘氨酸 (Phg) ； 环己基丙氨酸 (Cha) ； 正亮氨酸 (Nle) ； 萘基丙氨酸 (Nal) ； 2- 氯苯丙氨酸 (Ocf) ； 3- 氯苯丙氨酸 (Mcf) ； 4- 氯苯丙氨酸 (Pcf) ； 2- 氟苯丙氨酸 (Off) ； 3- 氟苯丙氨酸 (Mff) ； 4- 氟苯丙氨酸 (Pff) ； 2- 溴苯丙氨酸 (Obf) ； 3- 溴苯丙氨酸 (Mbf) ； 4- 溴苯丙氨酸 (Pbf) ； 2- 甲基苯丙氨酸 (Omf) ； 3- 甲基苯丙氨酸 (Mmf) ； 4- 甲基苯 丙氨酸 (Pmf) ； 2- 硝基苯丙氨酸 (Onf) ； 3- 硝基苯丙氨酸 (Mnf) ； 4- 硝基苯丙氨酸 (Pnf) ； 2- 氰基苯丙氨酸 (Ocf) ； 3- 氰基苯丙氨酸 (Mcf) ； 4- 氰基苯丙氨酸 (Pcf) ； 2- 三氟甲基苯 丙氨酸 (Otf) ； 3- 三氟甲基苯丙氨酸 (Mtf) ； 4- 三氟甲基苯丙氨酸 (Ptf) ； 4- 氨基苯丙氨酸 (Paf) ； 4- 碘苯丙氨酸 (Pif) ； 4- 氨基甲基苯丙氨酸 (Pamf) ； 2， 4- 二氯苯丙氨酸 (Opef) ； 3， 4- 二 氯 苯 丙 氨 酸 (Mpcf) ； 2， 4- 二 氟 苯 丙 氨 酸 (Opff) ； 3， 4- 二 氟 苯 丙 氨 酸 (Mpff) ； 吡 啶 -2- 基 丙 氨 酸 (2pAla) ； 吡 啶 -3- 基 丙 氨 酸 (3pAla) ； 吡 啶 -4- 基 丙 氨 酸 (4pAla) ； 萘 -1- 基丙氨酸 (1nAla) ； 萘 -2- 基丙氨酸 (2nAla) ； 噻唑基丙氨酸 (taAla) ； 苯并噻吩基 丙氨酸 (bAla) ； 噻吩基丙氨酸 (tAla) ； 呋喃基丙氨酸 (fAla) ； 高苯丙氨酸 (hPhe) ； 高酪 氨酸 (hTyr) ； 高色氨酸 (hTrp) ； 五氟苯丙氨酸 (5ff) ； 苯乙烯丙氨酸 (styrylkalanine， sAla) ； 蒽基丙氨酸 (authrylalanine， aAla) ； 3， 3- 二苯基丙氨酸 (Dfa) ； 3- 氨基 -5- 苯 基 戊 酸 (phenypentanoic acid， Afp) ； 青 霉 胺 (Pen) ； 1， 2， 3， 4- 四 氢 异 喹 啉 -3- 羧 酸 (Tic) ； β-2- 噻吩基丙氨酸 (Thi) ； 蛋氨酸亚砜 (Mso) ； N(w)- 硝基精氨酸 (nArg) ； 高赖 氨酸 (hLys) ； 磷酸甲基苯丙氨酸 (pmPhe) ； 磷酸丝氨酸 (pSer) ； 磷酸苏氨酸 (pThr) ； 高天 冬氨酸 (hAsp) ； 高谷氨酸 (hGlu) ； 1- 氨基环戊 -(2 或 3)- 烯 -4 羧酸 ； 哌可酸 (PA)， 氮杂 环丁烷 -3- 羧酸 (ACA) ； 1- 氨基环戊烷 -3- 羧酸 ； 烯丙基甘氨酸 (aOly) ； 炔丙基甘氨酸 (pgGly) ； 高丙氨酸 (hAla) ； 正缬氨酸 (nVal) ； 高亮氨酸 (hLeu)、 高缬氨酸 (hVal) ； 高异亮 氨酸 (hIle) ； 高精氨酸 (hArg) ； N- 乙酰基赖氨酸 (AcLys) ； 2， 4- 二氨基丁酸 (Dbu) ； 2， 3- 二 氨基丁酸 (Dab) ； N- 甲基缬氨酸 (MeVal) ； 高半胱氨酸 (hCys) ； 高丝氨酸 (hSer) ； 羟脯氨酸 (Hyp) 和高脯氨酸 (hPro)。本文所述的单胺氧化酶可以包含的其他的非编码氨基酸对于本 领域的技术人员来说将是明显的 ( 参见， 例如， 在 Fasman， 1989， CRC Practical Handbookof Biochemistry and Molecular Biology(CRC 生物化学和分子生物学实践手册 )， CRC Press， Boca Raton， FL， 在第 3-70 页和其中所引用的参考文献中所提供的多种氨基酸， 该文 献及其参考文献全部都通过引用并入 )。这些氨基酸可以为 L- 构型或 D- 构型。
     本领域的技术人员将认识到本文所公开的单胺氧化酶还可以包含具有侧链保护 基团的氨基酸或残基。这种被保护的氨基酸在这种情况下属于芳族类别， 它们的非限制性 实例包括 ( 保护基团在括号中列出 ) 但不限于 ： Arg(tos)、 Cys( 甲基苄基 )、 Cys( 硝基吡啶 硫酰基 )、 Glu(δ- 苄基酯 )、 Gln( 呫吨基 )、 Asn(N-δ- 呫吨基 )、 His(bom)、 His( 苄基 )、 His(tos)、 Lys(fmoc)、 Lys(tos)、 Ser(O- 苄基 )、 Thr(O- 苄基 ) 和 Tyr(O- 苄基 )。
     本文所述的单胺氧化酶可以包含的构象上受限的非编码氨基酸可以包括但不限 于 N- 甲基氨基酸 (L- 构型 ) ； 1- 氨基环戊 -(2 或 3)- 烯 -4- 羧酸 ； 哌可酸 ； 氮杂环丁烷 -3- 羧 酸； 高脯氨酸 (hPro) ； 和 1- 氨基环戊烷 -3- 羧酸。
     如上所述， 可以将引入天然存在的多肽中来产生工程化单胺氧化酶的各种修饰靶 向于特定的酶特性。
     5.6 编码工程化单胺氧化酶的多核苷酸
     在另一方面， 本公开内容提供编码本文所公开的工程化单胺氧化酶的多核苷酸。 所述多核苷酸可与控制基因表达的一个或多个异源调节序列可操作地连接以产生能够表 达多肽的重组多核苷酸。 可以将含有编码工程化单胺氧化酶的异源多核苷酸的表达构建体 引入适当的宿主细胞中以表达相应的单胺氧化酶多肽。
     由于知道对应于各种氨基酸的密码子， 所以蛋白序列的可用性提供了能够编码主 题物的所有多核苷酸的说明。 其中相同的氨基酸被可选的密码子或同义密码子编码的遗传 密码的简并性容许制备极大量的核酸， 它们全部编码本文所公开的改良的单胺氧化酶。因 此， 在鉴定了具体的氨基酸序列的情况下， 本领域的技术人员能够通过以不改变蛋白氨基 酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子序列来制备任何数目的不同核酸。在此方面， 本公开内容特定地涵盖每一个可能的多核苷酸变异， 所述多核苷酸变异可以通过选择基于 可能的密码子选择的组合而制备， 并且对于本文所公开的任何多肽， 所有这些变异被认为 是特定地公开的， 所述多肽包括表 2 和 3 中所呈现的氨基酸序列。
     在一些实施方案中， 多核苷酸包含编码具有如下的氨基酸序列的单胺氧化酶的核 苷酸序列 ： 与本文所述的参考工程化单胺氧化酶的任一个相比具有至少约 80％或更多的 序列同一性、 约 85％或更高的序列同一性、 约 90％或更高的序列同一性、 约 95％或更高的 序列同一性、 约 96％或更高的序列同一性、 约 97％或更高的序列同一性、 约 98％或更高的 序列同一性、 或 99％或更高的序列同一性。在一些实施方案中， 多核苷酸编码包含选自下 列的氨基酸序列的工程化单胺氧化酶 ： SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ IDNO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ ID NO ： 20、 或 SEQ ID NO ： 36。
     在多个实施方案中， 优选选择适合蛋白在其中表达的宿主细胞的密码子。 例如， 使 用在细菌中使用的优选密码子来在细菌中表达基因， 使用在酵母中使用的优选密码子来在 酵母中表达 ； 并且使用在哺乳动物中使用的优选密码子来在哺乳动物细胞中表达。举例来 说， SEQ ID NO ： 1 的多核苷酸被密码子优化以便在大肠杆菌中表达， 但是另外还编码天然存 在的黑曲霉单胺氧化酶。
     在某些实施方案中， 不需要替代所有的密码子来优化单胺氧化酶的密码子使用，因为天然序列将包含优选的密码子并且因为优选密码子的使用可能不是所有氨基酸残基 都需要的。因此， 编码单胺氧化酶的密码子优化的多核苷酸可以在全长编码区的约 40％、 50％、 60％、 70％、 80％或大于 90％的密码子位置含有优选的密码子。
     在一些实施方案中， 编码工程化单胺氧化酶的多核苷酸选自 ： SEQ IDNO ： 3、 SEQ ID NO ： 7、 SEQ ID NO ： 9、 SEQ ID NO ： 11、 SEQ ID NO ： 13、 SEQID NO ： 15、 SEQ ID NO ： 17、 SEQ ID NO ： 19、 或 SEQ ID NO ： 35。在一些实施方案中， 多核苷酸能够在高度严格条件下与包含 SEQ ID NO ： 5 或 SEQ IDNO ： 31 的多核苷酸杂交， 其中能够在高度严格条件下杂交的多核苷酸编 码功能单胺氧化酶。
     在其他实施方案中， 多核苷酸包含如下的多核苷酸 ： 编码本文所述的单胺氧化酶， 但是在核苷酸水平上与编码工程化单胺氧化酶的参考多核苷酸具有约 80％或更高的序列 同一性、 约 85％或更高的序列同一性、 约 90％或更高的序列同一性、 约 95％或更高的序列 同一性、 约 98％或更高的序列同一性、 或 99％或更高的序列同一性。在一些实施方案中， 参 考多核苷酸选自下列序列所表示的多核苷酸序列 ： SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID NO ： 7、 SEQID NO ： 9、 SEQ ID NO ： 11、 SEQ ID NO ： 13、 SEQ ID NO ： 15、 SEQ ID NO ： 17、 SEQ ID NO ： 19、 或 SEQ ID NO ： 35。
     可以多种方式操作编码改良的单胺氧化酶的分离的多核苷酸以提供多肽的表达。 依据表达载体， 分离的多核苷酸在插入载体之前的操作可能是期望的或必需的。利用重组 DNA 方法修饰多核苷酸和核酸序列的技术是本领域中熟知的。指南提供在 Sambrook 等人， 2001， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual( 分子克隆 ： 实验室手册 )， 第 3 版， Cold Spring HarborLaboratory Press ； 和 Current Protocols in Molecular Biology( 分子生 物学最新实验方案 )， Ausubel.F. 编辑， Greene Pub.Associates， 1998， 更新至 2006。
     对于细菌宿主细胞， 用于指导本公开内容的核酸构建体转录的合适启动子包 括从下列基因中获得的启动子 ： 大 肠 杆 菌 lac 操 纵 子、 天 蓝 色 链 霉 菌 (Streptomyces coelicolor) 琼 脂 糖 酶 基 因 (dagA)、 枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bacillussubtilis) 果 聚 糖 蔗 糖 酶 基因 (sacB)、 地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)α- 淀粉酶基因 (amyL)、 嗜热脂 肪芽孢杆菌 (Bacillus stearothermophilus) 麦芽糖淀粉酶基因 (amyM)、 解淀粉芽孢杆 菌 (Bacillus amyloliquefaciens)α- 淀粉酶基因 (amyQ)、 地衣芽孢杆菌青霉素酶基因 (penP)、 枯草芽孢杆菌 xylA 和 xylB 基因以及原核 β- 内酰胺酶基因 (Villa-Kamaroff 等 人， 1978， Proc.Natl Acad.Sci.USA 75 ： 3727-3731) ； 以及 tac 启动子 (DeBoer 等人， 1983， Proc.Natl Acad.Sci.USA 80 ： 21-25)。其他启动子描述于 Scientific American， 1980， 242 ： 74-94 中的 “Useful proteins from recombinant bacteria( 来自重组细菌的有用蛋 白 )” ； 和 Sambrook 等人， 如上。
     对于丝状真菌宿主细胞， 用于指导本公开内容的核酸构建体转录的合适启动子包 括从下列酶的基因获得的启动子 ： 米曲霉 TAKA 淀粉酶、 米赫根毛霉 (Rhizomucor miehei) 天冬氨酸蛋白酶、 黑曲霉中性 α- 淀粉酶、 黑曲霉酸稳定的 α- 淀粉酶、 黑曲霉或泡盛曲霉 (Aspergillus awamori) 葡萄糖淀粉酶 (glaA)、 米赫根毛霉脂肪酶、 米曲霉碱性蛋白酶、 米 曲霉磷酸丙糖异构酶、 构巢曲霉乙酰胺酶和尖孢镰刀菌 (Fusarium oxysporum) 胰蛋白酶样 蛋白酶 (WO 96/00787) ； 以及 NA2-tpi 启动子 ( 来自黑曲霉中性 α- 淀粉酶基因和米曲霉 磷酸丙糖异构酶基因的启动子的杂合体 ) 以及它们的突变启动子、 截短启动子和杂合启动子。 在酵母宿主中， 有用的启动子可以来自下列酶的基因 ： 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 烯醇化酶 (ENO-1)、 酿酒酵母半乳糖激酶 (GAL1)、 酿酒酵母醇脱氢酶 / 甘油 醛 -3- 磷酸脱氢酶 (ADH2/GAP) 和酿酒酵母 3- 磷酸甘油酸激酶。用于酵母宿主细胞的其他 有用启动子由 Romanos 等人， 1992， Yeast 8 ： 423-488 描述。
     控制序列还可以是合适的转录终止子序列， 转录终止子序列是被宿主细胞识别以 终止转录的序列。终止子序列与编码多肽的核酸序列的 3’ - 端可操作地连接。在选择的宿 主细胞中有功能的任何终止子可用于本文所公开的方法中。
     例如， 用于丝状真菌宿主细胞的示例性转录终止子可以从下列的基因获得 ： 米曲 霉 TAKA 淀粉酶、 黑曲霉葡萄糖淀粉酶、 构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、 黑曲霉 α- 葡萄糖苷酶 和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
     用于酵母宿主细胞的示例性终止子可以从下列的基因获得 ： 酿酒酵母烯醇化酶、 酿酒酵母细胞色素 C(CYC1) 和酿酒酵母甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他 有用终止子由 Romanos 等人， 1992， 如上描述。
     控制序列还可以是合适的前导序列， 前导序列是对于宿主细胞翻译重要的 mRNA 的非翻译区。前导序列与编码多肽的核酸序列的 5’ - 端可操作地连接。可以使用在选择的 宿主细胞中有功能的任何前导序列。 用于丝状真菌宿主细胞的示例性前导序列从下列的基 因获得 ： 米曲霉 TAKA 淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶。 用于酵母宿主细胞的合适前导序 列从下列的基因获得 ： 酿酒酵母烯醇化酶 (ENO-1)、 酿酒酵母 3- 磷酸甘油酸激酶、 酿酒酵母 α- 因子和酿酒酵母醇脱氢酶 / 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 (ADH2/GAP)。
     控制序列还可以是多聚腺苷酸化序列， 多聚腺苷酸化序列是与核酸序列的 3’ -端 可操作地连接并且在被转录时被宿主细胞识别为向被转录的 mRNA 添加多聚腺苷残基的信 号的序列。在选择的宿主细胞中有功能的任何多聚腺苷酸化序列可用于本文所公开的方 法中。用于丝状真菌宿主细胞的示例性多聚腺苷酸化序列可以从下列的基因获得 ： 米曲霉 TAKA 淀粉酶、 黑曲霉葡萄糖淀粉酶、 构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、 尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋 白和黑曲霉 α- 葡萄糖苷酶。 可用于酵母宿主细胞的多聚腺苷酸化序列由 Guo 和 Sherman， 1995， Mol Cell Bio 15 ： 5983-5990 描述。
     控制序列还可以是编码与多肽的氨基端连接并指导编码的多肽进入细胞分泌途 径的氨基酸序列的信号肽编码区。核酸序列编码序列的 5’ 端可以固有地含有在翻译阅读 框中与编码分泌多肽的编码区区段天然连接的信号肽编码区。 可选择地， 编码序列的 5′端 可以含有对编码序列为外来的信号肽编码区。 在编码序列不是天然含有信号肽编码区时可 能需要外来信号肽编码区。
     可选择地， 外来信号肽编码区可以简单替代天然信号肽编码区以增强多肽的分 泌。然而， 指导表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区可用于本 文所公开的方法中。
     细菌宿主细胞的有效信号肽编码区是从下列的基因获得的信号肽编码区 ： 芽孢杆 菌 (Bacillus)NClB 11837 麦芽糖淀粉酶、 嗜热脂肪芽孢杆菌 α- 淀粉酶、 地衣芽孢杆菌枯 草菌素、 地衣芽孢杆菌 β- 内酰胺酶、 嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶 (nprT、 nprS、 nprM) 和 枯草芽孢杆菌 prsA。其他的信号肽由 Simonen 和 Palva， 1993， Microbiol Rev 57 ： 109-137
     描述。 用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区可以是从下列的基因获得的信号 肽编码区 ： 米曲霉 TAKA 淀粉酶、 黑曲霉中性淀粉酶、 黑曲霉葡萄糖淀粉酶、 米赫根毛霉天 冬氨酸蛋白酶、 特异腐质霉 (Humicola insolens) 纤维素酶和绵毛状腐质霉 (Humicola lanuginosa) 脂肪酶。
     可用于酵母宿主细胞的信号肽可以来自酿酒酵母 α 因子和酿酒酵母转化酶的基 因。其他有用的信号肽编码区由 Romanos 等人， 1992， 如上描述。
     控制序列还可以是编码位于多肽氨基端的氨基酸序列的前肽编码区。所得的 多肽被称为前酶 (proenzyme) 或前多肽 ( 或在一些情况下， 酶原 )。前多肽一般是无 活性的并且其可以通过自前多肽催化裂解或自催化裂解前肽而转化为成熟的活性多 肽。前肽编码区可以从下列的基因获得 ： 枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶 (aprE)、 枯草芽孢 杆菌中性蛋白酶 (nprT)、 酿酒酵母 α 因子、 米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉 (Myceliophthorathermophila) 乳糖酶 (WO 95/33836)。
     在信号肽和前肽区均存在于多肽的氨基端时， 前肽区位于多肽的氨基端相邻的位 置并且信号肽区位于前肽区的氨基端相邻的位置。
     还可能期望的是添加调节序列， 该调节序列容许相对于宿主细胞生长调节多肽表 达。 调节系统的实例是响应于化学或物理刺激物而引起基因表达开启或关闭的那些调节系 统， 所述化学或物理刺激物包括调节化合物的存在。 在原核宿主细胞中， 合适的调节序列包 括 lac、 tac 和 trp 操纵子系统。在酵母宿主细胞中， 合适的调节系统包括 ： 例如， ADH2 系统 或 GAL1 系统。在丝状真菌中， 合适的调节序列包括 TAKAα 淀粉酶启动子、 黑曲霉葡萄糖淀 粉酶启动子和米曲霉葡萄糖淀粉酶启动子。
     调节序列的其他实例是容许基因扩增的那些调节序列。在真核系统中， 这些调节 序列包括在氨甲喋呤的存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因和具有重金属时扩增的金属硫 蛋白基因。在这些情况下， 编码本公开内容的单胺氧化酶的核酸序列将与调节序列可操作 地连接。
     因此， 在另一实施方案中， 本公开内容还涉及包含编码工程化单胺氧化酶或其变 体的多核苷酸和一个或多个表达调节区的重组表达载体， 所述表达调节区如启动子和终止 子、 复制起点等， 这取决于它们要引入的宿主的类型。 可以将上述各种核酸和控制序列连接 在一起以产生重组表达载体， 该重组表达载体可包括一个或多个方便的限制性位点以容许 编码多肽的核酸序列在这些位点插入或取代。可选择地， 可以通过将本公开内容的核酸序 列或包含该序列的核酸构建体插入到合适的表达载体中来表达本公开内容的核酸序列。 在 制备表达载体中， 编码序列位于载体中使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地 连接。
     重组表达载体可以是可以方便地进行重组 DNA 程序并且可以使得多核苷酸序列 表达的任何载体 ( 例如， 质粒或病毒 )。 载体的选择通常取决于载体与该载体要引入其中的 宿主细胞的相容性。载体可以是线型质粒或闭合的环状质粒。
     表达载体可以是自主复制的载体， 即， 作为染色体外实体存在的不依赖于染色体 复制而复制的载体， 例如， 质粒、 染色体外元件、 微型染色体或人工染色体。 载体可以含有用 于确保自我复制的任何部件 (means)。可选择地， 载体可以是在被引入宿主细胞中时， 整合
     到基因组中并与其所整合进的染色体一起被复制的载体。 此外， 可以使用单个载体或质粒、 或一起含有要引入宿主细胞基因组的总 DNA 的两个或更多个载体或质粒、 或者转座子。
     本公开内容的表达载体优选含有一个或多个可选择标记物， 该标记物容许容易地 选择转化的细胞。 可选择标记物是产物能提供杀生物剂或病毒抗性、 重金属抗性、 营养缺陷 型的原养型以及类似特性的基因。细菌可选择标记物的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣 芽孢杆菌的 dal 基因或赋予如下抗生素抗性的标记物 ： 例如氨苄西林抗性、 卡那霉素抗性、 氯霉素抗性 ( 实施例 1) 或四环素抗性。用于酵母宿主细胞的合适的标记物是 ADE2、 HIS3、 LEU2、 LYS2、 MET3、 TRP1 和 URA3。
     用于丝状真菌宿主细胞的可选择标记物包括但不限于 ： amdS( 乙 酰 胺 酶 )、 argB( 鸟氨酸氨甲酰转移酶 )、 bar( 丝膦菌素乙酰基转移酶 )、 hph( 潮霉素磷酸转移酶 )、 niaD( 硝酸还原酶 )、 pyrG( 乳清酸核苷 -5 ′ - 磷酸脱羧酶 )、 sC( 硫酸腺苷转移酶 ) 和 trpC( 邻氨基苯甲酸合酶 ) 以及它们的等同物。用于曲霉细胞的实施方案包括构巢曲霉或 米曲霉的 amdS 和 pyrG 基因以及吸水链霉菌 (Streptomyces hygroscopicus) 的 bar 基因。
     本公开内容的表达载体优选含有容许载体整合到宿主细胞基因组中或者容许载 体在所述细胞中不依赖于基因组而自主复制的元件。对于向宿主细胞基因组中整合， 载体 可能依赖于编码多肽的核酸序列或载体的任何其他元件以通过同源重组或非同源重组将 载体整合到基因组中。
     可选择地， 表达载体可以含有用于指导通过同源重组向宿主细胞基因组中整合的 其他核酸序列。 所述其他核酸序列能够在染色体中的精确位置将载体整合到宿主细胞基因 组中。为了增加在精确位置整合的可能性， 整合元件应优选含有足够数目的与相应的靶序 列高度同源的核酸以增强同源重组的可能性， 所述足够数目例如 100 至 10,000 个碱基对， 优选 400 至 10,000 个碱基对， 并且最优选 800 至 10,000 个碱基对。整合元件可以是与宿 主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外， 整合元件可以是非编码的或编码的核酸 序列。另一方面， 可以通过非同源重组将载体整合到宿主细胞基因组中。
     对于自主复制， 载体可以还包含复制起点， 复制起点使得载体能够在所研究的宿 主细胞中自主复制。细菌复制起点的实例是 P15A ori( 如在图 5 的质粒中所显示的 ) 或质 粒 pBR322、 pUC19、 pACYC177( 该质粒具有 P15A ori) 的复制起点、 或容许在大肠杆菌中复 制的 pACYC184 以及容许在芽胞杆菌中复制的 pUB110、 pE194、 pTA1060 或 pAMβ1。用于酵 母宿主细胞中的复制起点的实例是 2 微米复制起点、 ARS1、 ARS4、 ARS1 和 CEN3 的组合、 以及 ARS4 和 CEN6 的组合。复制起点可以是具有使其机能在宿主细胞中温度敏感的突变的复制 起点 ( 参见， 例如 Ehrlich， 1978， Proc Natl Acad Sci.USA 75 ： 1433)。
     可以将多于 1 拷贝的本公开内容的核酸序列插入到宿主细胞中以增加基因产物 的产生。核酸序列拷贝数的增加可以如下来获得 ： 通过将至少一个额外拷贝的序列整合到 宿主细胞基因组中 ； 或通过在细胞含有扩增拷贝的可选择标记物基因时随核酸序列包括可 扩增的可选择标记物基因， 并且从而可以通过在合适的选择剂存在下培育细胞来选择额外 拷贝的核酸序列。
     用于本文所公开的方法的许多表达载体是可商购获得的。 合适的商业表达载体包 TM 括： 来自 Sigma-Aldrich Chemicals， St.Louis MO. 的 p3xFLAGTM 表达载体， 它包括用于 在哺乳动物宿主细胞中表达的 CMV 启动子和 hGH 多聚腺苷酸化位点以及用于在大肠杆菌中扩增的 pBR322 复制起点和氨苄霉素抗性标记物。 其他合适的表达载体是可从 Stratagene， LaJolla CA 商 购 获 得 的 pBluescriptII SK(-) 和 pBK-CMV、自 pBR322(GibcoBRL)、 pUC(Gibco BRL)、 pREP4、 pCEP4(Invitrogen) 或 pPoly 衍生的质粒 (Lathe 等人， 1987， Gene 57 ： 193-201)。
     5.7 表达单胺氧化酶的宿主细胞
     在另一方面， 本公开内容提供包含编码本公开内容的改良单胺氧化酶的多核苷酸 的宿主细胞， 所述多核苷酸与用于在宿主细胞中表达单胺氧化酶的一个或多个控制序列可 操作地连接。用于表达由本公开内容的表达载体编码的单胺氧化酶多肽的宿主细胞是本 领域中熟知的并且包括但不限于 ： 细菌细胞， 如大肠杆菌、 克菲尔乳杆菌 (Lactobacillus kefir)、 短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)、 小乳杆菌 (Lactobacillus minor)、 链霉菌 和鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 细胞 ； 真菌细胞， 如酵母细胞 ( 例如， 酿 酒酵母或巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)(ATCC 登录号 201178)) ； 昆虫细胞， 如果蝇 (Drosophila)S2 和灰翅夜蛾 (Spodoptera)Sf9 细胞 ； 动物细胞， 如 CHO、 COS、 BHK、 293 和 Bowes 黑素瘤细胞 ； 以及植物细胞。用于上述宿主细胞的适当培养基和生长条件是本领域 中熟知的。
     可以通过本领域中已知的多种方法将表达单胺氧化酶的多核苷酸引入细胞中。 技 术包括但不限于 ： 电穿孔、 生物射弹粒子轰击、 脂质体介导的转染、 氯化钙转染和原生质体 融合。将多核苷酸引入细胞中的多种方法对于熟悉的技术人员来说是明显的。
     示例性的宿主细胞是大肠杆菌 (Escherichia coli)W3110。表达载体通过将 编码改良单胺氧化酶的多核苷酸可操作地连接到质粒 pCK110900 中来制造， 所述质粒 pCK110900 与受 lacI 阻遏物控制的 lac 启动子可操作地连接。表达载体还含有 P15a 复制 起点和氯霉素抗性基因。通过使细胞进行氯霉素选择来分离在大肠杆菌 W3110 中含有主题 多核苷酸的细胞。
     5.8 产生工程化单胺氧化酶的方法
     在一些实施方案中， 为制备本公开内容的改良单胺氧化酶多核苷酸和多肽， 从黑 曲霉或米曲霉获得 ( 或衍生 ) 催化氧化反应的天然存在的单胺氧化酶。 在一些实施方案中， 将母体多核苷酸序列密码子优化以增强单胺氧化酶在特定宿主细胞中的表达。作为例示， 由基于可在 Genbank 数据库中获得的黑曲霉单胺氧化酶序列的已知氨基酸序列 (Genbank 登录号 L38858) 制备的寡核苷酸构建编码黑曲霉野生型单胺氧化酶多肽的母体多核苷酸 序列。 将指定为 SEQ ID NO ： 1 的母体多核苷酸序列进行密码子优化以便在大肠杆菌中表达， 并且将密码子优化的多核苷酸克隆到表达载体中， 将单胺氧化酶基因的表达置于 lac 启动 子和 lacI 阻遏基因的控制下。鉴定在大肠杆菌中表达活性单胺氧化酶的克隆并对基因测 序以确定它们的身份。 指定的序列 (SEQ ID NO ： 2) 是用作工程化单胺氧化酶的大部分实验 和文库构建的起点的母体序列， 所述工程化单胺氧化酶是由黑曲霉单胺氧化酶进化的。
     如上面所讨论的， 工程化单胺氧化酶可以通过使编码天然存在的单胺氧化酶的多 核苷酸进行诱变和 / 或定向进化方法而获得。示例性的定向进化技术是如下列文献中所 描述的诱变和 / 或 DNA 改组 ： Stemmer， 1994， ProcNatl Acad Sci USA 91 ： 10747-10751 ； WO 95/22625 ； WO 97/0078 ； WO97/35966 ； WO 98/27230 ； WO 00/42651 ； WO 01/75767 和美国 专利 6,537,746。 可以使用的其他定向进化程序包括但不限于 ： 交错延伸方法 (StEP)、 体外重组 (Zhao 等人， 1998， Nat.Biotechnol.16 ： 258-261)、 诱变 PCR(Caldwell 等人， 1994， PCR Methods Appl.3 ： S136-S140) 和盒式诱变 (Black 等人， 1996， Proc Natl Acad Sci USA 93 ： 3525-3529)。
     筛选诱变处理之后获得的克隆中具有期望的改良酶特性的工程化单胺氧化酶。 由表达文库测量酶活性可以使用标准生物化学技术进行， 例如但不限于可以使用公布的 用于测量单胺氧化酶的方法或其改造方法进行， 例如但不限于 Zhou 等人 (Zhou 等人 “A One-Step Fluorometric Methodfor the Continuous Measurement of Monoamine Oxidase Activity( 单 胺 氧 化 酶 活 性 连 续 测 量 的 一 步 式 荧 光 法 )， ” 1997 Anal.Biochem.253 ： 169-74) 和 Szutowicz 等人 (Szutowicz 等人， “Colorimetric Assay for MonoamineOxidase in Tissues Using Peroxidase and2， 2′ -Azino(3-ethtylbenzthaizoline-6-sulfonic Acid)as Chromogen( 使用过氧化物酶和 2， 2′ - 连氮基 (3- 乙基苯并噻唑啉 -6- 磺酸 ) 作 为色原进行的组织中单胺氧化酶的比色测定 )， ” 1984， Anal.Biochem.138 ： 86-94) 所公开 的那些方法。酶活性的比较是使用限定的酶制剂、 在设定条件下的限定的测定和一种或多 种限定的底物进行的， 如本文进一步详细描述的 ； 或者使用例如 Zhou 和 Szutowicz 的方法 进行。 一般地， 当比较裂解物时， 测定细胞数和测定的蛋白的量并且使用相同的表达系统和 相同的宿主细胞来将宿主细胞产生的酶和裂解物中存在的酶的量的差异最小化。 在期望改 良的酶特性是热稳定性时， 可以在使酶制剂经受限定的温度并测量热处理后剩余的酶活性 的量来测量酶活性。然后分离含有编码单胺氧化酶的多核苷酸的克隆， 将该克隆测序以鉴 定核苷酸序列改变 ( 若存在 )， 并将其用于在宿主细胞中表达酶。
     当已知工程化多肽的序列时， 编码酶的多核苷酸可以根据已知的合成方法通过 标准的固相方法来制备。在一些实施方案中， 可以分别合成最多约 100 个碱基的片段， 然 后将它们连接 ( 例如， 通过酶连接或化学连接方法或聚合酶介导的方法 ) 以形成任何期 望的连续序列。例如， 可以通过化学合成使用如下的方法来制备本文所公开的多核苷酸 和寡核苷酸 ： 例如 Beaucage 等人， 1981， Tet Lett 22 ： 1859-69 所描述的经典的亚磷酰 胺方法 ； 或 Matthes 等人， 1984， EMBO J.3 ： 801-05 所描述的方法， 例如， 如同该方法在自 动化合成方法中所通常实践的一样。根据亚磷酰胺方法， 在例如自动化 DNA 合成仪中合 成寡核苷酸， 将其纯化、 退火、 连接并克隆在适当的载体中。此外， 基本上任何核酸可以从 多种商业来源的任一种获得， 例如 The Midland Certified Reagent Company， Midland， TX、 The GreatAmerican Gene Company， Ramona， CA、 ExpressGen Inc.Chicago， IL、 OperonTechnologies Inc.， Alameda， CA 以及许多其他商业来源。
     可以使用用于蛋白纯化的熟知技术的任一种或多种将在宿主细胞中表达的工程 化单胺氧化酶从所述细胞和或培养基中回收， 所述熟知技术包括但不限于 ： 溶菌酶处理、 超 声处理、 过滤、 盐析、 超速离心以及色谱。用于裂解和从诸如大肠杆菌的细菌中高效提取蛋 白的合适的溶液可以商品名 CelLytic BTM 从 St.Louis MO 的 Sigma-Aldrich 商购获得。
     用于分离单胺氧化酶的色谱技术包括但不限于 ： 反相色谱高效液相色谱、 离子交 换色谱、 凝胶电泳和亲和色谱。用于纯化特定酶的条件将部分取决于诸如静电荷、 疏水性、 亲水性、 分子量、 分子形状等因素， 并且对于本领域技术人员来说将是明显的。
     在一些实施方案中， 可以使用亲和技术来分离改良的单胺氧化酶。对于亲和色谱 纯化， 可以使用与单胺氧化酶特异性结合的任何抗体。 对于抗体制备， 可以通过用化合物注射来免疫多种宿主动物， 包括但不限于 ： 家兔、 小鼠、 大鼠等。 可以借助于侧链官能团或与侧 链官能团连接的连接物来将化合物连接到合适的载体如 BSA 上。可以依据宿主物种使用多 种佐剂来增加免疫反应， 所述佐剂包括但不限于 ： Freund’ s( 完整的和不完整的 )、 矿物胶 如氢氧化铝、 表面活性物质如溶血卵磷脂、 复合多元醇、 聚阴离子、 肽、 油乳液、 匙孔血蓝蛋 白、 二硝基苯酚和可能有用的人佐剂如 BCG( 卡介苗 ) 和短小棒状杆菌 (Corynebacterium parvum)。
     5.9 使用工程化单胺氧化酶的方法以及用其制备的化合物
     本文所描述的单胺氧化酶可以催化结构式 I 的底物化合物氧化为结构式 II(a) 的 立体异构产物 ：
     其中， 每个 A、 M 和 M’ 如上所述。
     在具体的实施方案中， 本文所述的单胺氧化酶可以催化底物 (1R， 5S)-6， 6- 二 甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷， 化合物 (1) 氧化为立体异构产物 (1R， 5S)-6， 6- 二甲 基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 -2- 烯， 化合物 (2) ：
     在将底物化合物 (1) 氧化为产物化合物 (2) 的这种方法的一些实施方案中， 与 SEQ ID NO ： 2 的野生型黑曲霉序列相比， 单胺氧化酶多肽必须具有至少下列氨基酸取代 ： (1) 残 基 465 是甘氨酸、 (2) 残基 289 是缬氨酸、 (3) 残基 384 是谷氨酰胺、 以及 (4) 残基 382 是亮 氨酸。
     在另一具体实施方案中， 本文所述的单胺氧化酶催化底物 (3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (3) 氧化为立体异构产物 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (4)， 化合物 (4) 可以进一步进行二聚化形成化合物 (5) ：
     在将底物化合物 (3) 氧化为产物化合物 (4) 的这种方法的一个实施方案中， 与 SEQ ID NO ： 1 的野生型黑曲霉序列相比， 单胺氧化酶多肽必须具有下列氨基酸取代的至少一种 ： (1) 残基 465 是甘氨酸、 (2) 残基 289 是缬氨酸、 (3) 残基 384 是谷氨酰胺、 以及 (4) 残基 365 是色氨酸。 在将底物化合物 (3) 还原为产物化合物 (4) 的这种方法的另一实施方案中， 与 SEQ ID NO ： 1 的野生型黑曲霉序列相比， 单胺氧化酶多肽必须具有下列氨基酸取代的至 少两个 ： (1) 残基 465 是甘氨酸、 (2) 残基 289 是缬氨酸、 (3) 残基 384 是谷氨酰胺、 (4) 残 基 365 是色氨酸、 以及 (3) 残基 99 是谷氨酸。在另一实施方案中， 与 SEQ ID NO ： 1 的野生 型黑曲霉序列相比， 单胺氧化酶必须具有下列氨基酸取代的至少三个 ： (1) 残基 465 是甘氨 酸、 (2) 残基 289 是缬氨酸、 (3) 残基 384 是谷氨酰胺、 (4) 残基 365 是色氨酸、 (5) 残基 99
     是谷氨酸以及 (4) 残基 135 是谷氨酰胺。在又一实施方案中， 与 SEQ ID NO ： 1 的野生型黑 曲霉序列相比， 单胺氧化酶必须具有至少下列氨基酸取代 ： (1) 残基 465 是甘氨酸、 (2) 残基 289 是缬氨酸、 (3) 残基 99 是谷氨酸、 以及 (4) 残基 135 是谷氨酰胺和 / 或残基 248 是天冬 氨酸。
     在将底物氧化为产物的这种方法的一个实施方案中， 底物被氧化为大于约 99％立 体异构体过量的产物， 其中单胺氧化酶包含对应于下列的序列 ： SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ IDNO ： 14、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 或 SEQ ID NO ： 20。
     在将底物还原为产物的这种方法的另一实施方案中， 在用大于约 25g/L 的底物和 小于约 5g/L 的多肽进行时， 在小于约 24 小时内至少约 50％的底物被转化为产物， 其中多 肽包含对应于下列的氨基酸序列 ： SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ IDNO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 或 SEQ ID NO ： 20。 在其他实施方案中， 本文所提供的单胺氧化酶的任一种可用于制备合成 Schering 505034((1R， 2S， 5S)-N-(4- 氨基 -1- 环丁基 -3， 4- 二氧代丁 -2- 基 )-3-((S)-2-(3- 叔丁 基脲基 )-3， 3- 二甲基丁酰基 )-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 甲酰胺 )) 的 中间体， Schering 505034 是可用于治疗病毒感染的蛋白酶抑制剂 (Malcolm 等人 (2006) Antimicrob.Agents Chemother.50(3) ： 1013-20)。合成 Schering 505034 的重要步骤是 将结构式 I 的化合物转化为结构式 II 的化合物， 或者更具体地， 将化合物 (1) 转化为化合 物 (2)。因此， 本公开内容提供用于制备 Schering 505034 的方法， 所述方法包括使用本公 开内容的单胺氧化酶多肽将化合物 (1) 转化为化合物 (2) 的步骤。本文所公开的用于制备 Schering 505034 的方法还可包括结合上述方案 3、 4、 5、 6、 8、 9、 10、 12 和 14 而描绘和描述的
     一个或多个步骤。
     在 其 他 实 施 方 案 中， 本文所提供的单胺氧化酶的任一种可用于制备合成 VX-950((N-((S)-1- 环己基 -2-((S)-1-((1S， 3aR， 6aS)-1-((R)-3-(2-( 环丙氨基 )-2- 氧 代乙酰基 ) 己酰基 ) 六氢环戊 [c] 吡咯 -2(1H)- 基 )-3， 3- 二甲基 -1- 氧代丁 -2- 基氨 基 )-2- 氧代乙基 ) 吡嗪 -2- 甲酰胺的中间体， VX-950 是可用于治疗病毒感染的蛋白酶抑制 剂 (Perni 等人 (2006)Antimicrob.Agents Chemother.50(3) ： 899-909)。合成 VX-950 的 重要步骤是将结构式 I 的化合物转化为结构式 II 的化合物， 或者更具体地， 将化合物 (3) 转化为化合物 (4)。 因此， 本公开内容提供用于制备 VX-950 的方法， 所述方法包括使用本公 开内容的单胺氧化酶多肽将化合物 (3) 转化为化合物 (4) 的步骤。本文所公开的用于制备 VX-950 的方法还可包括结合上述方案 3、 4、 5、 6、 7、 9、 10、 11 和 13 而描绘和描述的一个或多 个步骤。
     如本领域的技术人员已知的， 单胺氧化酶催化的氧化反应通常需要辅因子。本文 所述的单胺氧化酶催化的氧化反应通常也需要辅因子黄素腺嘌呤核苷酸 (FAD)。如本文所 用， 术语 “辅因子” 是指与单胺氧化酶组合起作用的非蛋白化合物。一般地， 将可以与单胺 氧化酶非共价或共价连接的氧化形式的辅因子添加至反应混合物中。氧化的 FAD 形式可以 通过分子氧而由还原形式 FAD-H2 再生。在另一实施方案中， 氧化的 FAD 形式可以由 NAD(P) 再生以提供 FAD 和 NAD(P)H。NAD(P) 继而可以通过使用 NAD(P)H- 依赖性醇脱氢酶 / 酮还 原酶将酮还原为醇而再生。
     本文所述的单胺氧化酶催化的氧化反应一般在溶剂中进行。合适的溶剂包括 水、 有机溶剂 ( 例如， 乙酸乙酯、 乙酸丁酯、 1- 辛醇 (octacnol)、 庚烷、 辛烷、 甲基叔丁醚 (MTBE)、 甲苯以及类似有机溶剂 ) 和离子液体 ( 例如， 1- 乙基 4- 甲基咪唑四氟硼酸盐、 1- 丁 基 -3- 甲基咪唑四氟硼酸盐、 1- 丁基 -3- 甲基咪唑六氟磷酸盐以及类似离子液体 )。在一 些实施方案中， 使用含水溶剂， 包括水和含水助溶剂系统。
     示例性的含水助溶剂系统具有水和一种或多种有机溶剂。一般地， 选择含水助溶 剂系统的有机溶剂组分使得该有机溶剂组分不会完全灭活单胺氧化酶。 可以通过利用如本 文所述的那些酶活性测定， 在候选溶剂系统中用感兴趣的限定底物测量指定的工程化单胺 氧化酶的酶活性来容易地鉴定适当的助溶剂系统。
     含水助溶剂系统的有机溶剂组分可以与含水组分混溶， 得到单一的液相 ； 或者可 以与含水组分部分混溶或不混溶， 得到两个液相。一般地， 在采用含水助溶剂系统时， 将其 选择为双相性的， 其中水分散在有机溶剂中或者反之亦然。 一般地， 在采用含水助溶剂系统 时， 期望的是选择可以容易地与水相分离的有机溶剂。一般地， 助溶剂系统中水与有机溶 剂的比通常在有机溶剂比水为约 90 ∶ 10 至约 10 ∶ 90(v/v) 的范围内和有机溶剂比水为 80 ∶ 20 与 20 ∶ 80(v/v) 之间的范围内。助溶剂系统可以在添加到反应混合物之前预形 成， 或者其可以在反应容器中原位形成。
     含水溶剂 ( 水或含水助溶剂系统 ) 可以是 pH 缓冲的或未缓冲的。一般地， 氧化可 以在约 10 或以下， 通常在约 5 至约 10 的范围内的 pH 下进行。在一些实施方案中， 氧化在 约 9 或以下， 通常在约 5 至约 9 的范围内的 pH 下进行。在一些实施方案中， 氧化在约 8 或 以下， 通常在约 5 至约 8 的范围内， 并且通常在约 6 至约 8 的范围内的 pH 下进行。氧化还 可以在约 7.8 或以下、 或 7.5 或以下的 pH 下进行。可选择地， 氧化可以在中性 pH， 即约 7 下进行。 在氧化反应过程中， 反应混合物的 pH 可以改变。典型的结构式 I 的胺在中性 pH 和约中性 pH 下是质子化的， 而结构式 II 的亚胺产物在中性 pH 和约中性 pH 下则通常不是 质子化的。因此， 在其中反应在中性 pH 或约中性 pH 下进行的典型实施方案中， 质子化的胺 向非质子化的亚胺的氧化将质子释放到水溶液中。 可以通过在反应过程中添加碱来将反应 混合物的 pH 维持在期望 pH 下或期望 pH 范围内。可选择地， 可以使用包含缓冲液的含水溶 剂控制 pH。维持期望的 pH 范围的合适的缓冲液是本领域中已知的并且包括 ： 例如， 磷酸盐 缓冲液、 三乙醇胺缓冲液以及类似缓冲液。还可以使用缓冲或碱添加的组合。
     用于中和酸的合适碱是 ： 有机碱， 例如胺、 醇盐以及类似有机碱 ； 和无机碱， 例如 氢氧化物盐 ( 例如， NaOH)、 碳酸盐 ( 例如， NaHCO3)、 碳酸氢盐 ( 例如， K2CO3)、 碱性磷酸盐 ( 例 如， K2HPO4、 Na3PO4) 以及类似无机碱。用于中和在反应过程中由胺氧化为亚胺而释放的质子 的优选的碱是胺底物本身。 在转化过程同时添加碱可以手动进行， 同时监测反应混合物 pH， 或者更方便地， 通过使用自动滴定器作为 pH 固定器 (pH stat)。还可以使用部分缓冲能力 和碱添加的组合进行过程控制。通常， 以水溶液添加在氧化过程中添加到未缓冲的或部分 缓冲的反应混合物中的碱。
     在进行本文所述的立体选择性氧化反应中， 可以将工程化单胺氧化酶以下列形式 添加到反应混合物中 ： 纯化的酶、 用编码单胺氧化酶的基因转化的全细胞、 和 / 或这种细胞 的细胞提取物和 / 或裂解物。用编码工程化单胺氧化酶的基因转化的全细胞或其细胞提取 物和 / 或裂解物可以多种不同的形式采用， 包括固体 ( 例如， 冻干的、 喷雾干燥的以及类似 形式 ) 或半固体 ( 例如， 粗糊料 )。
     可以通过沉淀 ( 硫酸铵、 聚乙烯亚胺、 热处理或类似方法 ) 部分纯化细胞提取物或 细胞裂解物， 随后在冻干之前是脱盐程序 ( 例如， 超滤、 透析和类似方法 )。 可以通过使用诸 如戊二醛的已知交联剂的交联或固定于固相 ( 例如， Eupergit C 和类似物 ) 来稳定任一细 胞制剂。
     可以将固体反应物 ( 例如， 酶、 盐等 ) 以多种不同形式提供到反应中， 包括 ： 粉末 ( 例如， 冻干的、 喷雾干燥的和类似形式 )、 溶液、 乳液、 悬浮液以及类似形式。可以使用本领 域普通技术人员已知的方法和设备容易地将反应物冻干或喷雾干燥。例如， 可以将蛋白溶 液在 -80℃以小份冷冻， 然后将其添加到预冷冻的冻干室中， 随后施加真空。从样品中移除 水之后， 在释放真空并取回冻干样品之前， 通常将温度升至 4℃持续 2 小时。
     氧化反应中所用的反应物的量一般将依据所需的产物的量以及同时采用的单胺 氧化酶底物的量而变化。 一般地， 使用约 50mg/ 升至约 5g/ 升的单胺氧化酶时可以使用约 5 克 / 升至 50 克 / 升的浓度的底物。本领域普通技术人员将容易地了解如何改变这些量来 使它们适合期望的产力水平和产物规模。 可以通过常规实验容易地确定任选试剂如过氧化 氢酶、 消泡剂和亚硫酸氢钠或偏亚硫酸氢钠的适当量。
     反应物添加的顺序不是严格的。可以将反应物在同一时间一起添加到溶剂 ( 例 如， 单相溶剂、 双相含水助溶剂系统以及类似溶剂 ) 中， 或者可选择地， 在不同的时间点， 一 些反应物可以分别添加， 并且一些反应物一起添加。在某些实施方案中， 可以将反应的一 种或多种组分以将单胺氧化酶的底物和 / 或产物抑制最小化或消除的水平连续添加 (“进 料” ) 至反应中。在某些实施方案中， 可以在反应过程中间断地添加单胺氧化酶， 例如约每
     隔 1 小时、 约每隔 2 小时、 约每隔 3 小时或约每隔 4 小时添加。
     进行本文所述的单胺氧化酶催化的氧化反应的合适条件包括可以通过常规实验 容易地优化的大量条件， 所述常规实验包括但不限于使工程化单胺氧化酶和底物在实验 pH 和温度下接触并通过例如本文所提供的实施例中描述的方法检测产物。
     单胺氧化酶催化的氧化通常在约 5℃至约 75℃的范围内的温度下进行。对于一些 实施方案， 反应在约 20℃至约 55℃的范围内的温度下进行。在其他的实施方案中， 反应在 约 20℃至约 45℃的范围内、 约 30℃至约 45℃的范围内或约 40℃至约 45℃的范围内的温度 下进行。反应还可以在环境温度下 ( 约 21℃ ) 进行。
     一般容许氧化反应进行到直至获得基本上完全的或接近完全的底物氧化。 可以使 用检测底物和 / 或产物的已知方法来监测底物至产物的氧化。合适的方法包括气相色谱、 HPLC 以及类似方法。转化产率一般大于约 50％、 还可以大于约 60％、 还可以大于约 70％、 还可以大于约 80％、 还可以大于约 90％并且通常大于约 97％。
     6. 实施例
     本公开内容的多种特征和实施方案在下列代表性实施例中示例， 这些实施例旨在 示例性的并且不旨在限制。
     实施例 1 ： 野生型单胺氧化酶基因获取和表达载体构建 .
     基于报道的单胺氧化酶氨基酸序列和如在美国临时申请系列第 60/848,950 号的 实施例 1 中所述的密码子优化算法将单胺氧化酶编码基因设计为在大肠杆菌 (W3110fhuA 或 UM2) 中表达， 所述美国临时申请系列第 60/848,950 号通过引用并入本文。使用由例 如 42 个核苷酸构成的寡核苷酸合成基因， 并将该基因克隆到受 lac 启动子控制的表达 载体 pCK110900( 如在美国专利申请公布 20060195947 的图 3 中所描绘的 ) 中。表达载 体还含有 P15a 复制起点和氯霉素抗性基因。使用标准方法将所得质粒转化到大肠杆菌 W3110 中。密码子优化的基因的实例以及编码多肽列于表 4 中。使用本领域中已知的方 法或其改造方法确定野生型单胺氧化酶的活性， 所述方法包括 Zhou 等人 (Zhou 等人 “A One-Step FluorometricMethod for the Continuous Measurement of Monoamine Oxidase Activity( 单 胺 氧 化 酶 活 性 连 续 测 量 的 一 步 式 荧 光 法 )， ” 1997 Anal.Biochem.253 ： 169-74) 和 Szutowicz 等人 (Szutowicz 等人， “Colorimetric Assay forMonoamine Oxidase in Tissues Using Peroxidase and2， 2′ -Azino(3-ethtylbenzthaizoline-6-sulfonic Acid)as Chromogen( 使用过氧化物酶和 2， 2′ - 连氮基 (3- 乙基苯并噻唑啉 -6- 磺酸 ) 作 为色原进行的组织中单胺氧化酶的比色测定 )， ” 1984， Anal.Biochem.138 ： 86-94) 所公开 的那些方法。酶活性的比较是使用限定的酶制剂、 在设定条件下的限定的测定和一种或多 种限定的底物进行的， 如本文进一步详细描述的 ； 或者使用例如 Zhou 和 Szutowicz 的方法 进行的。 一般地， 当比较裂解物时， 测定细胞数和测定的蛋白的量并且使用相同的表达系统 和相同的宿主细胞来将宿主细胞产生的酶和裂解物中存在的酶的量的差异最小化。
     将编码本公开内容的工程化单胺氧化酶的多核苷酸同样地克隆到用于在大肠杆 菌 W3110 中表达的载体 pCK110900 中。
     实施例 2 ： 单胺氧化酶粉末的产生 ； 摇瓶程序 .
     如下从摇瓶培养物制备单胺氧化酶粉末 ： 将含有带感兴趣的单胺氧化酶基因的 质粒的单个大肠杆菌微生物菌落接种到含有 30μg/ml 氯霉素和 1％葡萄糖的 50ml Luria Bertani 肉汤中。 使细胞在 30℃的培养箱中生长过夜 ( 至少 16 小时 )， 同时以 250rpm 振荡。 将培养物稀释到在 1 升烧瓶中的 250ml 2XYT(16g/L 细菌用胰蛋白胨、 10g/L 酵母提取物、 5g/L NaCl， pH 7.0)、 1mM MgSO4、 30μg/ml 氯霉素中至 600nm 处的光密度 (OD600) 为 0.2， 并容许其在 30℃下生长。在培养物的 OD600 为 0.6 至 0.8 时用 1mMIPTG 诱导单胺氧化酶基 15 分钟， 4℃ ) 收获细胞并弃 因的表达并孵育过夜 ( 至少 16 小时 )。通过离心 (5000rpm， 去上清液。用等体积的冷 (4℃ )100mM 三乙醇胺 ( 盐酸盐 ) 缓冲液， pH 7.0( 任选包含 2mM MgSO4) 重悬细胞团粒， 并如上通过离心收获。 将洗涤的细胞重悬在两体积的冷三乙醇胺 ( 盐 酸盐 ) 缓冲液， pH 7.0 中并以 12000psi 通过弗氏压碎器两次， 同时保持温度在 4℃。通过 离心 (9000rpm， 45 分钟， 4℃ ) 移除细胞碎片。 收集澄清的裂解物上清液并储存在 -20℃下。 冻干冷冻的澄清裂解物， 得到粗单胺氧化酶的干燥粉末。
     实施例 3 ： 单胺氧化酶的制备 ； 发酵程序 .
     如下通过发酵制备单胺氧化酶粉末 ： 在充气搅拌的 15L 发酵罐中， 使 6.0L 的生长 培养基升至温度为 30℃， 所述生长培养基含有 0.88g/L 硫酸铵、 0.98g/L 柠檬酸钠 ； 12.5g/ L 三水磷酸氢二钾、 6.25g/L 磷酸二氢钾、 6.2g/LTastone-154 酵母提取物、 0.083g/L 柠檬酸 铁铵和 8.3ml/L 的微量元素溶液， 该微量元素溶液含有 2g/L 二水氯化钙、 2.2g/L 七水硫酸 锌、 0.5g/L 一水硫酸锰、 1g/L 七水硫酸亚铜、 0.1g/L 四水钼酸铵和 0.02g/L 十水四硼酸钠。 用指数生长晚期的大肠杆菌 W3110 培养物接种发酵罐， 所述大肠杆菌 W3110 培养物含有具 有感兴趣的单胺氧化酶基因的质粒， 其如实施例 3 所述在摇瓶中生长至 0.5 至 2.0 的起始 OD600。 以 500 至 1500rpm 搅拌发酵罐， 并以 1.0-15.0L/ 分钟向发酵容器中供给空气以维持 30％饱和或更高的溶氧水平。通过添加 20％ v/v 氢氧化铵将培养物的 pH 控制在 7.0。通 过添加进料溶液维持培养物的生长， 所述进料溶液含有 ： 500g/L 结晶葡萄糖、 12g/L 氯化铵 和 10.4g/L 七水硫酸镁。在培养物达到 OD600 为 50 后， 通过添加异丙基 -β-D- 硫代半乳 糖苷 (IPTG) 至终浓度为 1mM 诱导单胺氧化酶表达。使培养物再生长 14 小时。将培养物冷
     却至 4℃并维持在 4℃直至收获。通过在 4℃下 Sorval RC12BP 离心机中以 5000G 离心 40 分钟来收获细胞。将收获的细胞直接用于随后的下游回收过程或将其储存 4 在 4℃下直到 如此使用。
     在细胞直接用于下游回收过程时， 在 4℃下将细胞团粒以每体积湿细胞糊料 2 体积的 100mM 三乙醇胺 ( 盐酸盐 ) 缓冲液， pH6.8 重悬。通过使用 12000psig 的压力将悬浮 液通过装备有两级匀浆阀组件的匀浆器来使胞内单胺氧化酶从细胞中释放。 在破裂后立即 将细胞匀浆冷却至 4℃。将 10％ w/v 聚乙烯亚胺溶液， pH 7.2 添加至裂解物中至终浓度为 0.5％ w/v 并搅拌 30 分钟。 通过在标准的实验室离心机中以 5000G 离心 30 分钟来澄清所得 悬浮液。滗去澄清的上清液并使用分子量截留为 30Kd 的纤维素超滤膜浓缩 10 倍。将最终 的浓缩物分散到浅容器中， 在 -20℃下冷冻并冻干成粉末。将单胺氧化酶粉末储存在 -80℃ 下。
     实施例 4 ： 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷， 化合物 (1) 转化为 (1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 -2- 烯， 化合物 (2) 的分析方法
     通过下面所述的手性 GC 方法测定 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷的转化 和 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 -2- 烯产物的立体异构纯度。洗脱顺序为 ： 底物 (1)( 保留时间约 7 分钟 )， 期望的 (1R， 2S)- 亚胺 (2)( 约 10.6 分钟 )， 不期望的 (1S， 2R) 亚 胺 ( 约 11.0 分钟 ) 柱子 ： Supelco Betadex 225( 部件号 24348)， 0.25mm×30m×0.25um ； 炉 温： 85℃等温 ； 载流 ： 1.1ml/ 分钟 ； 进样体积 ： 4μL ； 以及分流进样 ： 100 ∶ 1 ； 进样器温度＝ 200℃ ； FID 检测。
     实施例 5 ： 八氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (3) 转化为 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六 氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (4) 的分析方法
     使用下面所述的手性 GC 方法测定八氢环戊 [c] 吡咯的转化和产物的立体异构纯 度。洗脱顺序为 ： 底物 (3)( 保留时间约 2.7 分钟 )， 期望的 (3aS， 6aR) 亚胺 (4)( 约 5.5 分钟 )， 不期望的 (3aR， 6aS)- 亚胺 ( 约 5.8 分钟 )。亚胺 (4) 的二聚体在进样口中热解 (thermolyze) 为亚胺。 柱子 ： Supelco Betadex225( 部件号 24348)， 0.25mm×30m×0.25um ； 炉温 ： 120℃等温 ； 载流 ： 1.1ml/ 分钟 ； 进样体积 ： 4μL ； 以及分流进样 ： 100 ∶ 1 ； 进样器温 度＝ 200℃ ； FID 检测。
     实施例 6 ： 野生型单胺氧化酶氧化化合物 (1)6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 烷的评定
     对 本 文 所 公 开 的 野 生 型 单 胺 氧 化 酶 进 行 了 它 们 将 6， 6 二 甲 基 -3- 氮 杂 二 环 [3.1.0] 己烷， 化合物 (1) 氧化为 6， 6- 甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 -2- 烯， 化合物 (2) 的 能力的筛选。 在空气下向 50-mL 3 颈烧瓶中添加 25mL 100mMpH 3.0 磷酸钾缓冲液和 330μL 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷， 得到均匀的溶液。经由浓 H3PO4 将 pH 调节至大约 7.3。向经 pH 调节的溶液中添加 60μL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Sigma Aldrich ； 目录号 C-3515) 和在 pH 8.0 的磷酸钾缓冲液中的 150mg 具有 SEQ ID NO 2( 黑曲霉 ) 或 SEQ IDNO 32( 米曲霉 ) 的野生型单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 2 的摇瓶方法制备 )。在空气下搅拌 所得的浅黄色溶液 24 小时。经由受反馈控制而以 1-5μL 逐份添加 1N NaOH 来将 pH 维持 在 7.2。( 胺反应物在中性 pH 下是质子化的 ； 亚胺产物则不是。所以必须中和释放质子的 作用以维持 pH)。
     用 10N NaOH 将 pH 增至大约 14 来猝灭反应， 采用用于分相的离心用 CDCl3 萃取混 合物。来自使用黑曲霉野生型单胺氧化酶的反应的 CDCl3 溶液的 1H-NMR 分析表明约 20％ 的胺 (1) 转化为亚胺 (2)。 与使用黑曲霉野生型单胺氧化酶的反应相比， 使用米曲霉野生型 单胺氧化酶的反应消耗了两倍量的 NaOH 溶液， 这表明转化了约两倍的量的胺 (1)。.根据实施例 4 的方法的手性 GC 分析显示了期望的 (1R， 5S)- 亚胺 (2)。未检测出 不期望的 (1S， 5R)- 亚胺对映体。
     这个实施例证明这些野生型单胺氧化酶对化合物 (1)6， 6 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷具有低活性， 并且将化合物 (1) 转化为期望的 (1R， 5S)- 亚胺 (2)。
     实施例 7 ： 野生型单胺氧化酶氧化八氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (3) 的评定
     对本文所公开的野生型单胺氧化酶进行了它们将 ( 八氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (3) 氧化为 (3aS， 6aR)1， 3a， 4， 5， 6， 6a 六氢环戊 [c] 吡咯 )， 化合物 (4) 的能力的筛选。在空气 下向 50-mL 3 颈烧瓶中添加 25mL 100mM pH 8.0 磷酸钾缓冲液和 375mg 的盐酸八氢环戊 [c] 吡咯并用 1N NaOH 将 pH 调节为大约 7.3。向经 pH 调节的溶液中添加 60μL 黑曲霉过 氧化氢酶悬浮液 ( 购自 Sigma Aldrich ； 目录号 C-3515) 和在 pH 8.0 的磷酸钾缓冲液中的 150mg 具有 SEQ ID NO 2( 黑曲霉 ) 的野生型单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 2 的摇瓶方法 制备 )。在空气下搅拌所得的浅黄色溶液 24 小时。经由受反馈控制而以 1-5μL 逐份添加 1N NaOH 来将 pH 维持在 7.2。24 小时后观察到少量或没有 NaOH 消耗。用 10N NaOH 将 pH 增至大约 14 来猝灭反应， 用 CDCl3 萃取混合物。经由离心 (6000rpm 5 分钟 ) 分相后， CDCl3 1 溶液的 H-NMR 分析表明极少或没有胺 (3) 转化为亚胺 (4)。
     这个实施例证明野生型单胺氧化酶对八氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (3) 即便存在任 何活性也具有极小的活性。
     实施例 8 ： 高通量测定单胺氧化酶对 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷， 化 合物 (1) 的活性
     将通过定向进化获得的并且含有进化的单胺氧化酶基因的质粒文库转化到大肠 杆菌中并在含有 1 ％葡萄糖和 30μg/mL 氯霉素 (CAM) 的 Luria-Bertani(LB) 肉汤上铺 板。在 30℃下孵育至少 16 小时之后， 使用 自动菌落挑取器 (Genetix USA， Inc.， Beaverton， OR) 将菌落挑取至含有下列物质的 96 孔浅孔微量滴定板中 ： 180μL Terrific 肉汤 (TB)、 1％葡萄糖、 30μg/mL 氯霉素 (CAM) 和 2mM MgSO4。使细胞在 30℃下 200rpm 震 荡下生长过夜。然后将 20μL 的这种培养物转移到含有下列物质的 96 孔深孔板中 ： 350μL Terrific 肉汤 (TB)、 2mM MgSO4 和 30μg/mL CAM。在 30℃下 250rpm 震荡下孵育深孔板 2.5 至 3 小时 (OD6000.6-0.8) 之后， 通过添加异丙基 βD 硫代半乳糖苷 (IPTG) 至终浓度为 1mM 诱导细胞培养物的重组基因表达。然后在 30℃下 250rpm 震荡下孵育板 15-23 小时。
     通过离心沉淀细胞， 重悬于 400μL 裂解缓冲液中并通过在室温下震荡至少 2 小时 裂解细胞。裂解缓冲液含有 50mM 磷酸钠缓冲液， pH 7.0、 1mg/mL 溶菌酶和 500μg/mL 硫酸 多粘菌素 (polymixin)B。通过离心沉淀细胞碎片。
     通过将 20μL 适当稀释的澄清的裂解物上清液转移到 96 孔深孔微量滴定板的孔 中来测量单胺氧化酶活性， 96 孔深孔微量滴定板的孔中具有含下列物质的 180μL 测定混 合物 ： 50mM 磷酸钠缓冲液 (pH 7.5)、 4U/ml 黑曲霉过氧化氢酶 (Sigma-C3515) 和以其乙酸 盐提供的 40mM 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷。密封测定板并在室温下震荡 4 小 时。通过添加 500μL 1 ∶ 1 的乙腈∶水猝灭反应并将板离心。离心后， 将 150μL 上清液 转移到浅孔板中用于通过根据实施例 4 的方法进行 HPLC 分析。
     HPLC 条件 ： 40℃的 2.1×75mm Zorbax Eclipse XDB C-18 3.5 微米粒度的柱子， 0.5mL/ 分钟的 60 ∶ 40 40mM 乙酸铵 / 乙腈的流动相。亚胺在约 1 分钟 (254nm) 洗脱。仅可以检测到亚胺并且使用亚胺信号的绝对峰面积进行变体的活性分级。
     可选择地， 用 100μL 10N NaOH 猝灭测定反应并用 1 ∶ 1 v/v MTBE 萃取并通过实 施例 4 的方法进行手性 GC 分析。
     实施例 9 ： 高通量测定单胺氧化酶对八氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (3) 的活性
     如实施例 8 中所述在 96 孔板上制备含有单胺氧化酶变体的裂解物。
     通过将 50μL 澄清的裂解物转移到 96 孔深孔微量滴定板的孔中来测量单胺氧化 酶的活性， 96 孔深孔微量滴定板的孔中具有含下列物质的 450μL 测定混合物 ： 100mM 磷酸 钠缓冲液 (pH 7.5)、 4U/ml 黑曲霉过氧化氢酶 (Sigma-C3515) 和 50mM 八氢环戊 [c] 吡咯。 密封测定板并在室温下震荡 16 小时。将板离心并将 100μL 上清液猝灭在浅孔板孔中的 100μL 乙腈中以用于根据实施例 5 的 HPLC 分析。
     通过添加 100μL 乙腈猝灭反应并将板离心。离心后， 100μL 上清液为 100μL 乙 腈并将其转移到浅孔板中用于通过根据实施例 4 的方法进行 HPLC 分析。
     HPLC 条件 ： 0℃的 2.1×75mm Zorbax Eclipse XDB C-18 3.5 微米粒度的柱子， 0.5mL/ 分钟的 70 ∶ 30 40mM 乙酸铵 / 乙腈的流动相。亚胺在约 1.3 分钟 (254nm) 洗脱。 仅可以检测到亚胺并且使用亚胺信号的绝对峰面积进行变体的分级。
     可选择地， 用 100μL 10N NaOH 猝灭测定反应并用 1 ∶ 1v/v MTBE 萃取并进行实 施例 5 的手性 GC 分析。
     这个实施例描述了用于鉴定在氧化八氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (3) 方面被改良的 单胺氧化酶变体的方法。
     实施例 10 ： (1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 -2- 烯， 化合物 (2) 的 制备级生产
     在约 25℃下向配备有 300rpm 的顶置式搅拌器的 500-mL 4 颈烧瓶中添加 150mL 的 Milli-Q 水和 1.2mL( 大约 1.0g ； 大约 9 毫摩尔 ) 的 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 烷， 得到 pH 为 11.8 的均匀溶液。逐份添加 Na2S2O5 直至达到 pH 7.5。向该无色溶液中添加 300μL Antifoam-204(Sigma 目录号 A-6226) 和 600μL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Sigma Aldrich ； 目录号 C-3515)， 得到 pH 7.5 的无色溶液。向此溶液中添加 1.5g 具有 SEQID NO 10 的单胺氧化酶粉末 ( 通过根据实施例 3 的发酵制备 )， 得到黄色溶液。 插入空气喷射探针 (air sparging probe)( 气流速率约 60mL/ 分钟 )， 并且反应混合物的 pH 开始立即降低。 经 由受反馈控制的 2N NaOH 进料维持 pH。大约 30 分钟后， pH 保持稳定并且不再进行碱进料。 又 10 分钟 ( 共 40 分钟 ) 之后， 将 120mL 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 NaHSO3 溶 液 ( 通过添加 20.8g 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷至 150mL dH2O 中并添加足够 的 Na2S2O5 至达到 pH 7.2 制备 ) 以 0.25mL/ 分钟的速率添加至反应中。反应混合物的 pH 开始立即下降并重新开始进料 2N NaOH。在大约 8 小时 (9 小时的总反应时间 ) 后完成 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷和 NaHSO3 的溶液的添加。继续碱添加并且在完成底 物添加之后增加碱添加速率。取 200μL 小份， 用 200μL 8N NaOH( 使氨基磺酸盐分解为游 离的亚胺 ) 猝灭并用 600μL CDCl3 萃取。CDCl3 提取物的 1H-NMR 分析显示底物 (1) 完全转 化为氮杂二环 [3.1.0] 己 -2- 烯， 化合物 (2)(1H-NMR(300MHz， CDCl3) 谱 ： δ7.42(s， 1H， N＝ C-H)， 3.81(dd ； J ＝ 6.1， 17.8 ； 1H)， 3.50(dd ； J ＝ 2.1， 17.8 ； 1H)， 2.06(m ； 1H)， 1.62(m， 1H)， 1.03(s， 3)， 0.80(s， 3H))。手性 GC 分析显示了 (1R， 5S) 对映体 (2)， 而没有可检测的 (1S， 2R) 对映体。
     反应混合物 “原样” 用于氨基腈的氰化反应 )。
     实施例 11 ： 在静态空气层下单胺氧化酶催化 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 烷 (1) 去对称化为 (1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 -2- 烯 (2).
     在空气下向 50-mL 3 颈烧瓶中添加 25mL 100mM pH 3.0 磷酸钾缓冲液和 330μL 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷， 得到均匀的溶液。使用浓 H3PO4 将 pH 调节至大约 7.5。向经 pH 调节的溶液中添加 60μL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Sigma Aldrich ； 目录号 C-3515) 和在 pH 8.0 的磷酸钾缓冲液中的 150mg 具有 SEQ ID NO 4、 SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO 8 的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 2 的方法制备 )。 在空气下搅拌所得的浅黄色溶液 24 小时。经由受反馈控制而以 1-5μL 逐份添加 1N NaOH 来将 pH 维持在 7.4。然后用 10N NaOH 将 pH 增至大约 14 来猝灭反应。用 CDCl3 萃取混合物样品。经由离心 (6000rpm 5 分 1 钟 ) 分相后， H-NMR 分析表明至少 95％的胺 (1) 转化为亚胺 (2)。通过实施例 4 的方法进 行的手性 GC 分析显示了 (1R， 5S)- 亚胺对映体 (2)。没有检测到 (1S， 2R) 对映体。
     实施例 12 ： 在氧气层下单胺氧化酶催化 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 (1) 去对称化为 (1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 -2- 烯 (2)
     在空气下向 50-mL 3 颈烧瓶中添加 25mL 100mM pH 3.0 磷酸钾缓冲液和 330μL 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷， 得到均匀的溶液。用浓 H3PO4 将 pH 调节至大约 7.5。向经 pH 调节的溶液中添加 60μL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Sigma Aldrich ； 目录号 C-3515) 和在 pH 8.0 的磷酸钾缓冲液中的 150mg SEQ ID NO 4、 SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO 8 的多肽的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 2 的方法制备 )。通过用氧气流冲洗顶空并将所 得浅黄色溶液在空气下搅拌 24 小时。经由受反馈控制而以 1-5μL 逐份添加 1N NaOH 来将 pH 维持在 7.4。用 10N NaOH 将 pH 增至大约 14 来猝灭反应。用 CDCl3 萃取混合物样品。经 1 由离心 (6000rpm 5 分钟 ) 分相后， H-NMR 分析表明至少 95％的胺 (1) 转化为亚胺 (2)。通 过实施例 4 的方法进行的手性 GC 分析显示了 (1R， 5S)- 亚胺对映体 (2)。没有检测到 (1S， 2R) 对映体。
     实施例 13 ： 在亚硫酸氢盐存在下空气喷射的情况下单胺氧化酶催化 6， 6- 二甲 基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 (1) 去对称化为 (1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 -2- 烯 (2)
     向 100-mL 烧 瓶 中 添 加 40mL 的 dH2O 和 1.8mL 的 6， 6- 二 甲 基 -3- 氮 杂 二 环 [3.1.0] 己烷， 得到 pH 为大约 11.4 的均匀溶液。向此溶液中添加 2.7g 的 Na2S2O5， 得到 均匀溶液并通过添加约 1mL 的 8N NaOH 将 pH 调节为大约 7.5。向此溶液中添加 60μL 的 Antifoam-204(Sigma， 目 录 号 A-6226)、 120μL 的 黑 曲 霉 过 氧 化 氢 酶 悬 浮 液 (Sigma Aldrich ； 目录号 C-3515) 和在 10mL 100mM pH 8.0 的磷酸钾缓冲液中的 300mg SEQ ID NO ： 8 的多肽的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 2 的方法制备 )。 通过多孔玻璃将空气喷射反应混 合物中并于室温 ( 约 21℃ ) 下在空气喷射下搅拌所得浅黄色溶液 24 小时。经由受反馈控 制的以 1μL 逐份添加 2.5N NaOH 来将 pH 维持在 7.4。用 10N NaOH 将 pH 增至大约 14 来猝 灭反应并将亚胺 - 亚硫酸氢盐加成物 ( 氨基磺酸盐 ) 分解为游离亚胺并通过萃取到 MTBE 中 来萃取分离产物。相分离之后， 经由蒸馏分离 (1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 1 己 -2- 烯， 产率为 86％。在 CDCl3 中的 H-NMR 分析 ( 如实施例 10 中 ) 确定化合物 (1) 转化为了亚胺化合物 (2)。通过实施例 4 的方法进行的手性 GC 分析显示了 (1R， 5S)- 亚胺对 映体 (2)。没有检测到 (1S， 2R) 对映体。
     用 1.0 当量在 D2O 中的 NaHSO3 处理如此获得的 (1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 1 [3.1.0] 己 -2- 烯。 H-NMR 分析表明了向亚硫酸氢盐加成物的定量转化， (1H-NMR(300MHz， D2O) 谱 ： δ4.8(d， J ＝ 1， 1H(NC(H)SO3 ； 主 要 非 对 映 体 )， 4.5(d， J ＝ 5， 1H(NC(H)SO3 ； 次 要非对映体 )， 3.4-3.6(m， 2H ； 次要非对映体 )， 3.25(dd， J ＝ 3， 10， 1H ； 主要非对映体 )， 3.05(dd， 1H ； J ＝ 1， 10 ； 主要非对映体 )， 1.65(m， 1H ； 主要和次要非对映体 )， 1.55(m， 1H， 主 要和次要非对映体 )， 1.22(s， 3H ； 次要非对映体 )， 1.15(s， 3H ； 次要非对映体 )， 1.10(s， 3H， 主要非对映体 )， 1.00(s， 3H ； 次要非对映体 )。
     实施例 14 ： 在空气喷射并同时添加底物和亚硫酸氢盐情况下单胺氧化酶催化 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 (1) 去对称化为 (1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 -2- 烯 (2).
     在室温 ( 约 21℃ ) 下向配备有 300rpm 的顶置式搅拌器的 500-mL 4 颈烧瓶中添 加 150mL 的 Milli-Q 水和 1.2mL( 大约 1.0g ； 大约 9 毫摩尔 ) 的 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷， 得到 pH 为 11.8 的均匀溶液。逐份添加 Na2S2O5 直至达到 pH 7.5。向该无色 溶液中添加 300μL Antifoam-204(Sigma 目录号 A-6226) 和 600μL 黑曲霉过氧化氢酶悬 浮液 (SigmaAldrich ； 目录号 C-3515)， 得到 pH 7.5 的无色溶液。 向此溶液中添加 1.5g SEQ ID NO ： 8 的多肽的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 3 的方法制备 )， 得到黄色溶液。插入空气 喷射探针并将空气以约 60mL/ 分钟的速率喷射反应中并且注意到反应混合物的 pH 开始立 即降低。经由受反馈控制的 2NNaOH 添加维持 pH。约 30 分钟后， pH 保持稳定并且不再进行 碱添加。又 10 分钟 ( 共 40 分钟 ) 之后， 将 120mL 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 NaHSO3 溶液 (20.8g 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷与 150mL dH2O 和足够的 Na2S2O5 至达到 pH 7.2) 以 0.25mL/ 分钟的速率添加至反应混合物中。 反应混合物的 pH 开始立即下 降并重新开始添加 2N NaOH。在约 8 小时 (9 小时的总反应时间 ) 后完成 6- 二甲基 -3- 氮 杂二环 [3.1.0] 己烷 /NaHSO3 的添加。继续碱添加并且在完成底物添加之后增加碱添加速 率。用 10NNaOH 将 pH 增至大约 14 来猝灭反应 ( 并分解亚胺 - 亚硫酸氢盐加成物 )， 用 MTBE 萃取混合物。相分离之后， 经由 MTBE 溶液的蒸馏分离 (1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 1 [3.1.0] 己 -2- 烯， 产率为 72％。在 CDCl3 中的 H-NMR 分析 ( 如实施例 10 中 ) 确定化合物 (1) 转化为了亚胺化合物 (2)。 通过实施例 4 的方法进行的手性 GC 分析显示了 (1R， 5S)- 亚 胺对映体 (2)。没有检测到 (1S， 2R) 对映体。
     实施例 15 ： (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈的制备 ( 静 态底物模式 )。
     向 100-mL 烧瓶中添加 40mL 的 dH2O 和 1.8mL 的 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷， 得到 pH 为大约 11.4 的均匀溶液。向此溶液中添加 2.7gNa2S2O5， 得到均匀溶液并用 约 1mL 8N NaOH 将 pH 调节为约 7.5。向此溶液中添加 60μL Antifoam-204(Sigma 目录 号 A-6226)、 120μL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Sigma Aldrich ； 目录号 C-3515) 和在 10mL 100mM pH8.0 的磷酸钾溶液中的 300mg SEQ ID NO 8 的多肽的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施 例 2 的方法制备 )。通过多孔玻璃将空气以约 10mL/ 分钟的速率喷射反应混合物中并于室 温 ( 约 21℃ ) 下在空气下搅拌所得浅黄色溶液 24 小时。整个过程中， 经由受反馈控制而以1μL 逐份添加 2.5N NaOH 来将 pH 维持在 7.4。24 小时后， 添加 1.0g(1.3 当量 )NaCN 至反 应混合物中， 然后加入 (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 磺酸盐。 在 室温下 ( 约 21℃ ) 再搅拌 15 分钟， 然后用 MTBE 萃取混合物。( 还可以使用 2-Me-THF 进行 萃取。 ) 在相分离和溶剂移除之后， 分离到 1.78g(90％产率 ) 浅黄色固体的 (1R， 2S， 5S)-6， 1 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈。在 CDCl3 中的 H-NMR 确定了 (1R， 2S， 5S)-6， 1 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈的制备 ( H-NMR(300MHz， CDCl3) 谱 ： δ3.92(d， J ＝ 1.2， 1H， NC(H)(CN))， 3.25(m， 1H)， 2.96(dd， J ＝ 2.1， 17.0)， 1.48(dd ； J ＝ 1， 2， 12.2 ； 1H)， 1.42(m， 1H)， 1.13(s， 3H)， 1.11(S， 3H))。
     当如此制备包含 (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 磺酸盐 的反应混合物并在室温下用 3.0 当量的 NaCN 处理该反应混合物 12 小时时， 在具有期望的 反式 ((1R， 2S， 5S) 立体异构体的混合物中观察到约 25％的非期望的顺式立体异构体 (1R， 2R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈。在 CDCl3 中的 1H-NMR 显示出在 4.22ppm 下为双重态 (J ＝ 4.2) 的顺式 - 氨基腈次甲基质子。
     实施例 16 ： (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈的制备 ( 连 续底物添加模式 )。
     步骤 1. 在室温 ( 约 21℃ ) 下向配备有顶置式搅拌器 (300rpm) 的 500-mL4 颈烧 瓶中添加 150mL Milli-Q 水和 1.2mL( 大约 1.0g 和 9 毫摩尔 )6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷， 得到 pH 为 11.8 的均匀溶液。逐份添加 Na2S2O5 直至 pH 达到 7.5。向该无色 溶液中添加 300μL Antifoam-204(Sigma 目录号 A-6226) 和 600μL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮 液 (SigmaAldrich ； 目录号 C-3515)， 得到 pH 7.5 的无色溶液。向此溶液中添加 300mg 具有 SEQ ID NO 12 的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 3 的方法制备 )， 得到黄色溶液。插入空气 喷射探针 ( 气流速率约 60mL/ 分钟 )， 并且反应混合物的 pH 开始立即降低。经由受反馈控 制的 2N NaOH 添加维持 pH。大约 40 分钟后， pH 保持稳定并且不再进行碱添加。又 10 分钟 ( 共 50 分钟 ) 之后， 将 150mL 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 NaHSO3 溶液 (26.1g 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷与 160mL dH2O 和足够的 Na2S2O5 至达到 pH 7.2) 以 0.12mL/ 分钟的速率添加至反应混合物中。 反应混合物的 pH 开始立即下降并重新开始添加 2N NaOH。在大约 21 小时 ( 大约 22 小时的总反应时间 ) 后完成 6.6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 /NaHSO3 添加。在底物添加完成之后， 以增加的速率继续碱添加。24 小时后， 1 通过 H NMR 分析判断反应完成。
     步骤 2. 在 24 小时后， 通过 1H NMR 分析判断反应完成， 将 10.0g NaCN(1.11 当量 ) 添加到反应混合物中， 得到 pH 9.9 的乳白色反应混合物。24 小时后， 通过 1H NMR 分析判断 反应完成。30 分钟后， 用 300mL MTBE 萃取反应物。排掉下层水相 ( 大约 250mL) 并将上层 有机层通过 6g(2” 直径 ×1/4” 高) 过滤。用 300mL MTBE 冲洗 并使用 冲洗中所用的 MTBE 萃取水相。合并有机相并使用旋转蒸发器在 40℃下于减压下浓缩 1 小 时， 得到白色固体。将白色固体在减压下进一步干燥 30 分钟， 得到 23.9g(95％产率 )(1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈。
     实施例 17 ： 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 羧酸甲酯的制备
     通过 PCT 国际申请公布 WO 2007/075790 中所述的程序将根据实施例 16 或 17 制 备的 (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈转化为相应的基本上对映体纯的 (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 羧酸甲酯。
     实施例 18 ： (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈的制备， NaCN 当量和反应时间对氨基腈的反 / 顺异构体比的影响。
     该程序与实施例 15 中直到添加 NaCN 之前的程序相同， 不同的是通过实施例 3 的 方法制备 SEQ ID NO 8 的单胺氧化酶粉末。24 小时后， 如表 5 中所示逐份添加 NaCN 至反 应混合物 (1.0 当量 NaCN 是 720mg 95％ NaCN)。在每个预定的时间间隔之后， 取出 200μL 1 小份， 用 1mL CDCl3 萃取并然后通过 H-NMR 分析。反 / 顺异构体比 ((1R， 5S)-6， 6- 二甲 基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈的期望的 2S 和不期望的 2R 差向异构体之间的比率 ) 通过氨基腈次甲基质子共振的 1H-NMR 积分 ( 反式异构体＝ 3.92ppm 处的双峰 ； 顺式异构体 ＝ 4.22ppm 处的双峰 ) 来测定。
     表5
     .ND ＝未测定。2. ＞ 100 意味着未检测到顺式次甲基共振。
     在最后的小份之后， 用 100mL 乙酸乙酯萃取反应混合物并通过粗砂过滤， 得到清 楚的相分离。添加 20mL 庚烷至有机相。经由在 40℃下的旋转真空蒸发 1 小时来蒸发有机 相以便干燥。1H-NMR 分析表明反 / 顺异构体比保持在 12 ∶ 1。
     实施例 19 ； (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈的制备， 方 法稳固性
     步骤 1. 在室温 ( 约 21℃ ) 下向配备有顶置式搅拌器 (300rpm) 的 500-mL4 颈烧瓶 中添加 150mL 的 Milli-Q 水和 1.2mL( 大约 1.0g 和 9 毫摩尔 ) 的 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷， 得到 pH 为 11.8 的均匀溶液。逐份添加 Na2S2O5 直至 pH 达到 7.5。向该无色 溶液中添加 300μL Antifoam-204(Sigma 目录号 A-6226) 和 600μL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮 液 (SigmaAldrich ； 目录号 C-3515)， 得到 pH 7.5 的无色溶液。向此溶液中添加 300mg 具有 SEQ ID NO 12 的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 3 的方法制备 )， 得到黄色溶液。插入空气 喷射探针 ( 气流速率约 60mL/ 分钟 )， 并且反应混合物的 pH 开始立即降低。经由受反馈控 制的 2N NaOH 添加维持 pH。大约 40 分钟后， pH 保持稳定并且不再进行碱添加。又 10 分钟 ( 共 50 分钟 ) 之后， 将 150mL 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 NaHSO3 溶液 (26.1g 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷与 160mL dH2O 和足够的 Na2S2O5 至达到 pH 7.2) 以 0.12mL/ 分钟的速率添加至反应混合物中。 反应混合物的 pH 开始立即下降并重新开始添加 2N NaOH。在大约 21 小时 ( 大约 22 小时的总反应时间 ) 后完成 6.6- 二甲基 -3- 氮杂二环
     73[3.1.0] 己烷 /NaHSO3 添加。在底物添加完成之后， 以增加的速率继续碱添加。24 小时后， 1 通过 H NMR 分析判断反应完成。
     步骤 2.24 小时之后， 添加 13.5g NaCN(1.5 当量 ) 至反应混合物中， 得到 pH9.9 的乳白色反应混合物。在室温下搅拌混合物 15 分钟和 45 分钟后取出 200μL 小份， 用 1mL 1 1 CDCl3 萃取小份并通过 H-NMR 分析萃取物。在两个时间点， 顺式立体异构体都低于 H-NMR 检测限。
     在 NaCN 添加后约 60 分钟， 用 300mL MTBE 萃取反应物。 排掉下层水相 ( 大约 250mL) 并将上层有机层通过 6g(2” 直径 ×1/4” 高) 使用 过滤。用 300mL MTBE 冲洗 并 冲洗中所用的 MTBE 萃取水相。合并有机层并使用旋转蒸发器在 40℃下于减压下浓缩 1 小时， 得到白色固体。将白色固体在减压下进一步干燥 30 分钟， 得到 22.5g(90％ 产率 )(1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈。顺式 (2R) 差向异构体 1 低于 H-NMR 检测限。
     此实施例说明这种氨基腈在室温下 pH 9.9 和存在 0.5 当量过量氰化物的条件下 1 小时后仍然呈立体异构纯的形式。
     实施例 20 ： (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈的制备， 方 法稳固性 步骤 1. 该程序与实施例 18 的步骤 1 相同。
     步骤 2.24 小时之后， 添加 11.0g NaCN(1.22 当量 ) 至反应混合物中， 得到 pH9.9 的乳白色反应混合物。在室温下搅拌 10 分钟后， 取出 200μL 小份， 用 1mL CDCl3 萃取。萃 1 取溶液的 H-NMR 分析表明完全转化为 (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 烷 -2- 腈， 即反式氨基腈， 而没有可检测的顺式 2R 立体异构体。
     在室温下再搅拌反应混合物 16 小时。16 小时后的 1H-NMR 分析表明反 / 顺氨基 腈比率为约 15 ∶ 1( 反 / 顺异构体比率通过氨基腈次甲基质子的 1H-NMR 积分测定 ： 反式＝ 3.92ppm 处的双峰 ； 顺式＝ 4.22ppm 处的双峰 )。
     实施例 21 ： 在静态空气下单胺氧化酶催化八氢环戊 [c] 吡咯去对称化为 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯
     在空气下向 50-mL 3 颈烧瓶中添加 25mL 100mM pH 8.0 磷酸钾缓冲液和 375mg 的 盐酸八氢环戊 [c] 吡咯， 随后通过添加 1N NaOH 将 pH 调节为大约 7.5。向经 pH 调节的溶 液中添加 60μL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Sigma Aldrich ； 目录号 C-3515) 和在 pH 8.0 的磷酸钾缓冲液中的 150mg 具有 SEQ ID NO 4 的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 2 的方法制 备 )。在空气下搅拌所得的浅黄色溶液 24 小时， 在此期间， 经由受反馈控制而以 1-5μL 逐 份添加 1N NaOH 将 pH 维持在 7.4。用 10N NaOH 使 pH 达到大约 14 来猝灭反应并通过萃取 到 CDCl3 中来分离产物， 通过 1H-NMR 分析转化， 显示出 1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯
     的形成。 当以高通量筛选鉴定用于此实施例的具有 SEQ ID NO.4 的单胺氧化酶时， 实施例 5 的手性 GC 测定方法显示其将八氢环戊 [c] 吡咯氧化为所需的 (3aR， 6aS)- 亚胺 (4)。没 有检测到 (3aS， 6aR) 对映体。
     实施例 22 ： (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 腈的制备
     在空气下向 50-mL 3 颈烧瓶中添加 25mL 100mM pH 8.0 磷酸钾缓冲液和 400mg 的
     盐酸八氢环戊 [c] 吡咯、 500mg Na2S2O5 并用 10N NaOH 将 pH 调节为大约 7.5。向经 pH 调节 的溶液中添加 30μL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Sigma Aldrich ； 目录号 C-3515) 和在 pH 8.0 的磷酸钾缓冲液中的 300mg 具有 SEQ ID NO 10 的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 2 的方 法制备 )。 在空气下搅拌所得的浅黄色溶液 24 小时， 在此期间， 经由受反馈控制而以 1-5μL 逐份添加 1N NaOH 将 pH 维持在 7.5。在搅拌 48 小时后， 添加 300mg NaCN 至反应混合物中， 将 pH 升至约 9.9。在室温下 ( 约 21℃ ) 再搅拌 1 小时， 然后用乙酸乙酯萃取。相分离和溶 剂蒸发后， 分离出 316mg 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 腈 (82％产率 )。1H-NMR 显示出约 90％的 (1S， 3aR， 6aS)， “反式” 和约 10％的 (1R， 3aR， 6aS) 差向异构体， “顺式” 。(1H-NMR(300MHz， CDCl3) 谱 ： δ3.95(d， J ＝ 6.6， 顺式氨基腈次甲基 H)， 3.62(d， J ＝ 1.2 ； 反式氨基腈次甲 基 H)， 3.15(m， 1H)， 2.71(m， 2H)， 2.62(m， 1H)， 1.63-1.92(m， 3H)， 1.55(m， 1H)， 1.22-1.45(m， 3H))。
     实施例 23 ： (3aR， 6aS)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (4) 及其相应 的二聚体， 化合物 (5) 的制备级生产。
     向 20℃加套和 300rpm 搅拌的 3-L 3 颈烧瓶中添加 500mL dH2O 和 20mL 在水中的 25wt％八氢环戊 [c] 吡咯溶液。用浓 H3PO4 将 pH 调节至大约 7.6， 得到无色的均匀溶液。向 此溶液中添加 2.0mL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Sigma Aldrich ； 目录号 C-3515) 和 5.0g SEQ ID NO ： 16 的多肽的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 3 的方法制备 )， 得到浅黄色溶液。 以大约 0.2L/ 分钟的干燥空气吹扫容器的顶空。通过受反馈控制以 20-100μL 逐份添加在 水中的 25wt％八氢环戊 [c] 吡咯溶液来将反应的 pH 维持在 7.5 直至已添加 380mL。( 在中 性溶液中的胺是质子化的 ； 亚胺不是。 反应释放了质子， 但是必须将其中和以维持 pH。 在此 实施例中， 胺本身是用作 pH- 固定器滴定剂的碱。) 在添加了 380mL 在水中的 25wt％八氢 环戊 [c] 吡咯溶液之后， 通过受反馈控制添加 1N NaOH 维持 pH 来完成反应 ( 对应于初始的 5g(45mmol) 底物。在不再观察到 NaOH 消耗之后， 取出浆液小份， 过滤并将固体空气干燥。 1
     溶解在多种溶剂中的固体的 H-NMR 谱显示出在溶液中不同比例的亚胺 (3aR， 6aS) 1 八氢环戊 [c] 吡咯 (4) 和其二聚体 (5)。 D6-DMSO 中的 H-NMR(300MHz) 显示二聚体而未检测 到游离亚胺 ( 谱 ： δ3.11(t， J ＝ 8.2 ； 1H)， 2.45(m， 1H)， 2.33(m， 1H)， 1.85(dd， J ＝ 7.2， 8.1， 1 1H)， 1.31-1.58(m， 7H))。CDCl3 中的 H-NMR(300MHz) 显示了亚胺和二聚体的混合物 ( 谱 ： δ3.22(m， 1H)， 2.65(m， 1H)， 2.30-2.40(m， 2H)， 1.89(m， 1H)， 1.50-1.70(m， 5H)， 1.43(m， 1 1H))。 17％ D3PO4/D2O(300MHz) 中的 H-NMR 仅显示出质子化的亚胺单体 ( 谱 ： δ7.6-8.2(br， 1H)， 3.5-3.8(br， 1H)， 2.8-3.5(br， 2H)， 2.2-2.8(br， 1H)， 0.5-1.7(br， 6H))。
     向大体积的反应混合物中添加 100mL 浓 HCl， 得到 pH 约 0 的黄色悬浮液 ( 将二聚 体分解为质子化亚胺 )。将黄色悬浮液在 4℃下以 8000 离心 10 分钟。滗去所得黄色上清 液并将其返回至反应容器中。将白色糊料 ( 通过离心沉淀 ) 重悬于 100mL dH2O 中并通过 滤纸过滤。用 dH2O(1×100mL) 冲洗残余物。将如此获得的含有盐酸 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯的所有酸性水溶液合并并直接用于生成氨基腈的氰化反应。
     当以高通量筛选鉴定用于此实施例的具有 SEQ ID NO.16 的单胺氧化酶时， 实施例 5 的手性 GC 测定显示其将八氢环戊 [c] 吡咯氧化为所需的 (3aR， 6aS)- 亚胺 (4)。没有检 测到 (3aS， 6aR) 对映体。
     实施例 24 ： 在静态空气或氧气下单胺氧化酶催化八氢环戊 [c] 吡咯去对称化为(3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯及其相应二聚体 ； 经由萃取的产物分离
     向 20℃加套和 300rpm 搅拌的 3-L 3 颈烧瓶中添加 500mL dH2O 和 20mL 在水中的 25wt％八氢环戊 [c] 吡咯溶液。用浓 H3PO4 将 pH 调节为大约 7.6， 得到无色的均匀溶液， 向 该溶液中添加 2.0mL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Novozyme “ ；Catalyzyme 101” ) 和 5.0g SEQ ID NO ： 16 的多肽的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 3 的方法制备 )， 得到浅黄色溶液。以大 约 0.2L/ 分钟的干燥空气吹扫容器的顶空。通过受反馈控制以 20-100μL 逐份添加在水中 的 25wt％八氢环戊 [c] 吡咯溶液来将反应的 pH 维持在 7.5 直至已添加 380mL。( 在中性溶 液中的胺是质子化的 ； 亚胺不是。反应释放了质子， 但是必须将其中和以维持 pH。在此实 施例中， 胺本身是用作 pH- 固定器滴定剂的碱。) 在添加了 380mL 在水中的 25wt％八氢环 戊 [c] 吡咯溶液之后， 通过添加 1N NaOH 维持 pH 来完成反应 ( 对应于初始的 5g(45mmol) 底物。在不再观察到 NaOH 消耗之后， 添加 1800mL MTBE 至不均匀的反应混合物中， 然后将 其加热至 45℃。通过 过滤之后， 弃去下层水相， 并用 10％柠檬酸萃取上层有机相， 并且将含有盐酸 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯的酸性水溶液直接用于根 据实施例 29 的方法制备 (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 羧酸。
     实施例 25 ： (3aR， 6aS) 八氢环戊 [c] 吡咯的二聚体， 化合物 (3) 的制备级制备
     在空气下向 30℃加套和 300rpm 搅拌的 500mL 3 颈烧瓶中添加 100mL dH2O 和 2.0mL 在水中的 25wt％八氢环戊 [c] 吡咯溶液 (0.5g 底物 )。 用浓 H3PO4 将 pH 调节至大约 7.8， 得到 无色的均匀溶液。 向此溶液中添加 0.2mL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Novozyme “Catalyzyme 101) 和 0.25gSEQ ID NO 36 的多肽的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 3 的方法制备 )。反应 的 pH 开始立即降低并且经由受反馈控制添加在水中的 25wt％八氢环戊 [c] 吡咯溶液来将 pH 维持在 pH 7.7。2 小时之后， 再添加 0.25g 单胺氧化酶粉末。(3aR， 6aS) 八氢环戊 [c] 吡 咯的二聚体开始从反应物中沉淀并且在实验持续期间反应混合物变为白色浆液。又 2 小时 ( 共 4 小时 ) 之后， 用约 0.6mL/ 分钟的氧气吹扫顶空， 并且在实验持续期间维持氧气吹扫。 24 小时的总反应时间之后， 再添加 0.5g 单胺氧化酶。48.5 小时的总反应时间后， 添加了共 32.3mL 在水中的 25wt％八氢环戊 [c] 吡咯溶液 ( 反应的总底物为 8.58g)。将反应混合物 转移到配备有短径蒸馏头的 500mL 单颈烧瓶中并将装置放置于加热套中。在加热加热套至 160℃之后， 二聚体开始蒸汽蒸馏到浸泡在冰浴中的接收烧瓶中。 汽相的温度为约 96℃。 约 30 分钟后， 已蒸馏出约 1/2 的反应物质并且汽相的温度为约 98℃。在此时停止蒸馏。将在 接收烧瓶中的白色固体在水中的悬浮液通过粗烧结漏斗 (coarsefritted funnel) 过滤并 容许白色固体空气干燥 2 小时， 得到 7.17g(84％产率 ) 的 (3aR， 6aS) 八氢环戊 [c] 吡咯二 聚体。
     实施例 26 ： 在静态空气下单胺氧化酶催化八氢环戊 [c] 吡咯去对称化为 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯及其相应二聚体 ； 经由蒸汽蒸馏的产物分离
     向 20℃加套和 300rpm 搅拌的 3-L 3 颈烧瓶中添加 500mL dH2O 和 20mL 在水中的 25wt％八氢环戊 [c] 吡咯溶液。用浓 H3PO4 将 pH 调节为大约 7.6， 得到无色的均匀溶液， 向 此溶液中添加 2.0mL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Novozyme “ ；Catalyzyme 101” ) 和 5.0g SEQ ID NO ： 16 的多肽的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 3 的方法制备 )， 得到浅黄色溶液。以大 约 0.2L/ 分钟的干燥空气吹扫容器的顶空。经由受反馈控制以 20-100μL 逐份添加在水中 的 25wt％八氢环戊 [c] 吡咯溶液来将反应的 pH 维持在 7.5。(3aR， 6aS) 八氢环戊 [c] 吡咯的二聚体开始从反应物中沉淀并且反应混合物变为白色浆液。在已添加了 380mL 在水中的 25wt％八氢环戊 [c] 吡咯溶液之后， 经由蒸汽蒸馏 ( 头温度仍为约 98℃ ) 从反应混合物中 分离产物。接收罐含有 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯二聚体在水中的悬 浮液。 添加 1.1-1.2 当量的浓 HCl 至接收罐中分解二聚体， 并得到盐酸 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯在水中的均匀溶液。此溶液直接用于在实施例 27 中制备 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 腈。
     实施例 27 ： (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 腈的制备
     将实施例 26 中制备的盐酸 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯的酸性 水溶液冷却至 0℃并以 300rpm 搅拌。 向 0℃的冷冻溶液中以 3mL/ 分钟添加在 100mL dH2O 中 的 50g NaCN( 氰化物对盐酸盐溶液的中和原位产生 HCN)。在开始 NaCN 添加后 2 小时， 添加 1000mL 甲苯 ( 在冰浴中预冷的 )， 得到两相混合物， 向此两相混合物中以 10mL/ 分钟添加饱 和 K2CO3 溶液直到水相的 pH 达到 9.8。 然后使用插管移除下层水相， 并在弃掉之前用漂白剂 ( 破坏剩余的氰化物 ) 处理。在室温下 ( 约 21℃ ) 将上层有机悬浮液 / 乳液在大约 15 分钟 内通过 545 的 20g 床 ( 约 1/4” 高 × 约 3” 直径 ) 过滤， 得到约 1000mL 无色有机相 和约 300mg 黄色水相以及大约 100mL“残相 (rag phase)” ( 位于上层有机相和下层水相之 间的中间层 )。 用甲苯 2×100mL 冲洗 垫。 在分液漏斗中合并溶液并排出水相和残层 (rag layer)， 并用漂白剂处理以便弃去。从有机相中取出小份的有机溶剂并蒸发至干燥。 1H-NMR(300MHz， CDCl3) 分析显示 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 腈 ( “反式” ) 及其 1 1R 差向异构体 ( “顺式” ) 以约 30 ∶ 1 比率存在 ( H-NMR(300MHz， CDCl3) 谱 ： δ3.95(d， J＝ 6.6， 顺式氨基腈次甲基 H)， 3.62(d， J ＝ 1.2 ； 反式氨基腈次甲基 H)， 3.15(m， 1H)， 2.71(m， 2H)， 2.62(m， 1H)， 1.63-1.92(m， 3H)， 1.55(m， 1H)， 1.22-1.45(m， 3H))。 将有机相冷却至大约 0℃并用 250mL 浓盐酸 ( 在冰浴中预冷 ) 萃取两次， 然后出现清楚和立即的相分离。( 由于 萃取是放热的， 所以有必要预冷萃取溶液。溶液的温度由约 4℃升至约室温 )。将合并的含 有盐酸 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 腈的浓 HCl 提取物 ( 共大约 600mL) 合并并 直接用于在实施例 28 中制备盐酸 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸。
     6.1 实施例 28 ： 盐酸 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸的制备
     将来自实施例 27 的盐酸 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 腈溶液加热至回 流持续 24 小时， 这之后蒸发掉大约 300mL 水 /HCl 并将剩余溶液冷却至大约 50-60℃。向 此温溶液中添加 500mL 甲苯并将剩余的水 ( 大约 100-120mL) 作为甲苯共沸物蒸馏掉。在 移除全部的水之后， 将所得的棕色固体和浅黄色甲苯的粘浆悬浮液冷却至室温 ( 约 21℃ )。 在过滤漏斗上收集固体并用甲苯冲洗 (2×200mL)。 将褐色固体空气干燥 2 小时并在真空下 进一步干燥过夜， 得到与 NH4Cl 副产物 1 ∶ 1 混合的 159g( 自八氢环戊 [c] 吡咯的总体产 率为 72％ )) 的盐酸 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸。
     溶解于 D2O 中的盐混合物的 1H-NMR 显示了大约 17 ∶ 1 的反 / 顺异构体 (1S/1R) 比 率。(1H-NMR(300MHz， D2O) 谱 ： δ4.32(d， J ＝ 5.5 ； 顺式氨基酸次甲基 )， 3.85(d， J ＝ 2.3 ； 反式氨基酸次甲基 )， 3.50(m， 1H)， 3.65-3.88(m， 3H)， 1.20-1.80(m， 6H))。
     6.2 实施例 29 ： 由盐酸 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸制备 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸叔丁酯草酸 1 ∶ 1 盐。
     步骤 1 ： 向 配 备 有 磁 力 搅 拌 棒 的 1650mL 厚 壁 玻 璃 耐 压 瓶 (Ace Glass， Inc.，8648-157) 中装入在实施例 28 中制备的 75g(306.9mmol) 盐酸 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸 / 氯化铵混合物、 375mL 二氯甲烷和 497mL 乙酸叔丁酯。在环境温度下 ( 约 21 ℃ ) 剧烈搅拌所得混合物以破坏大的聚集物， 得到搅拌无阻的悬浮液 (free-stirring suspension)。使用盐水 - 冰浴将此悬浮液冷却至 0℃的内部温度并在 15 分钟内逐滴添加 75.4mL(1162mmol) 甲磺酸， 在此期间将内部温度升至 5℃。密封耐压瓶， 并在 18 小时内容 许反应混合物在剧烈搅拌下升温至环境温度 ( 约 21℃ )， 在此期间反应混合物变为在琥珀 色溶液中的白色无机盐悬浮液。将混合物在冰浴中冷却并仔细将耐压瓶通气并开盖。将混 合物转移到 3L 烧瓶中并边搅拌边在冰浴中冷却。在 35 分钟内添加 400mL 在水中的 50％ ( 重量 ： 重量 )NaOH 至混合物中， 同时保持其温度低于 20℃。停止搅拌并容许分相。将有 机相 ( 约 850mL) 移入单独的容器中。用 375mL 二氯甲烷萃取剩余水相和残层 (pH 13， 约 800mL)。 合并有机相 ( 约 1250mL) 并用水 (2×225mL) 洗涤。 过滤所得有机相以移除残层和 任何不溶性材料， 通过旋转真空蒸发移除任何溶剂， 得到 48.3g 深琥珀色油。该油的 1H NMR 谱显示为 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸叔丁酯。
     根据相同程序进行的第二次制备产生 50.6g 反式 -(1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸叔丁酯油。
     步骤 2 ： 将来自根据步骤 1 的两次制备的 97.9g(463.3mmol)(1S， 3aR， 6aS)- 八氢 环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸叔丁酯溶解在 750mL 乙酸叔丁酯中并装入配备有顶置式机械搅拌装 置、 温度计、 添加漏斗和回流冷凝器的 3L 四颈烧瓶中。在环境温度 ( 约 21℃ ) 下搅拌的同 时， 在 37 分钟内逐滴添加 44.0g(488.6mmol) 草酸在 750mL 2- 丙醇中的溶液， 将混合物的 温度升至 31℃。在添加约 50mL 草酸溶液之后固体开始沉淀， 并且在添加 450mL 之后得到 粘稠的悬浮液。添加 500mL 草酸盐溶液后， 将沉淀的固体再溶解， 得到深黄色溶液。在添加 600mL 草酸溶液之后固体开始迅速再次沉淀并且持续直到草酸添加结束。然后将此悬浮液 加热至 78℃， 得到稀悬浮液， 容许其边搅拌边被动地冷却至环境温度 ( 约 21℃ )。自冷却 开始后 16 小时， 通过过滤收集沉淀的固体并用异丙醇 (450mL)、 乙酸异丙酯 (450mL) 和甲 基叔丁基甲醚 (450mL) 连续洗涤。在真空炉 (30℃， 25″真空， N2 气流 ) 中干燥固体， 得到 为稠密的褐色自由流动粉末的 118.1g(1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸叔丁酯 草酸 1 ∶ 1 盐 ( 自盐酸 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸的产率为 64％ )( 通过 GC 分析为 99.7％纯度 )， 其表现出 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸叔丁酯草酸 1 (1 ∶ 1) 盐的预期 H-NMR 谱。
     (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸叔丁酯草酸 (1 ∶ 1) 盐的重结晶 ： 将 来自上面步骤 2 的褐色粉末 (118.1g， 391.9mmol) 和异丙醇 (1950mL) 装入配备有机械搅拌 装置、 温度计和回流冷凝器的 3L 四颈烧瓶中。将悬浮液搅拌并加热至 74℃至将盐完全溶 解， 得到黄色溶液。减慢搅拌并容许溶液被动地冷却至环境温度 ( 约 21℃ )。自冷却开始 20 小时后， 通过过滤收集沉淀的固体并用异丙醇 (1L)、 乙酸异丙酯 (1L) 和甲基叔丁基甲 醚 (1L) 连续洗涤。在真空炉 (40℃， 28″真空， N2 气流 ) 干燥固体， 得到微细米白色针状的 110.45g(1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸叔丁酯草酸 1 ∶ 1 盐 ( 自盐酸 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸的产率为 59.7％ )， 通过 GC 分析为 99.9％纯度 )。手性 GC 分析仅显示了期望的 (1S， 3aR， 6aS)- 立体异构体。未检测到其 (2S)- 差向异构体。
     1. 技术领域 本公开内容涉及基本上立体异构纯的结构式 II 至 VII 的稠合二环脯氨酸化合物：
     其中 A、 M、 M’ 和 R5 如本文所描述的 ； 涉及用于它们制备的生物催化方法 ； 并且涉 及那些方法中使用的生物催化酶。
     2. 序列表、 表格或计算机程序的引用
     根 据 37C.F.R.§1.821 以 计 算 机 可 读 形 式 (CRF) 同 时 电 子 提 交 的 文 件 名 为 CX2-020WO01.txt 的 “序列表” 通过引用并入本文。序列表的电子副本是在 2009 年 6 月 23 日创建的， 文件大小为 110 千字节。
     3. 背景
     二 环 脯 氨 酸 类 似 物 用 于 拟 肽 药 物 (peptidomimetic drug) 的 发 现 和 开 发。(A.Trabocchi 等 人 (2008)Amino Acids(2008)34 ： 1-24)。 丙 型 肝 炎 病 毒 蛋 白 酶 抑 制 剂 boceprevir(SCH 505034 ； ((1R， 2S， 5S)-N-(4- 氨 基 -1- 环 丁 基 -3， 4- 二 氧 代 丁 -2- 基 )-3-((S)-2-(3- 叔 丁 基 脲 基 )-3， 3- 二 甲 基 丁 酰 基 )-6， 6- 二 甲 基 -3- 氮 杂 二 环 [3.1.0] 己 烷 -2- 甲 酰 胺 )(Malcolm 等 人 (2006)Antimicrob.Agents Chemother.50(3) ： 101320)， 和 telaprevir(VX 950 ； N-((S)-1- 环 己 基 -2-((S)-1-((1S， 3aR， 6aS)-1-((R)-3-(2-( 环 丙 氨 基 )-2- 氧 代 乙 酰 基 ) 己 酰 基 ) 六 氢 环 戊 [c] 吡 咯 -2(1H)- 基 )-3， 3- 二甲基 -1- 氧代丁 -2- 基氨基 )-2- 氧代乙基 ) 吡嗪 -2- 甲酰胺 ) (Perni 等人 (2006)Antimicrob.Agents Chemother.50(3) ： 899909)。
     2. 序列表、 表格或计算机程序的引用
     根 据 37C.F.R.§1.821 以 计 算 机 可 读 形 式 (CRF) 同 时 电 子 提 交 的 文 件 名 为 CX2-020WO01.txt 的 “序列表” 通过引用并入本文。序列表的电子副本是在 2009 年 6 月 23 日创建的， 文件大小为 110 千字节。
     3. 背景
     二 环 脯 氨 酸 类 似 物 用 于 拟 肽 药 物 (peptidomimetic drug) 的 发 现 和 开 发。(A.Trabocchi 等 人 (2008)Amino Acids(2008)34 ： 1-24)。 丙 型 肝 炎 病 毒 蛋 白 酶 抑 制 剂 boceprevir(SCH 505034 ； ((1R， 2S， 5S)-N-(4- 氨 基 -1- 环 丁 基 -3， 4- 二 氧 代 丁 -2- 基 )-3-((S)-2-(3- 叔 丁 基 脲 基 )-3， 3- 二 甲 基 丁 酰 基 )-6， 6- 二 甲 基 -3- 氮 杂 二 环 [3.1.0] 己 烷 -2- 甲 酰 胺 )(Malcolm 等 人 (2006)Antimicrob.Agents Chemother.50(3) ： 101320)， 和 telaprevir(VX 950 ； N-((S)-1- 环 己 基 -2-((S)-1-((1S， 3aR， 6aS)-1-((R)-3-(2-( 环 丙 氨 基 )-2- 氧 代 乙 酰 基 ) 己 酰 基 ) 六 氢 环 戊 [c] 吡 咯 -2(1H)- 基 )-3， 3- 二甲基 -1- 氧代丁 -2- 基氨基 )-2- 氧代乙基 ) 吡嗪 -2- 甲酰胺 ) (Perni 等人 (2006)Antimicrob.Agents Chemother.50(3) ： 899909)。
    
     Boceprevir 和 telaprevir 分别是由下面所显示的顺 - 稠合二环 L- 脯氨酸类似物 (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 羧酸和 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸的酯制备的 ：
     WO 2000/20824 和 WO 2000/218369 描述了包括对应于结构式 VI 的各种稠合二环 L- 脯氨酸类似物的大量其他丙型肝炎蛋白酶抑制剂。
     尽管已经报道了使用有机化学的方法和工具合成这种复杂分子的方法， 但是那些 合成通常是多步的、 复杂的、 昂贵的、 低效的、 总产率低的方法。
     Wu 等人 (WO 2007/075790) 公开了由相应的结构式 (1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮 杂二环 [3.1.0] 己烷的对称 ( 非手性 ) 二环胺制备二环脯氨酸类似物 (1R， 2S， 5S)-6， 6- 甲 基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 羧酸的甲基酯， 由所述二环胺氧化为相应的如下结构式 的外消旋亚胺开始 ：
     尽管已经报道了使用有机化学的方法和工具合成这种复杂分子的方法， 但是那些 合成通常是多步的、 复杂的、 昂贵的、 低效的、 总产率低的方法。
     Wu 等人 (WO 2007/075790) 公开了由相应的结构式 (1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮 杂二环 [3.1.0] 己烷的对称 ( 非手性 ) 二环胺制备二环脯氨酸类似物 (1R， 2S， 5S)-6， 6- 甲 基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 羧酸的甲基酯， 由所述二环胺氧化为相应的如下结构式 的外消旋亚胺开始 ：
    
     随后外消旋亚胺与氰化物反应得到如下结构式的外消旋氨基腈 ：
     然后该外消旋氨基腈与酸和甲醇反应得到如下结构式的外消旋氨基酸甲酯 ：最后， 通过非对映体盐拆分来分离这些 (1R， 2S， 5S)( 不期望的 ) 和 (1S， 2R， 5R) ( 期望的 ) 立体异构的甲基酯， 形成具有前一对映体的二 - 对甲苯基 -D- 酒石酸盐或具有后 一对映体的二 - 对甲苯基 -L- 酒石酸酒石酸盐。
     Tanoury 等人 (WO 2007/022459) 公开了如下从相应的对称 ( 非手性 ) 二环胺合成 外消旋 ( 叔丁氧基羰基 ) 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸 ： 制备 N-Boc 衍生物， 并使其在存在多 于化学计量的大量二胺螯合物存在下与引火剂仲丁基锂反应， 然后与二氧化碳反应以制备 如下所描绘的外消旋 N-Boc 氨基酸， 所述反应全部都在低于 -70℃下进行 ：
     Tanoury 等人 (WO 2007/022459) 公开了如下从相应的对称 ( 非手性 ) 二环胺合成 外消旋 ( 叔丁氧基羰基 ) 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸 ： 制备 N-Boc 衍生物， 并使其在存在多 于化学计量的大量二胺螯合物存在下与引火剂仲丁基锂反应， 然后与二氧化碳反应以制备 如下所描绘的外消旋 N-Boc 氨基酸， 所述反应全部都在低于 -70℃下进行 ：
    
     然后使用诸如 S-1- 氨基四氢萘的单对映体手性碱通过非对映体盐拆分分离这些 外消旋 Boc- 酸的 (1R， 2S， 5S)( 不期望的 ) 和 (1S， 2R， 5R)( 期望的 ) 立体异构体。
     尽管通过这些方法获得了氨基酸衍生物的期望立体异构体， 但是这些二环脯氨酸 类似物的对映体混合物的拆分固有地包括了用于制备外消旋混合物的所有材料 ( 例如， 原 料、 试剂、 溶剂、 催化剂 ) 中至少一半的浪费。
     还已经报道了氨基酸 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸及其酯的化学 合成的其他方法， 所述方法包括 (i)N- 乙酰基 -3- 氮杂二环 [3.3.0] 辛烷的阳极氧化 (EA 00090362) 和 (ii) 噻唑内鎓盐方法 (Letters in Drug Design &Discovery(2005)2(7) ： 497502) ； J.Org.Chem.1994， 59， 2773-8)。
     由结构式 I((1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 ) 的相应的对称 ( 非 手性 ) 二环胺不对称地制备结构式 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸及其结构式 V 的酯的氨基酸的方法避免了形成外消旋混合物和随后分离对映体的需要， 该方法与上面 所描述的基于拆分的方法相比可能更有效、 浪费更少并且更加有成本效率。
     已经使用单胺氧化酶经由用氧将一种对映体立体特异性地氧化为相应的亚胺而 拆分和去外消旋化 (deracemize) 外消旋手性胺。 已经报道了黑曲霉 (Aspergillus niger)
     尽管通过这些方法获得了氨基酸衍生物的期望立体异构体， 但是这些二环脯氨酸 类似物的对映体混合物的拆分固有地包括了用于制备外消旋混合物的所有材料 ( 例如， 原 料、 试剂、 溶剂、 催化剂 ) 中至少一半的浪费。
     还已经报道了氨基酸 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸及其酯的化学 合成的其他方法， 所述方法包括 (i)N- 乙酰基 -3- 氮杂二环 [3.3.0] 辛烷的阳极氧化 (EA 00090362) 和 (ii) 噻唑内鎓盐方法 (Letters in Drug Design &Discovery(2005)2(7) ： 497502) ； J.Org.Chem.1994， 59， 2773-8)。
     由结构式 I((1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 ) 的相应的对称 ( 非 手性 ) 二环胺不对称地制备结构式 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸及其结构式 V 的酯的氨基酸的方法避免了形成外消旋混合物和随后分离对映体的需要， 该方法与上面 所描述的基于拆分的方法相比可能更有效、 浪费更少并且更加有成本效率。
     已经使用单胺氧化酶经由用氧将一种对映体立体特异性地氧化为相应的亚胺而 拆分和去外消旋化 (deracemize) 外消旋手性胺。 已经报道了黑曲霉 (Aspergillus niger)
     的 黄 素 依 赖 性 单 胺 氧 化 酶 的 衍 生 物 (MAO N)(Shilling 等 人 (1995)Biochim.Biophys. Acta.1243 ： 52937) 可与非特异性化学还原剂组合用于去外消旋化 (d/l)α 甲基苄胺以提 供对映体纯的 (93 ％ ee)(d)α 甲基苄胺 (Alexeeva 等人 (2002)Angew.Chem.Int.Ed.41 ： 3177-3180)。黑曲霉的黄素依赖性单胺氧化酶的衍生物还用于去外消旋化 (R/S)-2- 苯基 吡咯烷以提供对映体纯的 (98％ ee)(R)-2- 苯基吡咯烷 (Carr 等人 (2005)， ChemBioChem 6： 63739 ； Gotor 等 人 “EnantioselectiveEnzymatic Desymmetrization in Organic Synthesis( 有机合成中的对映体选择性酶促去对称化 )， ” Chem.Rev.(2005)105 ： 313-54)。
     因此， 期望的是不仅提供基本上对映体纯的手性化合物， 尤其是可用作合成中间 体的手性胺化合物， 而且还提供用于它们的不对称合成的有效的、 可放大的生物催化方法。 因此， 还期望的是提供可用于那些生物催化方法中的酶。
     4. 概述
     本公开内容提供基本上立体异构纯的结构式 II(a) 的二环亚胺化合物 ( 及其结构 式 II(b) 的二聚体 )， 该化合物尤其可用作合成立体异构性被限定的治疗剂的新颖中间体 ：
     包括其盐和水合物， 其中 A 是 O、 CR1R2、 -C ＝ C- 或 -CH2-CH2-， 其中 R1 和 R2 各自独 立地选自 -H、 -COOH、 -X、 -NH2、 -CH2NHC(NH)NH2、 -CX3、 -CH3、 -CH2CH3， 并且其中 X 选自 F、 Cl 和 Br。M 和 M’ 二者可以都存在或者可以都不存在， 并且当 M 和 M’ 二者都存在时， M 和 M’ 是相 同的并且选自 O 和 CR3R4， 其中 R3 和 R4 是 H， 或者 M 的 R3 或 R4 和 M’ 的 R3 或 R4 形成亚甲基 桥接， 条件是 ： (a) 当 M 和 M’ 是 O 时， A 不是 O ； 并且当 A 是 O 时， M 和 M’ 不是 O ； (b) 当 M 和 M’ 是 CR3R4 时， A 可以是 -CH ＝ CH- 或 -CH2-CH2- ； 并且 (c) 当 M 和 M’ 是 CR3R4 并且具有一个 或多个立体中心时， M 和 M’ 的立体中心具有相反的立体化学性。
     本公开内容还提供基本上对映体纯的根据结构式 III(a) 和结构式 III(b) 的氨基 磺酸盐化合物， 其尤其可用作合成对映体异构性被限定的治疗剂的新颖中间体 ：
     本公开内容还提供基本上对映体纯的根据结构式 III(a) 和结构式 III(b) 的氨基 磺酸盐化合物， 其尤其可用作合成对映体异构性被限定的治疗剂的新颖中间体 ：
    
     包括其盐和水合物， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。
     此外， 本公开内容提供了基本上对映体纯的结构式 IV(a) 的氨基腈化合物， 该化 合物可用作合成立体异构性被限定的治疗剂的新颖中间体。基本上对映体纯的结构式
     此外， 本公开内容提供了基本上对映体纯的结构式 IV(a) 的氨基腈化合物， 该化 合物可用作合成立体异构性被限定的治疗剂的新颖中间体。基本上对映体纯的结构式
     IV(a) 的反式氨基腈化合物还可以提供为包含基本上对映体纯的结构式 IV(b) 的顺式氨基 腈化合物的混合物，
     包括其盐和水合物， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。
     本公开内容提供任选被保护的基本上对映体纯的结构式 V 的化合物， 该化合物尤 其可用作合成对映体异构性被限定的治疗剂的中间体 ：
     本公开内容提供任选被保护的基本上对映体纯的结构式 V 的化合物， 该化合物尤 其可用作合成对映体异构性被限定的治疗剂的中间体 ：
    
     包括其盐和水合物， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述， 并且其中 R5 选自由下列组成 的组 ： 保护基团 ( 例如， 苄基或三甲基甲硅烷基以及类似基团 )、 -(C1-C2) 烷基、 -(C1-C3) 烷 5 基、 -(C1-C4) 烷基和 -(C1-C6) 烷基。在某些非限制性实施方案中， R 是甲基、 乙基或叔丁基。
     本公开内容还提供任选被保护的基本上对映体纯的结构式 V(b) 的化合物 ( 对应 于结构式 V 的化合物的顺式对映体 ) ：
     本公开内容还提供任选被保护的基本上对映体纯的结构式 V(b) 的化合物 ( 对应 于结构式 V 的化合物的顺式对映体 ) ：
    
     包括其盐和水合物， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述， 并且其中 R5 选自由下列组成 的组 ： 保护基团 ( 例如， 苄基或三甲基甲硅烷基以及类似基团 )、 -(C1-C2) 烷基、 -(C1-C3) 烷 5 基、 -(C1-C4) 烷基和 -(C1-C6) 烷基。在某些非限制性实施方案中， R 是甲基、 乙基或叔丁基。
     本公开内容还提供基本上对映体纯的羧基取代的结构式 VI 的化合物， 该化合物 尤其可用作合成对映体异构性被限定的治疗剂的中间体 ：
     本公开内容还提供基本上对映体纯的羧基取代的结构式 VI 的化合物， 该化合物 尤其可用作合成对映体异构性被限定的治疗剂的中间体 ：
    
    
    
    包括其盐和水合物， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。 本公开内容还提供任选被保护的基本上对映体纯的结构式 VI(b) 的化合物 ( 对应于结构式 VI 的化合物的顺式对映体 ) ：
    包括其盐和水合物， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。
     此外， 本公开内容还提供基本上对映体纯的结构式 VII 的化合物， 该化合物尤其 可用作合成对映体异构性被限定的治疗剂的中间体 ：
    
    包括其盐和水合物， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。
     本公开内容还提供任选被保护的基本上对映体纯的结构式 VII(b) 的化合物 ( 对 应于结构式 VII 的化合物的顺式对映体 ) ：
    
    包括其盐和水合物， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。
     因此， 在具体的实施方案中， 本公开内容提供可用作合成一种或多种治疗剂的中 间体的下列稠合二环脯氨酸化合物， 以及用于合成至少下列稠合二环脯氨酸化合物的生物 催化方法 ：
    
    本公开内容提供可用作合成一种或多种治疗剂的中间体的下列稠合二环脯氨酸化合物， 以及用于合成至少下列稠合二环脯氨酸化合物的生物催化方法 ：
    在其他具体实施方案中， 本公开内容提供可用作合成一种或多种治疗剂的中间体 的下列化合物， 以及用于合成这些化合物的生物催化方法 ：
    
    因此， 本公开内容提供可用作合成一种或多种治疗剂的中间体的稠合二环脯氨酸 化合物， 以及用于合成这些稠合二环脯氨酸化合物的生物催化方法 ：
     本公开内容还提供用于生物催化合成基本上立体异构纯的结构式 II 至 VII 的化 合物的方法。在一个实施方案中， 本公开内容提供制备基本上立体异构纯的根据结构式 II 的亚胺化合物的方法， 所述化合物包括其盐， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述的。所述方法包 括使根据结构式 I 的对称 ( 非手性 ) 二环胺化合物
    
    其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述， 在辅因子的存在下在其中单胺氧化酶将结构式 I 的 胺化合物氧化为相应的结构式 II(a) 的亚胺化合物、 其式 II(b) 的二聚体和它们的混合物 的条件下与氧和单胺氧化酶接触。在某些实施方案中， 辅因子选自由下列组成的组 ： FAD、 FMN、 NADP 和 NAD。在具体的实施方案中， 辅因子是 FAD。在某些实施方案中， 反应混合物还 包含可用于促进将单胺氧化酶催化的反应的过氧化氢副产物歧化为分子氧和水的组分， 如 在方案 2( 下文 ) 中描绘的。在某些实施方案中， 该组分选自例如但不限于 Pd 和 Fe 以及类 似物的化学剂中， 而在其他实施方案中， 该组分是酶， 例如酶过氧化氢酶。在具体的实施方 案中， 反应混合物还包含酶过氧化氢酶， 所述过氧化氢酶催化方案 2 中所描绘的将过氧化 氢 (H2O2) 分解为分子氧和水的歧化反应。
     在某些实施方案中， 能够将结构式 I 的胺化合物氧化为相应的结构式 II(a) 的亚 胺化合物的单胺氧化酶由曲霉属 (Aspergillus) 的物种获得。在具体的实施方案中， 单 胺氧化酶是黑曲霉单胺氧化酶， 而在其他实施方案中， 单胺氧化酶是米曲霉 (Aspergillus oryzae) 单胺氧化酶。 在任一情况下， 单胺氧化酶可以从相应的曲霉属物种纯化或者可以作 为在异源宿主中表达的重组蛋白分离， 所述异源宿主例如但不限于大肠杆菌 (E.coli.)。
     在另一实施方案中， 能够将结构式 I 的胺化合物氧化为相应的结构式 II(a) 的亚 胺化合物的单胺氧化酶包含多于一种单胺氧化酶的部分， 例如包含黑曲霉单胺氧化酶的氨 基端部分和米曲霉单胺氧化酶的羧基端部分的融合蛋白或杂合蛋白。在具体的实施方案 中， 单胺氧化酶是 495 个氨基酸的蛋白 (SEQ ID NO ： 6)， 其中氨基端的 314 个氨基酸对应于 黑曲霉的氨基端的 314 个氨基酸 (SEQ ID NO ： 2)， 并且羧基端的 181 个氨基酸对应于米曲 霉的羧基端的 181 个氨基酸 (SEQ ID NO ： 32)。在其他具体实施方案中， 单胺氧化酶是选自 下列的 SEQ ID NO ： 6 的 495 个氨基酸的蛋白的衍生物 ： SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ IDNO ： 18、 SEQ ID NO ： 20 和 SEQ ID NO ： 36， 它们的每一个携 带与 SEQ IDNO ： 6 的氨基酸序列相比的至少一个氨基酸取代。
     在某些实施方案中， 能够将结构式 I 的胺化合物氧化为相应的结构式 II(a) 的亚 胺化合物的单胺氧化酶衍生自 SEQ ID NO ： 2 的曲霉属单胺氧化酶并且与 SEQ ID NO ： 2 的黑 曲霉单胺氧化酶的氨基酸序列相比具有两个或更多个氨基酸取代。在具体的实施方案中， 能够将结构式 I 的胺化合物氧化为相应的结构式 II 的亚胺化合物的单胺氧化酶包含 SEQ ID NO ： 4 或 SEQID NO ： 8 的氨基酸序列。
     在其他实施方案中， 能够将结构式 I 的胺化合物氧化为相应的结构式 II(a) 的亚 胺化合物的单胺氧化酶是融合蛋白， 其中氨基端氨基酸序列衍生自第一曲霉单胺氧化酶， 而羧基端氨基酸序列衍生自另一曲霉单胺氧化酶的氨基酸序列。在某些非限制性实施方 案中， 这种融合蛋白的氨基端和羧基端部分二者可以独立地选自由下列组成的组之中 ： SEQ ID NO ： 22、 SEQID NO ： 24、 SEQ ID NO ： 26、 SEQ ID NO ： 28、 SEQ ID NO ： 30、 SEQ ID NO ： 32 和 SEQ ID NO ： 34。在具体的实施方案中， 融合蛋白的氨基端部分衍生自 SEQ ID NO ： 32 的蛋
     白， 而融合蛋白的羧基端部分衍生自 SEQ ID NO ： 2 的蛋白。
     在某些实施方案中， 本公开内容提供制备根据结构式 III(a) 或 III(b) 的氨基磺 酸盐化合物的方法， 所述化合物包括其盐和水合物， A、 M 和 M’ 如上文所描述的。这些方法 包括使根据结构式 I 的对称二环胺化合物在产生氨基磺酸盐 ( 亚胺 - 亚硫酸氢盐加成物 ) 化合物的条件下与氧、 单胺氧化酶和亚硫酸氢盐接触， A、 M 和 M’ 如上文所述。在具体的实 施方案中， 氧化反应混合物还包含酶过氧化氢酶。
     本公开内容还提供制备基本上立体异构纯的根据结构式 IV(a) 的氨基腈化合物 的方法， 所述化合物包括其盐和水合物， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。该方法包括使根据 结构式 I 的对称二环胺化合物与氧、 单胺氧化酶和亚硫酸氢盐接触， 随后在产生氨基腈化 合物的条件下与氰化物接触， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所述。在具体的实施方案中， 氧化反应 混合物还包含酶过氧化氢酶。
     本公开内容提供制备基本上立体异构纯的根据结构式 IV 的氨基腈化合物的方 法， 所述化合物包括其盐， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。该方法包括使根据结构式 I 的对 称二环胺化合物与氧、 单胺氧化酶接触形成结构式 II(a) 的亚胺、 其结构式 II(b) 的二聚体 或它们的混合物， 随后在产生氨基腈化合物的条件下与氰化物接触， 其中 A、 M 和 M’ 如上文 所述。在具体的实施方案中， 氧化反应混合物还包含酶过氧化氢酶。
     本公开内容还提供制备基本上立体异构纯的根据结构式 VI 的氨基酸化合物的方 法， 所述化合物包括其盐， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述， 所述方法是由结构式 II(a) 的化合 物 ( 或结构式 II(b) 的化合物 ) 开始的， 或者由结构式 IV(a) 氨基腈化合物开始。所述方 法包括在其中氨基腈化合物转化为结构式 VI 的氨基酸化合物的条件下使基本上立体异构 纯的根据结构式 IV 的氨基腈化合物与酸和水接触， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。
     本公开内容还提供制备基本上立体异构纯的根据结构式 VI 的氨基酸化合物的方 法， 所述化合物包括其盐和共晶 ( 例如， NH4Cl)， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。该方法包括 使根据结构式 I 的对称 ( 非手性 ) 胺化合物与氧、 单胺氧化酶接触， 随后在适于产生基本上 立体异构纯的根据结构式 IV 的氨基腈化合物的条件下与氰化物接触， 其中 A、 M 和 M’ 如上 文所述。在某些实施方案中， 氧化反应混合物还包含酶过氧化氢酶。在氨基腈化合物转化 为结构式 VI 的氨基酸化合物的条件下使如此形成的氨基腈化合物与酸和水接触。
     本公开内容还提供制备基本上立体异构纯的根据结构式 VI 的氨基酸化合物的方 法， 所述化合物包括其盐和共晶 ( 例如， NH4Cl)， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。该方法包括 使根据结构式 I 的对称 ( 非手性 ) 胺化合物与氧、 单胺氧化酶和亚硫酸氢盐接触， 随后在适 于产生基本上对映体纯的根据结构式 IV 的氨基腈化合物的条件下与氰化物接触， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所述。在某些实施方案中， 氧化反应混合物还包含酶过氧化氢酶。在其中氨基 腈化合物转化为结构式 VI 的氨基酸化合物的条件下使如此形成的氨基腈化合物与酸和水 接触。在其他实施方案中， 在氨基腈化合物转化为结构式 V 的氨基酯化合物的条件下使如 此形成的氨基腈化合物与酸和醇接触。
     此外， 本公开内容提供使用本文所公开的新颖的化合物和新颖的方法制备基本上 立体异构纯的被保护的根据结构式 V 的氨基酸化合物的方法， 所述化合物包括其盐， 其中 5 A、 M、 M’ 和 R 如上文所描述， 所述新颖的方法包括生物催化方法。所述方法包括在其中氨 基腈化合物转化为结构式 V 的氨基酸酯化合物的条件下使基本上立体异构纯的根据结构式 IV 的氨基腈化合物与酸和醇接触， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。
     本公开内容还提供使用本文所公开的新颖的化合物和新颖的方法制备基本上对 映体纯的根据结构式 VI 的氨基酸化合物的方法， 所述化合物包括其盐， 其中 A、 M、 M’ 如上文 所描述， 所述新颖的方法包括生物催化方法。所述方法包括在其中氨基腈化合物转化为结 构式 VI 的氨基酸化合物的条件下使基本上对映体纯的根据结构式 IV 的氨基腈化合物与酸 ( 例如， HCl) 接触， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。
     本公开内容还提供制备基本上对映体纯的根据结构式 VI 的氨基酸化合物的方 法， 所述化合物包括其盐和共晶 ( 例如， NH4Cl)， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。该方法包括 使根据结构式 I 的胺化合物与氧和单胺氧化酶以及 NaHSO3 接触， 随后在适于产生基本上对 映体纯的根据结构式 IV 的氨基腈化合物的条件下与氰化物接触， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所 述。在某些实施方案中， 反应混合物还包含酶过氧化氢酶。在其中氨基腈化合物转化为结 构式 VI 的氨基酸化合物的条件下使如此形成的氨基腈化合物与 HCl 接触。
     此外， 本公开内容提供使用本文所公开的新颖的化合物和新颖的方法制备基本上 对映体纯的根据结构式 V 的氨基酸酯化合物的方法， 所述化合物包括其盐， 其中 A、 M、 M’ 和 5 R 如上文所描述， 所述新颖的方法包括生物催化方法。所述方法包括在其中氨基腈化合物 转化为结构式 V 的氨基酯化合物的条件下使基本上对映体纯的根据结构式 IV 的氨基腈化 合物与酸 ( 例如， HCl) 和醇接触， 其中 A、 M、 M’ 如上文所描述。
     本公开内容还提供制备基本上对映体纯的根据结构式 VII 的氨基酰胺化合物的 方法， 所述化合物包括其盐， 其中 A、 M 和 M’ 如上文所描述。所述方法包括使根据结构式 I 的胺化合物与氧和单胺氧化酶和任选的过氧化氢酶和亚硫酸氢盐接触， 随后在适于产生基 本上对映体纯的根据结构式 IV 的氨基腈化合物的条件下与氰化物接触， 其中结构式 I 中的 A、 M、 M’ 如上文所描述， 结构式 IV 中的 A、 M、 M’ 如上文所描述， 并然后在氨基腈化合物可以 转化成结构式 VII 的氨基酸酰胺化合物的条件下使所述氨基腈化合物与 HCl 和水接触。
     能够将结构式 I 的胺化合物氧化为相应的结构式 II 的亚胺化合物的本公开内容 的单胺氧化酶与 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 32 和 SEQ ID NO ： 6 的氨基酸序列相比具有一个 或多个氨基酸取代。这种氨基酸取代为单胺氧化酶提供了一种或多种改良的特性， 包括酶 活性增加、 立体选择性增加、 热稳定性增加、 溶剂稳定性增加、 产物抑制降低、 底物抑制降低 或对反应副产物的敏感性降低。 这种氨基酸取代还可以改善单胺氧化酶在宿主细胞中的溶 解性、 稳定性和表达水平， 例如作为在异源宿主细胞中重组表达的蛋白， 所述异源宿主细胞 例如但不限于大肠杆菌宿主细胞。
     本公开内容还提供编码这种单胺氧化酶的多核苷酸和在所公开的生物催化方法 中使用多肽的方法。
     在一些实施方案中， 本说明书中公开的单胺氧化酶与 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 32 或 SEQ ID NO ： 6 的酶相比在它们的酶活性速率， 即将结构式 I 的胺化合物转化为相应的结 构式 II 的亚胺化合物的速率方面是有所改善的。在一些实施方案中， 所公开的单胺氧化酶 能够以下列速率将底物转化为产物 ： SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 32 或 SEQ ID NO ： 6 的单胺氧 化酶所表现的速率的至少 1.5- 倍、 2- 倍、 3- 倍、 4- 倍、 5- 倍、 10- 倍、 25- 倍、 50- 倍、 100- 倍、 或大于 100- 倍。具有这种特性的示例性多肽包括但不限于包含对应于 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 SEQID NO ： 20 和 SEQ IDNO ： 36 的氨基酸序列的多肽。
     在一些实施方案中， 本文公开的单胺氧化酶能够将结构式 I 的胺化合物转化为相 应的结构式 II 的亚胺化合物， 其中对映体过量百分比为至少约 95％。 具有这种特性的示例 性多肽包括但不限于包含对应于 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ IDNO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ ID NO ： 20 和 SEQ ID NO ： 36 的氨基 酸序列的多肽。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶基于 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ IDNO ： 16、 SEQ ID NO ： 18 和 SEQ ID NO ： 20 的序列式， 并且可以包含与所述序列式至少约 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 或 99％相同的氨基酸序列。 这些差异可以是 一个或多个氨基酸插入、 缺失、 取代或这些改变的任何组合。在一些实施方案中， 氨基酸序 列差异可以包含非保守的、 保守的以及非保守的和保守的氨基酸取代的组合。本文描述了 可以进行这些改变的各种氨基酸残基位置。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO.6 的残基 99 和 SEQ ID NO ： 32 的残基 97 的氨基酸谷氨酰胺被酸性氨基酸 即天冬氨酸或谷氨酸取代的氨基酸序列。在具体的实施方案中， 该谷氨酰胺残基被谷氨酸 残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO.6 的残基 365 和 SEQ ID NO ： 32 的残基 363 的氨基酸酪氨酸被不同的芳族 氨基酸即苯丙氨酸或色氨酸氨酸保守地取代的氨基酸序列。在具体的实施方案中， 该酪氨 酸残基被色氨酸残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO.6 的残基 382 和 SEQ ID NO ： 32 的残基 380 的氨基酸苯丙氨酸被非极性氨 基酸即缬氨酸、 异亮氨酸、 丙氨酸、 甘氨酸、 蛋氨酸或亮氨酸取代的氨基酸序列。 在具体的实 施方案中， 该苯丙氨酸残基被亮氨酸残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO.6 的残基 465 和 SEQ ID NO ： 32 的残基 463 的氨基酸丝氨酸被非极性氨基 酸即缬氨酸、 异亮氨酸、 丙氨酸、 蛋氨酸、 亮氨酸或甘氨酸取代的氨基酸序列。 在具体的实施 方案中， 该丝氨酸残基被甘氨酸残基取代。
     在其他实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO.6 的残基 135 的氨基酸苏氨酸被另一极性氨基酸即丝氨酸、 谷氨酰胺或天冬 酰胺保守地取代的氨基酸序列。 在具体的实施方案中， 该苏氨酸残基被谷氨酰胺残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO.6 的残基 284 的氨基酸天冬酰胺被酸性氨基酸即天冬氨酸或谷氨酸取代的 氨基酸序列。在具体的实施方案中， 该天冬酰胺残基被谷氨酸残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 的残基 289 的氨基酸被另一非极性氨基酸即甘氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸或蛋氨酸 保守取代的氨基酸序列。在具体的实施方案中， 该丙氨酸残基被缬氨酸残基取代。
     在其他实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ：2 的残基 384 的氨基酸赖氨酸被另一极性氨基酸即丝氨酸、 苏氨酸或谷氨酰胺保守地取代 的氨基酸序列。在具体的实施方案中， 该赖氨酸残基被谷氨酰胺残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶是如下的单胺氧化酶 ： 其为 黑曲霉单胺氧化酶 (SEQ ID NO ： 2) 的同源物或米曲霉单胺氧化酶 (SEQ ID NO ： 44) 的同源 物并且携带对应于本文所公开的那些氨基酸取代的一个或多个氨基酸取代。 示例性同源物 包括单胺氧化酶 SEQ IDNO ： 22、 SEQ ID NO ： 24、 SEQ ID NO ： 26、 SEQ ID NO ： 28、 SEQ ID NO ： 30、 SEQ ID NO ： 32 和 SEQ ID NO ： 34。在其他实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶 是选自下列序列的酶并且携带对应于本文所公开的那些氨基酸取代的一个或多个氨基酸 取代的单胺氧化酶 ： SEQ ID NO ： 22、 SEQ IDNO ： 24、 SEQ ID NO ： 26、 SEQ ID NO ： 28、 SEQ ID NO ： 30、 SEQ ID NO ： 32 和 SEQ ID NO ： 34。
     在另一方面， 本公开内容提供编码本文所述的工程化单胺氧化酶的多核苷酸或在 高度严格条件下与这种多核苷酸杂交的多核苷酸。 所述多核苷酸可以包含启动子和可用于 表达编码的工程化单胺氧化酶的其他调节元件， 并且所述多核苷酸可以利用被优化用于特 定的期望表达系统的密码子。示例性多核苷酸包括但不限于 SEQ ID NO ： 1、 SEQ ID NO ： 5、 SEQ IDNO ： 7、 SEQ ID NO ： 9、 SEQ ID NO ： 11、 SEQ ID NO ： 13、 SEQ ID NO ： 15、 SEQ ID NO ： 17、 SEQ ID NO ： 19、 SEQ ID NO ： 31 和 SEQ ID NO ： 35。 在另一方面， 本公开内容提供包含本文所述的多核苷酸和 / 表达载体的宿主细 胞。所述宿主细胞可以是曲霉属的细胞， 例如黑曲霉、 米曲霉或构巢曲霉 (Aspergillus nidulans)， 或者它们可以是不同的生物体， 例如大肠杆菌或酿酒酵母 (S.cerevisiae)。宿 主细胞可用于表达和分离本文所描述的工程化单胺氧化酶， 或者可选地， 它们可直接用于 将底物转化为立体异构的产物。
     无论是用全细胞、 细胞提取物还是纯化的单胺氧化酶进行方法， 均可以使用单一 的单胺氧化酶， 或者可选择地， 可以使用两种或更多种单胺氧化酶的混合物。
     本文所述的单胺氧化酶能够催化结构式 I 的化合物氧化为结构式 II(a) 的化合 物：
    
    在 具 体 的 实 施 方 案 中， 本 文 所 述 的 单 胺 氧 化 酶 能 够 催 化 (1R， 5S)-6， 6- 二 甲 基 -3- 氮 杂 二 环 [3.1.0] 己 烷， 化 合 物 (1) 氧 化 为 (1R， 5S)-6， 6- 二 甲 基 -3- 氮 杂 二 环 [3.1.0] 己 -2- 烯， 化合物 (2) ：
    
    
    在另一具体实施方案中， 本文所述的单胺氧化酶能够催化 (3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (3) 氧化为 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (4) ：在将结构式 I 的化合物氧化为结构式 II(a) 的化合物的方法的一些实施方案中， 底物被氧化为大于约 99％立体异构体过量的产物， 其中单胺氧化酶包含对应于 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 6、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ IDNO ： 20、 或 SEQ ID NO ： 36 的序列。
     在将结构式 I 的化合物氧化为结构式 II(a) 的化合物的这种方法的一些实施方案 中， 用约 1-10g/L 的多肽， 在小于约 24 小时内至少约 10-20％的 1-100g/L 底物被转化为产 物， 其中所述多肽包含对应于 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 6、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ IDNO ： 14、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ ID NO ： 20、 或 SEQ ID NO ： 36 的氨基酸序列。
     在将底物还原为产物的这种方法的一些实施方案中， 在用大于约 25-50g/L 的底 物和小于约 1-5g/L 的多肽进行时， 在小于约 24 小时内至少约 95％的底物被转化为产物， 其 中所述多肽包含对应于 SEQ ID NO ： 4、 SEQ IDNO ： 6、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ ID NO ： 20、 或 SEQ ID NO ： 36 的氨 基酸序列。
     5. 详述
     5.1 本公开内容的稠合二环脯氨酸化合物
     5.1.1 式 II(a) 和式 II(b) 的稠合二环脯氨酸化合物
     本公开内容提供基本上对映体纯的结构式 II(a) 的稠合二环脯氨酸化合物和其 二聚体结构式 II(b) 的化合物以及它们的混合物 ：
    
    包括它们盐和水合物， 其中 A 是 O、 CR1R2、 -C ＝ C- 或 -CH2-CH2-， 其中 R1 和 R2 各自 独立地选自 -H、 -COOH、 -X、 -NH2、 -CH2NHC(NH)NH2、 -CX3、 -CH3、 -CH2CH3， 并且其中 X 选自 F、 Cl 和 Br。M 和 M’ 二者可以都存在或者可以都不存在， 并且当 M 和 M’ 二者都存在时， M 和 M’ 是 3 4 3 4 3 4 3 4 相同的并且选自 O 和 CR R ， 其中 R 和 R 是 H， 或者 M 的 R 或 R 和 M’ 的 R 或 R 形成亚甲 基桥接， 条件是 ： (a) 当 M 和 M’ 是 O 时， A 不是 O ； 并且当 A 是 O 时， M 和 M’ 不是 O ； (b) 当 M 3 4 3 4 和 M’ 是 CR R 时， A 可以是 -CH ＝ CH- 或 -CH2-CH2- ； 并且 (c) 当 M 和 M’ 是 CR R 并且具有 一个或多个立体中心时， M 和 M’ 的立体中心具有相反的立体化学性。
     在一个实施方案中， A 是 -CH2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH3)
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH3)2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH2CH3)-。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)2。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)(CH3)-。
     在一个实施方案中， M 和 M’ 不存在， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -CH(CH3)、 -CH(C2H5)-、 -C(CH3)2-、 -C(C2H5)2-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH)2-、 CH(NH2)- 和 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 不存在并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -C(CH3)2-、 -C(CH3)2- 和 -C(C2H5)2-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 是 -CH2-， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -O-、 -CH2-、 -C( CH3)2-、 -CH(CH3)-、 -C(C2H5)2-、 -CH(C2H5)-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH )2-、 -CH(NH2)- 和 -C(H2)NHC(NH)NH2-。
     在 又 一 实 施 方 案 中， M 和 M’ 是 -CH2-，并 且 A 选 自 由 下 列 组 成 的 组： -O-、 -CH2- 和 -C(CH3)2-。
     在再一实施方案中， M 和 M’ 是 -O-， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -CH(CH3)、 -CH(C2H5)-、 -C(CH3)2-、 -C(C2H5)2-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH)2-、 CH(NH2)- 和 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-。
     在 另 一 实 施 方 案 中， M 和 M’ 是 -O-，并 且 A 选 自 由 下 列 组 成 的 组： -CH2-、 -C(CH3)2- 和 -C(C2H5)2-。
     已知许多吡咯烷化合物 ( 例如， 3， 4- 二氢 -2H- 吡咯 ) 的亚胺由于环的张力除二聚 体以外形成热力学有利的三聚体， 或者形成热力学有利的三聚体而不形成二聚体。 因此， 在 某些实施方案中， 上述式 II(a) 化合物的任一种还可以以具有结构式 II(c) 的三聚体形式 存在
     在某些实施方案中， 本公开内容提供式 II(a) 的化合物的三聚体， 例如， 式 II(c) 的化合物， 和它们与式 II(a) 和 / 或式 II(b) 的化合物的混合物。
     5.1.2 结构式 III 的氨基磺酸盐
     本公开内容还提供基本上对映体纯的结构式 III(a) 和 III(b) 的氨基磺酸盐化合 物：
    
    包括其盐、 水合物和混合物， 其中 A 是 O、 CR1R2、 -C ＝ C- 或 -CH2-CH2-， 其中 R1 和 R2 各自独立地选自 -H、 -COOH、 -X、 -NH2、 -CH2NHC(NH)NH2、 -CX3、 -CH3、 -CH2CH3， 并且其中 X 选自 F、 Cl 和 Br。M 和 M’ 二者可以都存在或者可以都不存在， 并且当 M 和 M’ 二者都存在时， M和 3 4 3 4 3 4 3 4 M’ 是相同的并且选自 O 和 CR R ， 其中 R 和 R 是 H， 或者 M 的 R 或 R 和 M’ 的 R 或 R 形成 亚甲基桥接， 条件是 ： (a) 当 M 和 M’ 是 O 时， A 不是 O ； 并且当 A 是 O 时， M 和 M’ 不是 O ； (b) 3 4 3 4 当 M 和 M’ 是 CR R 时， A 可以是 -CH ＝ CH- 或 -CH2-CH2- ； 并且 (c) 当 M 和 M’ 是 CR R 并且 具有一个或多个立体中心时， M 和 M’ 的立体中心具有相反的立体化学性。
     在一个实施方案中， A 是 -CH2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH3)-。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH3)2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH2CH3)-。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)2。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)(CH3)-。
     在一个实施方案中， M 和 M’ 不存在， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -CH(CH3)、 -CH(C2H5)-、 -C(CH3)2-、 -C(C2H5)2-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH)2-、 CH(NH2)- 和 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 不存在， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -C(CH3)2、 -C(CH3)2- 和 -C(C2H5)2-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 是 -CH2-， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -O-、 -CH2-、 -C( CH3)2-、 -CH(CH3)-、 -C(C2H5)2-、 -CH(C2H5)-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH )2-、 -CH(NH2)- 和 -C(H2)NHC(NH)NH2
     在 又 一 实 施 方 案 中， M 和 M’ 是 -CH2-，并 且 A 选 自 由 下 列 组 成 的 组： -O-、 -CH2- 和 -C(CH3)2-。
     在再一实施方案中， M 和 M’ 是 -O-， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -CH(CH3)、 -CH(C2H5)-、 -C(CH3)2-、 -C(C2H5)2-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH)2-、 CH(NH2)- 和 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-。
     在 另 一 实 施 方 案 中， M 和 M’ 是 -O-，并 且 A 选 自 由 下 列 组 成 的 组： -CH2-、 -C(CH3)2- 和 -C(C2H5)2-。
     5.1.3 结构式 IV 的氨基腈化合物
     另外， 本公开内容还提供基本上对映体纯的结构式 IV(a) 和 IV(b) 的氨基腈化合物：包括其盐、 水合物和混合物， 其中 A 是 O、 CR1R2、 -C ＝ C- 或 -CH2-CH2-， 其中 R1 和 R2 各自独立地选自 -H、 -COOH、 -X、 -NH2、 -CH2NHC(NH)NH2、 -CX3、 -CH3、 -CH2CH3， 并且其中 X 选自 F、 Cl 和 Br。M 和 M’ 二者可以都存在或者可以都不存在并且当 M 和 M’ 二者都存在时， M和 3 4 3 4 3 4 3 4 M’ 是相同的并且选自 O 和 CR R ， 其中 R 和 R 是 H， 或者 M 的 R 或 R 和 M’ 的 R 或 R 形成 亚甲基桥接， 条件是 ： (a) 当 M 和 M’ 是 O 时， A 不是 O ； 并且当 A 是 O 时， M 和 M’ 不是 O ； (b) 3 4 3 4 当 M 和 M’ 是 CR R 时， A 可以是 -CH ＝ CH- 或 -CH2-CH2- ； 并且 (c) 当 M 和 M’ 是 CR R 并且 具有一个或多个立体中心时， M 和 M’ 的立体中心具有相反的立体化学性。
     在一个实施方案中， A 是 -CH2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH3)-。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH3)2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH2CH3)-。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)2。
    在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)(CH3)-。
     在一个实施方案中， M 和 M’ 不存在， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -CH(CH3)、 -CH(C2H5)-、 -C(CH3)2-、 -C(C2H5)2-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH)2-、 CH(NH2)- 和 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 不存在， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -C(CH3)2、 -C(CH3)2- 和 -C(C2H5)2-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 是 -CH2-， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -O-、 -CH2-、 -C( CH3)2-、 -CH(CH3)-、 -C(C2H5)2-、 -CH(C2H5)-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH )2-、 -CH(NH2)- 和 -C(H2)NHC(NH)NH2-。
     在 又 一 实 施 方 案 中， M 和 M’ 是 -CH2-，并 且 A 选 自 由 下 列 组 成 的
     组： -O-、 -CH2- 和 -C(CH3)2-。
     5.1.4 结构式 V 的稠合二环脯氨酸化合物
     本公开内容提供结构式 V 的稠合二环脯氨酸化合物 ：
    包括其盐和水合物， 其中 A、 M 和 M’ ， 其中 R5 选自由下列组成的组 ： 保护基团 ( 例如， 苄基或三甲基甲硅烷基以及类似基团 )、 -(C1-C2) 烷基、 -(C1-C3) 烷基、 -(C1-C4) 5 烷 基 和 -(C1-C6) 烷 基。 在 某 些 非 限 制 性 实 施 方 案 中， R 是 甲 基、 乙 基 或 叔 丁 基， 包括 1 2 1 2 其 盐 和 水 合 物， 其 中 A 是 O、 CR R 、 -C ＝ C- 或 -CH2-CH2-， 其中 R 和 R 各自独立地选 自 -H、 -COOH、 -X、 -NH2、 -CH2NHC(NH)NH2、 -CX3、 -CH3、 -CH2CH3， 并且其中 X 选自 F、 Cl 和 Br。M 和 M’ 二者可以都存在或者可以都不存在， 并且当 M 和 M’ 二者都存在时， M 和 M’ 是相同的 3 4 3 4 3 4 3 4 并且选自 O 和 CR R ， 其中 R 和 R 是 H， 或者 M 的 R 或 R 和 M’ 的 R 或 R 形成亚甲基桥接， 条件是 ： (a) 当 M 和 M’ 是 O 时， A 不是 O ； 并且当 A 是 O 时， M 和 M’ 不是 O ； (b) 当 M 和 M’ 是 3 4 3 4 CR R 时， A 可以是 -CH ＝ CH- 或 -CH2-CH2- ； 并且 (c) 当 M 和 M’ 是 CR R 并且具有一个或多 个立体中心时， M 和 M’ 的立体中心具有相反的立体化学性。
     在一个实施方案中， A 是 -CH2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH3)-。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH3)2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH2CH3)
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)2。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)(CH3)-。
     在一个实施方案中， M 和 M’ 不存在， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -CH(CH3)、 -CH(C2H5)-、 -C(CH3)2-、 -C(C2H5)2-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH)2-、 CH(NH2)- 和 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 不存在并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -C(CH3)2-、 -C(CH3)2- 和 -C(C2H5)2-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 是 -CH2-， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -O-、 -CH2-、 -C( CH3)2-、 -CH(CH3)-、 -C(C2H5)2-、 -CH(C2H5)-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH )2-、 -CH(NH2)- 和 -C(H2)NHC(NH)NH2-。
     在 又 一 实 施 方 案 中， M 和 M’ 是 -CH2-，并 且 A 选 自 由 下 列 组 成 的 组： -O-、 -CH2- 和 -C(CH3)2-。
     在一个实施方案中， R5 是苄基。
     在一个实施方案中， R5 是三甲基甲硅烷基。
     在另一实施方案中， R5 是甲基。
     在又一实施方案中， R5 是乙基。
     在另一实施方案中， R5 是叔丁基。
     5.1.5 结构式 VI 的稠合二环脯氨酸化合物 本公开内容还提供基本上对映体纯的根据结构式 VI 的化合物 ：包括其盐和水合物， 其中 A 是 O、 CR1R2、 -C ＝ C- 或 -CH2-CH2-， 其中 R1 和 R2 各自独 立地选自 -H、 -COOH、 -X、 -NH2、 -CH2NHC(NH)NH2、 -CX3、 -CH3、 -CH2CH3， 并且其中 X 选自 F、 Cl 和 Br。M 和 M’ 二者可以都存在或者可以都不存在， 并且当 M 和 M’ 二者都存在时， M 和 M’ 是相 3 4 3 4 3 4 3 4 同的并且选自 O 和 CR R ， 其中 R 和 R 是 H， 或者 M 的 R 或 R 和 M’ 的 R 或 R 形成亚甲基 桥接， 条件是 ： (a) 当 M 和 M’ 是 O 时， A 不是 O ； 并且当 A 是 O 时， M 和 M’ 不是 O ； (b) 当 M 和 3 4 3 4 M’ 是 CR R 时， A 可以是 -CH ＝ CH- 或 -CH2-CH2- ； 并且 (c) 当 M 和 M’ 是 CR R 并且具有一个 或多个立体中心时， M 和 M’ 的立体中心具有相反的立体化学性。
     在一个实施方案中， A 是 -CH2-。
    在另一实施方案中， A 是 -CH(CH3)-。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH3)2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH2CH3)-。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)2。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)(CH3)-。
     在一个实施方案中， M 和 M’ 不存在， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -CH(CH3)、 -CH(C2H5)-、 -C(CH3)2-、 -C(C2H5)2-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH)2-、 CH(NH2)- 和 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 不存在并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -C(CH3)2-、 -C(CH3)2- 和 -C(C2H5)2-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 是 -CH2-， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -O-、 -CH2-、 -C( CH3)2-、 -CH(CH3)-、 -C(C2H5)2-、 -CH(C2H5)-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH )2-、 -CH(NH2)- 和 -C(H2)NHC(NH)NH2-。
     在 又 一 实 施 方 案 中， M 和 M’ 是 -CH2-，并 且 A 选 自 由 下 列 组 成 的 组： -O-、 -CH2- 和 -C(CH3)2-。
     5.1.6 结构式 VII 的稠合二环脯氨酸化合物
     此外， 本公开内容提供基本上对映体纯的结构式 VII 的杂二环亚氨基酸化合物 ：
    
    包括其盐和水合物， 其中 A 是 O、 CR1R2、 -C ＝ C- 或 -CH2-CH2-， 其中 R1 和 R2 各自独 立地选自 -H、 -COOH、 -X、 -NH2、 -CH2NHC(NH)NH2、 -CX3、 -CH3、 -CH2CH3， 并且其中 X 选自 F、 Cl 和Br。M 和 M’ 二者可以都存在或者可以都不存在并且当 M 和 M’ 二者都存在时， M 和 M’ 是相 3 4 3 4 3 4 3 4 同的并且选自 O 和 CR R ， 其中 R 和 R 是 H， 或者 M 的 R 或 R 和 M’ 的 R 或 R 形成亚甲基 桥接， 条件是 ： (a) 当 M 和 M’ 是 O 时， A 不是 O ； 并且当 A 是 O 时， M 和 M’ 不是 O ； (b) 当 M 和 3 4 3 4 M’ 是 CR R 时， A 可以是 -CH ＝ CH- 或 -CH2-CH2- ； 并且 (c) 当 M 和 M’ 是 CR R 并且具有一个 或多个立体中心时， M 和 M’ 的立体中心具有相反的立体化学性。
     在一个实施方案中， R6 和 R7 均是氢。
     在一个实施方案中， A 是 -CH2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH3)
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH3)2-。
     在另一实施方案中， A 是 -CH(CH2CH3)-。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)2。
     在另一实施方案中， A 是 -C(CH2CH3)(CH3)-。
     在一个实施方案中， M 和 M’ 不存在， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -CH(CH3)、 -CH(C2H5)-、 -C(CH3)2-、 -C(C2H5)2-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH)2-、 CH(NH2)- 和 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 不存在并且 A 选自由下列组成的组 ： -CH2-、 -C(CH3)2-、 -C(CH3)2- 和 -C(C2H5)2-。
     在另一实施方案中， M 和 M’ 是 -CH2-， 并且 A 选自由下列组成的组 ： -O-、 -CH2-、 -C( CH3)2-、 -CH(CH3)-、 -C(C2H5)2-、 -CH(C2H5)-、 -CF2-、 -CCl2-、 -CBr2-、 -C(CF3)2-、 -CH(COOH)-、 -C(COOH )2-、 -CH(NH2)- 和 -C(H2)NHC(NH)NH2-。
     在 又 一 实 施 方 案 中， M 和 M’ 是 -CH2-，并 且 A 选 自 由 下 列 组 成 的 组： -O-、 -CH2- 和 -C(CH3)2-。
     5.2 本公开内容的单胺氧化酶
     能够将结构式 I 的胺化合物氧化为相应的结构式 II 的亚胺化合物的本公开内容 的单胺氧化酶与 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 6 和 SEQ ID NO ： 32 的氨基酸序列相比具有一个 或多个氨基酸取代。这种氨基酸取代为单胺氧化酶提供了一种或多种改善的特性， 包括酶 活性增加、 立体特异性增加、 热稳定性增加、 溶剂稳定性增加、 产物抑制降低、 底物抑制降低 或对反应副产物的敏感性降低。 这种氨基酸取代还可以改善单胺氧化酶在宿主细胞中的表 达水平、 溶解性和 / 或稳定性， 例如作为在异源宿主细胞中重组表达的蛋白， 所述异源宿主 细胞例如但不限于大肠杆菌宿主细胞。在一个实施方案中， 氨基酸取代 S465G 提供本公开 内容的单胺氧化酶在大肠杆菌中的表达水平、 溶解性和 / 或稳定性的明显增加。
     本公开内容还提供编码这种单胺氧化酶的多核苷酸和在所公开的生物催化方法 中使用多肽的方法。
     在一些实施方案中， 本说明书中公开的单胺氧化酶与 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 6 或 SEQ ID NO ： 32 的酶相比在它们的酶活性速率， 即将结构式 I 的胺化合物转化为相应的结 构式 II 的亚胺化合物的速率方面是有所改善的。在一些实施方案中， 所公开的单胺氧化酶 能够以下列速率将底物转化为产物 ： SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 6 和 SEQ ID NO ： 32 的单胺氧 化酶所表现的速率的至少 1.5- 倍、 2- 倍、 3- 倍、 4- 倍、 5- 倍、 10- 倍、 25- 倍、 50- 倍、 100- 倍、 或大于 100- 倍。具有这种特性的示例性多肽包括但不限于包含对应于 SEQ ID NO ： 4、 SEQID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ ID NO ： 20、 或 SEQ IDNO ： 36 的氨基酸序列的多肽。
     在一些实施方案中， 本文公开的单胺氧化酶能够将结构式 I 的胺化合物转化为相 应的结构式 II 的亚胺化合物， 其中非对映体过量百分比为至少约 95％。具有这种特性的 示例性多肽包括但不限于包含对应于 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ IDNO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ ID NO ： 20、 或 SEQ ID NO ： 36 的氨 基酸序列的多肽。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶基于 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ IDNO ： 16、 SEQ ID NO ： 18 或 SEQ ID NO ： 20 的序列式， 并且可以包含与所述序列式至少约 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％相同的氨基酸序列。这些差异可以是 氨基酸插入、 缺失、 取代或这些改变的任何组合。在一些实施方案中， 氨基酸序列差异可以 包含非保守的氨基酸取代、 保守的氨基酸取代以及非保守的氨基酸取代和保守的氨基酸取 代的组合。本文描述了可以进行这些改变的各种氨基酸残基位置。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 6 的残基 99 和 SEQ ID NO ： 32 的残基 97 的氨基酸谷氨酰胺被酸性氨基酸 即天冬氨酸或谷氨酸取代的氨基酸序列。在具体的实施方案中， 该谷氨酰胺残基被谷氨酸 残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 6 的残基 365 和 SEQ ID NO ： 32 的残基 363 的氨基酸酪氨酸被不同的芳族 氨基酸即苯丙氨酸或色氨酸氨酸保守地取代的氨基酸序列。在具体的实施方案中， 该酪氨 酸残基被色氨酸残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 6 的残基 382 和 SEQ ID NO ： 32 的残基 380 的氨基酸苯丙氨酸被非极性氨 基酸即缬氨酸、 异亮氨酸、 丙氨酸、 甘氨酸、 蛋氨酸或亮氨酸取代的氨基酸序列。 在具体的实 施方案中， 该苯丙氨酸残基被亮氨酸残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 6 的残基 465 和 SEQ ID NO ： 32 的残基 463 的氨基酸丝氨酸被非极性氨基 酸即缬氨酸、 异亮氨酸、 丙氨酸、 蛋氨酸、 亮氨酸或甘氨酸取代的氨基酸序列。 在具体的实施 方案中， 该丝氨酸残基被甘氨酸残基取代。
     在其他实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 6 的残基 135 的氨基酸苏氨酸被另一极性氨基酸即丝氨酸、 谷氨酰胺或天 冬酰胺保守地取代的氨基酸序列。在具体的实施方案中， 该苏氨酸残基被谷氨酰胺残基取 代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 6 的残基 284 的氨基酸天冬酰胺被酸性氨基酸即天冬氨酸或谷氨酸取代的 氨基酸序列。在具体的实施方案中， 该天冬酰胺残基被谷氨酸残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 6 的残基 289 的氨基酸丙氨酸被另一非极性氨基酸即甘氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸或蛋氨酸取代的氨基酸序列。 在具体的实施方案中， 该丙氨酸残基被缬氨酸残 基取代。
     在其他实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶包含其中对应于 SEQ ID NO ： 2 的残基 384 的氨基酸赖氨酸被另一极性氨基酸即丝氨酸、 苏氨酸或谷氨酰胺保守地取代 的氨基酸序列。在具体的实施方案中， 该赖氨酸残基被谷氨酰胺残基取代。
     在一些实施方案中， 本公开内容的改良的单胺氧化酶是如下的单胺氧化酶 ： 其为 黑曲霉单胺氧化酶 (SEQ ID NO ： 2) 的同源物或米曲霉单胺氧化酶 (SEQ ID NO ： 32) 的同源 物并且携带对应于本文所公开的那些氨基酸取代的一个或多个氨基酸取代。 示例性同源物 包括下列序列的单胺氧化酶 ： SEQ ID NO ： 22、 SEQ ID NO ： 24、 SEQ ID NO ： 26、 SEQ ID NO ： 28、 SEQ IDNO ： 30、 SEQ ID NO ： 32 和 SEQ ID NO ： 34。因此， 在某些实施方案中， 本公开内容的改 良的单胺氧化酶是选自下列序列的酶的携带对应于本文所公开的那些氨基酸取代的一个 或多个氨基酸取代的单胺氧化酶 ： SEQ IDNO ： 22、 SEQ ID NO ： 24、 SEQ ID NO ： 26、 SEQ ID NO ： 28、 SEQ ID NO ： 30、 SEQ ID NO ： 32 和 SEQ ID NO ： 34。
     5.3 定义
     如本文所用的下列术语旨在具有下列含义。
     “单胺氧化酶” 是指具有将上述结构式 I 的化合物氧化为相应的上述结构式 II 的 产物的酶能力的多肽。该多肽通常利用氧化的辅因子， 例如但不限于黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD)、 黄素腺嘌呤单核苷酸 (FMN)、 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 或烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸磷酸 (NADP)。在具体的实施方案中， 氧化的辅因子是 FAD。如本文所用的单胺氧化酶包 括天然存在的 ( 野生型 ) 单胺氧化酶以及通过人操作产生的非天然存在的工程化多肽。
     “编码序列” 是指编码蛋白的氨基酸序列的那部分核酸 ( 例如， 基因 )。
     “天然存在的” 或 “野生型” 是指天然发现的形式。例如， 天然存在的或野生型多肽 或多核苷酸序列是在生物体中存在的可以从天然来源分离的序列并且该序列没有通过人 操作被故意地修饰。
     当结合例如细胞、 核酸或多肽使用时， “重组” 是指已经以否则不会天然存在的方 式被修饰、 或者与材料的天然形式或固有形式相同但是产自或源于合成材料和 / 或通过使 用重组技术的操作产生或衍生的材料， 或相应于该材料的天然形式或固有形式的材料。非 限制性实例包括但不限于 ： 表达在固有 ( 非重组 ) 形式的细胞中不存在的基因或者表达否 则以不同的水平表达的固有基因的重组细胞。
     “序列同一性百分比” 和 “百分比同源性” 在本文中可互换使用， 是指多核苷酸和 多肽之间的比较， 并且是通过在比较窗口中比较两条最佳比对的序列来确定的， 其中多核 苷酸或多肽序列在比较窗口中的部分与两条序列最佳比对的参考序列 ( 其不包含添加或 缺失 ) 相比可以包含添加或缺失 ( 即， 缺口 )。百分比可以如下计算 ： 确定在两条序列中 出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数从而产生匹配位置数， 用匹配位置数除以比较窗 口中位置的总数并将结果乘以 100， 得出序列同一性的百分比。可选择地， 百分比可以如 下计算 ： 确定在两条序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数或者与缺口对齐的 核酸碱基或氨基酸残基的位置数从而得出匹配位置数， 用匹配位置数除以比较窗口中位置 的总数并将结果乘以 100， 得出序列同一性的百分比。本领域的技术人员了解存在许多已 确立的算法可用于比对两条序列。可以通过下列算法进行比较序列的最佳比对 ： 例如， 通过 Smith 和 Waterman， 1981， Adv.Appl.Math.2 ： 482 的局部同源性算法 ； 通过 Needleman 和 Wunsch， 1970， J.Mol.Biol.48 ： 443 的 同 源 比 对 算 法 ； 通 过 Pearson 和 Lipman， 1988， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 ： 2444 的相似性检索方法 ； 通过这些算法的计算机化执行 ( 在 GCG Wisconsin 软件包中的 GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 TFASTA) 或通过视觉检查 ( 大体参见， CurrentProtocols in Molecular Biology( 分子生物学最新实验方案 )， F.M.Ausubel 等 人， 编辑， Current Protocols， Greene Publishing Associates， Inc. 与 JohnWiley&Sons， Inc. 合资， (1995 补充材料 )(Ausubel))。适于确定百分比序列同一性和序列相似性的 算法的实例是 BLAST 和 BLAST 2.0 算法， 它们分别描述于 ： Altschul 等人， 1990， J.Mol. Biol.215 ： 403-410 和 Altschul 等人， 1977， Nucleic Acids Res.3389-3402 中。 进行 BLAST 分析的软件通过美国国家生物技术信息中心网站可公开获得。这种算法包括首先通过鉴 定在查询序列中长度为 W 的短字 (word) 来鉴定高评分序列对 (HSP)， 所述短字在与数据 库序列中相同长度的字比对时符合或满足一些正值阈值评分 T。T 是指相邻字评分阈值 (Altschul 等人， 如上 )。这些最初的相邻字匹配字串 (word hit) 充当启动寻找含有它们 的更长 HSP 的种子。然后字匹配字串沿着各序列在两个方向延伸， 只要累积比对评分可以 增加即可。 对于核苷酸序列， 累积评分使用参数 M( 匹配残基对的奖励评分 (rewardscore) ； 总是大于 0) 和 N( 错配残基的惩罚评分， 总是小于 0) 计算。对于氨基酸序列， 使用评分矩 阵来计算累积评分。在下列情况下停止各方向的字匹配字串延伸 ： 累积比对评分由其达 到的最大值降低了量 X ； 累积评分由于一个或多个负评分残基比对的累积而变为零或低于 零； 或到达任一序列的末端。BLAST 算法参数 W、 T 和 X 决定比对的灵敏度和速度。BLASTN 程序 ( 对于核苷酸序列 ) 使用下列作为缺省参数 ： 字长 (wordlength， W) 为 11， 期望值 (E) 为 10， M ＝ 5， N ＝ -4， 以及两条链的比较。对于氨基酸序列， BLASTP 程序使用下列缺省参 数： 字长 (W) 为 3， 期望值 (E) 为 10 以及 BLOSUM62 评分矩阵 ( 参见 Henikoff 和 Henikoff， 1989， Proc Natl Acad Sci USA 89 ： 10915)。示例性的序列比对和％序列同一性的确定可 以采用 GCG Wisconsin 软件包 (Accelrys， Madison WI) 中的 BESTFIT 或 GAP 程序， 使用所 提供的缺省参数。
     “参考序列” 是指用作序列比较的基础的确定序列。参考序列可以是较大序列的子 序列， 例如全长基因或多肽序列的区段。一般地， 参考序列是至少 20 个核苷酸或氨基酸残 基长、 至少 25 个残基长、 至少 50 个残基长或全长的核酸或多肽。由于两条多核苷酸或多肽 可以各自 (1) 包含两个序列之间相似的序列 ( 即， 完整序列的一部分 ) 并且 (2) 还可以包 含两个序列之间差异的序列， 所以两条 ( 或更多条 ) 多核苷酸或多肽之间的序列比较通常 通过在 “比较窗口” 内比较两条多核苷酸的序列而鉴定和比较局部区域的序列相似性来进 行。
     “比较窗口” 是指其中可以将序列与至少 20 个连续核苷酸或氨基酸的参考序列相 比较的至少约 20 个连续核苷酸位置或氨基酸残基的概念上的区段， 并且其中在比较窗口 中的序列部分与两条序列最佳比对的参考序列 ( 其不包含添加或缺失 ) 相比可以包含 20％ 或更少的添加或缺失 ( 即， 缺口 )。比较窗口可以长于 20 个连续残基并且任选包含 30 个连 续残基、 40 个连续残基、 50 个连续残基、 100 个连续残基或更长的窗口。
     “基本的同一性” 是指在至少 20 个残基位置的比较窗口内、 通常在至少 30-50 个残 基的窗口内， 与参考序列相比具有至少 80％序列同一性、 至少 85％同一性和 89％至 95％序列同一性， 更通常至少 99％序列同一性的多核苷酸或多肽序列， 其中序列同一性百分比是 通过在比较窗口内将参考序列与包含参考序列的总计 20％或更少的缺失或添加的序列相 比计算而来的。在应用于多肽的特定实施方案中， 术语 “基本的同一性” 意指在通过例如程 序 GAP 或 BESTFIT 使用缺省空位权重 (gap weihgt) 进行最佳比对时， 两条多肽序列具有至 少 80％序列同一性， 优选至少 89％序列同一性， 至少 95％序列同一性或更高的序列同一性 ( 例如， 99％序列同一性 )。优选地， 不相同的残基位置是由于保守的氨基酸取代而不同。
     当用于给定氨基酸或多核苷酸序列编号的下文中时， “对应于” 、 “关于” 或 “相对 于” 是指在给定的氨基酸或多核苷酸序列与指定的参考序列相比较时， 所述参考序列的残 基编号。换言之， 给定的聚合物的残基编号或残基位置是关于参考序列指定的而非通过给 定氨基酸或多核苷酸序列中的残基的实际数字位置指定。例如， 可以通过引入缺口以优化 两条序列之间的残基匹配， 将诸如工程化单胺氧化酶的氨基酸序列的给定氨基酸序列与参 考序列比对。 在这些情况下， 尽管存在缺口， 但给定氨基酸或多核苷酸序列中残基的编号是 关于其所比对的参考序列而指定的。
     “立体选择性” 是指在化学反应或酶促反应中， 一种立体异构体相对于另一立体异 构体优先形成。 立体选择性可以是部分的， 这时一种立体异构体的形成比另一种有利， 或者 立体选择性可以是完全的， 这时只形成一种立体异构体。 当立体异构体是对映体时， 立体选 择性是指对映体选择性， 即一种对映体在两种对映体总和中的分数 ( 通常报道为百分比 )。 其 ( 通常为百分比 ) 在本领域中通常可选地报道为根据如下公式由其计算的对映体过量 (e.e.) ： [ 主要对映体 - 次要对映体 ]/[ 主要对映体 + 次要对映体 ]。在立体异构体是非对 映异构体时， 立体选择性是指非对映体选择性， 即一种非对映体在两种非对映体混合物中 的分数 ( 通常报道为百分比 )， 通常可选地报道为非对映体过量 (d.e.)。对映体过量和非 对映体过量是立体异构体过量的类型。
     “高立体选择性” ： 是指能够将底物转化为具有至少约 99％立体异构体过量的相应 产物的单胺氧化酶多肽。
     “立体特异性” 是指在化学反应或酶促反应中， 一种立体异构体相对于另一立体异 构体优先转化。 立体特异性可以是部分的， 这时一种立体异构体的转化比另一种有利， 或者 立体特异性可以是完全的， 这时只转化一种立体异构体。
     “化学选择性” 是指在化学反应或酶促反应中， 一种产物相对于另一产物优先形 成。
     “改良的酶特性” 是指与参考单胺氧化酶相比表现出任何酶特性改良的单胺氧化 酶多肽。 对于本文所述的工程化单胺氧化酶多肽， 一般进行与野生型单胺氧化酶的比较， 尽 管在一些实施方案中， 参考单胺氧化酶可以是另一种改良的单胺氧化酶。期望改良的酶特 性包括但不限于 ： 酶活性 ( 其可以根据百分比底物转化表示 )、 热稳定性、 pH 活性谱、 辅因 子需求、 对抑制剂 ( 例如， 产物抑制 ) 的不应性、 立体特异性、 立体选择性 ( 包括对映体选择 性 )、 溶解性和稳定性以及在宿主细胞中的表达水平。
     “增加的酶活性” 是指工程化单胺氧化酶多肽的改良的特性， 它可以通过与参考 单胺氧化酶相比的比活性 ( 例如， 产生的产物 / 时间 / 重量蛋白 ) 的增加或底物转化为产 物的百分比转化 ( 例如， 使用指定量的单胺氧化酶时在指定的时间段中起始量的底物转化 为产物的转化百分比 ) 的增加代表。确定酶活性的示例性方法在实施例中提供。可以影响关于酶活性的任何特性， 包括经典的酶特性 Km、 Vmax 或 kcat， 它们的改变可以导致酶活性 增加。酶活性的改善可以为相应的野生型单胺氧化酶的酶活性的约 1.5 倍至多达天然存 在的单胺氧化酶或单胺氧化酶多肽来源的另一工程化单胺氧化酶的酶活性的 2 倍、 5 倍、 10 倍、 20 倍、 25 倍、 50 倍、 75 倍、 100 倍或更多倍。技术人员应理解任何酶的活性是扩散限 制的， 使得催化转换速率不会超过底物 ( 包括任何所需的辅因子 ) 的扩散速率。扩散限制 或 kcat/Km 的理论最大值一般是约 108 至 109(M-1s-1)。因此， 单胺氧化酶的酶活性的任何改 善将具有与该单胺氧化酶所作用的底物的扩散速率有关的上限。单胺氧化酶活性可以使 用已公布的测量单胺氧化酶的方法或其改造方法测量， 例如但不限于 Zhou 等人 (Zhou 等 人 “A One-StepFluorometric Method for the Continuous Measurement of Monoamine OxidaseActivity( 单胺氧化酶活性连续测量的一步式荧光法 )， ” 1997 Anal.Biochem.253 ： 169-74) 和 Szutowicz 等人 (Szutowicz 等人， “Colorimetric Assay forMonoamine Oxidase in Tissues Using Peroxidase and2， 2′ -Azino(3-ethtylbenzthaizoline-6-sulfonic Acid)as Chromogen( 使用过氧化物酶和 2， 2′ - 连氮基 (3- 乙基苯并噻唑啉 -6- 磺酸 ) 作 为色原进行的组织中单胺氧化酶的比色测定 )， ” 1984， Anal.Biochem.138 ： 86-94) 所公开 的那些方法。酶活性的比较是使用限定的酶制剂、 在设定条件下的限定的测定和一种或多 种限定的底物进行的， 如本文进一步详细描述的或者使用例如 Zhou 和 Szutowicz 的方法。 一般地， 当比较裂解物时， 确定测定的细胞数和测定的蛋白的量并且使用相同的表达系统 和相同的宿主细胞来将宿主细胞产生的酶和裂解物中存在的酶的量的差异最小化。
     “转化” ： 是指底物至相应产物的酶促氧化。 “百分比转化” 是指在指定条件下一段 时间内被氧化为产物的底物的百分比。因此， 单胺氧化酶多肽的 “酶活性” 或 “活性” 可以 表示为底物至产物的 “百分比转化” 。
     “热稳定的” 是指单胺氧化酶多肽在暴露于升高的温度 ( 例如 40-80℃ ) 一段时间 ( 例如， 0.5-24 小时 ) 后与未处理的酶相比保持相似的活性 ( 例如大于 60％至 80％ )。
     “溶剂稳定的” 是指是指单胺氧化酶多肽在暴露于不同浓度 ( 例如， 5％ -99％ ) 的 溶剂 ( 异丙醇、 四氢呋喃、 2- 甲基四氢呋喃、 丙酮、 甲苯、 乙酸丁酯、 甲基叔丁醚等 ) 一段时间 ( 例如， 0.5-24 小时 ) 后与未处理的酶相比保持相似的活性 ( 大于例如 60％至 80％ )。
     “pH 稳定的” 是指单胺氧化酶多肽在暴露于高或低 pH( 例如 4.5-6 或 8 至 12) 一段 时间 ( 例如， 0.5-24 小时 ) 后与未处理的酶相比保持相似的活性 ( 大于例如 60％至 80％ )。
     “热稳定和溶剂稳定的” 是指是热稳定和溶剂稳定的单胺氧化酶多肽。
     如本文在工程化单胺氧化酶上下文中所用的 “衍生自” 确定工程化所根据的起源 单胺氧化酶和 / 或编码这种单胺氧化酶的基因。例如， SEQ ID NO ： 8 的工程化单胺氧化酶 是通过在多代中人工进化编码 SEQ ID NO ： 2 的黑曲霉单胺氧化酶的基因获得的。因此， 这 种工程化的单胺氧化酶 “衍生自” SEQID NO ： 2 的野生型单胺氧化酶。
     “亲 水 氨 基 酸 或 残 基”是 指 具 有 表 现 出 根 据 Eisenberg 等 人， 1984， J.Mol. Biol.179 ： 125-142 的标准化的一致性疏水量表小于零的疏水性的侧链的氨基酸或残 基。遗传编码的亲水氨基酸包括 L-Thr(T)、 L-Ser(S)、 L-His(H)、 L-Glu(E)、 L-Asn(N)、 L-Gln(Q)、 L-Asp(D)、 L-Lys(K) 和 L-Arg(R)。
     “酸性氨基酸或残基” 是指当氨基酸包含在肽或多肽中时， 具有表现出小于约 6 的 pK 值的侧链的亲水氨基酸或残基。酸性氨基酸在生理 pH 下由于氢离子的丢失而通常具有带负电荷的侧链。遗传编码的酸性氨基酸包括 L-Glu(E) 和 L-Asp(D)。
     “碱性氨基酸或残基” 是指当氨基酸包含在肽或多肽中时， 具有表现出大于约 6 的 pK 值的侧链的亲水氨基酸或残基。碱性氨基酸在生理 pH 下由于与水合氢离子的缔合而通 常具有带正电荷的侧链。遗传编码的碱性氨基酸包括 L-Arg(R) 和 L-Lys(K)。
     “极性氨基酸或残基” 是指具有如下的侧链的亲水氨基酸或残基 ： 在生理 pH 下不 带电荷， 但是其具有其中两个原子所共同拥有的电子对被这两个原子之一更紧密地持有的 至少一个键。遗传编码的极性氨基酸包括 L-Asn(N)、 L-Gln(Q)、 L-Ser(S) 和 L-Thr(T)。
     “疏 水 氨 基 酸 或 残 基”是 指 具 有 表 现 出 根 据 Eisenberg 等 人， 1984， J.Mol. Biol.179 ： 125-142 的标准化的一致性疏水量表大于零的疏水性的侧链的氨基酸或残 基。遗传编码的疏水氨基酸包括 L-Pro(P)、 L-Ile(I)、 L-Phe(F)、 L-Val(V)、 L-Leu(L)、 L-Trp(W)、 L-Met(M)、 L-Ala(A) 和 L-Tyr(Y)。
     “芳族氨基酸或残基” 是指具有包含至少一个芳环或杂芳环的侧链的亲水性或疏 水性氨基酸或残基。遗传编码的芳族氨基酸包括 L-Phe(F)、 L-Tyr(Y) 和 L-Trp(W)。尽 管 L-His(H) 由于其杂环氮原子的 pKa 而有时被归类为碱性残基或者由于其侧链包含杂芳 环而被归类为芳族残基， 但在本文中组氨酸被归类为亲水残基或 “限制残基 (constrained residue)” ( 参见下文 )。
     “限制氨基酸或残基” 是指具有限制的几何性质的氨基酸或残基。本文中， 限制残 基包括 L-pro(P) 和 L-his(H)。 组氨酸由于其具有相对小的咪唑环而具有限制的几何性质。 脯氨酸由于其还具有五元环而具有限制的几何性质。
     “非极性氨基酸或残基” 是指具有如下的侧链的疏水氨基酸或残基 ： 在生理 pH 下 不带电荷并且具有其中两个原子所共同拥有的电子对一般被这两个原子的每一个同等程 度的持有的键 ( 即侧链不是极性的 )。遗传编码的非极性氨基酸包括 L-Gly(G)、 L-Leu(L)、 L-Val(V)、 L-Ile(I)、 L-Met(M) 和 L-Ala(A)。
     “脂肪族氨基酸或残基” 是指具有脂肪族烃侧链的疏水氨基酸或残基。遗传编码的 脂肪族氨基酸包括 L-Ala(A)、 L-Val(V)、 L-Leu(L) 和 L-Ile(I)。
     “半胱氨酸。 ” 氨基酸 L-Cys(C) 的不寻常之处在于其可以与其他 L-Cys(C) 氨基酸 或其他含硫烷基或巯基的氨基酸形成二硫键。 “半胱氨酸样残基” 包括半胱氨酸和含有可用 于形成二硫键的巯基部分的其他氨基酸。L-Cys(C)( 和具有含 -SH 侧链的其他氨基酸 ) 以 还原的游离 -SH 或氧化的二硫键形式存在于肽中的能力影响了 L-Cys(C) 是赋予肽净疏水 特征还是亲水特征。虽然 L-Cys(C) 表现出根据 Eisenberg(Eisenberg 等人， 1984， 如上 ) 的标准化的一致性量表 0.29 的疏水性， 但应了解， 为了本公开内容的目的， 将 L-Cys(C) 归 类为其自身的独特组中。
     “小氨基酸或残基” 是指具有由共三个或更少的碳和 / 或杂原子 ( 不包括 α- 碳 和氢 ) 构成的侧链的氨基酸或残基。小氨基酸或残基可以根据上述定义被进一步归类为脂 肪族的、 非极性的、 极性的或酸性的小氨基酸或残基。遗传编码的小氨基酸包括 L-Ala(A)、 L-Val(V)、 L-Cys(C)、 L-Asn(N)、 L-Ser(S)、 L-Thr(T) 和 L-Asp(D)。
     “含羟基氨基酸或残基” 是指含有羟基 (-OH) 部分的氨基酸。遗传编码的含羟基氨 基酸包括 L-Ser(S)、 L-Thr(T) 和 L-Tyr(Y)。
     “保守的” 氨基酸取代或突变是指具有相似侧链的残基的可互换性， 并且因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。然而， 如本文所 用， 如果保守的突变可以代替地为脂肪族至脂肪族、 非极性至非极性、 极性至极性、 酸性至 酸性、 碱性至碱性、 芳族至芳族、 或限制残基至限制残基的取代， 则保守的突变不包括亲水 至亲水、 疏水至疏水、 含羟基至含羟基或小残基至小残基的取代。此外， 如本文所用， A、 V、 L 或 I 可以保守地突变为另一脂肪族残基或另一非极性残基。下表 1 显示了示例性的保守取 代。.
     表1： 保守取代
    “非保守取代” 是指用具有显著不同的侧链特性的氨基酸进行的多肽中氨基酸的 取代或突变。非保守取代可以使用上面所列的定义组之间而不是之内的氨基酸。在一个实 施方案中， 非保守突变影响 (a) 取代区域中肽主链的结构 ( 例如， 脯氨酸取代甘氨酸 )、 (b) 电荷或疏水性、 或 (c) 侧链体积。
     “缺失” 是指通过从参考多肽移除一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。缺失可 以包括移除 1 个或多个氨基酸、 2 个或更多个氨基酸、 5 个或更多个氨基酸、 10 个或更多个 氨基酸、 15 个或更多个氨基酸、 或 20 个或更多个氨基酸、 多达构成参考酶的氨基酸总数的 10％或多达构成参考酶的氨基酸总数的 20％， 同时保留酶活性和 / 或保留工程化单胺氧化 酶的改良特性。缺失可以针对多肽的内部和 / 或端部。在多个实施方案中， 缺失可以包含 连续的区段或者可以是不连续的。
     “插入” 是指通过从参考多肽添加一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。在一些 实施方案中， 改良的工程化单胺氧化酶包括将一个或多个氨基酸插入天然存在的单胺氧化 酶中以及将一个或多个氨基酸插入其他改良的单胺氧化酶多肽中。 插入可以是在多肽的内 部， 或羧基端或氨基端。如本文所用的插入包括如本领域中已知的融合蛋白。插入可以是 连续氨基酸区段或者被天然存在的多肽中的一个或多个氨基酸分隔开。
     关于指定的参考序列的 “与 ...... 不同” 或 “不同于” 是指给定氨基酸或多核苷
     酸序列在与参考序列比对时的差异。一般地， 可以在两条序列最佳比对时确定差异。差异 包括与参考序列相比的氨基酸残基的插入、 缺失或取代。
     如本文所用的 “片段” 是指具有氨基端和 / 或羧基端缺失， 但是其中剩余的氨基酸 序列与序列的相应位置相同的多肽。片段可以是至少 14 个氨基酸长、 至少 20 个氨基酸长、 至少 50 个氨基酸长或更长以及多达全长单胺氧化酶多肽的 70％、 80％、 90％、 95％、 98％和 99％。
     “分离的多肽” 是指与其天然伴随的其他污染物如蛋白、 脂和多核苷酸基本上分离 的多肽。该术语涵盖由它们的天然存在的环境或表达系统 ( 例如， 宿主细胞或体外合成 ) 中移出或纯化的多肽。 改良的单胺氧化酶可以存在于细胞中、 存在于细胞培养基中， 或以各 种形式制备， 例如裂解物或分离的制剂。如此， 在一些实施方案中， 改良的单胺氧化酶可以 是分离的多肽。
     “基本上纯的多肽” 是指其中多肽物质是存在的主要物质 ( 即， 以摩尔或重量计， 其比组合物中的任何其他单独的大分子物质更丰富 ) 的组合物， 并且该组合物在主题物质 以摩尔或％重量计构成至少约 50％的存在的大分子物质时大体上是基本上纯化的组合物。 一般地， 基本上纯的单胺氧化酶组合物以摩尔数或％重量计占组合物中存在的全部大分子 物质的约 60％或更多、 约 70％或更多、 约 80％或更多、 约 90％或更多、 约 95％或更多和约 98％或更多。在一些实施方案中， 将主题物质纯化为基本上同质的 ( 即， 通过常规检测方法 在组合物中不能检测到污染物质 )， 其中组合物基本上由单一的大分子物质组成。溶剂物 质、 小分子 ( ＜ 500 道尔顿 ) 和元素铁物质不被认为是大分子物质。在一些实施方案中， 分 离的改良单胺氧化酶多肽是基本上纯的多肽组合物。
     如本文所用的 “严格杂交” 是指其中核酸杂交物 (hybrid) 稳定的条件。如本领 域的技术人员已知的， 杂交物的稳定性是以杂交物的熔解温度 (Tm) 反映的。一般地， 杂交 物的稳定性取决于离子强度、 温度、 G/C 含量、 以及离液剂的存在。多核苷酸的 Tm 值可以 使用预测熔解温度的已知方法计算 ( 参见， 例如 Baldino 等人， Methods Enzymology 168 ： 761-777 ； Bolton 等人， 1962， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48 ： 1390 ； Bresslauer 等人， 1986， Proc.Natl.Acad.Sci USA 83 ： 8893-8897 ； Freier 等 人， 1986， Proc.Natl.Acad.SciUSA 83 ： 9373-9377 ； Kierzek 等人， Biochemistry 25 ： 7840-7846 ； Rychlik 等人， 1990， Nucleic Acids Res 18 ： 6409-6412( 勘 误， 1991， Nucleic Acids Res19 ： 698) ； Sambrook 等 人， 如 上)； Suggs 等人， 1981， 在 Developmental BiologyUsing Purified Genes( 使用纯化基因 的发育生物学 )(Brown 等人， 编辑 )， 683-693 页中， Academic Press ； 以及 Wetmur， 1991， Crit Rev Biochem MolBiol 26 ： 227-259。所有出版物均通过引用并入本文 )。在一些实 施方案中， 多核苷酸编码本文所公开的多肽并且在限定的条件下与编码本公开内容的工程 化单胺氧化酶的序列的互补序列杂交， 所述限定的条件如中度严格或高度严格的条件。
     “杂交严格性” 指核酸的这种洗涤条件。一般地， 杂交反应在较低严格性的条件 下进行， 随后进行不同的但是较高严格性的洗涤。术语 “中度严格杂交” 是指容许靶 DNA 结合与靶 DNA 具有约 60％同一性， 优选约 75％同一性、 约 85％同一性 ； 与靶多核苷酸具有 大于约 90％同一性的互补核酸的条件。示例性的中度严格条件是等同于下列的条件 ： 在 42 ℃下在 50 ％甲酰胺、 5×Denhart ′ s 溶液、 5×SSPE、 0.2 ％ SDS 中杂交， 随后 42 ℃下在 0.2×SSPE、 0.2％ SDS 中洗涤。 “高度严格性杂交” 一般是指比在限定多核苷酸序列的溶液条件下确定的热熔解温度 Tm 低约 10℃或更少的条件。在一些实施方案中， 高度严格性条 件是指仅容许在 65℃下 0.018M NaCl 中形成稳定的杂交物的那些核酸序列杂交的条件。 ( 即， 如本文所预期的， 如果杂交物在 65℃下 0.018M NaCl 中不稳定， 则其在高度严格性条 件下将是不稳定的 )。高度严格性条件通过下列提供 ： 例如在等同于 42℃下在 50％甲酰 胺、 5×Denhart′ s 溶液、 5×SSPE、 0.2％ SDS 中的条件中杂交， 随后 65℃下在 0.1×SSPE 和 0.1％ SDS 中洗涤。其他高度严紧格杂交条件以及中度严格条件在上文所引用的参考文献 中描述。
     “异源的” 多核苷酸是指通过实验室技术被引入宿主细胞的多核苷酸， 并且包括从 宿主细胞中移除， 经受实验室操作， 然后被再次引入宿主细胞的多核苷酸。
     “密码子优化的” 是指将编码蛋白的多核苷酸密码子改变为在具体生物体中优先 使用以便使所编码的蛋白在感兴趣的生物体中有效地表达的那些密码子。 尽管由于大部分 氨基酸由几种密码子 ( 称为 “同义物” 或 “同义” 密码子 ) 代表而使遗传密码是简并的， 但 熟知的是特定生物体的密码子使用是非随机的并且偏爱特定的密码子三联体。 这种密码子 使用偏倚关于给定基因、 共同功能或祖先起源 (ancestra origin) 的基因、 相对于低拷贝数 蛋白的高表达蛋白和生物体基因组的聚集蛋白编码区可能是更高的。在一些实施方案中， 可以将编码单胺氧化酶的多核苷酸密码子优化以用于从被选择用于表达的宿主生物体中 最佳地制备。 “优选的、 最佳的、 高密码子使用偏倚密码子” 可互换地是指如下的密码子 ： 其与 编码相同氨基酸的密码子相比在蛋白编码区以更高的频率使用。优选的密码子可以就下 列方面而确定 ： 在单个基因中的密码子使用、 一组共同功能或起源的基因的密码子使用、 高表达的基因的密码子使用、 在整个生物体中聚集的蛋白编码区的密码子频率、 相关生物 体的聚集的蛋白编码区的密码子频率或它们的组合。频率随基因表达水平增加的密码子 通常是用于表达的最佳密码子。已知用于确定密码子频率 ( 例如， 密码子使用、 相对的同 义密码子使用 ) 和特定生物体中密码子偏好的多种方法， 包括多变量分析， 例如使用聚 类分析或相应分析和用于基因的有效密码子数 ( 参见 GCG CodonPreference， Genetics Computer Group WisconsinPackage ； CodonW， John Peden， University of Nottingham ； McInerney， J.O， 1998， Bioinformatics 14 ： 372-73 ； Stenico 等 人， 1994， Nucleic Acids Res.222437-46 ； Wright， F.， 1990， Gene 87 ： 23-29)。越来越多的生物体的密码子使用表 是可用的 ( 参见， 例如 Wada 等人， 1992， Nucleic Acids Res.20 ： 2111-2118 ； Nakamura 等 人， 2000， Nucl.Acids Res.28 ： 292 ； Duret， 等人， 如上 ； Henaut 和 Danchin， “Escherichia coli and Salmonella( 大肠杆菌和沙门氏菌 )， ” 1996， Neidhardt， 等人编辑， ASM Press， Washington D.C.， 第 2047-2066 页。获得密码子使用的数据来源可以依赖于能够编码蛋 白的任何可用的核苷酸序列。这些数据集包括实际上已知的编码表达的蛋白的核酸序列 ( 例如， 完整蛋白编码序列 -CDS)、 表达序列标签 (ESTS) 或基因组序列的预测编码区 ( 参 见， 例如， Mount， D.， Bioinformatics ： Sequence andGenome Analysis( 生物信息学 ： 序列 Cold Spring Harbor， 和基因组分析 )， 第 8 章， Cold SpringHarbor Laboratory Press， N.Y.， 2001 ； Uberbacher， E.C.， 1996， Methods Enzymol.266 ： 259-281 ； Tiwari 等人， 1997， Comput.Appl.Bioscl.13 ： 263-270)。
    
    “控制序列” 在本文中定义为包括对于表达本公开内容的多肽是必需的或有利的所有组分。每种控制序列对于编码多肽的核酸序列来说可以是固有的或外来的。这种控制 序列包括但不限于 ： 前导序列、 多聚腺苷酸化序列、 前肽序列、 启动子、 信号肽序列和转录终 止子。最低程度上， 控制序列包含启动子、 转录和翻译终止信号。控制序列可以为了引入促 进控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区连接的特定限制位点的目的而具有连接序列。
     “可操作地连接” 在本文中被定义为一种构造， 其中控制序列被适当地放置在相对 于 DNA 序列的编码序列的位置处以便使控制序列指导多核苷酸和 / 或多肽的表达。
     “启动子序列” 是宿主细胞所识别的用于表达编码区的核酸序列。控制序列可以包 含适当的启动子序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在选 择的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列， 包括突变的、 截短的和杂合的启动子， 并且 可以从编码对宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
     “-(C1-C10) 烷基” 意指具有 1 至 10 个碳原子的直链或支链的非环状烃。代表性 直链 -(C1-C10) 烷基包括 ： - 甲基、 - 乙基、 - 正丙基、 - 正丁基、 - 正戊基、 - 正己基、 - 正庚 基、 - 正辛基、 - 正壬基和 - 正癸基。 支链烷基意指诸如 - 甲基、 - 乙基或 - 丙基的一个或多个 直链 -(C1-C8) 烷基取代了直链烷基的 -CH2- 基团中的一个或两个氢。支链非环状烃意指诸 如 - 甲基、 - 乙基或 - 丙基的一个或多个直链 -(C1-C10) 烷基取代了直链非环状烃的 -CH2- 基 团中的一个或两个氢。 代表性的支链 -(C1-C10) 烷基包括异丙基、 仲丁基、 异丁基、 叔丁基、 异 戊基、 新戊基、 1- 甲基丁基、 2- 甲基丁基、 3- 甲基丁基、 1， 1- 二甲基丙基、 1， 2- 二甲基丙基、 1- 甲基戊基、 2- 甲基戊基、 3- 甲基戊基、 4- 甲基戊基、 1- 乙基丁基、 2- 乙基丁基、 3- 乙基丁 基、 1， 1- 二甲基丁基、 1， 2- 二甲基丁基、 1， 3- 二甲基丁基、 2， 2- 二甲基丁基、 2， 3- 二甲基丁 基、 3， 3- 二甲基丁基、 1- 甲基己基、 2- 甲基己基、 3- 甲基己基、 4- 甲基己基、 5- 甲基己基、 1， 2- 二甲基戊基、 1， 3- 二甲基戊基、 1， 2- 二甲基己基、 1， 3- 二甲基己基、 3， 3- 二甲基己基、 1， 2- 二甲基庚基、 1， 3- 二甲基庚基、 和 3， 3- 二甲基庚基。
     “-(C1-C6) 烷基” 意指具有 1 至 6 个碳原子的直链或支链非环状烃。代表性的直 链 -(C1-C6) 烷基包括 ： - 甲基、 - 乙基、 - 正丙基、 - 正丁基、 - 正戊基和 - 正己基。代表性的 支链 (C1-C6) 烷基包括异丙基、 - 仲丁基、 - 异丁基、 - 叔丁基、 - 异戊基、 - 新戊基、 1- 甲基丁 基、 2- 甲基丁基、 3- 甲基丁基、 1， 1- 二甲基丙基、 1， 2- 二甲基丙基、 1- 甲基戊基、 2- 甲基戊 基、 3- 甲基戊基、 4- 甲基戊基、 1- 乙基丁基、 2- 乙基丁基、 3- 乙基丁基、 1， 1- 二甲基丁基、 1， 2- 二甲基丁基、 1， 3- 二甲基丁基、 2， 2- 二甲基丁基、 2， 3- 二甲基丁基和 3， 3- 二甲基丁基。
     “-(C1-C4) 烷基” 意指具有 1 至 4 个碳原子的直链或支链非环状烃。代表性的直 链 -(C1-C4) 烷基包括 ： - 甲基、 - 乙基、 - 正丙基和 - 正丁基。代表性的支链 -(C1-C4) 烷基 包括 - 异丙基、 - 仲丁基、 - 异丁基和 - 叔丁基。
     “-(C1-C3) 烷基” 意指具有 1 至 3 个碳原子的直链或支链非环状烃。代表性的直链 (C1-C3) 烷基包括 - 甲基、 - 乙基和 - 正丙基。代表性的支链 -(C1-C3) 烷基包括 - 异丙基。
     “-(C1-C2) 烷 基”意 指 具 有 1 个 或 2 个 碳 原 子 的 直 链 非 环 状 烃。 代 表 性 的 直 链 -(C1-C2) 烷基包括 - 甲基和 - 乙基。
     “-(C2-C10) 烯基” 意指具有 2 至 10 个碳原子并且包含至少一个碳 - 碳双键的直链或 支链的非环状烃。 支链烯基意指诸如 - 甲基、 - 乙基或 - 丙基的一个或多个直链 -(C1-C8) 烷 基取代了直链烯基的 -CH2- 或 -CH ＝基团中的一个或两个氢。 代表性的直链和支链 (C2-C10) 烯基包括 ： - 乙烯基、 - 丙烯基、 1- 丁烯基、 -2- 丁烯基、 - 异丁烯基、 -1- 戊烯基、 -2- 戊烯基、 -3- 甲基 -1- 丁烯基、 2- 甲基 -2- 丁烯基、 -2， 3- 二甲基 -2- 丁烯基、 -1- 己烯基、 -2- 己 烯基、 -3- 己烯基、 -1- 庚烯基、 -2- 庚烯基、 -3- 庚烯基、 -1- 辛烯基、 -2- 辛烯基、 -3- 辛烯 基、 -1- 壬烯基、 -2- 壬烯基、 -3- 壬烯基、 -1- 癸烯基、 -2- 癸烯基、 -3- 癸烯基以及类似基 团。
     “-(C2-C6) 烯基” 意指具有 2 至 6 个碳原子并且包含至少一个碳 - 碳双键的直链或 支链的非环状烃。代表性的直链和支链 -(C2-C6) 烯基包括 ： - 乙烯基、 - 丙烯基、 -1- 丁烯 基、 -2- 丁烯基、 - 异丁烯基、 -1- 戊烯基、 -2- 戊烯基、 -3- 甲基 -1- 丁烯基、 -2- 甲基 -2- 丁 烯基、 -2， 3- 二甲基 -2- 丁烯基、 -1- 己烯基、 -2- 己烯基、 -3- 己烯基以及类似基团。
     “-(C2-C10) 炔基” 意指具有 2 至 10 个碳原子并且包含至少一个碳 - 碳三键的直链 或支链的非环状烃。支链炔基意指诸如 - 甲基、 - 乙基或 - 丙基的一个或多个直链 -(C1-C8) 烷基取代了直链炔基的 -CH2- 基团中的一个或两个氢。 代表性的直链和支链 -(C2-C10) 炔基 包括 - 乙炔基、 - 丙炔基、 -1- 丁炔基、 -2- 丁炔基、 -1- 戊炔基、 -2- 戊炔基、 -3- 甲基 -1- 丁 炔基、 -4- 戊炔基、 -1- 己炔基、 -2- 己炔基、 -5- 己炔基、 -1- 庚炔基、 -2- 庚炔基、 -6- 庚炔 基、 -1- 辛炔基、 -2- 辛炔基、 -7- 辛炔基、 -1- 壬炔基、 -2- 壬炔基、 -8- 壬炔基、 -1- 癸炔 基、 -2- 癸炔基、 -9- 癸炔基以及类似基团。
     “-(C2-C6) 炔基” 意指具有 2 至 6 个碳原子并且包含至少一个碳 - 碳三键的直链 或支链的非环状烃。代表性的直链和支链 (C2-C6) 炔基包括 ： - 乙炔基、 - 丙炔基、 -1- 丁炔 基、 -2- 丁炔基、 -1- 戊炔基、 -2- 戊炔基、 -3- 甲基 -1- 丁炔基、 -4- 戊炔基、 -1- 己炔基、 -2- 己 炔基、 -5- 己炔基以及类似基团。
     “-(C1-C6) 烷氧基” 意指具有 1 个或更多个醚基团和 1 至 6 个碳原子的直链或支 链非环状烃。代表性的直链和支链 (C1-C6) 烷氧基包括 - 甲氧基、 - 乙氧基、 - 甲氧基甲 基、 -2- 甲氧基乙基、 -5- 甲氧基戊基、 -3- 乙氧基丁基以及类似基团。
     “-(C3-C12) 环烷基” 意指具有 3 至 12 个碳原子的饱和的单环烃。代表性的 (C3-C12) 环烷基是 ： - 环丙基、 - 环丁基、 - 环戊基、 - 环己基、 - 环庚基、 - 环辛基、 - 环壬基、 - 环癸基 和 - 环十二烷基。
     “-(C4-C8) 环烷基” 或 “4 至 8 元环烷基环” 意指具有 4 至 8 个碳原子的饱和的单环 烃。代表性的 -(C4-C8) 环烷基是 - 环丁基、 - 环戊基、 - 环己基、 - 环庚基和 - 环辛基。
     “-(C3-C8) 环烷基” 意指具有 3 至 8 个碳原子的饱和的单环烃。代表性的 -(C3-C8) 环烷基包括 - 环丙基、 - 环丁基、 - 环戊基、 - 环己基、 - 环庚基和 - 环辛基。
     “-(C3-C7) 环烷基” 意指具有 3 至 7 个碳原子的饱和的单环烃。代表性的 (C3-C7) 环烷基包括 - 环丙基、 - 环丁基、 - 环戊基、 - 环己基和 - 环庚基。
     “(6 至 10 元 ) 杂二环” 或 “(6 至 10 元 ) 二环杂环”意指饱和的、 不饱和的非芳 族的或芳族的 6 至 10 元二环、 杂环。-(6- 至 10 元 ) 杂二环含有独立地选自下列的 1 至 4 个杂原子 ： 可以被季铵化的氮 ； 氧； 和硫， 包括亚砜和砜。-(6 至 10 元 ) 杂二环可以经由 氮和碳原子连接。代表性的 -(6 至 10 元 ) 杂二环包括 ： -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷、 -喹 啉基 (quinolinyl)、 - 异喹啉基 (isoquinolinyl)、 - 色酮基、 - 香豆素基、 - 吲哚基、 -吲 嗪 基、 苯 并 [b] 呋 喃 基、 苯 并 [b] 噻 吩 基、 - 吲 唑 基、 - 嘌 呤 基、 -4H- 喹 嗪 基、 异喹啉基 (isoquinolyl)、 - 喹啉基 (quinolyl)、 - 酞嗪基、 - 萘啶基、 - 咔唑基、 -β- 咔啉基、 - 二氢 吲哚基、 - 异二氢吲哚基、 -1， 2， 3， 4- 四氢喹啉基、 -1， 2， 3， 4- 四氢异喹啉基、 吡咯并吡咯基以及类似基团。
     “-CH2( 卤 )” 意指其中甲基的一个氢被卤素取代的甲基。代表性 -CH2( 卤 ) 基团 包括 -CH2F、 -CH2Cl、 -CH2Br 和 -CH2I。
     “-CH2( 卤 )2” 意指其中甲基的两个氢被卤素取代的甲基。代表性的 -CH( 卤 )2 基 团包括 -CHF2、 -CHCl2、 -CHBr2、 -CHBrCl、 -CHClI 和 -CHI2。
     “-C( 卤 )3” 意指其中甲基的每个氢都被卤素取代的甲基。代表性的 -C( 卤 )3 基 团包括 -CF3、 -CCl3、 -CBr3 和 -CI3。
     “- 卤素” 或 “- 卤” 意指 -F、 -Cl、 -Br 或 -I。
     本文所用的 “氧代” 、 “＝ O” 以及类似术语意指与碳或另一元素双键键合的氧原子。
     当第一基团被 “一个或多个第二基团取代” 时， 第一基团的一个或多个氢原子被相 应数目的第二基团取代。当第二基团的数目为两个或更多时， 各第二基团可以是相同的或 不同的。
     在一个实施方案中， 第一基团被最多三个第二基团取代。
     在另一实施方案中， 第一基团被一个或两个第二基团取代。
     在另一实施方案中， 第一基团仅被一个第二基团取代。
     如本文所用术语 “立体异构体” 、 “立体异构形式” 以及类似术语是用于单个分子的 所有异构体的一般术语， 它们仅在它们的原子在空间中的方向上不同。它包括对映体和具 有彼此不为镜像的多于一个的手性中心的化合物的异构体 (“非对映体” )。
     术语 “手性中心” 是指四个不同的基团所连接的碳原子。
     术语 “对映体” 或 “对映体的” 是指在其镜像上不可重叠并且因此是光学活性的 分子， 其中对映体使偏振光平面以一个方向旋转并且其镜像使偏振光平面以相反的方向旋 转。
     术语 “外消旋的” 是指光学上无活性的对映体的等份混合物。
     术语 “拆分” 是指分子的两种对映体形式之一的分离或浓缩或排除。
     如本文所用的 “基本上对映体纯” 意指化合物的指定对映体以比相同化合物的另 一对映体更高的程度或度存在。 因此， 在具体实施方案中， 基本上对映体纯的化合物以比相 同化合物的另一对映体 80％、 85％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％对映体过量存在。
     如本文所用的 “基本上立体异构纯” 意指化合物的指定对映体或非对映体以比相 同化合物的另一对映体或非对映体更高的程度或度存在。 如上文关于 “立体选择性” 所提到 的， 对映体过量和非对映体过量是立体异构体过量的类型。因此， 在具体实施方案中， 基本 上立体异构纯的化合物以比相同化合物的另一对映体或非对映体 80％、 85％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％立体异构体过量存在。
     5.4 制备本公开内容的杂二环化合物的方法
     本公开内容的杂二环化合物是使用下面所公开的生物催化方法， 利用本文所公开 的单胺氧化酶作为生物催化剂来装配的。
     方案 1
    方案 1 描绘由本公开内容的单胺氧化酶催化的反应， 通过该反应仲胺即根据结构 式 I 的杂二环化合物被氧化为相应的结构式 II(a) 的亚胺化合物。
     方案 2
    
    方案 2 描绘三个基础反应， 这三个基础反应在一起提供方案 1 中所描绘的总体净 反应。在方案 2 的第一个反应中， 通过本公开内容的单胺氧化酶 ( 其与黄素腺嘌呤核苷酸 辅因子 (FAD) 形成复合体 ) 将仲胺即根据结构式 I 的杂二环化合物立体选择性地氧化为 相应的结构式 II(a) 亚胺化合物以提供相应的基本上对映体纯的结构式 II 的亚胺和还原 的单胺氧化酶 FAD 复合体 ( 酶 -FAD-H2)。在第二步中， 通过分子氧将还原的单胺氧化酶 ( 酶 -FAD-H2 复合体 ) 重新氧化， 产生作为副产物的过氧化氢 (H2O2)。在第三个反应 ( 其不 通过单胺氧化酶催化 ) 中， 过氧化氢 (H2O2) 分解为水和氧。
     底物结构式 I 的仲胺是可商购获得的或者使用本领域中已知的方法和试剂或 者根据本公开内容容易地由本领域中已知的方法和试剂修改的方法和试剂容易地合成 的 ( 参见， 例如 Delalu 等人 (1999)J.HeterocyclicChem.36， 681 ； WO 2007/022459 ； 和 WO 2007/075790 ； 以及其中所引用的参考文献 )。
     过氧化氢是能够不可逆地灭活单胺氧化酶的强氧化剂。 因此， 在某些实施方案中， 可使用组分来促进上述方案 2 的步骤 3 中所描绘的歧化反应， 在该反应中， 过氧化氢 (H2O2) 被分解为分子氧和水。在某些实施方案中， 该组分选自化学剂， 例如但不限于 Pd、 Fe 以及类 似物， 而在其他实施方案中， 该组分是酶， 例如酶过氧化氢酶。 在具体的实施方案中， 反应混 合物还包含催化方案 2 的步骤 3 的歧化反应的过氧化氢酶， 在该反应中两分子的过氧化氢 被分解， 提供两分子的水和一个分子氧。 在具体的实施方案中， 过氧化氢酶是黑曲霉过氧化 氢酶， 它以约 0.01％至约 1％ (w/v)、 约 0.05％至约 0.5％ (w/v) 或约 0.1％至约 0.2％ (w/ v) 的浓度包括在反应中。
    在其中结构式 I 的化合物是挥发性液体的情况下， 为了利于处理， 可以将其作为 盐提供。在此实施方案的一个方面， 通过将 1 当量的乙酸添加到游离碱溶解于如庚烷中的 10％溶液中而将胺底物转化为乙酸盐。收集沉淀的盐， 用溶剂 ( 例如， 从其中沉淀盐的溶 剂， 如庚烷 ) 洗涤并在减压下在室温下 ( 约 21℃ ) 干燥。
     如在方案 1 中所指出的， 最终的氧化剂是分子氧。鉴于氧在水中的溶解度有限并
     且根据该溶解度随温度和含盐量 ( 溶质浓度 ) 增加而降低， 必须通过气液传质由气相补充 用于反应的溶液中的分子氧。通常， 为实际反应速率而提供的优选的单胺氧化酶的活性和 量足以使反应受气液传质的速率限制。如所熟知的， 气液传质的速率依赖于气体在液体 中的分压、 气体在液体中的溶解度和气液界面面积。因此， 可以通过提供强烈的气液混合 的工程化环境来增加受气液传质速率限制的反应的速率， 包括通过喷雾、 空心轴叶轮抽吸 (hollow shaft impeller aspiration)、 逆流气液循环、 垂直的蛇形管流以及类似方法。 此 外， 在任何工程化环境中， 可以通过增加氧分压来增加受氧气气液传质速率限制的反应的 速率， 所述增加氧分压通过增加总气压进行或者增加气体中的氧分数 ( 例如用纯化的氧富 集或代替空气 ) 进行或者通过两者进行。在具体的实施方案中， 连续监测溶氧浓度和 / 或 从气相耗氧的速率， 并调节进氧速率、 分压、 混合效率或它们的组合以提供有益的反应速率 或直到完成的总体反应时间。
     在某些实施方案中， 反应混合物还可以包含至少一种消泡剂。在具体的实施方案 中， 消泡剂是可商购获得的材料， 例如但不限于于 Antifoam-204 或 Antifoam Y-30(Sigma， St.Louis MO) 或类似物。 在其他实施方案中， 反应可以包含多于一种消泡剂。 消泡剂可以约 0.01％至约 1％ ( 若是固体为 w/v， 或者若是液体为 v/v)、 约 0.05％至约 0.5％、 或约 0.1％ 至约 0.2％的浓度包含在反应中。 在某些实施方案中， 可以从反应混合物分离氧化的结构式 II 的亚胺化合物， 将其 纯化并表征。在下文所述的其他实施方案中， 可以将结构式 II 的亚胺化合物转化为另一加 成物或中间体并且用于后续步骤而不分离或纯化。
     方案 3
    
    在某些实施方案中， 本公开内容的单胺氧化酶可能受到产物结构式 II 的亚胺的 抑制。因此， 在具体的实施方案中， 其中结构式 I 的化合物被氧化为结构式 II 的化合物的 反应还包含将与结构式 II 的亚胺化合物反应形成加成物的试剂， 所述加成物具有降低的 或消除的抑制本公开内容的单胺氧化酶的能力， 如方案 3 中所描绘的。在此实施方案的一 个方面， 在反应开始添加该试剂或间断地或连续地添加该试剂， 添加的量高至足以防止抑 制量的结构式 II 的亚胺化合物积累但又低至足以避免酶抑制量的该试剂的积累。在一个 实施方案中， 该试剂为亚硫酸氢钠， 其可以作为偏亚硫酸氢钠方便地提供， 偏亚硫酸氢钠在 水中水解为亚硫酸氢钠。亚硫酸氢盐与结构式 II 的亚胺化合物反应提供了结构式 III 的 亚硫酸盐加成物。在某些实施方案中， 将亚硫酸氢钠以使得这种试剂被 “瞬时” 消耗的速率 连续地添加至反应中， 并且可能的结构式 II 的抑制性亚胺产物被 “诱捕” 为较低抑制性或 无抑制性的结构式 III 的亚硫酸盐加成化合物。
     无论单胺氧化酶被亚胺产物抑制与否， 添加亚硫酸氢盐以使亚胺产物反应还提供 实际方法的工程化选择。 本发明的某些亚胺是高挥发性的， 并且在它们之中， 一些是恶臭的
     和 / 或有毒的。它们作为游离碱的限制需要封闭的反应、 没有气体流、 或化学诱捕的有效 凝聚 ( 例如通过亚硫酸氢盐溶液 )。生成它们的亚硫酸氢盐加成物 ( 氨基磺酸盐 ) 的原位 反应消除了这些工程化限制， 同时还提供了在同一反应容器中用氰化物进行后续反应的选 择。
     结构式 III 的亚硫酸氢盐加成化合物的形成在增加的 pH 下可以被逆转， 由此再产 生相应的结构式 II 的亚胺。因此， 在某些实施方案中， 通过添加碱如 10N NaOH 将 pH 升至 约 13 再产生结构式 II 的亚胺来猝灭方案 3 的反应， 所述结构式 II 的亚胺可以用例如甲基 叔丁醚 (“MBTE” ) 萃取， 并且在某些实施方案中通过蒸馏来分离， 得到为无色油的结构式 II 的亚胺。
     在某些实施方案中， 部分监测和控制添加结构式 I 的底物、 螯合剂 ( 例如， 亚硫酸 氢钠 ) 和 pH 控制剂 ( 例如， NaOH) 的速率以最小化或消除单胺氧化酶的底物抑制和产物抑 制， 该单胺氧化酶用作将结构式 I 的化合物转化为结构式 II 的化合物的生物催化剂。
     方案 4
    在另一实施方案中， 将 NaCN 添加至方案 3 的反应物中， 并容许 pH 升至约 pH 10， 由此将结构式 III 的亚硫酸盐加成物立体选择性地转化为结构式 IV(a) 的反式氨基腈化合 物， 如方案 4 中所描绘的。在此实施方案的方面中， 将约 1 至约 3 当量、 约 1 至约 2 当量、 约 1.05 至约 1.5 当量或约 1.1 至约 1.2 当量的 NaCN( 相对于结构式 II 的亚胺化合物 ) 添加 到反应中以将结构式 III 的亚硫酸盐加成物转化为结构式 IV(a) 的反式氨基腈化合物。此 外， 式 III 的化合物的反应产生结构式 IV(b) 的顺式氨基腈化合物。
     可以使用下列物质从反应混合物 ( 有机溶剂 ： 含水反应混合物为 1 ∶ 1) 中萃取结 构式 IV(a) 的反式氨基腈化合物 ： 例如， 2- 甲基四氢呋喃、 MTBE 或乙酸异丙酯。可以从有机 溶剂萃取物例如有机萃取物中回收反式氨基腈化合物， 任选的中间体的进一步澄清物可在 减压下浓缩， 得到结构式 IV 的氨基腈化合物。
     方案 5
    
    在某些实施方案中， 使结构式 II 的亚胺化合物反应形成方案 5 中所描绘的二聚体 结构 ( 参见， 例如， Int.J.Chem.Kinet.1998， 30(2)， 129-136)， 从而最小化或消除本公开内
     容的单胺氧化酶的产物抑制。无论单胺氧化酶被亚胺产物抑制与否， 二聚化都还可以提供 实际方法的工程化选择。二聚体的挥发性若存在的话也远远低于相应的亚胺， 大大减轻了 对工程化限制挥发性亚胺的需要。 此外， 二聚体通常可以通过过滤、 萃取或蒸气蒸馏而从反 应混合物容易地回收， 并且通常可以直接用于方法的后续步骤中。 可选择地， 通常可以将二 聚体溶解在酸性溶液中以提供单体亚胺盐溶液， 该单体亚胺盐溶液适合用于后续步骤来产 生期望的二环脯氨酸类似物和衍生物。
     方案 6
    已知在一些条件下， 吡咯烷单体化合物 ( 例如， 3， 4- 二氢 -2H- 吡咯 ) 的亚胺形成 二聚体， 然后形成热力学有利的三聚体结构。因此， 某些结构式 II(a) 的化合物不仅可以形 成二聚体， 而且随后继续完全形成三聚体 ( 例如， 式 II(c) 的化合物 ) ； 或者形成三聚体与 单体和二聚体化合物的某种混合物。
    形成这种三聚体的有利性可能依赖于取代基。然而， 预期结构式 II(c) 的这种三 聚体化合物在用于本公开内容的反应中时与二聚体相比表现出极小的反应性差异。因此， 不受机制的束缚， 预计进行结构式 II(c) 的三聚体形成的任何结构式 II(a) 的化合物将表 现出与二聚体形式等价的反应性。
    在萃取到溶剂如 MTBE 或甲苯中之后， 可以使根据方案 5 形成的二聚体与 NaCN 和 酸 ( 例如， 柠檬酸、 乙酸或盐酸 ) 接触或与 HCN 接触 ( 在 0℃ )， 得到结构式 IV(a) 的反式氨 基腈化合物和式 IV(b) 的顺式氨基腈化合物。
     方案 7
    
    可以使根据例如方案 4 或方案 6 制备的结构式 IV(a) 的反式氨基腈化合物与含水 酸 ( 例如， HCl 或 H2SO4) 接触， 以提供结构式 VI 的氨基酸。其中部分 R5 是叔丁基的结构式 V 的相应叔丁酯是通过使结构式 VI 的胺化合物与酸 ( 例如甲烷磺酸 ) 和异丁烯或叔丁酯 ( 例如， 乙酸叔丁酯 ) 接触制备的， 如方案 7 中所描绘。
     方案 8
    
    在另一实施方案中， 可以使根据例如方案 4 或方案 6 制备的结构式 IV(a) 的反式 氨基腈化合物在 Pinner 反应中与 HCl 和甲醇接触， 得到其中部分 R5 是 -CH3 的结构式 V 的 甲酯， 如方案 8 中所显示的。
     方案 9
    
    方案 9 描绘由结构式 I 的仲胺制备根据结构式 V 和 VI 的化合物的总过程， 其中结 构式 II 的亚胺产物在其转化为结构式 IV 的氨基腈的过程中作为结构式 III 的亚硫酸盐加 成物保持在水溶液中。
     方案 10
    
    方案 10 描绘由结构式 I 的仲胺制备根据结构式 V 和 VI 的化合物的总过程， 其中 结构式 II 的亚胺产物在其转化为结构式 IV 的氨基腈的过程中被二聚化为结构式 II(b) 的 化合物。
     方案 11
    
    方案 11 描绘由结构式 I 的仲胺制备根据结构式 VI 和结构式 V( 其中部分 R5 是叔 丁基 ) 的化合物的总过程， 该过程结合了方案 4 和 7 的反应。
     方案 12
    
    方案 12 描绘由结构式 I 的仲胺制备根据结构式 V( 其中部分 R5 是 -CH3) 的化合物的总过程， 该过程结合了方案 4 和 8 的反应。
     方案 13
    方案 13 描绘由结构式 I 的仲胺制备根据结构式 V( 其中部分 R5 是叔丁基 ) 的化 合物的总过程， 该过程结合了方案 6 和 7 的反应。
     方案 14
    
    方案 14 描绘由结构式 I 的仲胺制备根据结构式 V( 其中部分 R5 是 -CH3) 的化合物 的总过程， 该过程结合了方案 6 和 8 的反应。
     方案 15
    
    方案 15 描绘了由结构式 I 的仲胺制备根据结构式 VIII 的化合物的总过程， 该过 程包括了方案 4 的反应。
     方案 16
    
    方案 16 描绘了由结构式 I 的仲胺制备根据结构式 VII 的化合物的总过程， 该过程 包括了方案 6 的反应。
     在另一实施方案中， 涉及结构式 IV(a) 的反式氨基腈化合物的方案 7-16 的任何过 程可以用结构式 IV(b) 的顺式氨基腈化合物进行。当对应于方案 7-16 的反应使用结构式 IV(b) 的顺式氨基腈化合物进行时， 形成所得的结构式 V(b)、 VI(b) 和 VII(b) 的顺式氨基 酸和酰胺。
    
    不受机制的束缚， 认识到在形成方案 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15 和 16 的结构式 V、 VI、 VII 的化合物的反应期间形成了酰亚胺酯 (imidate) 中间体。 因此， 在另一实施方案中， 6 本公开内容提供结构式 VIII 的酰亚胺酯化合物， 其中 R 是 H 或烷基。
    因此， 在上述方法的一些实施方案中， 结构式 VIII 的酰亚胺酯化合物可用于制备 结构式 V、 VI 和 VII 的化合物。
    
    5.5 单胺氧化酶
     本公开内容提供了能够将底物结构式 I 的化合物立体选择性地氧化或转化为结 构式 II 的化合物的工程化单胺氧化酶。在具体的实施方案中， 本公开内容提供能够将底物 化合物 (1) 立体选择性地氧化或转化为化合物 (2) 的工程化单胺氧化酶。在其他实施方案 中， 本公开内容提供能够将底物化合物 (3) 立体选择性地氧化或转化为化合物 (4) 的工程 化单胺氧化酶。在两种情况下， 本公开内容的单胺氧化酶在与天然存在的野生型黑曲霉单 胺氧化酶 (SEQ ID NO ： 2) 或米曲霉单胺氧化酶 (SEQ ID NO ： 32) 或它们的杂交物 (SEQ ID NO ： 6) 相比时， 或与其他工程化单胺氧化酶 ( 例如， SEQ ID NO ： 8 的单胺氧化酶 ) 相比时， 还表现出改良的特性。期望改良的酶特性包括但不限于 ： 酶活性、 热稳定性、 pH 活性谱、 辅 因子需求、 对抑制剂 ( 例如产物抑制 ) 的不应性、 立体特异性、 立体选择性、 溶剂稳定性、 溶 解性和在宿主细胞中的稳定性和表达水平。 改良可以涉及单一的酶特性如酶活性或不同酶特性例如酶活性和立体选择性的组合。
     编码天然存在的黑曲霉和米曲霉的单胺氧化酶的多核苷酸序列以及由此相应氨 基酸序列对于黑曲霉可从 Genbank 登录号 L38858 获得并且对于米曲霉可从 Genbank 登录 号 XM_001822832 获得。
     在一些实施方案中， 本文所公开的单胺氧化酶可以具有对参考序列 ( 例如， 天然 存在的多肽或工程化多肽 ) 的大量修饰以产生改良的单胺氧化酶特性。在这种实施方案 中， 对氨基酸序列的修饰数可以包括一个或多个氨基酸、 2 个或更多个氨基酸、 3 个或更多 个氨基酸、 4 个或更多个氨基酸、 5 个或更多个氨基酸、 6 个或更多个氨基酸、 8 个或更多个氨 基酸、 10 个或更多个氨基酸、 15 个或更多个氨基酸、 或 20 个或更多个氨基酸、 多达参考酶序 列氨基酸总数的 10％、 多达参考酶序列氨基酸总数的 20％、 或多达参考酶序列氨基酸总数 的 30％。在一些实施方案中， 产生改良的单胺氧化酶特性的对天然存在的多肽或工程化多 肽的修饰数可以包括约 1-2、 1-3、 1-4、 1-5、 1-6、 1-7、 1-8、 1-9、 1-10、 1-15、 1-20、 1-21、 1-22、 1-23、 1-24、 1-25、 或约 1-30 个对参考序列的修饰。修饰可以包括插入、 缺失、 取代、 或它们 的组合。
     在一些实施方案中， 修饰包括对参考序列的氨基酸取代。可以产生改良的单胺氧 化酶特性的取代可以位于一个或多个氨基酸、 2 个或更多个氨基酸、 3 个或更多个氨基酸、 4 个或更多个氨基酸、 5 个或更多个氨基酸、 6 个或更多个氨基酸、 8 个或更多个氨基酸、 10 个或更多个氨基酸、 或 20 个或更多个氨基酸、 多达参考酶序列氨基酸总数的 10％、 多达参 考酶序列氨基酸总数的 20％、 或多达参考酶序列氨基酸总数的 30％。在一些实施方案中， 产生改良的单胺氧化酶特性的对天然存在的多肽或工程化多肽的取代数可以包括约 1-2、 1-3、 1-4、 1-5、 1-6、 1-7、 1-8、 1-9、 1-10、 1-15、 1-20、 1-21、 1-22、 1-23、 1-24、 1-25、 或 约 1-30 个对参考序列的氨基酸取代。
     在一些实施方案中， 与野生型或另一工程化多肽相比， 单胺氧化酶的改良特性是 关于其立体选择性增加， 即， 在本文中， 用于将结构式 I 的化合物氧化为结构式 II 的化合 物， 或在具体实施方案中将化合物 (1) 氧化或转化为化合物 (2) 或将化合物 (3) 氧化为化 合物 (4) 的产物的立体异构体过量的增加。在一些实施方案中， 单胺氧化酶的改良特性是 关于其将更高百分比的底物转化或还原为产物的能力增加。在一些实施方案中， 单胺氧化 酶的改良特性是关于其将底物转化为产物的速率增加。 这种酶活性的改良可以通过使用与 野生型或其他参考序列相比较少的改良单胺氧化酶来氧化或转化相同量的产物的能力来 证明。在一些实施方案中， 单胺氧化酶的改良特性是关于其稳定性或热稳定性。在一些实 施方案中， 单胺氧化酶具有多于一种的改良特性。
     在一些实施方案中， 本公开内容的单胺氧化酶能够将底物 (1R， 5S)-6， 6- 二甲 基 -3- 氮 杂 二 环 [3.1.0] 己 烷， 化 合 物 (1) 转 化 为 (1R， 5S)-6， 6- 二 甲 基 -3- 氮 杂 二 环 [3.1.0] 己 -2- 烯， 化合物 (2)， 其中立体异构体过量百分比为至少约 95％并且与具有 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 32 或 SEQ ID NO ： 6 的氨基酸序列的参考多肽相比速率有所改善。具 有这种特性的示例性多肽包括但不限于包含对应于 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 8 和 SEQ ID NO ： 10 的氨基酸序列的多肽。
     在一些实施方案中， 本公开内容的单胺氧化酶能够将底物 (3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (3) 转化为 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (4)，其中立体异构体过量百分比为至少约 95％并且与具有 SEQID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 32 或 SEQ ID NO ： 6 的氨基酸序列的参考多肽相比速率有所改善。具有这种特性的示例性多肽包括但 不限于包含对应于 SEQ IDNO ： 10、 14、 16、 18、 20 和 36 的氨基酸序列的多肽。
     下面的表 2 和 3 提供了本文所公开的 SEQ ID NO 列表及相关活性。 除非另外指明， 否则下面的序列基于野生型黑曲霉单胺氧化酶序列 (SEQ IDNO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2)。在下 面的表 2 和 3 中， 每行列出了两个 SEQ IDNO， 其中奇数序列是指编码偶数序列所提供的氨 基酸序列的核苷酸序列。列出突变 ( 即， 残基改变 ) 数目列是指与 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 的野生型黑曲霉单胺氧化酶氨基酸序列相比的氨基酸取代数目。每个表后是说明文 字， 指明各表中符号 “+” “++” “+++” 和 “++++” 的意义。
     表2： 序列表和关于将化合物 (1) 转化为化合物 (2) 方面的相应活性改良 ：
    表3： 序列表和关于将化合物 (3) 转化为化合物 (4) 方面的相应活性改良 ：
    在一些实施方案中， 本公开内容的单胺氧化酶包含与包含 SEQ IDNO ： 2 序列的参 考序列相比至少约 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％相同的氨基酸序列， 条件是多肽包含其中对应于残基位置 289 的氨基酸 残基是缬氨酸， 对应于残基位置 348 的氨基酸残基是谷氨酰胺， 对应于残基位置 382 的氨基 酸残基是亮氨酸， 并且对应于残基 465 的氨基酸是甘氨酸的氨基酸序列。在一些实施方案 中， 这些单胺氧化酶可以具有对 SEQ ID NO ： 12 的氨基酸序列的一个或多个修饰。 所述修饰 可以包括取代、 缺失和插入。 取代可以是非保守取代、 保守取代或非保守取代和保守取代的 组合。
     在一些实施方案中， 本公开内容的单胺氧化酶包含与包含 SEQ IDNO ： 2 序列的参 考序列相比至少约 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％相同的氨基酸序列， 条件是多肽包含其中对应于残基位置 289 的氨基酸 残基是缬氨酸， 对应于残基位置 348 的氨基酸残基是谷氨酰胺， 对应于残基位置 365 的氨基 酸残基是色氨酸， 并且对应于残基 465 的氨基酸是甘氨酸的氨基酸序列。在一些实施方案 中， 这些单胺氧化酶可以具有对 SEQ ID NO ： 14 的氨基酸序列的一个或多个修饰。 所述修饰 可以包括取代、 缺失和插入。 取代可以是非保守取代、 保守取代或非保守取代和保守取代的 组合。
     在一些实施方案中， 本公开内容的单胺氧化酶包含与包含 SEQ IDNO ： 2 序列的参 考序列相比至少约 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％相同的氨基酸序列， 条件是多肽包含其中对应于位置 99 的残基的氨基酸 残基是谷氨酸， 对应于残基 289 的残基是缬氨酸， 对应于残基位置 348 的氨基酸残基是谷氨 酰胺， 对应于残基位置 365 的氨基酸残基是色氨酸， 并且对应于残基位置 465 的氨基酸残基 是甘氨酸的氨基酸序列。 在一些实施方案中， 这些单胺氧化酶可以具有对 SEQ ID NO ： 16 的 氨基酸序列的一个或多个修饰。所述修饰可以包括取代、 缺失和插入。取代可以是非保守 取代、 保守取代或非保守取代和保守取代的组合。
     在一些实施方案中， 本公开内容的单胺氧化酶包含与包含 SEQ IDNO ： 2 序列的参 考序列相比至少约 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％相同的氨基酸序列， 条件是多肽包含其中对应于残基位置 99 的氨基酸残 基是谷氨酸， 对应于位置 135 的残基是谷氨酰胺， 对应于残基 289 的残基是缬氨酸， 对应于 残基位置 348 的氨基酸残基是谷氨酰胺， 对应于残基位置 365 的氨基酸残基是色氨酸， 并且 对应于残基位置 465 的氨基酸残基是甘氨酸的氨基酸序列。在一些实施方案中， 这些单胺 氧化酶可以具有对 SEQ ID NO ： 18 的氨基酸序列的一个或多个修饰。所述修饰可以包括取 代、 缺失和插入。取代可以是非保守取代、 保守取代或非保守取代和保守取代的组合。
     在一些实施方案中， 本公开内容的单胺氧化酶包含与包含 SEQ IDNO ： 2 序列的参 考序列相比至少约 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％相同的氨基酸序列， 条件是多肽包含其中对应于残基位置 99 的氨基酸残 基是谷氨酸， 对应于位置 135 的残基是谷氨酰胺， 对应于位置 284 的残基是天冬氨酸， 对应 于残基 289 的残基是缬氨酸， 对应于残基位置 348 的氨基酸残基是谷氨酰胺， 对应于位置 356 的氨基酸残基是缬氨酸， 对应于残基位置 365 的氨基酸残基是色氨酸， 并且对应于残基 位置 465 的氨基酸残基是甘氨酸的氨基酸序列。在一些实施方案中， 这些单胺氧化酶可以具有对 SEQ ID NO ： 20 的氨基酸序列的一个或多个修饰。 所述修饰可以包括取代、 缺失和插 入。取代可以是非保守取代、 保守取代或非保守取代和保守取代的组合。
     在一些实施方案中， 改良的单胺氧化酶包含与对应于如表 2 和 3 中所列的 SEQ ID NO ： 4、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20 或 36 的氨基酸序列至少约 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 或 99％相同的氨基酸序列， 其中所述改良的 单胺氧化酶氨基酸序列包括表 2 和 3 的氨基酸序列中所呈现的任一组特定的氨基酸取代 组合。在一些实施方案中， 这些单胺氧化酶可以在其他氨基酸残基处另外具有约 1-2、 1-3、 1-4、 1-5、 1-6、 1-7、 1-8、 1-9、 1-10 或 1-20 个突变。 突变可以包括插入、 缺失、 取代、 或它们的 组合。在一些实施方案中， 另外的突变包括保守取代。
     如熟悉的技术人员将了解的， 本文所述的多肽并不限于遗传编码的氨基酸。除遗 传编码的氨基酸外， 本文所述的多肽可以整体地或部分地包含天然存在的氨基酸和 / 或 合成的非编码氨基酸。本文所描述的单胺氧化酶可以包含的某些常遇到的非编码氨基酸 包括但不限于 ： 遗传编码的氨基酸的 D- 立体异构体 ； 2， 3- 二氨基丙酸 (Dpr) ； α- 氨基异 丁酸 (Aib) ； ε- 氨基己酸 (Aha) ； δ- 氨基戊酸 (Ava) ； N- 甲基甘氨酸或肌氨酸 (MeGly 或 Sar) ； 鸟氨酸 (Orn) ； 瓜氨酸 (Cit) ； 叔丁基丙氨酸 (Bua) ； 叔丁基甘氨酸 (Bug) ； N- 甲基异 亮氨酸 (MeIle) ； 苯基甘氨酸 (Phg) ； 环己基丙氨酸 (Cha) ； 正亮氨酸 (Nle) ； 萘基丙氨酸 (Nal) ； 2- 氯苯丙氨酸 (Ocf) ； 3- 氯苯丙氨酸 (Mcf) ； 4- 氯苯丙氨酸 (Pcf) ； 2- 氟苯丙氨酸 (Off) ； 3- 氟苯丙氨酸 (Mff) ； 4- 氟苯丙氨酸 (Pff) ； 2- 溴苯丙氨酸 (Obf) ； 3- 溴苯丙氨酸 (Mbf) ； 4- 溴苯丙氨酸 (Pbf) ； 2- 甲基苯丙氨酸 (Omf) ； 3- 甲基苯丙氨酸 (Mmf) ； 4- 甲基苯 丙氨酸 (Pmf) ； 2- 硝基苯丙氨酸 (Onf) ； 3- 硝基苯丙氨酸 (Mnf) ； 4- 硝基苯丙氨酸 (Pnf) ； 2- 氰基苯丙氨酸 (Ocf) ； 3- 氰基苯丙氨酸 (Mcf) ； 4- 氰基苯丙氨酸 (Pcf) ； 2- 三氟甲基苯 丙氨酸 (Otf) ； 3- 三氟甲基苯丙氨酸 (Mtf) ； 4- 三氟甲基苯丙氨酸 (Ptf) ； 4- 氨基苯丙氨酸 (Paf) ； 4- 碘苯丙氨酸 (Pif) ； 4- 氨基甲基苯丙氨酸 (Pamf) ； 2， 4- 二氯苯丙氨酸 (Opef) ； 3， 4- 二 氯 苯 丙 氨 酸 (Mpcf) ； 2， 4- 二 氟 苯 丙 氨 酸 (Opff) ； 3， 4- 二 氟 苯 丙 氨 酸 (Mpff) ； 吡 啶 -2- 基 丙 氨 酸 (2pAla) ； 吡 啶 -3- 基 丙 氨 酸 (3pAla) ； 吡 啶 -4- 基 丙 氨 酸 (4pAla) ； 萘 -1- 基丙氨酸 (1nAla) ； 萘 -2- 基丙氨酸 (2nAla) ； 噻唑基丙氨酸 (taAla) ； 苯并噻吩基 丙氨酸 (bAla) ； 噻吩基丙氨酸 (tAla) ； 呋喃基丙氨酸 (fAla) ； 高苯丙氨酸 (hPhe) ； 高酪 氨酸 (hTyr) ； 高色氨酸 (hTrp) ； 五氟苯丙氨酸 (5ff) ； 苯乙烯丙氨酸 (styrylkalanine， sAla) ； 蒽基丙氨酸 (authrylalanine， aAla) ； 3， 3- 二苯基丙氨酸 (Dfa) ； 3- 氨基 -5- 苯 基 戊 酸 (phenypentanoic acid， Afp) ； 青 霉 胺 (Pen) ； 1， 2， 3， 4- 四 氢 异 喹 啉 -3- 羧 酸 (Tic) ； β-2- 噻吩基丙氨酸 (Thi) ； 蛋氨酸亚砜 (Mso) ； N(w)- 硝基精氨酸 (nArg) ； 高赖 氨酸 (hLys) ； 磷酸甲基苯丙氨酸 (pmPhe) ； 磷酸丝氨酸 (pSer) ； 磷酸苏氨酸 (pThr) ； 高天 冬氨酸 (hAsp) ； 高谷氨酸 (hGlu) ； 1- 氨基环戊 -(2 或 3)- 烯 -4 羧酸 ； 哌可酸 (PA)， 氮杂 环丁烷 -3- 羧酸 (ACA) ； 1- 氨基环戊烷 -3- 羧酸 ； 烯丙基甘氨酸 (aOly) ； 炔丙基甘氨酸 (pgGly) ； 高丙氨酸 (hAla) ； 正缬氨酸 (nVal) ； 高亮氨酸 (hLeu)、 高缬氨酸 (hVal) ； 高异亮 氨酸 (hIle) ； 高精氨酸 (hArg) ； N- 乙酰基赖氨酸 (AcLys) ； 2， 4- 二氨基丁酸 (Dbu) ； 2， 3- 二 氨基丁酸 (Dab) ； N- 甲基缬氨酸 (MeVal) ； 高半胱氨酸 (hCys) ； 高丝氨酸 (hSer) ； 羟脯氨酸 (Hyp) 和高脯氨酸 (hPro)。本文所述的单胺氧化酶可以包含的其他的非编码氨基酸对于本 领域的技术人员来说将是明显的 ( 参见， 例如， 在 Fasman， 1989， CRC Practical Handbookof Biochemistry and Molecular Biology(CRC 生物化学和分子生物学实践手册 )， CRC Press， Boca Raton， FL， 在第 3-70 页和其中所引用的参考文献中所提供的多种氨基酸， 该文 献及其参考文献全部都通过引用并入 )。这些氨基酸可以为 L- 构型或 D- 构型。
     本领域的技术人员将认识到本文所公开的单胺氧化酶还可以包含具有侧链保护 基团的氨基酸或残基。这种被保护的氨基酸在这种情况下属于芳族类别， 它们的非限制性 实例包括 ( 保护基团在括号中列出 ) 但不限于 ： Arg(tos)、 Cys( 甲基苄基 )、 Cys( 硝基吡啶 硫酰基 )、 Glu(δ- 苄基酯 )、 Gln( 呫吨基 )、 Asn(N-δ- 呫吨基 )、 His(bom)、 His( 苄基 )、 His(tos)、 Lys(fmoc)、 Lys(tos)、 Ser(O- 苄基 )、 Thr(O- 苄基 ) 和 Tyr(O- 苄基 )。
     本文所述的单胺氧化酶可以包含的构象上受限的非编码氨基酸可以包括但不限 于 N- 甲基氨基酸 (L- 构型 ) ； 1- 氨基环戊 -(2 或 3)- 烯 -4- 羧酸 ； 哌可酸 ； 氮杂环丁烷 -3- 羧 酸； 高脯氨酸 (hPro) ； 和 1- 氨基环戊烷 -3- 羧酸。
     如上所述， 可以将引入天然存在的多肽中来产生工程化单胺氧化酶的各种修饰靶 向于特定的酶特性。
     5.6 编码工程化单胺氧化酶的多核苷酸
     在另一方面， 本公开内容提供编码本文所公开的工程化单胺氧化酶的多核苷酸。 所述多核苷酸可与控制基因表达的一个或多个异源调节序列可操作地连接以产生能够表 达多肽的重组多核苷酸。 可以将含有编码工程化单胺氧化酶的异源多核苷酸的表达构建体 引入适当的宿主细胞中以表达相应的单胺氧化酶多肽。
     由于知道对应于各种氨基酸的密码子， 所以蛋白序列的可用性提供了能够编码主 题物的所有多核苷酸的说明。 其中相同的氨基酸被可选的密码子或同义密码子编码的遗传 密码的简并性容许制备极大量的核酸， 它们全部编码本文所公开的改良的单胺氧化酶。因 此， 在鉴定了具体的氨基酸序列的情况下， 本领域的技术人员能够通过以不改变蛋白氨基 酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子序列来制备任何数目的不同核酸。在此方面， 本公开内容特定地涵盖每一个可能的多核苷酸变异， 所述多核苷酸变异可以通过选择基于 可能的密码子选择的组合而制备， 并且对于本文所公开的任何多肽， 所有这些变异被认为 是特定地公开的， 所述多肽包括表 2 和 3 中所呈现的氨基酸序列。
     在一些实施方案中， 多核苷酸包含编码具有如下的氨基酸序列的单胺氧化酶的核 苷酸序列 ： 与本文所述的参考工程化单胺氧化酶的任一个相比具有至少约 80％或更多的 序列同一性、 约 85％或更高的序列同一性、 约 90％或更高的序列同一性、 约 95％或更高的 序列同一性、 约 96％或更高的序列同一性、 约 97％或更高的序列同一性、 约 98％或更高的 序列同一性、 或 99％或更高的序列同一性。在一些实施方案中， 多核苷酸编码包含选自下 列的氨基酸序列的工程化单胺氧化酶 ： SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ IDNO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ ID NO ： 20、 或 SEQ ID NO ： 36。
     在多个实施方案中， 优选选择适合蛋白在其中表达的宿主细胞的密码子。 例如， 使 用在细菌中使用的优选密码子来在细菌中表达基因， 使用在酵母中使用的优选密码子来在 酵母中表达 ； 并且使用在哺乳动物中使用的优选密码子来在哺乳动物细胞中表达。举例来 说， SEQ ID NO ： 1 的多核苷酸被密码子优化以便在大肠杆菌中表达， 但是另外还编码天然存 在的黑曲霉单胺氧化酶。
     在某些实施方案中， 不需要替代所有的密码子来优化单胺氧化酶的密码子使用，因为天然序列将包含优选的密码子并且因为优选密码子的使用可能不是所有氨基酸残基 都需要的。因此， 编码单胺氧化酶的密码子优化的多核苷酸可以在全长编码区的约 40％、 50％、 60％、 70％、 80％或大于 90％的密码子位置含有优选的密码子。
     在一些实施方案中， 编码工程化单胺氧化酶的多核苷酸选自 ： SEQ IDNO ： 3、 SEQ ID NO ： 7、 SEQ ID NO ： 9、 SEQ ID NO ： 11、 SEQ ID NO ： 13、 SEQID NO ： 15、 SEQ ID NO ： 17、 SEQ ID NO ： 19、 或 SEQ ID NO ： 35。在一些实施方案中， 多核苷酸能够在高度严格条件下与包含 SEQ ID NO ： 5 或 SEQ IDNO ： 31 的多核苷酸杂交， 其中能够在高度严格条件下杂交的多核苷酸编 码功能单胺氧化酶。
     在其他实施方案中， 多核苷酸包含如下的多核苷酸 ： 编码本文所述的单胺氧化酶， 但是在核苷酸水平上与编码工程化单胺氧化酶的参考多核苷酸具有约 80％或更高的序列 同一性、 约 85％或更高的序列同一性、 约 90％或更高的序列同一性、 约 95％或更高的序列 同一性、 约 98％或更高的序列同一性、 或 99％或更高的序列同一性。在一些实施方案中， 参 考多核苷酸选自下列序列所表示的多核苷酸序列 ： SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID NO ： 7、 SEQID NO ： 9、 SEQ ID NO ： 11、 SEQ ID NO ： 13、 SEQ ID NO ： 15、 SEQ ID NO ： 17、 SEQ ID NO ： 19、 或 SEQ ID NO ： 35。
     可以多种方式操作编码改良的单胺氧化酶的分离的多核苷酸以提供多肽的表达。 依据表达载体， 分离的多核苷酸在插入载体之前的操作可能是期望的或必需的。利用重组 DNA 方法修饰多核苷酸和核酸序列的技术是本领域中熟知的。指南提供在 Sambrook 等人， 2001， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual( 分子克隆 ： 实验室手册 )， 第 3 版， Cold Spring HarborLaboratory Press ； 和 Current Protocols in Molecular Biology( 分子生 物学最新实验方案 )， Ausubel.F. 编辑， Greene Pub.Associates， 1998， 更新至 2006。
     对于细菌宿主细胞， 用于指导本公开内容的核酸构建体转录的合适启动子包 括从下列基因中获得的启动子 ： 大 肠 杆 菌 lac 操 纵 子、 天 蓝 色 链 霉 菌 (Streptomyces coelicolor) 琼 脂 糖 酶 基 因 (dagA)、 枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bacillussubtilis) 果 聚 糖 蔗 糖 酶 基因 (sacB)、 地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)α- 淀粉酶基因 (amyL)、 嗜热脂 肪芽孢杆菌 (Bacillus stearothermophilus) 麦芽糖淀粉酶基因 (amyM)、 解淀粉芽孢杆 菌 (Bacillus amyloliquefaciens)α- 淀粉酶基因 (amyQ)、 地衣芽孢杆菌青霉素酶基因 (penP)、 枯草芽孢杆菌 xylA 和 xylB 基因以及原核 β- 内酰胺酶基因 (Villa-Kamaroff 等 人， 1978， Proc.Natl Acad.Sci.USA 75 ： 3727-3731) ； 以及 tac 启动子 (DeBoer 等人， 1983， Proc.Natl Acad.Sci.USA 80 ： 21-25)。其他启动子描述于 Scientific American， 1980， 242 ： 74-94 中的 “Useful proteins from recombinant bacteria( 来自重组细菌的有用蛋 白 )” ； 和 Sambrook 等人， 如上。
     对于丝状真菌宿主细胞， 用于指导本公开内容的核酸构建体转录的合适启动子包 括从下列酶的基因获得的启动子 ： 米曲霉 TAKA 淀粉酶、 米赫根毛霉 (Rhizomucor miehei) 天冬氨酸蛋白酶、 黑曲霉中性 α- 淀粉酶、 黑曲霉酸稳定的 α- 淀粉酶、 黑曲霉或泡盛曲霉 (Aspergillus awamori) 葡萄糖淀粉酶 (glaA)、 米赫根毛霉脂肪酶、 米曲霉碱性蛋白酶、 米 曲霉磷酸丙糖异构酶、 构巢曲霉乙酰胺酶和尖孢镰刀菌 (Fusarium oxysporum) 胰蛋白酶样 蛋白酶 (WO 96/00787) ； 以及 NA2-tpi 启动子 ( 来自黑曲霉中性 α- 淀粉酶基因和米曲霉 磷酸丙糖异构酶基因的启动子的杂合体 ) 以及它们的突变启动子、 截短启动子和杂合启动子。 在酵母宿主中， 有用的启动子可以来自下列酶的基因 ： 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 烯醇化酶 (ENO-1)、 酿酒酵母半乳糖激酶 (GAL1)、 酿酒酵母醇脱氢酶 / 甘油 醛 -3- 磷酸脱氢酶 (ADH2/GAP) 和酿酒酵母 3- 磷酸甘油酸激酶。用于酵母宿主细胞的其他 有用启动子由 Romanos 等人， 1992， Yeast 8 ： 423-488 描述。
     控制序列还可以是合适的转录终止子序列， 转录终止子序列是被宿主细胞识别以 终止转录的序列。终止子序列与编码多肽的核酸序列的 3’ - 端可操作地连接。在选择的宿 主细胞中有功能的任何终止子可用于本文所公开的方法中。
     例如， 用于丝状真菌宿主细胞的示例性转录终止子可以从下列的基因获得 ： 米曲 霉 TAKA 淀粉酶、 黑曲霉葡萄糖淀粉酶、 构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、 黑曲霉 α- 葡萄糖苷酶 和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
     用于酵母宿主细胞的示例性终止子可以从下列的基因获得 ： 酿酒酵母烯醇化酶、 酿酒酵母细胞色素 C(CYC1) 和酿酒酵母甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他 有用终止子由 Romanos 等人， 1992， 如上描述。
     控制序列还可以是合适的前导序列， 前导序列是对于宿主细胞翻译重要的 mRNA 的非翻译区。前导序列与编码多肽的核酸序列的 5’ - 端可操作地连接。可以使用在选择的 宿主细胞中有功能的任何前导序列。 用于丝状真菌宿主细胞的示例性前导序列从下列的基 因获得 ： 米曲霉 TAKA 淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶。 用于酵母宿主细胞的合适前导序 列从下列的基因获得 ： 酿酒酵母烯醇化酶 (ENO-1)、 酿酒酵母 3- 磷酸甘油酸激酶、 酿酒酵母 α- 因子和酿酒酵母醇脱氢酶 / 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 (ADH2/GAP)。
     控制序列还可以是多聚腺苷酸化序列， 多聚腺苷酸化序列是与核酸序列的 3’ -端 可操作地连接并且在被转录时被宿主细胞识别为向被转录的 mRNA 添加多聚腺苷残基的信 号的序列。在选择的宿主细胞中有功能的任何多聚腺苷酸化序列可用于本文所公开的方 法中。用于丝状真菌宿主细胞的示例性多聚腺苷酸化序列可以从下列的基因获得 ： 米曲霉 TAKA 淀粉酶、 黑曲霉葡萄糖淀粉酶、 构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、 尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋 白和黑曲霉 α- 葡萄糖苷酶。 可用于酵母宿主细胞的多聚腺苷酸化序列由 Guo 和 Sherman， 1995， Mol Cell Bio 15 ： 5983-5990 描述。
     控制序列还可以是编码与多肽的氨基端连接并指导编码的多肽进入细胞分泌途 径的氨基酸序列的信号肽编码区。核酸序列编码序列的 5’ 端可以固有地含有在翻译阅读 框中与编码分泌多肽的编码区区段天然连接的信号肽编码区。 可选择地， 编码序列的 5′端 可以含有对编码序列为外来的信号肽编码区。 在编码序列不是天然含有信号肽编码区时可 能需要外来信号肽编码区。
     可选择地， 外来信号肽编码区可以简单替代天然信号肽编码区以增强多肽的分 泌。然而， 指导表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区可用于本 文所公开的方法中。
     细菌宿主细胞的有效信号肽编码区是从下列的基因获得的信号肽编码区 ： 芽孢杆 菌 (Bacillus)NClB 11837 麦芽糖淀粉酶、 嗜热脂肪芽孢杆菌 α- 淀粉酶、 地衣芽孢杆菌枯 草菌素、 地衣芽孢杆菌 β- 内酰胺酶、 嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶 (nprT、 nprS、 nprM) 和 枯草芽孢杆菌 prsA。其他的信号肽由 Simonen 和 Palva， 1993， Microbiol Rev 57 ： 109-137
     描述。 用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区可以是从下列的基因获得的信号 肽编码区 ： 米曲霉 TAKA 淀粉酶、 黑曲霉中性淀粉酶、 黑曲霉葡萄糖淀粉酶、 米赫根毛霉天 冬氨酸蛋白酶、 特异腐质霉 (Humicola insolens) 纤维素酶和绵毛状腐质霉 (Humicola lanuginosa) 脂肪酶。
     可用于酵母宿主细胞的信号肽可以来自酿酒酵母 α 因子和酿酒酵母转化酶的基 因。其他有用的信号肽编码区由 Romanos 等人， 1992， 如上描述。
     控制序列还可以是编码位于多肽氨基端的氨基酸序列的前肽编码区。所得的 多肽被称为前酶 (proenzyme) 或前多肽 ( 或在一些情况下， 酶原 )。前多肽一般是无 活性的并且其可以通过自前多肽催化裂解或自催化裂解前肽而转化为成熟的活性多 肽。前肽编码区可以从下列的基因获得 ： 枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶 (aprE)、 枯草芽孢 杆菌中性蛋白酶 (nprT)、 酿酒酵母 α 因子、 米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉 (Myceliophthorathermophila) 乳糖酶 (WO 95/33836)。
     在信号肽和前肽区均存在于多肽的氨基端时， 前肽区位于多肽的氨基端相邻的位 置并且信号肽区位于前肽区的氨基端相邻的位置。
     还可能期望的是添加调节序列， 该调节序列容许相对于宿主细胞生长调节多肽表 达。 调节系统的实例是响应于化学或物理刺激物而引起基因表达开启或关闭的那些调节系 统， 所述化学或物理刺激物包括调节化合物的存在。 在原核宿主细胞中， 合适的调节序列包 括 lac、 tac 和 trp 操纵子系统。在酵母宿主细胞中， 合适的调节系统包括 ： 例如， ADH2 系统 或 GAL1 系统。在丝状真菌中， 合适的调节序列包括 TAKAα 淀粉酶启动子、 黑曲霉葡萄糖淀 粉酶启动子和米曲霉葡萄糖淀粉酶启动子。
     调节序列的其他实例是容许基因扩增的那些调节序列。在真核系统中， 这些调节 序列包括在氨甲喋呤的存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因和具有重金属时扩增的金属硫 蛋白基因。在这些情况下， 编码本公开内容的单胺氧化酶的核酸序列将与调节序列可操作 地连接。
     因此， 在另一实施方案中， 本公开内容还涉及包含编码工程化单胺氧化酶或其变 体的多核苷酸和一个或多个表达调节区的重组表达载体， 所述表达调节区如启动子和终止 子、 复制起点等， 这取决于它们要引入的宿主的类型。 可以将上述各种核酸和控制序列连接 在一起以产生重组表达载体， 该重组表达载体可包括一个或多个方便的限制性位点以容许 编码多肽的核酸序列在这些位点插入或取代。可选择地， 可以通过将本公开内容的核酸序 列或包含该序列的核酸构建体插入到合适的表达载体中来表达本公开内容的核酸序列。 在 制备表达载体中， 编码序列位于载体中使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地 连接。
     重组表达载体可以是可以方便地进行重组 DNA 程序并且可以使得多核苷酸序列 表达的任何载体 ( 例如， 质粒或病毒 )。 载体的选择通常取决于载体与该载体要引入其中的 宿主细胞的相容性。载体可以是线型质粒或闭合的环状质粒。
     表达载体可以是自主复制的载体， 即， 作为染色体外实体存在的不依赖于染色体 复制而复制的载体， 例如， 质粒、 染色体外元件、 微型染色体或人工染色体。 载体可以含有用 于确保自我复制的任何部件 (means)。可选择地， 载体可以是在被引入宿主细胞中时， 整合
     到基因组中并与其所整合进的染色体一起被复制的载体。 此外， 可以使用单个载体或质粒、 或一起含有要引入宿主细胞基因组的总 DNA 的两个或更多个载体或质粒、 或者转座子。
     本公开内容的表达载体优选含有一个或多个可选择标记物， 该标记物容许容易地 选择转化的细胞。 可选择标记物是产物能提供杀生物剂或病毒抗性、 重金属抗性、 营养缺陷 型的原养型以及类似特性的基因。细菌可选择标记物的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣 芽孢杆菌的 dal 基因或赋予如下抗生素抗性的标记物 ： 例如氨苄西林抗性、 卡那霉素抗性、 氯霉素抗性 ( 实施例 1) 或四环素抗性。用于酵母宿主细胞的合适的标记物是 ADE2、 HIS3、 LEU2、 LYS2、 MET3、 TRP1 和 URA3。
     用于丝状真菌宿主细胞的可选择标记物包括但不限于 ： amdS( 乙 酰 胺 酶 )、 argB( 鸟氨酸氨甲酰转移酶 )、 bar( 丝膦菌素乙酰基转移酶 )、 hph( 潮霉素磷酸转移酶 )、 niaD( 硝酸还原酶 )、 pyrG( 乳清酸核苷 -5 ′ - 磷酸脱羧酶 )、 sC( 硫酸腺苷转移酶 ) 和 trpC( 邻氨基苯甲酸合酶 ) 以及它们的等同物。用于曲霉细胞的实施方案包括构巢曲霉或 米曲霉的 amdS 和 pyrG 基因以及吸水链霉菌 (Streptomyces hygroscopicus) 的 bar 基因。
     本公开内容的表达载体优选含有容许载体整合到宿主细胞基因组中或者容许载 体在所述细胞中不依赖于基因组而自主复制的元件。对于向宿主细胞基因组中整合， 载体 可能依赖于编码多肽的核酸序列或载体的任何其他元件以通过同源重组或非同源重组将 载体整合到基因组中。
     可选择地， 表达载体可以含有用于指导通过同源重组向宿主细胞基因组中整合的 其他核酸序列。 所述其他核酸序列能够在染色体中的精确位置将载体整合到宿主细胞基因 组中。为了增加在精确位置整合的可能性， 整合元件应优选含有足够数目的与相应的靶序 列高度同源的核酸以增强同源重组的可能性， 所述足够数目例如 100 至 10,000 个碱基对， 优选 400 至 10,000 个碱基对， 并且最优选 800 至 10,000 个碱基对。整合元件可以是与宿 主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外， 整合元件可以是非编码的或编码的核酸 序列。另一方面， 可以通过非同源重组将载体整合到宿主细胞基因组中。
     对于自主复制， 载体可以还包含复制起点， 复制起点使得载体能够在所研究的宿 主细胞中自主复制。细菌复制起点的实例是 P15A ori( 如在图 5 的质粒中所显示的 ) 或质 粒 pBR322、 pUC19、 pACYC177( 该质粒具有 P15A ori) 的复制起点、 或容许在大肠杆菌中复 制的 pACYC184 以及容许在芽胞杆菌中复制的 pUB110、 pE194、 pTA1060 或 pAMβ1。用于酵 母宿主细胞中的复制起点的实例是 2 微米复制起点、 ARS1、 ARS4、 ARS1 和 CEN3 的组合、 以及 ARS4 和 CEN6 的组合。复制起点可以是具有使其机能在宿主细胞中温度敏感的突变的复制 起点 ( 参见， 例如 Ehrlich， 1978， Proc Natl Acad Sci.USA 75 ： 1433)。
     可以将多于 1 拷贝的本公开内容的核酸序列插入到宿主细胞中以增加基因产物 的产生。核酸序列拷贝数的增加可以如下来获得 ： 通过将至少一个额外拷贝的序列整合到 宿主细胞基因组中 ； 或通过在细胞含有扩增拷贝的可选择标记物基因时随核酸序列包括可 扩增的可选择标记物基因， 并且从而可以通过在合适的选择剂存在下培育细胞来选择额外 拷贝的核酸序列。
     用于本文所公开的方法的许多表达载体是可商购获得的。 合适的商业表达载体包 TM 括： 来自 Sigma-Aldrich Chemicals， St.Louis MO. 的 p3xFLAGTM 表达载体， 它包括用于 在哺乳动物宿主细胞中表达的 CMV 启动子和 hGH 多聚腺苷酸化位点以及用于在大肠杆菌中扩增的 pBR322 复制起点和氨苄霉素抗性标记物。 其他合适的表达载体是可从 Stratagene， LaJolla CA 商 购 获 得 的 pBluescriptII SK(-) 和 pBK-CMV、自 pBR322(GibcoBRL)、 pUC(Gibco BRL)、 pREP4、 pCEP4(Invitrogen) 或 pPoly 衍生的质粒 (Lathe 等人， 1987， Gene 57 ： 193-201)。
     5.7 表达单胺氧化酶的宿主细胞
     在另一方面， 本公开内容提供包含编码本公开内容的改良单胺氧化酶的多核苷酸 的宿主细胞， 所述多核苷酸与用于在宿主细胞中表达单胺氧化酶的一个或多个控制序列可 操作地连接。用于表达由本公开内容的表达载体编码的单胺氧化酶多肽的宿主细胞是本 领域中熟知的并且包括但不限于 ： 细菌细胞， 如大肠杆菌、 克菲尔乳杆菌 (Lactobacillus kefir)、 短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)、 小乳杆菌 (Lactobacillus minor)、 链霉菌 和鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 细胞 ； 真菌细胞， 如酵母细胞 ( 例如， 酿 酒酵母或巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)(ATCC 登录号 201178)) ； 昆虫细胞， 如果蝇 (Drosophila)S2 和灰翅夜蛾 (Spodoptera)Sf9 细胞 ； 动物细胞， 如 CHO、 COS、 BHK、 293 和 Bowes 黑素瘤细胞 ； 以及植物细胞。用于上述宿主细胞的适当培养基和生长条件是本领域 中熟知的。
     可以通过本领域中已知的多种方法将表达单胺氧化酶的多核苷酸引入细胞中。 技 术包括但不限于 ： 电穿孔、 生物射弹粒子轰击、 脂质体介导的转染、 氯化钙转染和原生质体 融合。将多核苷酸引入细胞中的多种方法对于熟悉的技术人员来说是明显的。
     示例性的宿主细胞是大肠杆菌 (Escherichia coli)W3110。表达载体通过将 编码改良单胺氧化酶的多核苷酸可操作地连接到质粒 pCK110900 中来制造， 所述质粒 pCK110900 与受 lacI 阻遏物控制的 lac 启动子可操作地连接。表达载体还含有 P15a 复制 起点和氯霉素抗性基因。通过使细胞进行氯霉素选择来分离在大肠杆菌 W3110 中含有主题 多核苷酸的细胞。
     5.8 产生工程化单胺氧化酶的方法
     在一些实施方案中， 为制备本公开内容的改良单胺氧化酶多核苷酸和多肽， 从黑 曲霉或米曲霉获得 ( 或衍生 ) 催化氧化反应的天然存在的单胺氧化酶。 在一些实施方案中， 将母体多核苷酸序列密码子优化以增强单胺氧化酶在特定宿主细胞中的表达。作为例示， 由基于可在 Genbank 数据库中获得的黑曲霉单胺氧化酶序列的已知氨基酸序列 (Genbank 登录号 L38858) 制备的寡核苷酸构建编码黑曲霉野生型单胺氧化酶多肽的母体多核苷酸 序列。 将指定为 SEQ ID NO ： 1 的母体多核苷酸序列进行密码子优化以便在大肠杆菌中表达， 并且将密码子优化的多核苷酸克隆到表达载体中， 将单胺氧化酶基因的表达置于 lac 启动 子和 lacI 阻遏基因的控制下。鉴定在大肠杆菌中表达活性单胺氧化酶的克隆并对基因测 序以确定它们的身份。 指定的序列 (SEQ ID NO ： 2) 是用作工程化单胺氧化酶的大部分实验 和文库构建的起点的母体序列， 所述工程化单胺氧化酶是由黑曲霉单胺氧化酶进化的。
     如上面所讨论的， 工程化单胺氧化酶可以通过使编码天然存在的单胺氧化酶的多 核苷酸进行诱变和 / 或定向进化方法而获得。示例性的定向进化技术是如下列文献中所 描述的诱变和 / 或 DNA 改组 ： Stemmer， 1994， ProcNatl Acad Sci USA 91 ： 10747-10751 ； WO 95/22625 ； WO 97/0078 ； WO97/35966 ； WO 98/27230 ； WO 00/42651 ； WO 01/75767 和美国 专利 6,537,746。 可以使用的其他定向进化程序包括但不限于 ： 交错延伸方法 (StEP)、 体外重组 (Zhao 等人， 1998， Nat.Biotechnol.16 ： 258-261)、 诱变 PCR(Caldwell 等人， 1994， PCR Methods Appl.3 ： S136-S140) 和盒式诱变 (Black 等人， 1996， Proc Natl Acad Sci USA 93 ： 3525-3529)。
     筛选诱变处理之后获得的克隆中具有期望的改良酶特性的工程化单胺氧化酶。 由表达文库测量酶活性可以使用标准生物化学技术进行， 例如但不限于可以使用公布的 用于测量单胺氧化酶的方法或其改造方法进行， 例如但不限于 Zhou 等人 (Zhou 等人 “A One-Step Fluorometric Methodfor the Continuous Measurement of Monoamine Oxidase Activity( 单 胺 氧 化 酶 活 性 连 续 测 量 的 一 步 式 荧 光 法 )， ” 1997 Anal.Biochem.253 ： 169-74) 和 Szutowicz 等人 (Szutowicz 等人， “Colorimetric Assay for MonoamineOxidase in Tissues Using Peroxidase and2， 2′ -Azino(3-ethtylbenzthaizoline-6-sulfonic Acid)as Chromogen( 使用过氧化物酶和 2， 2′ - 连氮基 (3- 乙基苯并噻唑啉 -6- 磺酸 ) 作 为色原进行的组织中单胺氧化酶的比色测定 )， ” 1984， Anal.Biochem.138 ： 86-94) 所公开 的那些方法。酶活性的比较是使用限定的酶制剂、 在设定条件下的限定的测定和一种或多 种限定的底物进行的， 如本文进一步详细描述的 ； 或者使用例如 Zhou 和 Szutowicz 的方法 进行。 一般地， 当比较裂解物时， 测定细胞数和测定的蛋白的量并且使用相同的表达系统和 相同的宿主细胞来将宿主细胞产生的酶和裂解物中存在的酶的量的差异最小化。 在期望改 良的酶特性是热稳定性时， 可以在使酶制剂经受限定的温度并测量热处理后剩余的酶活性 的量来测量酶活性。然后分离含有编码单胺氧化酶的多核苷酸的克隆， 将该克隆测序以鉴 定核苷酸序列改变 ( 若存在 )， 并将其用于在宿主细胞中表达酶。
     当已知工程化多肽的序列时， 编码酶的多核苷酸可以根据已知的合成方法通过 标准的固相方法来制备。在一些实施方案中， 可以分别合成最多约 100 个碱基的片段， 然 后将它们连接 ( 例如， 通过酶连接或化学连接方法或聚合酶介导的方法 ) 以形成任何期 望的连续序列。例如， 可以通过化学合成使用如下的方法来制备本文所公开的多核苷酸 和寡核苷酸 ： 例如 Beaucage 等人， 1981， Tet Lett 22 ： 1859-69 所描述的经典的亚磷酰 胺方法 ； 或 Matthes 等人， 1984， EMBO J.3 ： 801-05 所描述的方法， 例如， 如同该方法在自 动化合成方法中所通常实践的一样。根据亚磷酰胺方法， 在例如自动化 DNA 合成仪中合 成寡核苷酸， 将其纯化、 退火、 连接并克隆在适当的载体中。此外， 基本上任何核酸可以从 多种商业来源的任一种获得， 例如 The Midland Certified Reagent Company， Midland， TX、 The GreatAmerican Gene Company， Ramona， CA、 ExpressGen Inc.Chicago， IL、 OperonTechnologies Inc.， Alameda， CA 以及许多其他商业来源。
     可以使用用于蛋白纯化的熟知技术的任一种或多种将在宿主细胞中表达的工程 化单胺氧化酶从所述细胞和或培养基中回收， 所述熟知技术包括但不限于 ： 溶菌酶处理、 超 声处理、 过滤、 盐析、 超速离心以及色谱。用于裂解和从诸如大肠杆菌的细菌中高效提取蛋 白的合适的溶液可以商品名 CelLytic BTM 从 St.Louis MO 的 Sigma-Aldrich 商购获得。
     用于分离单胺氧化酶的色谱技术包括但不限于 ： 反相色谱高效液相色谱、 离子交 换色谱、 凝胶电泳和亲和色谱。用于纯化特定酶的条件将部分取决于诸如静电荷、 疏水性、 亲水性、 分子量、 分子形状等因素， 并且对于本领域技术人员来说将是明显的。
     在一些实施方案中， 可以使用亲和技术来分离改良的单胺氧化酶。对于亲和色谱 纯化， 可以使用与单胺氧化酶特异性结合的任何抗体。 对于抗体制备， 可以通过用化合物注射来免疫多种宿主动物， 包括但不限于 ： 家兔、 小鼠、 大鼠等。 可以借助于侧链官能团或与侧 链官能团连接的连接物来将化合物连接到合适的载体如 BSA 上。可以依据宿主物种使用多 种佐剂来增加免疫反应， 所述佐剂包括但不限于 ： Freund’ s( 完整的和不完整的 )、 矿物胶 如氢氧化铝、 表面活性物质如溶血卵磷脂、 复合多元醇、 聚阴离子、 肽、 油乳液、 匙孔血蓝蛋 白、 二硝基苯酚和可能有用的人佐剂如 BCG( 卡介苗 ) 和短小棒状杆菌 (Corynebacterium parvum)。
     5.9 使用工程化单胺氧化酶的方法以及用其制备的化合物
     本文所描述的单胺氧化酶可以催化结构式 I 的底物化合物氧化为结构式 II(a) 的 立体异构产物 ：
    其中， 每个 A、 M 和 M’ 如上所述。
     在具体的实施方案中， 本文所述的单胺氧化酶可以催化底物 (1R， 5S)-6， 6- 二 甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷， 化合物 (1) 氧化为立体异构产物 (1R， 5S)-6， 6- 二甲 基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 -2- 烯， 化合物 (2) ：
    
    在将底物化合物 (1) 氧化为产物化合物 (2) 的这种方法的一些实施方案中， 与 SEQ ID NO ： 2 的野生型黑曲霉序列相比， 单胺氧化酶多肽必须具有至少下列氨基酸取代 ： (1) 残 基 465 是甘氨酸、 (2) 残基 289 是缬氨酸、 (3) 残基 384 是谷氨酰胺、 以及 (4) 残基 382 是亮 氨酸。
    
    在另一具体实施方案中， 本文所述的单胺氧化酶催化底物 (3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (3) 氧化为立体异构产物 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (4)， 化合物 (4) 可以进一步进行二聚化形成化合物 (5) ：
    在将底物化合物 (3) 氧化为产物化合物 (4) 的这种方法的一个实施方案中， 与 SEQ ID NO ： 1 的野生型黑曲霉序列相比， 单胺氧化酶多肽必须具有下列氨基酸取代的至少一种 ： (1) 残基 465 是甘氨酸、 (2) 残基 289 是缬氨酸、 (3) 残基 384 是谷氨酰胺、 以及 (4) 残基 365 是色氨酸。 在将底物化合物 (3) 还原为产物化合物 (4) 的这种方法的另一实施方案中， 与 SEQ ID NO ： 1 的野生型黑曲霉序列相比， 单胺氧化酶多肽必须具有下列氨基酸取代的至 少两个 ： (1) 残基 465 是甘氨酸、 (2) 残基 289 是缬氨酸、 (3) 残基 384 是谷氨酰胺、 (4) 残 基 365 是色氨酸、 以及 (3) 残基 99 是谷氨酸。在另一实施方案中， 与 SEQ ID NO ： 1 的野生 型黑曲霉序列相比， 单胺氧化酶必须具有下列氨基酸取代的至少三个 ： (1) 残基 465 是甘氨 酸、 (2) 残基 289 是缬氨酸、 (3) 残基 384 是谷氨酰胺、 (4) 残基 365 是色氨酸、 (5) 残基 99
    是谷氨酸以及 (4) 残基 135 是谷氨酰胺。在又一实施方案中， 与 SEQ ID NO ： 1 的野生型黑 曲霉序列相比， 单胺氧化酶必须具有至少下列氨基酸取代 ： (1) 残基 465 是甘氨酸、 (2) 残基 289 是缬氨酸、 (3) 残基 99 是谷氨酸、 以及 (4) 残基 135 是谷氨酰胺和 / 或残基 248 是天冬 氨酸。
     在将底物氧化为产物的这种方法的一个实施方案中， 底物被氧化为大于约 99％立 体异构体过量的产物， 其中单胺氧化酶包含对应于下列的序列 ： SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ IDNO ： 14、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 或 SEQ ID NO ： 20。
     在将底物还原为产物的这种方法的另一实施方案中， 在用大于约 25g/L 的底物和 小于约 5g/L 的多肽进行时， 在小于约 24 小时内至少约 50％的底物被转化为产物， 其中多 肽包含对应于下列的氨基酸序列 ： SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 14、 SEQ IDNO ： 16、 SEQ ID NO ： 18、 或 SEQ ID NO ： 20。 在其他实施方案中， 本文所提供的单胺氧化酶的任一种可用于制备合成 Schering 505034((1R， 2S， 5S)-N-(4- 氨基 -1- 环丁基 -3， 4- 二氧代丁 -2- 基 )-3-((S)-2-(3- 叔丁 基脲基 )-3， 3- 二甲基丁酰基 )-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 甲酰胺 )) 的 中间体， Schering 505034 是可用于治疗病毒感染的蛋白酶抑制剂 (Malcolm 等人 (2006) Antimicrob.Agents Chemother.50(3) ： 1013-20)。合成 Schering 505034 的重要步骤是 将结构式 I 的化合物转化为结构式 II 的化合物， 或者更具体地， 将化合物 (1) 转化为化合 物 (2)。因此， 本公开内容提供用于制备 Schering 505034 的方法， 所述方法包括使用本公 开内容的单胺氧化酶多肽将化合物 (1) 转化为化合物 (2) 的步骤。本文所公开的用于制备 Schering 505034 的方法还可包括结合上述方案 3、 4、 5、 6、 8、 9、 10、 12 和 14 而描绘和描述的
     一个或多个步骤。
     在 其 他 实 施 方 案 中， 本文所提供的单胺氧化酶的任一种可用于制备合成 VX-950((N-((S)-1- 环己基 -2-((S)-1-((1S， 3aR， 6aS)-1-((R)-3-(2-( 环丙氨基 )-2- 氧 代乙酰基 ) 己酰基 ) 六氢环戊 [c] 吡咯 -2(1H)- 基 )-3， 3- 二甲基 -1- 氧代丁 -2- 基氨 基 )-2- 氧代乙基 ) 吡嗪 -2- 甲酰胺的中间体， VX-950 是可用于治疗病毒感染的蛋白酶抑制 剂 (Perni 等人 (2006)Antimicrob.Agents Chemother.50(3) ： 899-909)。合成 VX-950 的 重要步骤是将结构式 I 的化合物转化为结构式 II 的化合物， 或者更具体地， 将化合物 (3) 转化为化合物 (4)。 因此， 本公开内容提供用于制备 VX-950 的方法， 所述方法包括使用本公 开内容的单胺氧化酶多肽将化合物 (3) 转化为化合物 (4) 的步骤。本文所公开的用于制备 VX-950 的方法还可包括结合上述方案 3、 4、 5、 6、 7、 9、 10、 11 和 13 而描绘和描述的一个或多 个步骤。
     如本领域的技术人员已知的， 单胺氧化酶催化的氧化反应通常需要辅因子。本文 所述的单胺氧化酶催化的氧化反应通常也需要辅因子黄素腺嘌呤核苷酸 (FAD)。如本文所 用， 术语 “辅因子” 是指与单胺氧化酶组合起作用的非蛋白化合物。一般地， 将可以与单胺 氧化酶非共价或共价连接的氧化形式的辅因子添加至反应混合物中。氧化的 FAD 形式可以 通过分子氧而由还原形式 FAD-H2 再生。在另一实施方案中， 氧化的 FAD 形式可以由 NAD(P) 再生以提供 FAD 和 NAD(P)H。NAD(P) 继而可以通过使用 NAD(P)H- 依赖性醇脱氢酶 / 酮还 原酶将酮还原为醇而再生。
     本文所述的单胺氧化酶催化的氧化反应一般在溶剂中进行。合适的溶剂包括 水、 有机溶剂 ( 例如， 乙酸乙酯、 乙酸丁酯、 1- 辛醇 (octacnol)、 庚烷、 辛烷、 甲基叔丁醚 (MTBE)、 甲苯以及类似有机溶剂 ) 和离子液体 ( 例如， 1- 乙基 4- 甲基咪唑四氟硼酸盐、 1- 丁 基 -3- 甲基咪唑四氟硼酸盐、 1- 丁基 -3- 甲基咪唑六氟磷酸盐以及类似离子液体 )。在一 些实施方案中， 使用含水溶剂， 包括水和含水助溶剂系统。
     示例性的含水助溶剂系统具有水和一种或多种有机溶剂。一般地， 选择含水助溶 剂系统的有机溶剂组分使得该有机溶剂组分不会完全灭活单胺氧化酶。 可以通过利用如本 文所述的那些酶活性测定， 在候选溶剂系统中用感兴趣的限定底物测量指定的工程化单胺 氧化酶的酶活性来容易地鉴定适当的助溶剂系统。
     含水助溶剂系统的有机溶剂组分可以与含水组分混溶， 得到单一的液相 ； 或者可 以与含水组分部分混溶或不混溶， 得到两个液相。一般地， 在采用含水助溶剂系统时， 将其 选择为双相性的， 其中水分散在有机溶剂中或者反之亦然。 一般地， 在采用含水助溶剂系统 时， 期望的是选择可以容易地与水相分离的有机溶剂。一般地， 助溶剂系统中水与有机溶 剂的比通常在有机溶剂比水为约 90 ∶ 10 至约 10 ∶ 90(v/v) 的范围内和有机溶剂比水为 80 ∶ 20 与 20 ∶ 80(v/v) 之间的范围内。助溶剂系统可以在添加到反应混合物之前预形 成， 或者其可以在反应容器中原位形成。
     含水溶剂 ( 水或含水助溶剂系统 ) 可以是 pH 缓冲的或未缓冲的。一般地， 氧化可 以在约 10 或以下， 通常在约 5 至约 10 的范围内的 pH 下进行。在一些实施方案中， 氧化在 约 9 或以下， 通常在约 5 至约 9 的范围内的 pH 下进行。在一些实施方案中， 氧化在约 8 或 以下， 通常在约 5 至约 8 的范围内， 并且通常在约 6 至约 8 的范围内的 pH 下进行。氧化还 可以在约 7.8 或以下、 或 7.5 或以下的 pH 下进行。可选择地， 氧化可以在中性 pH， 即约 7 下进行。 在氧化反应过程中， 反应混合物的 pH 可以改变。典型的结构式 I 的胺在中性 pH 和约中性 pH 下是质子化的， 而结构式 II 的亚胺产物在中性 pH 和约中性 pH 下则通常不是 质子化的。因此， 在其中反应在中性 pH 或约中性 pH 下进行的典型实施方案中， 质子化的胺 向非质子化的亚胺的氧化将质子释放到水溶液中。 可以通过在反应过程中添加碱来将反应 混合物的 pH 维持在期望 pH 下或期望 pH 范围内。可选择地， 可以使用包含缓冲液的含水溶 剂控制 pH。维持期望的 pH 范围的合适的缓冲液是本领域中已知的并且包括 ： 例如， 磷酸盐 缓冲液、 三乙醇胺缓冲液以及类似缓冲液。还可以使用缓冲或碱添加的组合。
     用于中和酸的合适碱是 ： 有机碱， 例如胺、 醇盐以及类似有机碱 ； 和无机碱， 例如 氢氧化物盐 ( 例如， NaOH)、 碳酸盐 ( 例如， NaHCO3)、 碳酸氢盐 ( 例如， K2CO3)、 碱性磷酸盐 ( 例 如， K2HPO4、 Na3PO4) 以及类似无机碱。用于中和在反应过程中由胺氧化为亚胺而释放的质子 的优选的碱是胺底物本身。 在转化过程同时添加碱可以手动进行， 同时监测反应混合物 pH， 或者更方便地， 通过使用自动滴定器作为 pH 固定器 (pH stat)。还可以使用部分缓冲能力 和碱添加的组合进行过程控制。通常， 以水溶液添加在氧化过程中添加到未缓冲的或部分 缓冲的反应混合物中的碱。
     在进行本文所述的立体选择性氧化反应中， 可以将工程化单胺氧化酶以下列形式 添加到反应混合物中 ： 纯化的酶、 用编码单胺氧化酶的基因转化的全细胞、 和 / 或这种细胞 的细胞提取物和 / 或裂解物。用编码工程化单胺氧化酶的基因转化的全细胞或其细胞提取 物和 / 或裂解物可以多种不同的形式采用， 包括固体 ( 例如， 冻干的、 喷雾干燥的以及类似 形式 ) 或半固体 ( 例如， 粗糊料 )。
     可以通过沉淀 ( 硫酸铵、 聚乙烯亚胺、 热处理或类似方法 ) 部分纯化细胞提取物或 细胞裂解物， 随后在冻干之前是脱盐程序 ( 例如， 超滤、 透析和类似方法 )。 可以通过使用诸 如戊二醛的已知交联剂的交联或固定于固相 ( 例如， Eupergit C 和类似物 ) 来稳定任一细 胞制剂。
     可以将固体反应物 ( 例如， 酶、 盐等 ) 以多种不同形式提供到反应中， 包括 ： 粉末 ( 例如， 冻干的、 喷雾干燥的和类似形式 )、 溶液、 乳液、 悬浮液以及类似形式。可以使用本领 域普通技术人员已知的方法和设备容易地将反应物冻干或喷雾干燥。例如， 可以将蛋白溶 液在 -80℃以小份冷冻， 然后将其添加到预冷冻的冻干室中， 随后施加真空。从样品中移除 水之后， 在释放真空并取回冻干样品之前， 通常将温度升至 4℃持续 2 小时。
     氧化反应中所用的反应物的量一般将依据所需的产物的量以及同时采用的单胺 氧化酶底物的量而变化。 一般地， 使用约 50mg/ 升至约 5g/ 升的单胺氧化酶时可以使用约 5 克 / 升至 50 克 / 升的浓度的底物。本领域普通技术人员将容易地了解如何改变这些量来 使它们适合期望的产力水平和产物规模。 可以通过常规实验容易地确定任选试剂如过氧化 氢酶、 消泡剂和亚硫酸氢钠或偏亚硫酸氢钠的适当量。
     反应物添加的顺序不是严格的。可以将反应物在同一时间一起添加到溶剂 ( 例 如， 单相溶剂、 双相含水助溶剂系统以及类似溶剂 ) 中， 或者可选择地， 在不同的时间点， 一 些反应物可以分别添加， 并且一些反应物一起添加。在某些实施方案中， 可以将反应的一 种或多种组分以将单胺氧化酶的底物和 / 或产物抑制最小化或消除的水平连续添加 (“进 料” ) 至反应中。在某些实施方案中， 可以在反应过程中间断地添加单胺氧化酶， 例如约每
     隔 1 小时、 约每隔 2 小时、 约每隔 3 小时或约每隔 4 小时添加。
     进行本文所述的单胺氧化酶催化的氧化反应的合适条件包括可以通过常规实验 容易地优化的大量条件， 所述常规实验包括但不限于使工程化单胺氧化酶和底物在实验 pH 和温度下接触并通过例如本文所提供的实施例中描述的方法检测产物。
     单胺氧化酶催化的氧化通常在约 5℃至约 75℃的范围内的温度下进行。对于一些 实施方案， 反应在约 20℃至约 55℃的范围内的温度下进行。在其他的实施方案中， 反应在 约 20℃至约 45℃的范围内、 约 30℃至约 45℃的范围内或约 40℃至约 45℃的范围内的温度 下进行。反应还可以在环境温度下 ( 约 21℃ ) 进行。
     一般容许氧化反应进行到直至获得基本上完全的或接近完全的底物氧化。 可以使 用检测底物和 / 或产物的已知方法来监测底物至产物的氧化。合适的方法包括气相色谱、 HPLC 以及类似方法。转化产率一般大于约 50％、 还可以大于约 60％、 还可以大于约 70％、 还可以大于约 80％、 还可以大于约 90％并且通常大于约 97％。
     6. 实施例
     本公开内容的多种特征和实施方案在下列代表性实施例中示例， 这些实施例旨在 示例性的并且不旨在限制。
     实施例 1 ： 野生型单胺氧化酶基因获取和表达载体构建 .
     基于报道的单胺氧化酶氨基酸序列和如在美国临时申请系列第 60/848,950 号的 实施例 1 中所述的密码子优化算法将单胺氧化酶编码基因设计为在大肠杆菌 (W3110fhuA 或 UM2) 中表达， 所述美国临时申请系列第 60/848,950 号通过引用并入本文。使用由例 如 42 个核苷酸构成的寡核苷酸合成基因， 并将该基因克隆到受 lac 启动子控制的表达 载体 pCK110900( 如在美国专利申请公布 20060195947 的图 3 中所描绘的 ) 中。表达载 体还含有 P15a 复制起点和氯霉素抗性基因。使用标准方法将所得质粒转化到大肠杆菌 W3110 中。密码子优化的基因的实例以及编码多肽列于表 4 中。使用本领域中已知的方 法或其改造方法确定野生型单胺氧化酶的活性， 所述方法包括 Zhou 等人 (Zhou 等人 “A One-Step FluorometricMethod for the Continuous Measurement of Monoamine Oxidase Activity( 单 胺 氧 化 酶 活 性 连 续 测 量 的 一 步 式 荧 光 法 )， ” 1997 Anal.Biochem.253 ： 169-74) 和 Szutowicz 等人 (Szutowicz 等人， “Colorimetric Assay forMonoamine Oxidase in Tissues Using Peroxidase and2， 2′ -Azino(3-ethtylbenzthaizoline-6-sulfonic Acid)as Chromogen( 使用过氧化物酶和 2， 2′ - 连氮基 (3- 乙基苯并噻唑啉 -6- 磺酸 ) 作 为色原进行的组织中单胺氧化酶的比色测定 )， ” 1984， Anal.Biochem.138 ： 86-94) 所公开 的那些方法。酶活性的比较是使用限定的酶制剂、 在设定条件下的限定的测定和一种或多 种限定的底物进行的， 如本文进一步详细描述的 ； 或者使用例如 Zhou 和 Szutowicz 的方法 进行的。 一般地， 当比较裂解物时， 测定细胞数和测定的蛋白的量并且使用相同的表达系统 和相同的宿主细胞来将宿主细胞产生的酶和裂解物中存在的酶的量的差异最小化。
    将编码本公开内容的工程化单胺氧化酶的多核苷酸同样地克隆到用于在大肠杆 菌 W3110 中表达的载体 pCK110900 中。
     实施例 2 ： 单胺氧化酶粉末的产生 ； 摇瓶程序 .
     如下从摇瓶培养物制备单胺氧化酶粉末 ： 将含有带感兴趣的单胺氧化酶基因的 质粒的单个大肠杆菌微生物菌落接种到含有 30μg/ml 氯霉素和 1％葡萄糖的 50ml Luria Bertani 肉汤中。 使细胞在 30℃的培养箱中生长过夜 ( 至少 16 小时 )， 同时以 250rpm 振荡。 将培养物稀释到在 1 升烧瓶中的 250ml 2XYT(16g/L 细菌用胰蛋白胨、 10g/L 酵母提取物、 5g/L NaCl， pH 7.0)、 1mM MgSO4、 30μg/ml 氯霉素中至 600nm 处的光密度 (OD600) 为 0.2， 并容许其在 30℃下生长。在培养物的 OD600 为 0.6 至 0.8 时用 1mMIPTG 诱导单胺氧化酶基 15 分钟， 4℃ ) 收获细胞并弃 因的表达并孵育过夜 ( 至少 16 小时 )。通过离心 (5000rpm， 去上清液。用等体积的冷 (4℃ )100mM 三乙醇胺 ( 盐酸盐 ) 缓冲液， pH 7.0( 任选包含 2mM MgSO4) 重悬细胞团粒， 并如上通过离心收获。 将洗涤的细胞重悬在两体积的冷三乙醇胺 ( 盐 酸盐 ) 缓冲液， pH 7.0 中并以 12000psi 通过弗氏压碎器两次， 同时保持温度在 4℃。通过 离心 (9000rpm， 45 分钟， 4℃ ) 移除细胞碎片。 收集澄清的裂解物上清液并储存在 -20℃下。 冻干冷冻的澄清裂解物， 得到粗单胺氧化酶的干燥粉末。
     实施例 3 ： 单胺氧化酶的制备 ； 发酵程序 .
     如下通过发酵制备单胺氧化酶粉末 ： 在充气搅拌的 15L 发酵罐中， 使 6.0L 的生长 培养基升至温度为 30℃， 所述生长培养基含有 0.88g/L 硫酸铵、 0.98g/L 柠檬酸钠 ； 12.5g/ L 三水磷酸氢二钾、 6.25g/L 磷酸二氢钾、 6.2g/LTastone-154 酵母提取物、 0.083g/L 柠檬酸 铁铵和 8.3ml/L 的微量元素溶液， 该微量元素溶液含有 2g/L 二水氯化钙、 2.2g/L 七水硫酸 锌、 0.5g/L 一水硫酸锰、 1g/L 七水硫酸亚铜、 0.1g/L 四水钼酸铵和 0.02g/L 十水四硼酸钠。 用指数生长晚期的大肠杆菌 W3110 培养物接种发酵罐， 所述大肠杆菌 W3110 培养物含有具 有感兴趣的单胺氧化酶基因的质粒， 其如实施例 3 所述在摇瓶中生长至 0.5 至 2.0 的起始 OD600。 以 500 至 1500rpm 搅拌发酵罐， 并以 1.0-15.0L/ 分钟向发酵容器中供给空气以维持 30％饱和或更高的溶氧水平。通过添加 20％ v/v 氢氧化铵将培养物的 pH 控制在 7.0。通 过添加进料溶液维持培养物的生长， 所述进料溶液含有 ： 500g/L 结晶葡萄糖、 12g/L 氯化铵 和 10.4g/L 七水硫酸镁。在培养物达到 OD600 为 50 后， 通过添加异丙基 -β-D- 硫代半乳 糖苷 (IPTG) 至终浓度为 1mM 诱导单胺氧化酶表达。使培养物再生长 14 小时。将培养物冷
    却至 4℃并维持在 4℃直至收获。通过在 4℃下 Sorval RC12BP 离心机中以 5000G 离心 40 分钟来收获细胞。将收获的细胞直接用于随后的下游回收过程或将其储存 4 在 4℃下直到 如此使用。
     在细胞直接用于下游回收过程时， 在 4℃下将细胞团粒以每体积湿细胞糊料 2 体积的 100mM 三乙醇胺 ( 盐酸盐 ) 缓冲液， pH6.8 重悬。通过使用 12000psig 的压力将悬浮 液通过装备有两级匀浆阀组件的匀浆器来使胞内单胺氧化酶从细胞中释放。 在破裂后立即 将细胞匀浆冷却至 4℃。将 10％ w/v 聚乙烯亚胺溶液， pH 7.2 添加至裂解物中至终浓度为 0.5％ w/v 并搅拌 30 分钟。 通过在标准的实验室离心机中以 5000G 离心 30 分钟来澄清所得 悬浮液。滗去澄清的上清液并使用分子量截留为 30Kd 的纤维素超滤膜浓缩 10 倍。将最终 的浓缩物分散到浅容器中， 在 -20℃下冷冻并冻干成粉末。将单胺氧化酶粉末储存在 -80℃ 下。
     实施例 4 ： 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷， 化合物 (1) 转化为 (1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 -2- 烯， 化合物 (2) 的分析方法
     通过下面所述的手性 GC 方法测定 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷的转化 和 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 -2- 烯产物的立体异构纯度。洗脱顺序为 ： 底物 (1)( 保留时间约 7 分钟 )， 期望的 (1R， 2S)- 亚胺 (2)( 约 10.6 分钟 )， 不期望的 (1S， 2R) 亚 胺 ( 约 11.0 分钟 ) 柱子 ： Supelco Betadex 225( 部件号 24348)， 0.25mm×30m×0.25um ； 炉 温： 85℃等温 ； 载流 ： 1.1ml/ 分钟 ； 进样体积 ： 4μL ； 以及分流进样 ： 100 ∶ 1 ； 进样器温度＝ 200℃ ； FID 检测。
     实施例 5 ： 八氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (3) 转化为 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六 氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (4) 的分析方法
     使用下面所述的手性 GC 方法测定八氢环戊 [c] 吡咯的转化和产物的立体异构纯 度。洗脱顺序为 ： 底物 (3)( 保留时间约 2.7 分钟 )， 期望的 (3aS， 6aR) 亚胺 (4)( 约 5.5 分钟 )， 不期望的 (3aR， 6aS)- 亚胺 ( 约 5.8 分钟 )。亚胺 (4) 的二聚体在进样口中热解 (thermolyze) 为亚胺。 柱子 ： Supelco Betadex225( 部件号 24348)， 0.25mm×30m×0.25um ； 炉温 ： 120℃等温 ； 载流 ： 1.1ml/ 分钟 ； 进样体积 ： 4μL ； 以及分流进样 ： 100 ∶ 1 ； 进样器温 度＝ 200℃ ； FID 检测。
     实施例 6 ： 野生型单胺氧化酶氧化化合物 (1)6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 烷的评定
     对 本 文 所 公 开 的 野 生 型 单 胺 氧 化 酶 进 行 了 它 们 将 6， 6 二 甲 基 -3- 氮 杂 二 环 [3.1.0] 己烷， 化合物 (1) 氧化为 6， 6- 甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 -2- 烯， 化合物 (2) 的 能力的筛选。 在空气下向 50-mL 3 颈烧瓶中添加 25mL 100mMpH 3.0 磷酸钾缓冲液和 330μL 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷， 得到均匀的溶液。经由浓 H3PO4 将 pH 调节至大约 7.3。向经 pH 调节的溶液中添加 60μL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Sigma Aldrich ； 目录号 C-3515) 和在 pH 8.0 的磷酸钾缓冲液中的 150mg 具有 SEQ ID NO 2( 黑曲霉 ) 或 SEQ IDNO 32( 米曲霉 ) 的野生型单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 2 的摇瓶方法制备 )。在空气下搅拌 所得的浅黄色溶液 24 小时。经由受反馈控制而以 1-5μL 逐份添加 1N NaOH 来将 pH 维持 在 7.2。( 胺反应物在中性 pH 下是质子化的 ； 亚胺产物则不是。所以必须中和释放质子的 作用以维持 pH)。
     用 10N NaOH 将 pH 增至大约 14 来猝灭反应， 采用用于分相的离心用 CDCl3 萃取混 合物。来自使用黑曲霉野生型单胺氧化酶的反应的 CDCl3 溶液的 1H-NMR 分析表明约 20％ 的胺 (1) 转化为亚胺 (2)。 与使用黑曲霉野生型单胺氧化酶的反应相比， 使用米曲霉野生型 单胺氧化酶的反应消耗了两倍量的 NaOH 溶液， 这表明转化了约两倍的量的胺 (1)。.根据实施例 4 的方法的手性 GC 分析显示了期望的 (1R， 5S)- 亚胺 (2)。未检测出 不期望的 (1S， 5R)- 亚胺对映体。
     这个实施例证明这些野生型单胺氧化酶对化合物 (1)6， 6 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷具有低活性， 并且将化合物 (1) 转化为期望的 (1R， 5S)- 亚胺 (2)。
     实施例 7 ： 野生型单胺氧化酶氧化八氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (3) 的评定
     对本文所公开的野生型单胺氧化酶进行了它们将 ( 八氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (3) 氧化为 (3aS， 6aR)1， 3a， 4， 5， 6， 6a 六氢环戊 [c] 吡咯 )， 化合物 (4) 的能力的筛选。在空气 下向 50-mL 3 颈烧瓶中添加 25mL 100mM pH 8.0 磷酸钾缓冲液和 375mg 的盐酸八氢环戊 [c] 吡咯并用 1N NaOH 将 pH 调节为大约 7.3。向经 pH 调节的溶液中添加 60μL 黑曲霉过 氧化氢酶悬浮液 ( 购自 Sigma Aldrich ； 目录号 C-3515) 和在 pH 8.0 的磷酸钾缓冲液中的 150mg 具有 SEQ ID NO 2( 黑曲霉 ) 的野生型单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 2 的摇瓶方法 制备 )。在空气下搅拌所得的浅黄色溶液 24 小时。经由受反馈控制而以 1-5μL 逐份添加 1N NaOH 来将 pH 维持在 7.2。24 小时后观察到少量或没有 NaOH 消耗。用 10N NaOH 将 pH 增至大约 14 来猝灭反应， 用 CDCl3 萃取混合物。经由离心 (6000rpm 5 分钟 ) 分相后， CDCl3 1 溶液的 H-NMR 分析表明极少或没有胺 (3) 转化为亚胺 (4)。
     这个实施例证明野生型单胺氧化酶对八氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (3) 即便存在任 何活性也具有极小的活性。
     实施例 8 ： 高通量测定单胺氧化酶对 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷， 化 合物 (1) 的活性
     将通过定向进化获得的并且含有进化的单胺氧化酶基因的质粒文库转化到大肠 杆菌中并在含有 1 ％葡萄糖和 30μg/mL 氯霉素 (CAM) 的 Luria-Bertani(LB) 肉汤上铺 板。在 30℃下孵育至少 16 小时之后， 使用 自动菌落挑取器 (Genetix USA， Inc.， Beaverton， OR) 将菌落挑取至含有下列物质的 96 孔浅孔微量滴定板中 ： 180μL Terrific 肉汤 (TB)、 1％葡萄糖、 30μg/mL 氯霉素 (CAM) 和 2mM MgSO4。使细胞在 30℃下 200rpm 震 荡下生长过夜。然后将 20μL 的这种培养物转移到含有下列物质的 96 孔深孔板中 ： 350μL Terrific 肉汤 (TB)、 2mM MgSO4 和 30μg/mL CAM。在 30℃下 250rpm 震荡下孵育深孔板 2.5 至 3 小时 (OD6000.6-0.8) 之后， 通过添加异丙基 βD 硫代半乳糖苷 (IPTG) 至终浓度为 1mM 诱导细胞培养物的重组基因表达。然后在 30℃下 250rpm 震荡下孵育板 15-23 小时。
     通过离心沉淀细胞， 重悬于 400μL 裂解缓冲液中并通过在室温下震荡至少 2 小时 裂解细胞。裂解缓冲液含有 50mM 磷酸钠缓冲液， pH 7.0、 1mg/mL 溶菌酶和 500μg/mL 硫酸 多粘菌素 (polymixin)B。通过离心沉淀细胞碎片。
     通过将 20μL 适当稀释的澄清的裂解物上清液转移到 96 孔深孔微量滴定板的孔 中来测量单胺氧化酶活性， 96 孔深孔微量滴定板的孔中具有含下列物质的 180μL 测定混 合物 ： 50mM 磷酸钠缓冲液 (pH 7.5)、 4U/ml 黑曲霉过氧化氢酶 (Sigma-C3515) 和以其乙酸 盐提供的 40mM 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷。密封测定板并在室温下震荡 4 小 时。通过添加 500μL 1 ∶ 1 的乙腈∶水猝灭反应并将板离心。离心后， 将 150μL 上清液 转移到浅孔板中用于通过根据实施例 4 的方法进行 HPLC 分析。
     HPLC 条件 ： 40℃的 2.1×75mm Zorbax Eclipse XDB C-18 3.5 微米粒度的柱子， 0.5mL/ 分钟的 60 ∶ 40 40mM 乙酸铵 / 乙腈的流动相。亚胺在约 1 分钟 (254nm) 洗脱。仅可以检测到亚胺并且使用亚胺信号的绝对峰面积进行变体的活性分级。
     可选择地， 用 100μL 10N NaOH 猝灭测定反应并用 1 ∶ 1 v/v MTBE 萃取并通过实 施例 4 的方法进行手性 GC 分析。
     实施例 9 ： 高通量测定单胺氧化酶对八氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (3) 的活性
     如实施例 8 中所述在 96 孔板上制备含有单胺氧化酶变体的裂解物。
     通过将 50μL 澄清的裂解物转移到 96 孔深孔微量滴定板的孔中来测量单胺氧化 酶的活性， 96 孔深孔微量滴定板的孔中具有含下列物质的 450μL 测定混合物 ： 100mM 磷酸 钠缓冲液 (pH 7.5)、 4U/ml 黑曲霉过氧化氢酶 (Sigma-C3515) 和 50mM 八氢环戊 [c] 吡咯。 密封测定板并在室温下震荡 16 小时。将板离心并将 100μL 上清液猝灭在浅孔板孔中的 100μL 乙腈中以用于根据实施例 5 的 HPLC 分析。
     通过添加 100μL 乙腈猝灭反应并将板离心。离心后， 100μL 上清液为 100μL 乙 腈并将其转移到浅孔板中用于通过根据实施例 4 的方法进行 HPLC 分析。
     HPLC 条件 ： 0℃的 2.1×75mm Zorbax Eclipse XDB C-18 3.5 微米粒度的柱子， 0.5mL/ 分钟的 70 ∶ 30 40mM 乙酸铵 / 乙腈的流动相。亚胺在约 1.3 分钟 (254nm) 洗脱。 仅可以检测到亚胺并且使用亚胺信号的绝对峰面积进行变体的分级。
     可选择地， 用 100μL 10N NaOH 猝灭测定反应并用 1 ∶ 1v/v MTBE 萃取并进行实 施例 5 的手性 GC 分析。
     这个实施例描述了用于鉴定在氧化八氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (3) 方面被改良的 单胺氧化酶变体的方法。
     实施例 10 ： (1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 -2- 烯， 化合物 (2) 的 制备级生产
     在约 25℃下向配备有 300rpm 的顶置式搅拌器的 500-mL 4 颈烧瓶中添加 150mL 的 Milli-Q 水和 1.2mL( 大约 1.0g ； 大约 9 毫摩尔 ) 的 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 烷， 得到 pH 为 11.8 的均匀溶液。逐份添加 Na2S2O5 直至达到 pH 7.5。向该无色溶液中添加 300μL Antifoam-204(Sigma 目录号 A-6226) 和 600μL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Sigma Aldrich ； 目录号 C-3515)， 得到 pH 7.5 的无色溶液。向此溶液中添加 1.5g 具有 SEQID NO 10 的单胺氧化酶粉末 ( 通过根据实施例 3 的发酵制备 )， 得到黄色溶液。 插入空气喷射探针 (air sparging probe)( 气流速率约 60mL/ 分钟 )， 并且反应混合物的 pH 开始立即降低。 经 由受反馈控制的 2N NaOH 进料维持 pH。大约 30 分钟后， pH 保持稳定并且不再进行碱进料。 又 10 分钟 ( 共 40 分钟 ) 之后， 将 120mL 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 NaHSO3 溶 液 ( 通过添加 20.8g 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷至 150mL dH2O 中并添加足够 的 Na2S2O5 至达到 pH 7.2 制备 ) 以 0.25mL/ 分钟的速率添加至反应中。反应混合物的 pH 开始立即下降并重新开始进料 2N NaOH。在大约 8 小时 (9 小时的总反应时间 ) 后完成 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷和 NaHSO3 的溶液的添加。继续碱添加并且在完成底 物添加之后增加碱添加速率。取 200μL 小份， 用 200μL 8N NaOH( 使氨基磺酸盐分解为游 离的亚胺 ) 猝灭并用 600μL CDCl3 萃取。CDCl3 提取物的 1H-NMR 分析显示底物 (1) 完全转 化为氮杂二环 [3.1.0] 己 -2- 烯， 化合物 (2)(1H-NMR(300MHz， CDCl3) 谱 ： δ7.42(s， 1H， N＝ C-H)， 3.81(dd ； J ＝ 6.1， 17.8 ； 1H)， 3.50(dd ； J ＝ 2.1， 17.8 ； 1H)， 2.06(m ； 1H)， 1.62(m， 1H)， 1.03(s， 3)， 0.80(s， 3H))。手性 GC 分析显示了 (1R， 5S) 对映体 (2)， 而没有可检测的 (1S， 2R) 对映体。
     反应混合物 “原样” 用于氨基腈的氰化反应 )。
     实施例 11 ： 在静态空气层下单胺氧化酶催化 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 烷 (1) 去对称化为 (1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 -2- 烯 (2).
     在空气下向 50-mL 3 颈烧瓶中添加 25mL 100mM pH 3.0 磷酸钾缓冲液和 330μL 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷， 得到均匀的溶液。使用浓 H3PO4 将 pH 调节至大约 7.5。向经 pH 调节的溶液中添加 60μL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Sigma Aldrich ； 目录号 C-3515) 和在 pH 8.0 的磷酸钾缓冲液中的 150mg 具有 SEQ ID NO 4、 SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO 8 的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 2 的方法制备 )。 在空气下搅拌所得的浅黄色溶液 24 小时。经由受反馈控制而以 1-5μL 逐份添加 1N NaOH 来将 pH 维持在 7.4。然后用 10N NaOH 将 pH 增至大约 14 来猝灭反应。用 CDCl3 萃取混合物样品。经由离心 (6000rpm 5 分 1 钟 ) 分相后， H-NMR 分析表明至少 95％的胺 (1) 转化为亚胺 (2)。通过实施例 4 的方法进 行的手性 GC 分析显示了 (1R， 5S)- 亚胺对映体 (2)。没有检测到 (1S， 2R) 对映体。
     实施例 12 ： 在氧气层下单胺氧化酶催化 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 (1) 去对称化为 (1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 -2- 烯 (2)
     在空气下向 50-mL 3 颈烧瓶中添加 25mL 100mM pH 3.0 磷酸钾缓冲液和 330μL 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷， 得到均匀的溶液。用浓 H3PO4 将 pH 调节至大约 7.5。向经 pH 调节的溶液中添加 60μL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Sigma Aldrich ； 目录号 C-3515) 和在 pH 8.0 的磷酸钾缓冲液中的 150mg SEQ ID NO 4、 SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO 8 的多肽的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 2 的方法制备 )。通过用氧气流冲洗顶空并将所 得浅黄色溶液在空气下搅拌 24 小时。经由受反馈控制而以 1-5μL 逐份添加 1N NaOH 来将 pH 维持在 7.4。用 10N NaOH 将 pH 增至大约 14 来猝灭反应。用 CDCl3 萃取混合物样品。经 1 由离心 (6000rpm 5 分钟 ) 分相后， H-NMR 分析表明至少 95％的胺 (1) 转化为亚胺 (2)。通 过实施例 4 的方法进行的手性 GC 分析显示了 (1R， 5S)- 亚胺对映体 (2)。没有检测到 (1S， 2R) 对映体。
     实施例 13 ： 在亚硫酸氢盐存在下空气喷射的情况下单胺氧化酶催化 6， 6- 二甲 基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 (1) 去对称化为 (1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 -2- 烯 (2)
     向 100-mL 烧 瓶 中 添 加 40mL 的 dH2O 和 1.8mL 的 6， 6- 二 甲 基 -3- 氮 杂 二 环 [3.1.0] 己烷， 得到 pH 为大约 11.4 的均匀溶液。向此溶液中添加 2.7g 的 Na2S2O5， 得到 均匀溶液并通过添加约 1mL 的 8N NaOH 将 pH 调节为大约 7.5。向此溶液中添加 60μL 的 Antifoam-204(Sigma， 目 录 号 A-6226)、 120μL 的 黑 曲 霉 过 氧 化 氢 酶 悬 浮 液 (Sigma Aldrich ； 目录号 C-3515) 和在 10mL 100mM pH 8.0 的磷酸钾缓冲液中的 300mg SEQ ID NO ： 8 的多肽的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 2 的方法制备 )。 通过多孔玻璃将空气喷射反应混 合物中并于室温 ( 约 21℃ ) 下在空气喷射下搅拌所得浅黄色溶液 24 小时。经由受反馈控 制的以 1μL 逐份添加 2.5N NaOH 来将 pH 维持在 7.4。用 10N NaOH 将 pH 增至大约 14 来猝 灭反应并将亚胺 - 亚硫酸氢盐加成物 ( 氨基磺酸盐 ) 分解为游离亚胺并通过萃取到 MTBE 中 来萃取分离产物。相分离之后， 经由蒸馏分离 (1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 1 己 -2- 烯， 产率为 86％。在 CDCl3 中的 H-NMR 分析 ( 如实施例 10 中 ) 确定化合物 (1) 转化为了亚胺化合物 (2)。通过实施例 4 的方法进行的手性 GC 分析显示了 (1R， 5S)- 亚胺对 映体 (2)。没有检测到 (1S， 2R) 对映体。
     用 1.0 当量在 D2O 中的 NaHSO3 处理如此获得的 (1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 1 [3.1.0] 己 -2- 烯。 H-NMR 分析表明了向亚硫酸氢盐加成物的定量转化， (1H-NMR(300MHz， D2O) 谱 ： δ4.8(d， J ＝ 1， 1H(NC(H)SO3 ； 主 要 非 对 映 体 )， 4.5(d， J ＝ 5， 1H(NC(H)SO3 ； 次 要非对映体 )， 3.4-3.6(m， 2H ； 次要非对映体 )， 3.25(dd， J ＝ 3， 10， 1H ； 主要非对映体 )， 3.05(dd， 1H ； J ＝ 1， 10 ； 主要非对映体 )， 1.65(m， 1H ； 主要和次要非对映体 )， 1.55(m， 1H， 主 要和次要非对映体 )， 1.22(s， 3H ； 次要非对映体 )， 1.15(s， 3H ； 次要非对映体 )， 1.10(s， 3H， 主要非对映体 )， 1.00(s， 3H ； 次要非对映体 )。
     实施例 14 ： 在空气喷射并同时添加底物和亚硫酸氢盐情况下单胺氧化酶催化 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 (1) 去对称化为 (1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 -2- 烯 (2).
     在室温 ( 约 21℃ ) 下向配备有 300rpm 的顶置式搅拌器的 500-mL 4 颈烧瓶中添 加 150mL 的 Milli-Q 水和 1.2mL( 大约 1.0g ； 大约 9 毫摩尔 ) 的 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷， 得到 pH 为 11.8 的均匀溶液。逐份添加 Na2S2O5 直至达到 pH 7.5。向该无色 溶液中添加 300μL Antifoam-204(Sigma 目录号 A-6226) 和 600μL 黑曲霉过氧化氢酶悬 浮液 (SigmaAldrich ； 目录号 C-3515)， 得到 pH 7.5 的无色溶液。 向此溶液中添加 1.5g SEQ ID NO ： 8 的多肽的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 3 的方法制备 )， 得到黄色溶液。插入空气 喷射探针并将空气以约 60mL/ 分钟的速率喷射反应中并且注意到反应混合物的 pH 开始立 即降低。经由受反馈控制的 2NNaOH 添加维持 pH。约 30 分钟后， pH 保持稳定并且不再进行 碱添加。又 10 分钟 ( 共 40 分钟 ) 之后， 将 120mL 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 NaHSO3 溶液 (20.8g 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷与 150mL dH2O 和足够的 Na2S2O5 至达到 pH 7.2) 以 0.25mL/ 分钟的速率添加至反应混合物中。 反应混合物的 pH 开始立即下 降并重新开始添加 2N NaOH。在约 8 小时 (9 小时的总反应时间 ) 后完成 6- 二甲基 -3- 氮 杂二环 [3.1.0] 己烷 /NaHSO3 的添加。继续碱添加并且在完成底物添加之后增加碱添加速 率。用 10NNaOH 将 pH 增至大约 14 来猝灭反应 ( 并分解亚胺 - 亚硫酸氢盐加成物 )， 用 MTBE 萃取混合物。相分离之后， 经由 MTBE 溶液的蒸馏分离 (1R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 1 [3.1.0] 己 -2- 烯， 产率为 72％。在 CDCl3 中的 H-NMR 分析 ( 如实施例 10 中 ) 确定化合物 (1) 转化为了亚胺化合物 (2)。 通过实施例 4 的方法进行的手性 GC 分析显示了 (1R， 5S)- 亚 胺对映体 (2)。没有检测到 (1S， 2R) 对映体。
     实施例 15 ： (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈的制备 ( 静 态底物模式 )。
     向 100-mL 烧瓶中添加 40mL 的 dH2O 和 1.8mL 的 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷， 得到 pH 为大约 11.4 的均匀溶液。向此溶液中添加 2.7gNa2S2O5， 得到均匀溶液并用 约 1mL 8N NaOH 将 pH 调节为约 7.5。向此溶液中添加 60μL Antifoam-204(Sigma 目录 号 A-6226)、 120μL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Sigma Aldrich ； 目录号 C-3515) 和在 10mL 100mM pH8.0 的磷酸钾溶液中的 300mg SEQ ID NO 8 的多肽的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施 例 2 的方法制备 )。通过多孔玻璃将空气以约 10mL/ 分钟的速率喷射反应混合物中并于室 温 ( 约 21℃ ) 下在空气下搅拌所得浅黄色溶液 24 小时。整个过程中， 经由受反馈控制而以1μL 逐份添加 2.5N NaOH 来将 pH 维持在 7.4。24 小时后， 添加 1.0g(1.3 当量 )NaCN 至反 应混合物中， 然后加入 (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 磺酸盐。 在 室温下 ( 约 21℃ ) 再搅拌 15 分钟， 然后用 MTBE 萃取混合物。( 还可以使用 2-Me-THF 进行 萃取。 ) 在相分离和溶剂移除之后， 分离到 1.78g(90％产率 ) 浅黄色固体的 (1R， 2S， 5S)-6， 1 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈。在 CDCl3 中的 H-NMR 确定了 (1R， 2S， 5S)-6， 1 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈的制备 ( H-NMR(300MHz， CDCl3) 谱 ： δ3.92(d， J ＝ 1.2， 1H， NC(H)(CN))， 3.25(m， 1H)， 2.96(dd， J ＝ 2.1， 17.0)， 1.48(dd ； J ＝ 1， 2， 12.2 ； 1H)， 1.42(m， 1H)， 1.13(s， 3H)， 1.11(S， 3H))。
     当如此制备包含 (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 磺酸盐 的反应混合物并在室温下用 3.0 当量的 NaCN 处理该反应混合物 12 小时时， 在具有期望的 反式 ((1R， 2S， 5S) 立体异构体的混合物中观察到约 25％的非期望的顺式立体异构体 (1R， 2R， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈。在 CDCl3 中的 1H-NMR 显示出在 4.22ppm 下为双重态 (J ＝ 4.2) 的顺式 - 氨基腈次甲基质子。
     实施例 16 ： (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈的制备 ( 连 续底物添加模式 )。
     步骤 1. 在室温 ( 约 21℃ ) 下向配备有顶置式搅拌器 (300rpm) 的 500-mL4 颈烧 瓶中添加 150mL Milli-Q 水和 1.2mL( 大约 1.0g 和 9 毫摩尔 )6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷， 得到 pH 为 11.8 的均匀溶液。逐份添加 Na2S2O5 直至 pH 达到 7.5。向该无色 溶液中添加 300μL Antifoam-204(Sigma 目录号 A-6226) 和 600μL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮 液 (SigmaAldrich ； 目录号 C-3515)， 得到 pH 7.5 的无色溶液。向此溶液中添加 300mg 具有 SEQ ID NO 12 的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 3 的方法制备 )， 得到黄色溶液。插入空气 喷射探针 ( 气流速率约 60mL/ 分钟 )， 并且反应混合物的 pH 开始立即降低。经由受反馈控 制的 2N NaOH 添加维持 pH。大约 40 分钟后， pH 保持稳定并且不再进行碱添加。又 10 分钟 ( 共 50 分钟 ) 之后， 将 150mL 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 NaHSO3 溶液 (26.1g 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷与 160mL dH2O 和足够的 Na2S2O5 至达到 pH 7.2) 以 0.12mL/ 分钟的速率添加至反应混合物中。 反应混合物的 pH 开始立即下降并重新开始添加 2N NaOH。在大约 21 小时 ( 大约 22 小时的总反应时间 ) 后完成 6.6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 /NaHSO3 添加。在底物添加完成之后， 以增加的速率继续碱添加。24 小时后， 1 通过 H NMR 分析判断反应完成。
     步骤 2. 在 24 小时后， 通过 1H NMR 分析判断反应完成， 将 10.0g NaCN(1.11 当量 ) 添加到反应混合物中， 得到 pH 9.9 的乳白色反应混合物。24 小时后， 通过 1H NMR 分析判断 反应完成。30 分钟后， 用 300mL MTBE 萃取反应物。排掉下层水相 ( 大约 250mL) 并将上层 有机层通过 6g(2” 直径 ×1/4” 高) 过滤。用 300mL MTBE 冲洗 并使用 冲洗中所用的 MTBE 萃取水相。合并有机相并使用旋转蒸发器在 40℃下于减压下浓缩 1 小 时， 得到白色固体。将白色固体在减压下进一步干燥 30 分钟， 得到 23.9g(95％产率 )(1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈。
     实施例 17 ： 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 羧酸甲酯的制备
     通过 PCT 国际申请公布 WO 2007/075790 中所述的程序将根据实施例 16 或 17 制 备的 (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈转化为相应的基本上对映体纯的 (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 羧酸甲酯。
     实施例 18 ： (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈的制备， NaCN 当量和反应时间对氨基腈的反 / 顺异构体比的影响。
     该程序与实施例 15 中直到添加 NaCN 之前的程序相同， 不同的是通过实施例 3 的 方法制备 SEQ ID NO 8 的单胺氧化酶粉末。24 小时后， 如表 5 中所示逐份添加 NaCN 至反 应混合物 (1.0 当量 NaCN 是 720mg 95％ NaCN)。在每个预定的时间间隔之后， 取出 200μL 1 小份， 用 1mL CDCl3 萃取并然后通过 H-NMR 分析。反 / 顺异构体比 ((1R， 5S)-6， 6- 二甲 基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈的期望的 2S 和不期望的 2R 差向异构体之间的比率 ) 通过氨基腈次甲基质子共振的 1H-NMR 积分 ( 反式异构体＝ 3.92ppm 处的双峰 ； 顺式异构体 ＝ 4.22ppm 处的双峰 ) 来测定。
     表5
    .ND ＝未测定。2. ＞ 100 意味着未检测到顺式次甲基共振。
     在最后的小份之后， 用 100mL 乙酸乙酯萃取反应混合物并通过粗砂过滤， 得到清 楚的相分离。添加 20mL 庚烷至有机相。经由在 40℃下的旋转真空蒸发 1 小时来蒸发有机 相以便干燥。1H-NMR 分析表明反 / 顺异构体比保持在 12 ∶ 1。
     实施例 19 ； (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈的制备， 方 法稳固性
     步骤 1. 在室温 ( 约 21℃ ) 下向配备有顶置式搅拌器 (300rpm) 的 500-mL4 颈烧瓶 中添加 150mL 的 Milli-Q 水和 1.2mL( 大约 1.0g 和 9 毫摩尔 ) 的 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷， 得到 pH 为 11.8 的均匀溶液。逐份添加 Na2S2O5 直至 pH 达到 7.5。向该无色 溶液中添加 300μL Antifoam-204(Sigma 目录号 A-6226) 和 600μL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮 液 (SigmaAldrich ； 目录号 C-3515)， 得到 pH 7.5 的无色溶液。向此溶液中添加 300mg 具有 SEQ ID NO 12 的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 3 的方法制备 )， 得到黄色溶液。插入空气 喷射探针 ( 气流速率约 60mL/ 分钟 )， 并且反应混合物的 pH 开始立即降低。经由受反馈控 制的 2N NaOH 添加维持 pH。大约 40 分钟后， pH 保持稳定并且不再进行碱添加。又 10 分钟 ( 共 50 分钟 ) 之后， 将 150mL 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 NaHSO3 溶液 (26.1g 6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷与 160mL dH2O 和足够的 Na2S2O5 至达到 pH 7.2) 以 0.12mL/ 分钟的速率添加至反应混合物中。 反应混合物的 pH 开始立即下降并重新开始添加 2N NaOH。在大约 21 小时 ( 大约 22 小时的总反应时间 ) 后完成 6.6- 二甲基 -3- 氮杂二环
     73[3.1.0] 己烷 /NaHSO3 添加。在底物添加完成之后， 以增加的速率继续碱添加。24 小时后， 1 通过 H NMR 分析判断反应完成。
     步骤 2.24 小时之后， 添加 13.5g NaCN(1.5 当量 ) 至反应混合物中， 得到 pH9.9 的乳白色反应混合物。在室温下搅拌混合物 15 分钟和 45 分钟后取出 200μL 小份， 用 1mL 1 1 CDCl3 萃取小份并通过 H-NMR 分析萃取物。在两个时间点， 顺式立体异构体都低于 H-NMR 检测限。
     在 NaCN 添加后约 60 分钟， 用 300mL MTBE 萃取反应物。 排掉下层水相 ( 大约 250mL) 并将上层有机层通过 6g(2” 直径 ×1/4” 高) 使用 过滤。用 300mL MTBE 冲洗 并 冲洗中所用的 MTBE 萃取水相。合并有机层并使用旋转蒸发器在 40℃下于减压下浓缩 1 小时， 得到白色固体。将白色固体在减压下进一步干燥 30 分钟， 得到 22.5g(90％ 产率 )(1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈。顺式 (2R) 差向异构体 1 低于 H-NMR 检测限。
     此实施例说明这种氨基腈在室温下 pH 9.9 和存在 0.5 当量过量氰化物的条件下 1 小时后仍然呈立体异构纯的形式。
     实施例 20 ： (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 腈的制备， 方 法稳固性 步骤 1. 该程序与实施例 18 的步骤 1 相同。
     步骤 2.24 小时之后， 添加 11.0g NaCN(1.22 当量 ) 至反应混合物中， 得到 pH9.9 的乳白色反应混合物。在室温下搅拌 10 分钟后， 取出 200μL 小份， 用 1mL CDCl3 萃取。萃 1 取溶液的 H-NMR 分析表明完全转化为 (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己 烷 -2- 腈， 即反式氨基腈， 而没有可检测的顺式 2R 立体异构体。
     在室温下再搅拌反应混合物 16 小时。16 小时后的 1H-NMR 分析表明反 / 顺氨基 腈比率为约 15 ∶ 1( 反 / 顺异构体比率通过氨基腈次甲基质子的 1H-NMR 积分测定 ： 反式＝ 3.92ppm 处的双峰 ； 顺式＝ 4.22ppm 处的双峰 )。
     实施例 21 ： 在静态空气下单胺氧化酶催化八氢环戊 [c] 吡咯去对称化为 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯
     在空气下向 50-mL 3 颈烧瓶中添加 25mL 100mM pH 8.0 磷酸钾缓冲液和 375mg 的 盐酸八氢环戊 [c] 吡咯， 随后通过添加 1N NaOH 将 pH 调节为大约 7.5。向经 pH 调节的溶 液中添加 60μL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Sigma Aldrich ； 目录号 C-3515) 和在 pH 8.0 的磷酸钾缓冲液中的 150mg 具有 SEQ ID NO 4 的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 2 的方法制 备 )。在空气下搅拌所得的浅黄色溶液 24 小时， 在此期间， 经由受反馈控制而以 1-5μL 逐 份添加 1N NaOH 将 pH 维持在 7.4。用 10N NaOH 使 pH 达到大约 14 来猝灭反应并通过萃取 到 CDCl3 中来分离产物， 通过 1H-NMR 分析转化， 显示出 1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯
    的形成。 当以高通量筛选鉴定用于此实施例的具有 SEQ ID NO.4 的单胺氧化酶时， 实施例 5 的手性 GC 测定方法显示其将八氢环戊 [c] 吡咯氧化为所需的 (3aR， 6aS)- 亚胺 (4)。没 有检测到 (3aS， 6aR) 对映体。
     实施例 22 ： (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 腈的制备
     在空气下向 50-mL 3 颈烧瓶中添加 25mL 100mM pH 8.0 磷酸钾缓冲液和 400mg 的
     盐酸八氢环戊 [c] 吡咯、 500mg Na2S2O5 并用 10N NaOH 将 pH 调节为大约 7.5。向经 pH 调节 的溶液中添加 30μL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Sigma Aldrich ； 目录号 C-3515) 和在 pH 8.0 的磷酸钾缓冲液中的 300mg 具有 SEQ ID NO 10 的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 2 的方 法制备 )。 在空气下搅拌所得的浅黄色溶液 24 小时， 在此期间， 经由受反馈控制而以 1-5μL 逐份添加 1N NaOH 将 pH 维持在 7.5。在搅拌 48 小时后， 添加 300mg NaCN 至反应混合物中， 将 pH 升至约 9.9。在室温下 ( 约 21℃ ) 再搅拌 1 小时， 然后用乙酸乙酯萃取。相分离和溶 剂蒸发后， 分离出 316mg 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 腈 (82％产率 )。1H-NMR 显示出约 90％的 (1S， 3aR， 6aS)， “反式” 和约 10％的 (1R， 3aR， 6aS) 差向异构体， “顺式” 。(1H-NMR(300MHz， CDCl3) 谱 ： δ3.95(d， J ＝ 6.6， 顺式氨基腈次甲基 H)， 3.62(d， J ＝ 1.2 ； 反式氨基腈次甲 基 H)， 3.15(m， 1H)， 2.71(m， 2H)， 2.62(m， 1H)， 1.63-1.92(m， 3H)， 1.55(m， 1H)， 1.22-1.45(m， 3H))。
     实施例 23 ： (3aR， 6aS)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯， 化合物 (4) 及其相应 的二聚体， 化合物 (5) 的制备级生产。
     向 20℃加套和 300rpm 搅拌的 3-L 3 颈烧瓶中添加 500mL dH2O 和 20mL 在水中的 25wt％八氢环戊 [c] 吡咯溶液。用浓 H3PO4 将 pH 调节至大约 7.6， 得到无色的均匀溶液。向 此溶液中添加 2.0mL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Sigma Aldrich ； 目录号 C-3515) 和 5.0g SEQ ID NO ： 16 的多肽的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 3 的方法制备 )， 得到浅黄色溶液。 以大约 0.2L/ 分钟的干燥空气吹扫容器的顶空。通过受反馈控制以 20-100μL 逐份添加在 水中的 25wt％八氢环戊 [c] 吡咯溶液来将反应的 pH 维持在 7.5 直至已添加 380mL。( 在中 性溶液中的胺是质子化的 ； 亚胺不是。 反应释放了质子， 但是必须将其中和以维持 pH。 在此 实施例中， 胺本身是用作 pH- 固定器滴定剂的碱。) 在添加了 380mL 在水中的 25wt％八氢 环戊 [c] 吡咯溶液之后， 通过受反馈控制添加 1N NaOH 维持 pH 来完成反应 ( 对应于初始的 5g(45mmol) 底物。在不再观察到 NaOH 消耗之后， 取出浆液小份， 过滤并将固体空气干燥。 1
     溶解在多种溶剂中的固体的 H-NMR 谱显示出在溶液中不同比例的亚胺 (3aR， 6aS) 1 八氢环戊 [c] 吡咯 (4) 和其二聚体 (5)。 D6-DMSO 中的 H-NMR(300MHz) 显示二聚体而未检测 到游离亚胺 ( 谱 ： δ3.11(t， J ＝ 8.2 ； 1H)， 2.45(m， 1H)， 2.33(m， 1H)， 1.85(dd， J ＝ 7.2， 8.1， 1 1H)， 1.31-1.58(m， 7H))。CDCl3 中的 H-NMR(300MHz) 显示了亚胺和二聚体的混合物 ( 谱 ： δ3.22(m， 1H)， 2.65(m， 1H)， 2.30-2.40(m， 2H)， 1.89(m， 1H)， 1.50-1.70(m， 5H)， 1.43(m， 1 1H))。 17％ D3PO4/D2O(300MHz) 中的 H-NMR 仅显示出质子化的亚胺单体 ( 谱 ： δ7.6-8.2(br， 1H)， 3.5-3.8(br， 1H)， 2.8-3.5(br， 2H)， 2.2-2.8(br， 1H)， 0.5-1.7(br， 6H))。
     向大体积的反应混合物中添加 100mL 浓 HCl， 得到 pH 约 0 的黄色悬浮液 ( 将二聚 体分解为质子化亚胺 )。将黄色悬浮液在 4℃下以 8000 离心 10 分钟。滗去所得黄色上清 液并将其返回至反应容器中。将白色糊料 ( 通过离心沉淀 ) 重悬于 100mL dH2O 中并通过 滤纸过滤。用 dH2O(1×100mL) 冲洗残余物。将如此获得的含有盐酸 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯的所有酸性水溶液合并并直接用于生成氨基腈的氰化反应。
     当以高通量筛选鉴定用于此实施例的具有 SEQ ID NO.16 的单胺氧化酶时， 实施例 5 的手性 GC 测定显示其将八氢环戊 [c] 吡咯氧化为所需的 (3aR， 6aS)- 亚胺 (4)。没有检 测到 (3aS， 6aR) 对映体。
     实施例 24 ： 在静态空气或氧气下单胺氧化酶催化八氢环戊 [c] 吡咯去对称化为(3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯及其相应二聚体 ； 经由萃取的产物分离
     向 20℃加套和 300rpm 搅拌的 3-L 3 颈烧瓶中添加 500mL dH2O 和 20mL 在水中的 25wt％八氢环戊 [c] 吡咯溶液。用浓 H3PO4 将 pH 调节为大约 7.6， 得到无色的均匀溶液， 向 该溶液中添加 2.0mL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Novozyme “ ；Catalyzyme 101” ) 和 5.0g SEQ ID NO ： 16 的多肽的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 3 的方法制备 )， 得到浅黄色溶液。以大 约 0.2L/ 分钟的干燥空气吹扫容器的顶空。通过受反馈控制以 20-100μL 逐份添加在水中 的 25wt％八氢环戊 [c] 吡咯溶液来将反应的 pH 维持在 7.5 直至已添加 380mL。( 在中性溶 液中的胺是质子化的 ； 亚胺不是。反应释放了质子， 但是必须将其中和以维持 pH。在此实 施例中， 胺本身是用作 pH- 固定器滴定剂的碱。) 在添加了 380mL 在水中的 25wt％八氢环 戊 [c] 吡咯溶液之后， 通过添加 1N NaOH 维持 pH 来完成反应 ( 对应于初始的 5g(45mmol) 底物。在不再观察到 NaOH 消耗之后， 添加 1800mL MTBE 至不均匀的反应混合物中， 然后将 其加热至 45℃。通过 过滤之后， 弃去下层水相， 并用 10％柠檬酸萃取上层有机相， 并且将含有盐酸 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯的酸性水溶液直接用于根 据实施例 29 的方法制备 (1R， 2S， 5S)-6， 6- 二甲基 -3- 氮杂二环 [3.1.0] 己烷 -2- 羧酸。
     实施例 25 ： (3aR， 6aS) 八氢环戊 [c] 吡咯的二聚体， 化合物 (3) 的制备级制备
     在空气下向 30℃加套和 300rpm 搅拌的 500mL 3 颈烧瓶中添加 100mL dH2O 和 2.0mL 在水中的 25wt％八氢环戊 [c] 吡咯溶液 (0.5g 底物 )。 用浓 H3PO4 将 pH 调节至大约 7.8， 得到 无色的均匀溶液。 向此溶液中添加 0.2mL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Novozyme “Catalyzyme 101) 和 0.25gSEQ ID NO 36 的多肽的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 3 的方法制备 )。反应 的 pH 开始立即降低并且经由受反馈控制添加在水中的 25wt％八氢环戊 [c] 吡咯溶液来将 pH 维持在 pH 7.7。2 小时之后， 再添加 0.25g 单胺氧化酶粉末。(3aR， 6aS) 八氢环戊 [c] 吡 咯的二聚体开始从反应物中沉淀并且在实验持续期间反应混合物变为白色浆液。又 2 小时 ( 共 4 小时 ) 之后， 用约 0.6mL/ 分钟的氧气吹扫顶空， 并且在实验持续期间维持氧气吹扫。 24 小时的总反应时间之后， 再添加 0.5g 单胺氧化酶。48.5 小时的总反应时间后， 添加了共 32.3mL 在水中的 25wt％八氢环戊 [c] 吡咯溶液 ( 反应的总底物为 8.58g)。将反应混合物 转移到配备有短径蒸馏头的 500mL 单颈烧瓶中并将装置放置于加热套中。在加热加热套至 160℃之后， 二聚体开始蒸汽蒸馏到浸泡在冰浴中的接收烧瓶中。 汽相的温度为约 96℃。 约 30 分钟后， 已蒸馏出约 1/2 的反应物质并且汽相的温度为约 98℃。在此时停止蒸馏。将在 接收烧瓶中的白色固体在水中的悬浮液通过粗烧结漏斗 (coarsefritted funnel) 过滤并 容许白色固体空气干燥 2 小时， 得到 7.17g(84％产率 ) 的 (3aR， 6aS) 八氢环戊 [c] 吡咯二 聚体。
     实施例 26 ： 在静态空气下单胺氧化酶催化八氢环戊 [c] 吡咯去对称化为 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯及其相应二聚体 ； 经由蒸汽蒸馏的产物分离
     向 20℃加套和 300rpm 搅拌的 3-L 3 颈烧瓶中添加 500mL dH2O 和 20mL 在水中的 25wt％八氢环戊 [c] 吡咯溶液。用浓 H3PO4 将 pH 调节为大约 7.6， 得到无色的均匀溶液， 向 此溶液中添加 2.0mL 黑曲霉过氧化氢酶悬浮液 (Novozyme “ ；Catalyzyme 101” ) 和 5.0g SEQ ID NO ： 16 的多肽的单胺氧化酶粉末 ( 通过实施例 3 的方法制备 )， 得到浅黄色溶液。以大 约 0.2L/ 分钟的干燥空气吹扫容器的顶空。经由受反馈控制以 20-100μL 逐份添加在水中 的 25wt％八氢环戊 [c] 吡咯溶液来将反应的 pH 维持在 7.5。(3aR， 6aS) 八氢环戊 [c] 吡咯的二聚体开始从反应物中沉淀并且反应混合物变为白色浆液。在已添加了 380mL 在水中的 25wt％八氢环戊 [c] 吡咯溶液之后， 经由蒸汽蒸馏 ( 头温度仍为约 98℃ ) 从反应混合物中 分离产物。接收罐含有 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯二聚体在水中的悬 浮液。 添加 1.1-1.2 当量的浓 HCl 至接收罐中分解二聚体， 并得到盐酸 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯在水中的均匀溶液。此溶液直接用于在实施例 27 中制备 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 腈。
     实施例 27 ： (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 腈的制备
     将实施例 26 中制备的盐酸 (3aS， 6aR)-1， 3a， 4， 5， 6， 6a- 六氢环戊 [c] 吡咯的酸性 水溶液冷却至 0℃并以 300rpm 搅拌。 向 0℃的冷冻溶液中以 3mL/ 分钟添加在 100mL dH2O 中 的 50g NaCN( 氰化物对盐酸盐溶液的中和原位产生 HCN)。在开始 NaCN 添加后 2 小时， 添加 1000mL 甲苯 ( 在冰浴中预冷的 )， 得到两相混合物， 向此两相混合物中以 10mL/ 分钟添加饱 和 K2CO3 溶液直到水相的 pH 达到 9.8。 然后使用插管移除下层水相， 并在弃掉之前用漂白剂 ( 破坏剩余的氰化物 ) 处理。在室温下 ( 约 21℃ ) 将上层有机悬浮液 / 乳液在大约 15 分钟 内通过 545 的 20g 床 ( 约 1/4” 高 × 约 3” 直径 ) 过滤， 得到约 1000mL 无色有机相 和约 300mg 黄色水相以及大约 100mL“残相 (rag phase)” ( 位于上层有机相和下层水相之 间的中间层 )。 用甲苯 2×100mL 冲洗 垫。 在分液漏斗中合并溶液并排出水相和残层 (rag layer)， 并用漂白剂处理以便弃去。从有机相中取出小份的有机溶剂并蒸发至干燥。 1H-NMR(300MHz， CDCl3) 分析显示 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 腈 ( “反式” ) 及其 1 1R 差向异构体 ( “顺式” ) 以约 30 ∶ 1 比率存在 ( H-NMR(300MHz， CDCl3) 谱 ： δ3.95(d， J＝ 6.6， 顺式氨基腈次甲基 H)， 3.62(d， J ＝ 1.2 ； 反式氨基腈次甲基 H)， 3.15(m， 1H)， 2.71(m， 2H)， 2.62(m， 1H)， 1.63-1.92(m， 3H)， 1.55(m， 1H)， 1.22-1.45(m， 3H))。 将有机相冷却至大约 0℃并用 250mL 浓盐酸 ( 在冰浴中预冷 ) 萃取两次， 然后出现清楚和立即的相分离。( 由于 萃取是放热的， 所以有必要预冷萃取溶液。溶液的温度由约 4℃升至约室温 )。将合并的含 有盐酸 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 腈的浓 HCl 提取物 ( 共大约 600mL) 合并并 直接用于在实施例 28 中制备盐酸 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸。
     6.1 实施例 28 ： 盐酸 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸的制备
     将来自实施例 27 的盐酸 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 腈溶液加热至回 流持续 24 小时， 这之后蒸发掉大约 300mL 水 /HCl 并将剩余溶液冷却至大约 50-60℃。向 此温溶液中添加 500mL 甲苯并将剩余的水 ( 大约 100-120mL) 作为甲苯共沸物蒸馏掉。在 移除全部的水之后， 将所得的棕色固体和浅黄色甲苯的粘浆悬浮液冷却至室温 ( 约 21℃ )。 在过滤漏斗上收集固体并用甲苯冲洗 (2×200mL)。 将褐色固体空气干燥 2 小时并在真空下 进一步干燥过夜， 得到与 NH4Cl 副产物 1 ∶ 1 混合的 159g( 自八氢环戊 [c] 吡咯的总体产 率为 72％ )) 的盐酸 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸。
     溶解于 D2O 中的盐混合物的 1H-NMR 显示了大约 17 ∶ 1 的反 / 顺异构体 (1S/1R) 比 率。(1H-NMR(300MHz， D2O) 谱 ： δ4.32(d， J ＝ 5.5 ； 顺式氨基酸次甲基 )， 3.85(d， J ＝ 2.3 ； 反式氨基酸次甲基 )， 3.50(m， 1H)， 3.65-3.88(m， 3H)， 1.20-1.80(m， 6H))。
     6.2 实施例 29 ： 由盐酸 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸制备 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸叔丁酯草酸 1 ∶ 1 盐。
     步骤 1 ： 向 配 备 有 磁 力 搅 拌 棒 的 1650mL 厚 壁 玻 璃 耐 压 瓶 (Ace Glass， Inc.，8648-157) 中装入在实施例 28 中制备的 75g(306.9mmol) 盐酸 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸 / 氯化铵混合物、 375mL 二氯甲烷和 497mL 乙酸叔丁酯。在环境温度下 ( 约 21 ℃ ) 剧烈搅拌所得混合物以破坏大的聚集物， 得到搅拌无阻的悬浮液 (free-stirring suspension)。使用盐水 - 冰浴将此悬浮液冷却至 0℃的内部温度并在 15 分钟内逐滴添加 75.4mL(1162mmol) 甲磺酸， 在此期间将内部温度升至 5℃。密封耐压瓶， 并在 18 小时内容 许反应混合物在剧烈搅拌下升温至环境温度 ( 约 21℃ )， 在此期间反应混合物变为在琥珀 色溶液中的白色无机盐悬浮液。将混合物在冰浴中冷却并仔细将耐压瓶通气并开盖。将混 合物转移到 3L 烧瓶中并边搅拌边在冰浴中冷却。在 35 分钟内添加 400mL 在水中的 50％ ( 重量 ： 重量 )NaOH 至混合物中， 同时保持其温度低于 20℃。停止搅拌并容许分相。将有 机相 ( 约 850mL) 移入单独的容器中。用 375mL 二氯甲烷萃取剩余水相和残层 (pH 13， 约 800mL)。 合并有机相 ( 约 1250mL) 并用水 (2×225mL) 洗涤。 过滤所得有机相以移除残层和 任何不溶性材料， 通过旋转真空蒸发移除任何溶剂， 得到 48.3g 深琥珀色油。该油的 1H NMR 谱显示为 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸叔丁酯。
     根据相同程序进行的第二次制备产生 50.6g 反式 -(1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸叔丁酯油。
     步骤 2 ： 将来自根据步骤 1 的两次制备的 97.9g(463.3mmol)(1S， 3aR， 6aS)- 八氢 环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸叔丁酯溶解在 750mL 乙酸叔丁酯中并装入配备有顶置式机械搅拌装 置、 温度计、 添加漏斗和回流冷凝器的 3L 四颈烧瓶中。在环境温度 ( 约 21℃ ) 下搅拌的同 时， 在 37 分钟内逐滴添加 44.0g(488.6mmol) 草酸在 750mL 2- 丙醇中的溶液， 将混合物的 温度升至 31℃。在添加约 50mL 草酸溶液之后固体开始沉淀， 并且在添加 450mL 之后得到 粘稠的悬浮液。添加 500mL 草酸盐溶液后， 将沉淀的固体再溶解， 得到深黄色溶液。在添加 600mL 草酸溶液之后固体开始迅速再次沉淀并且持续直到草酸添加结束。然后将此悬浮液 加热至 78℃， 得到稀悬浮液， 容许其边搅拌边被动地冷却至环境温度 ( 约 21℃ )。自冷却 开始后 16 小时， 通过过滤收集沉淀的固体并用异丙醇 (450mL)、 乙酸异丙酯 (450mL) 和甲 基叔丁基甲醚 (450mL) 连续洗涤。在真空炉 (30℃， 25″真空， N2 气流 ) 中干燥固体， 得到 为稠密的褐色自由流动粉末的 118.1g(1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸叔丁酯 草酸 1 ∶ 1 盐 ( 自盐酸 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸的产率为 64％ )( 通过 GC 分析为 99.7％纯度 )， 其表现出 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸叔丁酯草酸 1 (1 ∶ 1) 盐的预期 H-NMR 谱。
     (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸叔丁酯草酸 (1 ∶ 1) 盐的重结晶 ： 将 来自上面步骤 2 的褐色粉末 (118.1g， 391.9mmol) 和异丙醇 (1950mL) 装入配备有机械搅拌 装置、 温度计和回流冷凝器的 3L 四颈烧瓶中。将悬浮液搅拌并加热至 74℃至将盐完全溶 解， 得到黄色溶液。减慢搅拌并容许溶液被动地冷却至环境温度 ( 约 21℃ )。自冷却开始 20 小时后， 通过过滤收集沉淀的固体并用异丙醇 (1L)、 乙酸异丙酯 (1L) 和甲基叔丁基甲 醚 (1L) 连续洗涤。在真空炉 (40℃， 28″真空， N2 气流 ) 干燥固体， 得到微细米白色针状的 110.45g(1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸叔丁酯草酸 1 ∶ 1 盐 ( 自盐酸 (1S， 3aR， 6aS)- 八氢环戊 [c] 吡咯 -1- 羧酸的产率为 59.7％ )， 通过 GC 分析为 99.9％纯度 )。手性 GC 分析仅显示了期望的 (1S， 3aR， 6aS)- 立体异构体。未检测到其 (2S)- 差向异构体。
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