酶减少来自含醛产品中醛的用途 发明领域 本发明涉及从含甲醛制品和从用所述制品处理的产品中酶促除去甲醛。
发明背景
甲醛 ( 出于方便目的， 下文中常称作 “FA” ) 是一种由工业广泛用来制造建筑材料 和众多家用产品的重要化学品。FA 例如用于纺织工业中抗皱整理， 用于木材加工业中生产 和涂覆粗纸板并且用于化学工业中生产合成树脂如酚醛塑料或氨基塑料。 由于其高度挥发 性， FA 在生产过程期间释放至空气中并且认为对健康和环境造成重大影响。
FA 具有四项基本用途 ： 作为树脂生产中的中间体 ； 作为工业化学品生产中的中间 体； 作为杀生物剂 ； 和作为终端消费品 (end-use consumeritem) 的制品中的组分。树脂制 造占总消耗量的约 65％。 约三分之一用于合成大量化学衍生物， 包括季戊四醇、 六亚甲基四 胺和丁二醇。2％用于织物处理并且少量的 FA 作为防腐剂或杀生物剂在消费品和工业产品 如化妆品、 洗发剂和胶水中存在。最大数量的 FA 用于与脲、 蜜胺、 萘磺酸盐和苯酚并且在较 少程度上与它们的衍生物产生缩合物 ( 即树脂 )。这些树脂的主要部分用于产生粘合剂和 填充性树脂， 所述的粘合剂和填充性树脂用于制造刨花板、 胶合板和家具。 这些缩合物也用 于产生可固化模塑材料 (curable molding material) ； 用作表面涂料的原料和用作控释氮 肥。它们也作为纺织、 皮革、 橡胶和水泥工业中的辅料使用。其他用途包括绝缘材料、 砂纸 和制动衬片中铸造用砂、 褐块石棉和玻璃绒毡的粘合剂。极少量的脲 -FA 缩合物用于泡沫 树脂的制造中， 其中所述的泡沫树脂用于采矿领域和用于建筑物以及运输车辆的绝缘中。
一些基于 FA 的产品含有过量的未反应 FA， 所述的未反应 FA 可以从产品释放或通 过后继水解释放。一个实例是脲 -FA 树脂。脲 -FA 树脂是实际上代表一整类相关制品的 通用名称。约 60％的脲 -FA 树脂产量由其中该树脂用作胶的刨花板和胶合板制造业消耗。 脲 -FA 树脂也用于装饰性层压板、 纺织品、 纸张和铸造用砂模中。
最后， FA 树脂用来处理纺织品以赋予衣物抗皱性。树脂或化学整理在大多数情况 下是现代纺织品生产的终末阶段。目的是将由机械和化学处理的漂白、 染色或印花的织物 转变成适于销售的状态。最重要的工艺之一是由棉、 其他纤维素纤维及它们与合成纤维的 混纺物 (blend) 组成的机织物和针织物的耐洗整理 (washfast finishing)。
起初， 开发树脂整理剂以改善粘胶的常用织物的收缩。这些化合物通常衍生自甲 醛和脲。 为改善棉在纺织品市场上的竞争性， 已经开发了基于甲醛、 脲和乙二醛的杂环交联 剂并且它们一般用于易于护理和无皱整理。由于疑似在人类中有害， 不得不使产品中和工 业过程中的 FA 水平尽可能地低。
现有技术公开了目的在于除去 FA 的多项技术， 其中所述的 FA 例如是从产品释放 时或直接从如上文所介绍的熟知和广泛使用的树脂释放时存在于空气中的 FA。美国专利 5,352,274 公开了利用多个波纹状基板的空气滤器， 其中所述的波纹状基板被堆叠或贴紧 并且具有用于吸附杂质如 FA、 乙醛和丙烯醛的截留碳尘。 此项技术提供了物理吸附 FA 分子 但未通过化学或生物化学反应降解的方法。US 5,830,414 公开了用活性小分子如强酸、 强 碱或强氧化剂处理碳纤维。 这些化学品仅可以用来处理具有高度化学抗性的纤维如活性碳
纤维。另外， 如此处理过的纤维对操作潜在有害。在 JP2001340436 中描述了甲醛降解酶在 空气滤器中的用途。
就纺织工业和建筑材料而言， FA 还原剂不应当不利地影响织物特性， 如手感、 收缩率、 强度保持和色调或白度或者刨花板的机械性能。并且， 它当然必须是在生产中 使用时经济并且在合理的水平上有效。在纺织工业中， 具有活性亚甲基的化合物已经用 作 FA 还原剂以减少从耐久压烫处理的织物中释放的 FA 的量， 如 Textile Chemist and Colorist， 第 16 卷， 第 12 期， 第 33 页， 1984 年 12 月 ( 由美国纺织化学师与印染师协会 (AmericanAssociation of Textile Chemists and Colorists) 发表 ) 所述。含有活性亚 甲基氢的 FA 还原剂也可以添加至含有脲 / 甲醛或蜜胺 / 甲醛树脂的涂层组合物以降低甲 醛浓度 ( 例如， 美国专利 5,795,933 中描述 )。另外， 已知脲及其衍生物的添加清除甲醛。
现有技术未曾公开这样的 FA 还原剂， 它们有效减少释放的 FA 至目前希望的低水 平而未不利影响待用所述树脂处理的材料的特性。目前， 在耐久压烫整理组合物 (durable press finishing composition) 中最广泛使用的 FA 还原剂是多元醇， 如二甘醇和山梨醇， 并且在刨花板的制造中最广泛使用的 FA 还原剂是含氮化合物如脲、 蜜胺、 二嗪、 三嗪和胺 化合物 ( 美国专利号 4,559,097)。 但是， 化合物如这些化合物在降低 FA 水平以产生目前希 望的低水平方面不是充分有效。另外， 它们仅结合 FA 并且不催化它降解。另外， 一些甲醛 清除剂如脲延缓织物交联剂的反应性， 从而降低它们的效率。 甲醛歧化酶 ( 此后称作 “FDM” ) 活性首先由 Kato 和合作者在 1983 年描述 (Kato 等人， 1983， Agric.Biol.Chem.， 47(1)， 第 39-46 页 )， 但是直至 1995 年才鉴定到相应的基 因 (Yanase 等人 1995， Biosci.Biotechnol.Biochem.， 59(2)， 197-202)。用于重组产生和 纯化可溶性 FDM 的首个方案已经于 2002 年发表 (Yanase 等人， 2002， Biosci.Biotechnol. Biochem.， 66(1)， 85-91)。FDM(Hasegawa 等 人， 2002， Acta Crystallogr.， Sect.A， 58， C102-C102) 和其他相关酶的晶体结构自 2002 年以来是可获得的 (Tanaka 等人， 2002， Journal of Molecular Biology， 324， 519-533)。
发明概述
因此， 作为本发明基础的技术问题是提供有效方法和手段以降低来自例如纺织或 建筑工业中用来处理多种材料的制品中的 FA 含量， 克服现有技术的缺点。该问题由本发明 的主题解决， 即， 发明人已经惊讶地发现用来处理此类材料的树脂中的甲醛含量可以使用 催化甲醛降解的酶有效地降低。
此外， 本发明描述了 FDM 突变体的设计、 表征和晶体结构， 其中所述的 FDM 突变体 具有针对甲醛的改善特异性、 针对乙醛的增强活性和提高的热稳定性。 特别地， 与野生型蛋 301 白相比， FDM I L 突变体对甲醛显示提高的活性并且是更为热稳定的。这种酶可以轻易地 通过发酵以高产量产生并且制剂为喷雾干燥的粉剂。
因此， 本发明的一个目的涉及催化甲醛降解的酶制剂用于降低含甲醛制品中甲醛 含量的用途。
在一个优选的实施方案中， 酶制剂含有包含 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列的酶或其 变体。在又一个实施方案中， 该酶是来自细菌菌株的甲醛歧化酶 (FDM)， 优选地是 E.C 分 类 EC 1.2.99.4. 或 EC 1.2.1.46. 的甲醛歧化酶， 其衍生自恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida) 菌株。
在一个特别优选的实施方案中， 酶制剂含有包含 SEQ ID NO ： 8 或 SEQID NO ： 10 的 氨基酸序列的酶。
在又一个优选的实施方案中， 所述制品是树脂。该树脂可以是用于织物的交联剂 或用来生成聚合物分散体的高分子分散剂。在一个优选的实施方案中， 交联剂用于含有纤 维素纤维如棉或粘胶纤维或其混合物和与合成纤维的混纺物的织物。
所得的聚合物分散体适于处理材料例如构筑或建筑材料、 皮革和兽皮、 纤维板、 刨 花板、 胶合板和 / 或毛毯和适于涂覆应用或造纸。
在另一个实施方案中， 本发明涉及用于降低含甲醛制品中甲醛含量的方法， 包括 使该制品与催化甲醛降解的酶制剂接触。
本发明也涉及用于降低织物中甲醛含量的方法， 包括用催化甲醛降解的酶制剂接 触该织物。此外， 它涉及包含织物用交联剂或高分子分散剂和催化甲醛降解的酶制剂的制 品。
本发明的其他实施方案涉及密码子优化的编码歧化酶的核酸、 含有该核酸的载体 和表达宿主。
另外， 本发明涉及编码新 FDM 变体的分离的核酸， 所述 FDM 变体的氨基酸序列， 以 及其具体用途。
附图描述
图1： 几种基于甲醛的交联试剂。(A) 脲 -FA、 (B) 蜜胺 -FA、 (C) 二羟甲基二羟基 亚乙基脲 (DMDHEU)。
图2： 通过 HPLC 确定的 FDM、 FDM I301L、 FDM F93A 和 FDMI301L/F93A 的乙醛歧化初速 度 (50mM K2HPO4pH 8， 100mM KCl 中的 20mM)。酶浓度 50μg/mL。
图3： 通过 HPLC 使用 FDM I301L 变体， 甲醛 ( 上图 ) 和乙醛 ( 下图 ) 随时间的酶促 转化。反应混合物以 30 分钟间隔历经 2 小时分析。反应以 50mMK2HPO4( 对于甲醛， pH 7.3 并且对于乙醛， pH 8)， 100mM KCl 和 20mM 醛进行。 酶浓度对于乙醛是 50μg/mL 并且对于甲 醛是 2.4μg/mL。保留时间甲醛 ： 16.6 分钟 ； 甲酸 ： 17.5 分钟 ； 甲醇 ： 22.9 分钟 ； 乙醛 ： 21.2 分钟 ； 乙酸 ： 18.9 分钟 ； 乙醇 ： 25.2 分钟。产物等摩尔生成。通过 RI 检测。 301
图4： FDM I L 和 FDM I301L/F93A 的温度 - 活性曲线。底物 ： 乙醛 301
图5： FDM 和 FDM I L 的温度 - 活性曲线。底物 ： 甲醛 301 93
图6： 以 FDM I L/F A 突变体的电子密度图所示的野生型 Phe 93。
图7： 与甲醛 (FA) 复合的野生型 FDM 的活性部位的特写图
图8： 与甲醛 (FA) 复合的 FDM I301L 的活性部位的特写图
图9： 与乙醛 (AA) 复合的 FDM I301L/F93A 的活性部位的特写图。
序列描述
SEQ ID NO ： 1
甲醛歧化酶的核酸序列， Genebank 登录号 L25862(CDS 323..1522)
SEQ ID NO ： 2
甲醛歧化酶的蛋白质序列， Genebank 登录号 L25862
SEQ ID NO ： 3
来自恶臭假单胞菌 F61 的 FDM 的优化 DNA 序列 (1197bp)SEQ ID NO ： 4 pDHE-FDM 的核苷酸序列 SEQ ID NO ： 5 pAgro 的核苷酸序列 SEQ ID NO ： 6 pHSG 的核苷酸序列 SEQ ID NO ： 7 甲醛歧化酶 Ile-301-Leu 的核酸序列 SEQ ID NO ： 8 甲醛歧化酶 Ile-301-Leu 的蛋白质序列 SEQ ID NO ： 9 甲醛歧化酶 Phe-93-Ala/Ile-301-Leu 的核酸序列 SEQ ID NO ： 10 甲醛歧化酶 Phe-93-Ala/Ile-301-Leu 的蛋白质序列 定义应当理解本发明不限于如描述那样的具体方法学、 方案、 细胞系、 植物物种或属、 构建体和试剂。还应当理解本文所用的术语目的仅在于描述具体实施方案， 并且不意图限 制本发明的范围， 本发明的范围将仅受所附权利要求书限制。 必须指出， 如本文中并且所附 权利要求中所用， 单数形式 “一个 (a)” 、 “一种 (an)” 和 “该 (the)” 包括复数指称， 除非上下 文另外明确地指明并非如此。因此， 例如， 对 “一种载体” 的提及是对一种或多种载体的提 及并且包括本领域技术人员已知的其等同物等。术语 “约” 在本文中用来指大约、 大致、 左 右和在……范围内。当术语 “约” 与一个数字范围联合使用时， 它通过扩展界限值高于和低 于所述数值而修饰该范围。通常而言， 术语 “约” 在本文中用来通过 20％、 优选 10％之上或 之下 ( 更高或更低 ) 变异而修饰高于和低于所述值的数值。如本文中所用， 用语 “或” 意指 特定表单的任何一员并且还包括该表单的成员的任意组合。
术语 “甲醛” 或 “FA” 是指通式 CH2O 的化合物， 其具有 CAS 编号 50-00-0。它也由 技术人员称作福尔马林 (formalin)、 蚁醛 (methylene oxide)、 甲醛 (methyl aldehyde)、 甲 醛 (methanal)、 HCHO、 甲醛 (formic aldehyde)、 甲醛 (oxomethane)、 福尔马林 (formol)、 甲 醛 (oxymethylene)、 morbicid、 veracur、 甲二醇、 福尔马林 40、 BFV、 fannoform、 formalith、 FYDE、 HOCH、 karsan、 lysoform、 superlysoform、 methan 21。在纯形式下， 甲醛是气体， 但 是经常在用水稀释后作为水合物 HO-(CH2O)n-H( 称作甲二醇 (methandiol)) 以液体形式使 用。甲醛的水溶液称作福尔马林。它是一种无色、 高度可燃液体或气体， 具有百万分之一份 (ppm) 时可觉察的刺激气味。为本发明的目的， 也包括甲醛混合物 ( 例如与水、 丙酮、 苯、 二 乙醚、 氯仿和乙醇的混合物 )。由本定义包括的甲醛聚合物包括低和高分子量聚合物， 特别 是低聚甲醛以及直链和环状聚甲醛。
术语 “乙醛” 或 “AA” 是指通式 CH3CHO 的化合物， 其具有 CAS 编号 75-07-0。它也 由技术人员称作醋醛 (ethanal) 并且是一种具有刺激性、 窒息性气味的无色液体， 其稀释 时略有果香味。乙醛是植物和动物有机体代谢中的中间体， 在所述代谢中可以少量检测到 乙醛。较大量的乙醛干扰生物过程。作为醇发酵过程中的中间体， 乙醛以微小量存在于全部酒精饮料中， 如啤酒、 葡萄酒和烈酒。也已在植物汁液和精油、 焙烘咖啡和烟草烟雾中检 测到乙醛。在较高浓度 ( 直至 1000ppm)， 乙醛刺激黏膜。空气中乙醛的感知限处于 0.07 和 0.25ppm 之间的范围内。在此浓度， 乙醛水果气味明显。在暴露于 25 和 50ppm 浓度 15 分钟 后， 已经观察到结膜刺激作用， 但是在暴露于 200ppm 乙醛 15 分钟后， 已经报道了短暂结膜 炎和对呼吸道的刺激作用。
术语 “丙酮醛” 指通式 (CH3-CO-CH ＝ O) 的化合物， 其具有 CAS 编号 78-98-8(Kato 等 人， 1983， Agric.Biol.Chem.， 47(1)， 第 39-46 页 )。 它 也 由 技 术 人 员 称 作 丙 酮 醛 (pyruvaldehyde)、 2- 氧代丙醛 (2-oxopopanal)、 2- 氧代丙醛 (2-oxopropionaldehyde)， 并 且是几条代谢途径的副产物。
“制品 (formulation)” ， 如本文中所用， 意指特定公式和 / 或配方制造的化学组合 物。因此， 它区别于天然存在的含 FA 源。该制品通过采用 FA 添加来制造。在一些情况下， 该制品也称作 “FA 缩合物” 。
如本文中所用， 短语 “树脂” 意指随后会发生反应以形成高分子量聚合物或交联功 能高分子链 ( 如纤维素 ) 的低分子量物质。特别地， 术语树脂指 “合成树脂” ， 其中将所述的 合成树脂定义为由本身没有树脂特征的充分定义的反应物 ( 包括甲醛 ) 之间受控化学反应 如聚加成反应或缩聚反应而产生的树脂。 合成树脂也可以意指通过聚合不饱和单体所获得 的树脂。该术语包括 (i) 烃树脂， 即， 从煤焦油、 石油和松节油流中通过聚合作用产生的合 成树脂。 这些树脂如天然树脂那样使用， 例如， 与其他聚合物组合以向材料赋予特定特性如 粘着性、 流动性和硬度， 和 (ii) 在甲醛存在下主要通过加聚和缩聚所获得的合成树脂， 它 们是更高分子量塑料合成过程中的中间体。 此类树脂的实例和优选实施方案在下文更详细 地公开。
如本文中所用， 术语 “酶制剂” 意图涵盖处于任意纯度水平的任意酶制剂 ( 无论怎 样获得 )( 包括使用表达该酶的宿主即大肠杆菌 (E.coli)， 只要该制剂是有酶促活性的。 本 发明的酶制剂包括显示多种不同比活性的制剂， 并且以带有一种或多种载体的混合物中或 多或少粗制的酶提取物形式便利地使用。
如本文中所用， 术语 “交联剂” 或 “交联物 (crosslinker)” 意指如上文定义的含 FA 树脂， 其可以用来交联织物中的纤维素分子以特别对纤维素织物赋予抗皱性和耐久压烫特 性。此类交联剂的实例和优选实施方案在下文更详细地公开。
如本文中所用， 术语 “织物” 或 “织物 (fabric)” 意指从天然织物如黄麻纤维、 剑麻、 苎麻纤维、 大麻和棉以及多种合成纤维如粘胶纤维、 人造丝、 纤维素酯、 乙烯基树脂纤维、 聚 丙烯腈及其共聚合物、 烯烃如乙烯、 聚酰亚胺或尼龙型的聚合物和共聚合物、 聚酯等制成的 产物和物品。所用的织物可以是具有单一组成或纤维混合物的那些织物。
术语 “高分子分散剂” 指在水中轻易可溶解的高分子电解质。 最常见的代表是碱金 属聚碳酸盐、 聚磺酸盐或聚磷酸盐， 通常是钠盐。 优选的分散剂通过芳香族化合物与甲醛缩 合来产生。芳香族磺酸与甲醛的缩合产物的用途是极广泛的。一般而言， 它们是基于萘磺 酸盐、 蜜胺磺酸盐或苯酚或其衍生物的阴离子甲醛树脂。其他的高分子分散剂包括基于阴 离子主链和非阴离子侧链的接枝聚合物。 因此， 通常， 使用聚羧酸酯作为主链并且使用聚烷 撑二醇作为侧链。 所述高分子分散剂允许降低水硬粘合剂混合物如基于水泥和硫酸钙的体 系中的含水量， 而不分别降低可加工性、 流变学特性。 它们进一步可以用来改善水硬粘合剂(hydraulic binder) 的可加工性或用来增加强度发展。 高分子分散剂在本领域也称作″超 级塑化剂″。此类高分子分散剂也用于织物染色液中以稳定染料分散体。
术语 “变体” 相对于某序列 ( 例如， 多肽或核酸序列如， 例如本发明的转录调节性 核苷酸序列 ) 而言意图指基本上相似的序列。对于包含可读框的核苷酸序列， 变体包括因 为遗传密码的简并性而编码与天然蛋白相同的氨基酸序列的那些序列。 如可以使用熟知的 分子生物学技术鉴定天然存在的等位基因变体， 例如用聚合酶链反应 (PCR) 和杂交技术。 变体核苷酸序列也包括合成衍生的核苷酸序列， 如通过例如使用位点定向诱变法产生的那 些核苷酸序列， 并且对于可读框而言， 编码天然蛋白， 以及编码相对于天然蛋白而言具有氨 基酸置换的多肽的那些核苷酸序列。通常， 本发明的核苷酸序列变体将对 SEQ ID NO ： 1的 核苷酸序列具有至少 30、 40、 50、 60 至 70％， 例如优选地 71％、 72％、 73％、 74％、 75％、 76％、 77 ％、 78 ％至 79 ％、 通常至少 80 ％、 例如、 81 ％ -84 ％、 至少 85 ％， 例如 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％至 98％和 99％核苷酸 “序列同一性” 。 “变体” 多肽意指从 SEQ ID NO ： 2 的蛋白质中通过对该天然蛋白的 N- 末端和 / 或 C 末端缺 失 ( 所谓截短 ) 或添加一个或多个氨基酸 ； 在该天然蛋白中一个或多个位点处缺失或添加 一个或多个氨基酸， 或置换该天然蛋白中一个或多个位点处的一个或多个氨基酸所衍生的 多肽。此类变体可以例如因遗传多态性或因人操作产生。用于此类操作的方法通常是本领 域已知的。 “序列同一性” 指两个最佳比对的 DNA 或氨基酸序列在组分 ( 例如核苷酸或氨基 酸 ) 比对窗口范围内不变的程度。受检序列和参比序列的比对节段的 “同一性分数” 是由 两个比对序列所共有的相同组分的数目除以参比序列节段 ( 即完整的参比序列或参比序 列的较小限定的部分 ) 中组分的总数目。 “％同一性” 是同一性分数乘以 100。用于比对比 较窗口的最佳序列比对是本领域技术人员熟知的并且可以通过工具如 Smith 和 Waterman 的局部同源性算法、 Needleman 和 Wunsch 的同源性比对算法、 Pearson 和 Lipman 的相似性 搜索方法并且优选地通过这些算法的计算机化执行如作为 GCG.RTM.Wisconsin Package. RTM.(Accelrys Inc.Burlington， Mass.) 的部分可获得的 GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 TFASTA 来实施。
术语 “ppm” ( 每百万分之 ... 份 ) 指质量份额并且等同于 “mg/kg” 。
多肽 / 蛋白质
术语 “多肽” 和 “蛋白质” 在本文中可互换地使用并且指由肽键连接在一起的聚合 形式的任意长度的氨基酸。
多核苷酸 / 核酸 / 核酸序列 / 核苷酸序列
术语 “多核苷酸” 、 “核酸序列” 、 “核苷酸序列” 、 “核酸” 、 “核酸分子” 在本文中可互 换地使用并且指任意长度的聚合非分支形式的核苷酸， 所述核苷酸是核糖核苷酸或脱氧核 糖核苷酸， 或这二者的组合。
同源物
蛋白质的 “同源物” 包括这样的肽、 寡肽、 多肽、 蛋白质和酶， 它们相对于所讨论的 未修饰蛋白具有氨基酸替换、 缺失和 / 或插入并且与从中衍生它们的未修饰蛋白具有相似 的生物学活性和功能活性。
缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
插入指将一个或多个氨基酸残基导入蛋白质中的预定位点。 插入可以包含氨基端 融合和 / 或羧基端融合以及序列内插入单个或多个氨基酸。通常， 在氨基酸序列内部的插 入将比 N 端融合物或 C 端融合物小， 为约 1 至 10 个残基级别。氨基端或羧基端融合蛋白或 融合肽的实例包括如酵母双杂交系统中所用的转录激活物的结合结构域或激活结构域、 噬 菌体外壳蛋白、 ( 组氨酸 )-6- 标签、 谷胱甘肽 S- 转移酶 - 标签、 蛋白 A、 麦芽糖结合蛋白、 二氢叶酸还原酶、 Tag·100 表位、 c-myc 表位、 肽 )、 HA 表位、 蛋白 C 表位和 VSV 表位。 置换指蛋白质的氨基酸以具有相似特性 ( 如相似的疏水性、 亲水性、 抗原性、 形成 或破坏 α- 螺旋结构或 β- 折叠结构的倾向性 ) 的其他氨基酸替换。氨基酸置换一般是 单残基的， 但是根据对多肽所设置的功能性约束条件， 可以聚簇， 可以从 1 个至 10 个氨基 酸变动 ； 插入通常是约 1 个至 10 个氨基酸残基级别。氨基酸置换优选地是保守性氨基酸 替换。保守性置换表是本领域熟知的 ( 见例如 Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman andCompany( 编著 ))。
氨基酸置换、 缺失和 / 或插入可以使用本领域熟知的肽合成技术如固相肽合成法 等或通过重组 DNA 操作轻易地进行。用于操作 DNA 序列以产生蛋白质的置换、 插入或缺 失变体的方法是本领域熟知的。例如， 用于在 DNA 的预定位点处产生置换突变的技术是 本领域技术人员熟知的并且包括 M13 诱变法、 T7-Gen 体外诱变法 (USB， Cleveland， OH)、
- 表位、 lacZ、 CMP( 钙调蛋白结合QuickChange 位点定向诱变法 (Stratagene， San Diego， CA)、 PCR 介导的位点定向诱变或其 他位点定向诱变法。
衍生物
“衍生物” 包括这样的肽、 寡肽、 多肽， 其中与天然存在形式的蛋白质 ( 如目的蛋 白 ) 的氨基酸序列相比， 它们包含以非天然存在氨基酸残基置换氨基酸或者添加非天然存 在的氨基酸残基。蛋白质的 “衍生物” 也包括这样的肽、 寡肽、 多肽， 其中与所述多肽的天然 存在形式的氨基酸序列相比， 它们包含天然存在改变 ( 糖基化、 酰化、 异戊二烯化、 磷酸化、 肉豆蔻酰化、 硫酸化等 ) 的氨基酸残基或非天然改变的氨基酸残基。与从中衍生衍生物的 氨基酸序列相比， 该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个 非氨基酸替代或添加 ( 例如报道分子或其他配体 )， 如结合的以促进检测该衍生物的报道 分子， 和相对于天然存在蛋白的氨基酸序列而言， 包含非天然存在的氨基酸残基。 此外， “衍 生物” 也包括天然存在形式的蛋白质与标签肽如 FLAG、 HIS6 或硫氧还蛋白 ( 对于标签肽的 综述， 见 Terpe， Appl.Microbiol.Biotechnol.60， 523-533， 2003) 的融合物。
发明详述
本发明涉及催化甲醛降解的酶制品用于降低含甲醛制剂中甲醛含量的用途。
催 化 甲 醛 降 解 的 酶 是 本 领 域 已 知 的。 例 如， Bystrykh 等 人 (1993)J.Gen. Microbiol.139， 1979-1985 ； Sakai， Y. 等人 (1995)FEMS Microbiol.Lett.127， 229-234 ； 或 Ito 等人 (1994)J.Bacteriol.176， 2483-2491 或 Gonzalez 等人， J.Biol.Chem.， Vol.281， NO.20， 第 14514-14522 页， 2006 年 5 月 19 日描述了可以用于降解 FA 的酶， 如 S- 甲酰谷胱 甘肽水解酶、 甲醛歧化酶、 甲酸甲酯合酶或谷胱甘肽非依赖性甲醛脱氢酶。
属于含锌中等链长的醇脱氢酶家族的酶特别适用于本发明 ( 也参见 Tanaka 等人， J.Mol.Biol.(2002)324， 519-533)。在一个优选的实施方案中， 与常见醇脱氢酶中的辅酶( 作为共底物 ) 区别的吡啶核苷酸 NAD(H) 与该酶紧密但不共价地结合并且充当辅因子。
“紧密地结合” 意指辅因子通过相互作用如离子键、 分子间力、 氢键、 范德华力、 疏 水相互作用与酶结合。由于该辅因子在歧化反应期间循环 ( 相同的酶还原 FA 成甲醇和氧 化 FA 成甲酸 )， 故本发明的方法具有使成本最小化的特有优点， 因为不必持续向反应混合 物提供该辅因子以维持酶活性。
特别适用于本发明用途的是作用于供体的醛或氧化基的氧化还原酶 (E.C 分类 1.2.)。优选具有除 NAD 或 NADP、 细胞色素、 氧、 二硫化物、 铁硫蛋白 (E.C. 分类 1.2.99) 之 外的受体的氧化还原酶。 优选地， 该酶是来自细菌菌株的甲醛歧化酶 ( 下文常称作 “FDM” )， 更优选地是 E.C 分类 EC1.2.99.4. 或 EC 1.2.1.46. 的甲醛歧化酶， 其衍生自恶臭假单胞 菌菌株。该酶在 Kato， N.， 等人 (1983)Agric.Biol.Chem.， 47(1)， 39-46， Yanase， H.， 等人 (1995)Biosci.Biotechnol.Biochem.， 59(2)， 197-202 和 Yanase， H.， 等人 (2002)Biosci. Biotechnol.Biochem.， 66(1)， 85-91 中进一步描述。
在一个优选的实施方案中， 酶制剂含有包含 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列的酶或其 变体。 在一个进一步优选的实施方案中， 酶制剂含有由 SEQ IDNO ： 1 的核酸编码的酶或其变 体。 在一个特别优选的实施方案中， 如下文以更多细节所述， 酶制剂含有这样的酶， 其 包含 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列的变体或衍生物， 其中第 93 位置处的苯丙氨酸和 / 或第 301 位置处的异亮氨酸和 / 或第 337 位置处的甲硫氨酸和 / 或第 127 位置处的苯丙氨酸已 经由任何的其他氨基酸置换。
对于本发明的用途， 酶制剂可以纯化以具有多个纯度水平的情况下或作为未纯化 的提取物使用， 例如作为细菌提取物， 即来自天然产生所需酶的细菌的或作为表达宿主使 用的细菌中的提取物。备选地， 也可以使用正在生长的细胞， 其中所述的细胞包含编码 FDM 的核酸、 携带所述核酸的核酸构建体或载体， 而不包括任何蛋白质纯化步骤。 也可以使用休 眠的或破裂的细胞。 破裂的细胞理解为意指例如通过用例如溶剂处理使之可通透的细胞或 已经通过酶处理、 通过机械处理 ( 例如弗氏压碎器或超声波 ) 或通过另一种方法破裂的细 胞。如此获得的粗提物以有利方式适合本发明的用途。也可以对该过程使用纯化或部分纯 化的酶。可以在该反应中有利使用的固定微生物或酶是同样适合的。当游离的生物或酶用 于本发明方法时， 在提取之前适当地移出它们， 例如通过过滤或离心。
取决于待接触的含 FA 制品， 酶制剂可以以游离 ( 可溶性或固态 ) 或固定的形式 使用。固定的酶意指被固定至惰性支持物的酶。适合的支持材料和固定于其上的酶在 EP-A-1149849， EP-A-1 069 183 和 DE-A 100193773 中公开和在其中所引用的参考文献中 公开。以这种方式， 参考这些出版物的全部公开内容。合适支持材料的实例是粘土、 粘土矿 物如高岭石、 硅藻土、 珍珠岩、 二氧化硅、 氧化铝、 碳酸钠、 碳酸钙、 纤维素粉、 阴离子交换材 料、 合成聚合物如聚苯乙烯、 丙烯酸树脂、 酚醛树脂、 聚氨酯、 聚烯烃如聚乙烯和聚丙烯。支 持材料通常以用于制备所支持酶的精细分开的颗粒形式使用， 优选多孔形式。支持材料的 粒径通常不大于 5mm， 尤其不大于 2mm( 筛目等级 )。类似地， 当使用作为完整细胞催化剂 的 FDM 时， 可以选择游离或固定的形式。支持材料的实例是藻酸钙和角叉菜胶。酶及细胞 也可以用戊二醛直接连接 ( 产生 CLEA 的交联 )。相应和其他的固定方法例如在 K.Drauz 和 H.Waldmann， Enzyme Catalysis in Organic Synthesis2002， 第 III 卷， 991-1032，
Wiley-VCH， Weinheim 中的 J.Lalonde 和 A.Margolin“Immobilization of Enzymes” 中描 述。
待使用的酶量取决于酶制剂的纯度水平。 本发明方法的常见量在每克处理的含 FA 制品 0.1 至 1000 单位之间变动， 优选地在每克处理的含 FA 制品 1 至 500 单位之间、 更优选 地 5 至 100 单位之间、 甚至更优选地 8 至 30 单位之间， 最优选地 9 至 15 单位之间变动。一 个单位定义为每分钟催化 1μmol 甲酸形成所需要的酶量。 纯化的 FDM 具有约 100-200U/mg 比活性。酶量仅是可以根据反应条件如温度和孵育时间变动的近似值。可以通过开展常规 实验轻易地确定最适酶量。
本发明可以应用于已经用甲醛整饰过的全部制品。 最大类别的含甲醛制品是含有 脲、 蜜胺、 萘和酚的树脂类别及其衍生物如 DMDHEU。喷雾干燥添加剂和流变性调节剂在产 生分散体 ( 如 FA 与酚磺酸或萘磺酸的缩聚物 ) 中使用。其他制品包括绝缘材料、 砂纸和 制动衬片中铸造用砂、 石棉和玻璃绒毡的粘合剂或在制造泡沫树脂中使用的脲 - 甲醛缩合 物。含有甲醛的其他制品包括季戊四醇 ( 主要以原料用于表面涂料中和安全炸药中 ) 和作 为酚 - 甲醛缩合物和安全炸药的交联剂使用的六亚甲基四胺。在化妆品工业中， 甲醛作为 防腐剂用于数百种产品， 例如， 皂类、 除臭剂、 洗发剂和指甲硬化制剂。 本领域也已知使用甲 醛溶液作为鞣皮液防腐剂、 分散体、 作物保护剂和木材防腐剂。另外， 糖工业中需要甲醛来 防止在糖浆回收期间的细菌生长。 因此， 在一个优选的实施方案中， 待与催化甲醛降解的酶制剂接触的含甲醛制品 是树脂。上文给出了树脂、 尤其是合成树脂的一般定义。
优选地， 本发明可以应用于通过加聚和缩聚获得的 FA 树脂。实例包括呋喃树脂、 酮与醛树脂， 如苯乙酮甲醛树脂或丙酮甲醛树脂、 酚树脂如线型酚醛清漆和可熔酚醛树脂、 环氧树脂如液态环氧树脂 (DGEBA)、 基于 DGEBA 的固态环氧树脂、 卤代环氧树脂、 环氧酚醛 清漆树脂、 磺酰胺树脂或苯胺树脂。
例如， 广泛用于胶粘木材的酚树脂是不同酚类化合物和醛类的缩合物。酚类化合 物可以是苯酚本身、 多羟基酚和脂族或芳香族取代的酚。酚类化合物的实例是烷基酚如间 苯二酚、 烷基间苯二酚、 甲酚类、 乙基酚和二甲酚， 并且还有天然来源的酚类化合物如单宁 类、 Cardenol 和强心酚。 酚树脂组合物中的基于甲醛的酚树脂包括间苯二酚 - 甲醛、 酚-间 苯二酚 - 甲醛和单宁 - 甲醛树脂。
在一个特别优选的实施方案中， FA 树脂是氨基树脂， 如脲树脂、 聚氨酯树脂、 蜜胺 树脂、 氨腈和双氰胺树脂。
氨基树脂通常用做粘合剂 ； 填充性树脂 ； 模塑材料 ； 制造表面涂料的原料 ； 纸张、 织物、 皮革和浮选法的辅料 ； 建筑材料的加强物 ； 超塑化剂 ； 玻璃纤维和铸造用砂铸件的粘 合剂 ； 打火机 ； 金刚砂纸 ； 阻燃涂料 ； 防火的易燃物品 ； 用于多种目的的泡沫树脂 ； 砂轮 ； 离 子交换树脂 ； 污水絮凝剂 ； 和微胶囊生产。
如本文中所用， 短语 “粘合剂” 意指将材料固定在一起的胶、 将材料固定在一起的 层压树脂和基质树脂。 胶和填充性树脂是从脲、 蜜胺和 / 或酚与甲醛制得的水质粘合剂。 本 领域已知的胶用于制造木基板材例如刨花板、 中密度纤维板 MDF、 定向刨花板 OSB、 胶合板、 芯板或夹芯板 (sheeting)。填充性树脂用于浸渍纸， 所述的浸渍纸用于木基板材的装饰性 涂层， 例如在家具和层压地板的表面上。填充性树脂用作刨花板、 胶合板、 纤维板和家具工
业中的树脂胶。填充性树脂也用来浸渍装饰性层压制品用纸和用于涂覆木刨花板。
目 前 通 常 在 一 般 用 来 交 联 纤 维 素 分 子 的 称 作 轧 烘 焙 工 艺 (pad-dry-cure process) 的方法中使纺织材料抗皱或免烫。 纤维素的这种交联赋予织物恢复其原始形状和 平滑的倾向。如上文所述， 一些类别的 DMDHEU 树脂已经在过去广泛用作这种工艺中的交联 剂。
因此， 在本发明的另一个实施方案中， 待与催化甲醛降解的酶制剂接触的交联物 是适于整理织物的交联剂。
已经在现有技术中广泛描述了织物整理工业中所用的交联剂 ( 见， 例如， Ullmann 第四版， 第 23 卷 )。本领域技术人员已知的交联剂包括 “自交联” 剂 ( 具有氮原子上的活泼 氢原子 ) 和 “反应物交联” 剂 ( 氮是杂环的部分 )。
脲、 取代脲或蜜胺的多功能羟甲基衍生物是商用易于打理用整理剂的优选交联 剂， 其中所述的多功能羟甲基衍生物通过甲醛与这些化合物反应产生。一个重要类别是由 环状脲衍生物的羟甲基化合物构成 ； 实例是二羟甲基乙撑脲、 二羟甲基丙撑脲和二羟甲基 脲酮 (dihydroxymethylurone)。 非环状化合物如多种烷基氨甲酸酯也是常见的整理剂。 与 纯的脲 - 甲醛化合物相反， 这些整理剂显示形成自交联树脂的微小倾向并且主要与纤维素 反应以使纤维交联。 脲自身的羟甲基衍生物特别地用于人造丝织物。实例包括二羟甲基脲、 N， N” -双 ( 羟甲基 ) 脲、 三羟甲基蜜胺的二甲醚、 脲酮类 (urons) 即四氢 -3， 5- 双 ( 羟甲基 )-4H-1， 3， 5- 氧二氮杂苯 -4- 酮、 环状脲产物、 氨甲酸酯的羟甲基衍生物、 尤其氨甲酸甲酯和氨甲酸 甲氧乙酯。
优选地， 使用通过乙二醛与脲反应产生的二羟乙撑脲的羟甲基衍生物作为易于 打理用整理剂中的交联剂， 例如 WO98/029393 中所述的二羟甲基二羟乙撑脲 (DMDHEU)、 1， 3- 二甲氧基甲基 DHEU 和完全甲基化产物。乙二醛 - 脲型产物的多种修饰法均为商用。已 经甲基化并含有羟基化合物的产品提供羟甲基型的市售易于打理用整理剂的最低甲醛散 出潜能。Ullmann 第四版第 23 卷第 7 章中描述了多种交联物。
由于所描述的交联剂主要用来交联纤维素分子， 故待处理的织物优选地含有纤维 素或纤维素纤维。
本发明适合处理含有至少 10 ％、 优选地至少 20 ％、 至少 30 ％、 至少 40 ％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 至少 80％、 至少 90％、 最优选直到 100％纤维素纤维的纤维状 纤维素材料。实例包括黄麻纤维、 亚麻、 麻布、 大麻、 粘胶纤维、 再生纤维素如人造丝和优选 地棉。纤维素材料可以是机织、 非机织或针织的或处于纤维、 棉短绒、 粗纱、 丝条、 稀纱布或 纸的形式。 纤维状纤维素材料可以完全由棉组成或由与合成纤维如聚酯或尼龙混纺的棉组 成。
如上文所述， 树脂， 特别地蜜胺树脂或任一其他氨基 -s- 三嗪如胍胺广泛地用作 建筑材料或超塑化剂 ( 也称作混凝土液化剂 )。出于这些目的， 所述树脂通常通过与其他 化合物反应进行改性。特别有用的是基于蜜胺、 甲醛和亚硫酸盐的缩合产物 ( 见例如 EP 0 336 165)。
这些聚合物可以在自由基引发剂、 乳化剂和 / 或保护性胶体 ( 此处称作调节剂和 其他添加剂 ) 存在下通过如定义部分中定义的高分子分散剂引发的乳液聚合常规地制备
为分散体。
因此， 在本发明的又一个优选的实施方案中， 树脂是使用来制备聚合物分散体的 含有 FA 的高分子分散剂或 FA- 缩合物。
术语 “聚合物分散体” 指用于建造化学领域的原料。产品包括丙烯酸分散体以及 丙烯酸粉末和苯乙烯 / 丁二烯分散体。它们增强建造化学品、 建筑用粘合剂和密封胶的可 加工性和技术性能。使用高级聚合物分散体和添加物作为建筑涂料原料， 与其他组分组合 以产生即用型产物如油漆、 木染料或织物整饰剂。 特别地， 该术语指含有甲基丙烯酸 (MAS)、 羟甲基甲基丙烯酰胺 (MAMol) 和 / 或羟甲基丙烯酰胺 (AMol) ； 丙烯酰胺、 丙烯酸、 丙烯腈、 丙烯酸酯和苯乙烯之均聚物和共聚物的分散体， 所述的分散体也用作织物涂料印花和 / 或 涂敷中的粘合剂。此类聚合物分散体的进一步的实例和优选实施方案在下文公开。
术语 “涂料印花 (pigment printing)”指片状纺织材料色彩提花 (coloristic patterning) 的方法， 所述方法是本领域的常识并且已经在世界各地长时间实施。 在涂料印 花中， 特定的涂料通常从含水印花浆中连同粘合剂系统一起施加至纤维网并且随后干燥。 用于固化所述优选的合成性树脂粘合剂系统并因而固定所施加着色剂的后续干热处理终 止该印花过程。
此外， 对于作为建筑材料的用途， 缩合产物如亚硫酸盐改性的蜜胺树脂、 萘磺酸盐 与水溶性乙烯基或丙烯酰基聚合物组合。适宜聚合物的实例是醋酸乙烯酯、 丙酸乙烯酯、 月桂酸乙烯酯、 氯乙烯、 偏二氯乙烯、 具有 3 至 18 个 C 原子的直链或支链乙烯酯、 聚 ( 乙烯 醇 )、 聚 ( 乙烯硫酸酯 )、 丙烯酰基和甲基丙烯酰基单体、 特别是酯类的产物， 也是可能以其 均聚物、 共聚物、 四聚物形式和作为接枝聚合物存在的苯乙烯和乙烷、 马来酸 - 苯乙烯共聚 物。
应用此类聚合物分散体的优选领域是油漆、 装饰性和保护性涂料和漆、 建筑用化 学品， 作为水泥砂浆中的添加物和填料、 造纸用辅助材料和纸张涂料、 织物涂料和塑料着色 剂。
而且， 本发明的发明人已经建立了不同方法以根据用途应用催化降解 FA 的酶制 剂。
因此， 本发明的另一个目的涉及用于降低含甲醛制品中甲醛含量的方法， 包括使 该制品与催化甲醛降解的酶制剂接触。
“接触” 可以在该制品的预期使用之前或期间发生。接触可以意指添加至和 / 或 ( 如果含 FA 制品为液体 ) 混合或 ( 如果该制品是相当粘稠或坚固的材料 ) 施加至某表面。
在一个实例中， 酶制剂可以直接地添加至刨花板制造中所用的脲 - 甲醛树脂或用 水稀释并在刨花板压制之前喷洒到其表面上。 应用或添加的酶取决于添加至刨花板的树脂 的性质和固化条件。但是， 可以通过测试多种酶量并且评价由板材释放的甲醛的量来确定 任意具体情况的恰当量。
本发明人也已经发现当直接应用催化甲醛降解的酶制剂至织物本身时可以降低 织物中的甲醛含量。
因此， 本发明的另一个目的涉及用于降低织物中甲醛含量的方法， 包括将催化甲 醛降解的酶制剂接触该织物。
优选地， 织物是已经在湿条件和干燥条件下通过用如上文所述的整理剂如乙二醛树脂、 福尔马林、 脲甲醛树脂、 二羟甲基脲、 脲甲醛的二甲醚、 蜜胺甲醛树脂、 环状乙撑脲甲 醛树脂例如二羟甲基脲、 三嗪 - 甲醛树脂、 三嗪酮甲醛树脂等加热、 干燥和固化而赋予抗折 和抗皱特性的 “交联织物” 。
简而言之， 用如上文所定义交联剂处理的织物以如实施例部分中所描述的酶制剂 浸渍。可以用湿或干燥的织物实施与酶制剂孵育之后残留 FA 的检测。优选地， 用湿织物进 行。
本发明中所指的含 FA 制品显示约 1 至 50000ppm 的甲醛浓度。常见量是 10 至 5000ppm。本发明的方法允许明显降低甲醛含量。
适当地， 与制品， 即与该酶制剂不接触的成品， 相比较， FA 含量降低了 10、 20、 30、 40、 50、 60 至 70％， 例如优选 71％、 72％、 73％、 74％、 75％、 76％、 77％、 78％至 79％， 通常至 少 80 ％， 例如 81 ％ -84 ％， 至少 85 ％例如 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94％、 95％、 96％、 97％至 98％和 99％和 100％。
确定残留 FA 含量的方法是现有技术中熟知的。甲醛可以通过物理或化学方法定 量地测定。甲醛的纯水溶液的定量测定可以通过测量其比重迅速实施。气相层析和高压液 相色谱法 (HPLC) 也可以用于直接测定。用于测定甲醛的最重要化学方法在 H.Petersen， N.Petri， Melliand Textilber.66(1985)217-222、 285-295、 363-369 中总结。最常使用亚 硫酸钠法。该方法基于甲醛与过量亚硫酸钠反应时所产生碱的定量释放。通过用酸滴定 测定以化学计量方式形成的碱。可以借助气体采样装置测定空气中的甲醛低至 μL/m3 范 围的浓度。Verein Deutscher Ingenieure(VDI) ； 1， Messen Immissionen， Bestimmen der Formaldehydkonzentration nachdem Sulfit-Pararosanilin-Verfahren， Richtlinie VDI 3484， Blatt 1， Düsseldorf 1979 中描述了通过亚硫酸盐 / 副品红法定量 测定空气中的甲醛。 存在用于织物中甲醛释放分析的众多其他检验方法， 如日本 LAW112( 即， 乙酰丙 酮法 )、 AATCC-112( 即， 变色酸法 )、 Shirley I 和 II 方法和其他方法。用于检测织物中 FA 的优选方法是由 “欧盟标准化委员会” 在 EN ISO 14184 第 1 部分和第 2 部分中使用的 LAW112 和 AATCC112 方法。就本发明的方法而言， 可以降低残留甲醛含量至少于 250、 优选 少于 100、 更优选少于 50、 甚至更优选少于 20 并且最优选少于 10ppm。
实施本发明方法所需要的温度范围可以在 10℃至 100℃、 优选 20℃至 40℃、 更优 选 25℃至 35℃之间变动， 最优选在 30℃。本发明的方法通常在 3 和 12 之间、 优选在 5 和 9 之间、 更优选在 7 和 8 之间变动的 pH 条件下实施。最适 pH 值可以通过本领域技术人员熟 知的手段确定和调整。
孵育时间可以根据所选的酶量、 反应温度和制品中的 FA 含量， 以及根据制品本身 的性质变动。通常， 孵育时间是在分钟或小时范围内， 优选地是 5 分钟至 10 小时， 更优选地 是 20 分钟至 5 小时， 更优选地是 30 分钟至 2 小时。最适孵育时间可以由本领域技术人员 根据所处理的产品轻易地确定和调整。
本发明方法可以在常规生物反应器中分批、 半连续或连续地实施。适合的方案
和生物反应器是技术工人熟悉的并且例如在通过引用方式并入本文的ChemieLexikon 第 9 版， Thieme Verlag， 条目标题 “Bioreactors” 或 Ullmann’ s Encyclopedia of Industrial Chemistry， 第 5 版， 第 B4 卷， 第 381ff 页中描述。反应器的运行和工艺方案可以针对想要的 FA 降解反应的具体要求适应于技术人员。如果该方法以分批模式进行， 则在 合成、 聚合、 分离后和任选地纯化该制品之后直接添加酶制剂。在使用 FA 歧化酶成功降解 甲醛之后， 酶可以与该制品分离。备选地， 该酶可以留在此制品中并且根据需要灭活， 例如 通过加热或酸化， 并且条件是这种灭活不有损于此制品。 如果该方法连续地进行， 则酶制剂 优选地固定在可以充填例如至特定柱中的载体上。一般地， 将制品在适合的条件下泵送经 过该柱。为进一步增强 FA 减低效果， 可以依次串联连接几个酶反应器。
为了本发明的目的， 酶制剂可以以本领域技术人员已知的任意形式、 配方和组成 添加。本领域技术人员将轻易理解适用于本发明的酶制剂将取决于几个因素， 包括但不 限于含 FA 制品的精确组成。他们还会理解存在用于配制酶制剂的几种方法。酶制剂可 以使用酶颗粒和 / 或液体制剂的标准方法配制。对与酶颗粒和 / 或酶的液体制剂有关的 步骤的描述存在于 1988 年 Helmut Uhlig， John Wiley and Sons 的 “ 《工业酶及其应用》 (IndustrialEnzymes and their Application)” 中。
适合的酶制剂例如是通过酶溶液的造粒、 挤出、 喷雾干燥、 或冻干可获得的固态酶 制剂以及优选地是酶的浓缩溶液， 其任选地含有稳定剂。 备选地， 处于固态或液态形式的酶 制剂可以吸附于固体载体上和 / 或胶囊化。已经提出用于制备固定化酶类的方法包括底物 结合法、 交联聚合法、 凝胶包含法等。 在一些实施方案中， 当用于本发明的酶制剂在颗粒组合物或液体中使用时， 希望 酶制剂处于包封粒子的形式以保护该酶在贮藏期间免受颗粒组合物的其他组分影响。此 外， 包封也是控制 FA 降解过程期间酶制剂可获得性的手段并且可以增强酶制剂的性能。构 思了在本发明中将使用任意合适的包封材料。包封材料一般包封酶制剂的至少部分。一般 地， 包封材料是水溶性和 / 或水可分散的。简而言之， 酶制剂与化合物如藻酸钠、 琼脂糖或 交联葡聚糖凝胶混合并且随后根据本领域已知的方法沉淀。备选地， 可通过喷雾干燥或挤 出酶制剂实施包封。
所述酶颗粒的保护性包衣材料的实例包括天然材料如糖类、 多糖、 多肽如胶原蛋 白、 白蛋白或明胶、 油、 脂肪酸、 蜡。作为包衣材料， 也包括半合成性材料如化学改性的纤维 素化合物、 淀粉衍生物或合成性包衣材料如聚丙烯酸酯、 聚酰胺。 包衣可以进一步包括通过 聚阳离子和聚阴离子相互作用所生成的聚合电解质络合物。 常见的聚阳离子包括天然化合 物如环磷酰胺 (cytosan) 以及合成性聚合物。
酶制剂可以与化学惰性载体材料或粘合材料一起造粒。载体材料包括硅酸盐、 碳 酸盐或硫酸盐。 粘合材料例如是非交联的聚合物组分如聚丙烯酸酯、 聚甲基丙烯酸酯、 聚乙 烯吡咯烷酮、 多糖。
备选地， 为了保护酶制剂免遭灭活或变性， 添加稳定化合物可能是合适的。 稳定化 合物的实例包括蛋白酶抑制剂， 如硼酸及其衍生物、 氨基醇和低级脂族醇。 酶制剂可以用化 合物如聚酰胺低聚物 (polyamid oligomer) 或高分子组分如木质素、 水溶性乙烯基共聚物 保护免受物理效应或 pH 变动的影响。此外， 抗氧化剂如二硫苏糖醇 (DTT) 是通常使用的酶 稳定剂。
如果催化甲醛降解的酶制剂应当直接并入含 FA 制品中， 则在一些实施方案中要 求酶以干燥的形式存在。如果仅在含 FA 制品的应用期间添加催化甲醛降解的酶制剂， 则酶 制剂可以以液态、 凝胶或糊膏样形式存在。 在本领域熟知的蛋白质纯化和分离方法后， 酶制
剂可以作为浓缩的水溶液、 混悬液或乳液添加。可以用来获得适合酶制剂的溶剂的实例包 括醇类、 烷醇胺或甘醇或二甘醇、 甘油、 山梨醇、 葡萄糖、 糖精。 为了提高黏度， 酶制剂可以含 有一种或多种增稠剂， 也称作溶胀剂。 适合的增稠剂包括例如藻酸盐、 果胶、 淀粉、 糊精或合 成性增稠剂聚碳酸、 聚乙二醇、 聚丙烯酰组合物、 聚酰胺或聚醚。
对于一些制制品， 希望酶制剂已经含于所述制品内， 保持这些制品中 FA 含量尽可 能低。
在一个优选的实施方案中， 本发明的酶制剂包含 (a)0.1-10％的 FA 降解酶， 优选 FDM， 和 (b)1-80％的一种或几种多元醇 ( 甘醇、 甘油、 山梨醇、 葡萄糖、 蔗糖、 聚乙二醇等 ) 和 (c)1-99％的水。
在本发明的另一个实施方案中， 将干 ( 固态 ) 酶制剂添加至固态产品配方。一旦 添加水至该固体制品， 则启动减低 FA 的活性。
因此， 本发明的另一个目的涉及适于织物整理的制品， 该制品包含交联剂和催化 甲醛降解的酶制剂。
酶制剂可以按照类似于已知的降低甲醛剂的方式使用。例如， 酶制剂可以并入包 含 N- 羟甲基交联系统的耐久压烫整理交联剂如 DMDHEU 中。完全或部分地由纤维素纤维组 成的织物可以用耐久压的整理组合物浸轧 (pad)、 泡沫整理或浸渍。 优选地， 该交联剂选择自由蜜胺 -FA、 脲 -FA 或脲 - 乙二醛 -FA 化合物组成的组。
本发明的另一个目的涉及适用于处理建造材料、 特别是水硬粘合剂如水泥、 石膏、 砂浆或贫石灰、 纤维板、 刨花板、 胶合板、 木材、 皮革和 / 或毛毯的制品， 该制剂包含如上文 所述的高分子分散剂和催化甲醛降解的酶制剂。
在一个优选的实施方案中， 聚合物分散剂选自由萘甲醛缩合物、 酚甲醛缩合物、 脲 甲醛缩合物和蜜胺甲醛缩合物组成的组。
可以提供交联剂或聚合物分散剂已经与酶制剂混合或可以提供为试剂盒， 其中将 酶制剂在上文所述的交联剂或聚合物分散体预期用途之前添加至交联剂或聚合物分散体， 旨在降低最终产品的 FA 含量。在一些情况下， 必须优化孵育时间以避免最终产品的过度降 解。
为了本发明的目的， 希望酶易于大量获得。 适当地， 该酶在允许大规模产生异源表 达蛋白质的细菌中表达。 为了优化表达， 即增加所表达酶的产量， 本发明的发明人已经构建 了编码催化甲醛降解的酶的核酸。
因此， 本发明的另一个目的涉及编码催化甲醛降解的酶的分离核酸， 其中该核酸 的序列为了在表达宿主中的表达而进行了密码子优化。
优选地， 表达宿主是大肠杆菌 (Escherichia coli)。
虽然大肠杆菌是通常用来表达催化甲醛降解的酶的细菌宿主细胞的一个实例， 但是其他细菌宿主细胞可以在本发明中用来表达外源 DNA， 所述的细菌宿主细胞包括例 如 埃 希 氏 菌 属 (Escherichia)、 肠 杆 菌 属 (Enterobacter)、 固 氮 菌 属 (Azotobacter)、 欧 文 氏 菌 属 (Erwinia)、 芽 孢 杆 菌 属 (Bacillus)、 假 单 胞 菌 属 (Pseudomonas)、 博德特 菌 属 (Bordetella)、 红 杆 菌 属 (Rhodobacter)、 苛 养 木 杆 菌 属 (Xyella)、 克雷伯氏菌属 (Klebsielia)、 变 形 杆 菌 属 (Proteus)、 沙 门 菌 属 (Salmonella)、 沙 雷 菌 属 (Serratia)、 志 贺 菌 属 (Shigella)、 根 瘤 菌 属 (Rhizobium)、 透 明 颤 菌 属 (Vitreoscilla) 和 副 球 菌
属 (Paracoccus)， 以 及 真 菌 宿 主 细 胞， 包 括 例 如 曲 霉 属 (Aspergillus)、 毕赤酵母属 (Pichia)、 木 霉 属 (Trichoderma)、 汉 逊 酵 母 属 (Hansenula)、 酵 母 属 (Saccharomyces)、 克 鲁 维 酵 母 属 (Kluyveromyces)、 裂 殖 酵 母 属 (Schizosaccharomyces)、 金小孢子属 (Chrysosporium)、 假丝酵母属 (Candida) 和球拟酵母属 (Torulopsis)
Burgess-Brown 等人， Protein Expr Purif.， 2008 年 5 月 ； 59(1) ： 94-102 中充分 描述了用于大肠杆菌中表达的密码子优化的特征和优点。
在一个优选的实施方案中， 该核酸的序列包含 SEQ ID NO ： 3 的序列或其变体。
本发明的另一个目的涉及含有本发明核酸的表达载体。
适合的载体包括噬菌体、 质粒、 病毒或逆转录病毒载体以及人工染色体， 如细菌或 酵母人工染色体。另外， 该术语还涉及靶向构建体， 允许靶向构建体随机或位点定向整合 至基因组 DNA 中。此类靶向构建体优选地包含用于如下文详述的同源或异源重组的长度 足够的 DNA。包含本发明多核苷酸的载体优选地还包含用于宿主中增殖和 / 或选择的选择 标记。载体可以通过本领域熟知的多项技术并入宿主细胞中。如果被导入宿主细胞中， 载 体可以停留在细胞质中或可以并入基因组中。在后一种情况下， 可以理解载体可以进一步 包含允许同源重组或异源插入的核酸序列。 载体可以通过常规转化或转染技术导入原核或 真核细胞中。如本上下文中所用， 术语 “转化” 和 “转染” 、 接合和转导， 意图包括用于将外 源核酸 ( 例如 DNA) 导入宿主细胞中的多种现有技术方法， 包括磷酸钙、 氯化铷或氯化钙共 沉淀法、 DEAE- 葡聚糖介导转染法、 脂质转染法、 天然感受态法、 碳基团簇法 (carbon-based cluster)、 化学介导的转移法、 电穿孔法或粒子轰击法 ( 例如 “基因枪法” )。
在一个优选的实施方案中， 适用于本发明的载体是包含 SEQ IDNO ： 4、 5 和或 6 的序 列的核酸。
本发明的另一个方面涉及催化乙醛 (AA) 降解的酶制剂用于降低含乙醛制品中乙 醛含量的用途。
如定义部分中所描述， AA 存在于多种液体和化合物中并且对人有害。此外， 已知 乙醛是聚乙烯醇中的残留化合物。聚乙烯醇是乙烯醇的聚合物。由于后者不能以游离形式 存在， 故迄今全部聚乙烯醇通过聚合醋酸乙烯酯来制造， 其中不像乙烯醇那样， 所述的醋酸 乙烯酯是稳定的。如此产生的聚醋酸乙烯酯随后接受醇解。由于聚乙烯醇的技术特性首先 取决于摩尔质量和残留乙酰基含量， 故设计工业制造工艺旨在确保精确地符合这些参数。
在一个特别优选的实施方案中， 如下文以更多细节所述， 酶制剂含有具备醛歧化 酶活性的酶， 其包含 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列的变体或衍生物， 其中第 93 位置处的苯丙 氨酸和 / 或第 301 位置处的异亮氨酸和 / 或第 337 位置处的甲硫氨酸和 / 或第 127 位置处 的苯丙氨酸被任何的其他氨基酸置换。
如附图进一步所说明， 对恶臭假单胞菌甲醛歧化酶酶 (SEQ ID NO ： 2) 的晶体结构 的分析允许鉴定到参与形成该酶反应中心的各个氨基酸残基或氨基酸序列部分， 从而可以 建立针对具有醛歧化酶活性、 尤其甲醛歧化酶或乙醛歧化酶活性的其他合适酶的模型系统 或参比酶。
特别地， 对于所述的特定参比酶， 可以鉴定某些关键氨基酸残基， 其中预测所述的 关键氨基酸残基参与形成底物袋的功能独特部分。所述的功能独特部分命名为催化位点 1(CS1)、 催化位点 2(CS2)、 催化位点 3(CS3)、 催化位点 4(CS4)。第一功能部分是 CS1 并且关键氨基酸残基是 Ile301。
另外， 发现在一级氨基酸序列中彼此不相邻的序列部分通过有助于结合口袋的相 同功能部分反而是功能相关的。因此， 观察到功能部分 CS2 包含关键氨基酸残基 Met337。
也观察到所述的参考酶形成结合口袋区域 CS3 和 CS4， 并且与其相关的氨基酸残 基可以根据它们相对与该酶结合的底物的偏好进一步细分。CS3 和 CS4 包含关键氨基酸残 基 Phe127 和 Phe93。
本发明的发明人已经惊讶地发现与具有 SEQ ID NO ： 2 的野生型恶臭假单胞菌酶的 活性相比， 通过置换一个或多个关键氨基酸残基， 该酶的活性可以提高至少 5％、 优选至少 7％、 更优选至少 10％、 最优选 10 至 20％。此外， 通过置换一个或多个关键氨基酸残基， 该 酶的热稳定可以提高， 导致如此温度下的稳定性， 其中所述的温度比具有 SEQ ID NO ： 2 的野 生型恶臭假单胞菌酶稳定的温度高至少 1、 2、 3、 4、 5 摄氏度。这使得本发明的酶就纯化和表 达条件而言特别有利。
因此， 本发明的另一个目的涉及分离的多肽， 其具有醛歧化酶活性并且包含 SEQ ID NO ： 2 的变体， 其中在 SEQ ID NO ： 2 第 93 位置处的苯丙氨酸和 / 或在 SEQ ID NO ： 2第 301 位置处的异亮氨酸和 / 或在 SEQ ID NO ： 2 第 337 位置处的甲硫氨酸和 / 或在 SEQ ID NO ： 2 第 127 位置处的苯丙氨酸由任何其他氨基酸置换。
本领域技术人员将理解也可以置换紧密靠近上文所提及氨基酸位置的氨基酸。 因 此， 另一个实施方案涉及分离的多肽， 其具有醛歧化酶活性并且包含 SEQ ID NO ： 2 的变体， 其中距 SEQ ID NO ： 2 第 93 位置处的苯丙氨酸 ±3、 ±2 或 ±1 个氨基酸位置的氨基酸和 / 或距 SEQ ID NO ： 2 第 301 位置处的异亮氨酸 ±3、 ±2 或 ±1 个氨基酸位置的氨基酸和 / 或 距 SEQ ID NO ： 2 第 337 位置处的甲硫氨酸 ±3、 ±2 或 ±1 个氨基酸位置的氨基酸和 / 或距 SEQ IDNO ： 2 第 127 位置处的苯丙氨酸 ±3、 ±2 或 ±1 个氨基酸位置的氨基酸被任何其他 氨基酸置换。
基于这种分析， 可以开发一种高度特征性序列模式， 借助所述序列模式可以搜索 具有所希望酶活性的其他候选蛋白。
通过使用所述序列模式搜索其他候选酶也将由本发明包括。 熟练的读者将理解以 上序列模式不受该模式的两个相邻氨基酸残基之间的确切距离限制。 以上序列模式中两个 相邻者之间的每个距离例如可以彼此独立地变动直至 ±10、 ±5、 ±3、 ±2 或 ±1 个氨基酸 位置， 而没有明显影响想要的酶活性。
与基于如根据本发明所获得的结晶学数据对各个氨基酸残基的上述功能性和空 间分析相一致， 可以鉴定作为本发明具有醛歧化酶活性的潜在有用酶的特征的独特部分氨 基酸序列。
根据又一个优选的实施方案， 歧化反应用分离或纯化的、 任选固定的醛歧化酶或 如上文更详细描述那样通过培养表达醛歧化酶酶活性的微生物进行。
对酶活性仅潜在具有微小影响的突变体的实例是对上文所提及结构元件 (CS1、 2、 3 或 4) 的底物口袋的几何学或运动性影响小或无影响的那些突变体。
对酶活性具有更明显影响的突变体的实例可以是对上文所提及结构元件 (CS1、 2、 3 或 4) 的底物口袋的几何学或运动性影响更强的那些突变体。
就 SEQ ID NO ： 2 的恶臭假单胞菌蛋白而言， 下文列出可以促成至少一种所述类型突变的关键氨基酸置换的非限制性实例。
技术人员将理解除上表中提到的氨基酸之外， 任意氨基酸也可以用作置换物。检 验此类突变体功能的测定法是本领域轻易可获得的并且在本发明的实施例部分分别描述。
本发明也涉及如下文进一步定义的核酸， 其编码具有如上文定义的醛歧化酶活性 的蛋白质。
本发明也涉及表达盒， 其包含与至少一个调节性核酸序列有效连接的如上文定义的核酸。 本发明也涉及包含如上文定义的至少一种表达盒或核酸的重组表达载体。
本发明也涉及携带如上文定义的至少一种表达载体的重组微生物。
本发明也涉及生物反应器， 所述生物反应器包含具有如上文定义的醛歧化酶活性 的至少一种蛋白质或如上文定义的重组微生物， 其任选地处于固定形式。
本发明也涉及制备具有醛歧化酶活性的酶的方法， 所述方法包括培育如上文定义 的重组微生物和任选地从培养物分离该醛歧化酶。
本发明也涉及具有醛歧化酶活性的蛋白质的晶形， 尤其那些形式， 其中具有醛歧 化酶活性的蛋白质如上文定义。
本发明也涉及制备如上文所定义具有醛歧化酶活性的蛋白质的晶形的方法， 所述 方法包括添加具有 8.3 至 8.7 范围例内 ( 例如 8.5) 的 pH、 优选以 Tris 缓冲液缓冲的结晶 剂 (3M 至 3.5M 硫酸铵， 优选 3.2M 硫酸铵， 或聚亚烷基二醇， 如聚乙二醇， 尤其 PEG 400 至 3500， 如 PEG 400) 至含有 ( 浓度约 1 至 50 或 5 至 20mg/ml 的 ) 所述蛋白质的溶液。
本发明的其他实施方案
本发明的蛋白质
本发明不限于具体公开的 “具有醛歧化酶活性的蛋白质” ， 还扩展至其功能等同 物。
在本发明的范围内， 具体公开的酶的 “功能等同物” 或类似物是其各种多肽， 它们 也具有所希望的生物学功能或活性， 例如酶活性。
例如， “功能等同物” 意指这些酶， 它们在用于酶活性的试验中显示至少 1 至 10％、 或至少 20％、 或至少 50％、 或至少 75％或、 至少 90％更高或更低的如本文中所定义的酶活 性。
根据本发明， “功能等同物” 尤其也意指突变体， 其中在上述的氨基酸序列的至少
一个序列位置中， 所述突变体具有与具体所述氨基酸不同的氨基酸， 但是拥有前述生物学 活性之一。 “功能等同物” 因而包含通过一个或多个氨基酸添加、 置换、 插入、 缺失和 / 倒位 可获得的突变体， 其中所述的变化可以出现于任意的序列位置内， 条件是它们导致具有本 发明特征曲线的突变体。如果突变体与未改变的多肽之间的反应性模式定量地重合， 即如 果相同底物例如以不同的速率被转化， 则特别地也提供了功能等同性。下表中显示适宜的 氨基酸置换的实例。
以上意义的 “功能等同物” 在也是所述多肽的 “前体” ， 以及所述多肽 “功能性衍生 物” 和 “盐” 。
在这种情况下， “前体” 是所述多肽的具有或没有所希望生物学活性的天然或合成 前体。
表述 “盐” 意指本发明蛋白质分子的羧基的盐以及氨基的酸加成盐。羧基的盐可
以按照已知方式产生并且包含无机盐， 例如钠、 钙、 铵、 铁和锌盐， 和与有机碱 ( 例如， 胺， 如 三乙醇胺、 精氨酸、 赖氨酸、 哌啶等 ) 的盐。本发明也涵盖酸加成盐， 例如与无机酸 ( 如氢氯 酸、 或硫酸 ) 的盐和与有机酸 ( 如乙酸和草酸 ) 的盐。
使用已知技术， 本发明多肽的 “功能等同物” 也可以在功能性氢基酸侧基团上或在 它们的 N 末端或 C 末端产生。此类衍生物包括例如羧酸基的脂族酯、 通过与氨或者与伯胺 或仲胺反应可获得的羧酸基的酰胺 ； 通过与酰基反应产生的游离氨基的 N- 酰基衍生物 ； 或 通过与酰基反应产生的游离羟基的 O- 酰基衍生物。
“功能等同物” 自然也包含可以从其他生物获得的多肽以及天然存在的变体。例 如， 同源序列区的区域可以通过序列比较来建立， 并且可以基于本发明的具体参数确定等 同酶。
“功能等同物” 也包含本发明多肽的片段， 优选地各个结构域或序列基序， 它们例 如显示所希望的生物学功能。
另外， “功能等同物” 是融合蛋白， 所述融合蛋白具有上文所述的多肽序列或从中 衍生的功能等同物之一和处于功能性 N 末端或 C 末端接合的至少一个功能不同的其他异源 序列 ( 即不存在融合蛋白诸部分的基本的相互功能妨碍 )。这些异源序列的非限制性例子 例如是信号肽、 组氨酸锚或酶。
根据本发明也包括的 “功能等同物” 是具体所公开蛋白质的同源物。 这些同源物拥 有如上文所述的百分数同一性值。所述值指与具体所公开氨基酸序列的同一性， 并可以根 据 Pearson 和 Lipman， Proc.Natl.Acad， Sci.(USA)85(8)， 1988， 2444-2448 的算法计算。也 可以从 BLAST 比对、 算法 blastp( 蛋白质 - 蛋白质 BLAST) 或通过使用如下文给出的 Clustal 设置计算出百分数同一性值。
本发明同源多肽的同一性百分数尤其意指氨基酸残基相对于本文中具体所述氨 基酸序列之一的总长度而言的同一性百分数。
在蛋白质可能糖基化的情况下， 本发明的 “功能等同物” 包含上文所述类型的蛋白 质， 所述蛋白质处于去糖基化和糖基化形式以及可以通过改变糖基化模式来获得的修饰形 式。本发明蛋白质或多肽的此类功能等同物或同源物可以通过诱变产生， 例如通过蛋白质 的点突变、 加长或缩短产生。
本发明蛋白质的此类功能等同物或同源物可以通过筛选突变体 ( 例如短缩突变 体 ) 的组合数据库鉴定。例如， 可以通过在核酸水平组合诱变 ( 例如通过酶促连接合成性 寡核苷酸的混合物 ) 产生蛋白质变体的多样化数据库。存在可以用于从简并的寡核苷酸 序列产生潜在同源物数据库的众多方法。可以在自动 DNA 合成仪上实施简并基因序列的 化学合成， 并且可以将合成性基因随后连接于合适的表达载体中。简并基因组的使用使得 在一种混合物中供应全部序列成为可能， 其中所述的全部序列编码所希望的潜在蛋白质序 列集合。合成简并寡核苷酸的方法是本领域技术人员已知的 ( 例如 Narang， S.A.(1983) Tetrahedron 39 ： 3； Itakura 等 人 (1984)Annu.Rev.Biochem.53 ： 323 ； Itakura 等 人， (1984)Science 198 ： 1056 ； Ike 等人 (1983)Nucleic Acids Res.11 ： 477)。
在现有技术中， 几项技术已知用于筛选通过点突变或缩短法产生的组合数据库的 基因产物并且用于筛选 cDNA 文库中具有所选特性的基因产物。这些技术可以适应于快速 筛选通过组合诱变本发明同源物所产生的基因库。基于高通量分析的最常用于筛选大基因库的技术包括在可以复制的表达载体中克隆基因库、 用所得的载体数据库转化合适细 胞并在下述条件表达组合基因， 在所述条件下对所希望活性的检测有助于分离编码其产 物被检测的基因的载体。递归总体诱变 (REM) 是一项提高数据库中功能性突变体频率的 技术， 它可以与筛选试验组合地使用， 旨在鉴定同源物 (Arkin 和 Yourvan(1992)PNAS 89 ： 7811-7815 ； Delgrave 等人 (1993)ProteinEngineering 6(3) ： 327-331)。
根据本发明的又一个实施方案， 提供了分离的多肽， 其选自 ：
(i) 由 SEQ ID NO ： 8 或 10 任一者代表的氨基酸序列 ；
(ii) 与 SEQ ID NO ： 8 或 10 任一者所代表的氨基酸序列具有至少 50％、 51％、 52％、 53 ％、 54 ％、 55 ％、 56 ％、 57 ％、 58 ％、 59 ％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、 75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98％或 99％序列同一性的氨基酸序列 ；
(iii) 以上 (i) 或 (ii) 中给出的任意氨基酸序列的衍生物。
编码性核酸序列
本发明也涉及编码如本文中所定义酶的核酸序列。 本发明也涉及与本文中具体公开的序列具有某种 “同一性” 程度的核酸。两种核 酸之间的 “同一性” 意指每种情况下在该核酸的全长范围内核苷酸的同一性。
例如， 同一性可以借助 Informax(USA) 公司 Vector NTI 软件包 7.1 程序， 使用 Clustal 方法 (Higgins DG， Sharp PM. 在微型计算机上快速和灵敏的多重序列比对 (Fast and sensitive multiple sequence alignments on amicrocomputer).Comput Appl. Biosci.1989 年 4 月 ； 5(2) ： 151-1) 用以下设置计算 ：
多重比对参数 ：
空位开口罚分 10
空位延伸罚分 10
空位分离罚分范围 8
空位分离罚分 关闭
比对延迟的同一性％ 40
残基特异性空位 关闭
亲水性残基空位 关闭
转换权重 0
配对比对参数 ：
FAST 算法 开启
K-tuple 大小 1
空位罚分 3
窗口大小 5
最佳对角线的数目 5
备 选 地， 同 一 性 可 以 根 据 Chenna， Ramu， Sugawara， Hideaki， Koike， Tadashi， Lopez， Rodrigo， Gibson， Toby J， Higgins， Desmond G， Thompson， Julie D. 采用 Clustal 系列程序的多重序列比对 (Multiple sequencealignment with the Clustal series of
programs).(2003)Nucleic Acids Res 31(13) ： 3497-500， 网页 ： http://www.ebi.ac.Uk/ Tools/clustalw/index.html 和以下设置来确定 ：
DNA 空位开口罚分 15.0
DNA 空位延伸罚分 6.66
DNA 矩阵 同一性
蛋白质空位开口罚分 10.0
蛋白质空位延伸罚分 0.2
蛋白质矩阵 Gonnet
蛋白质 /DNA ENDGAP -1
蛋白质 /DNA GAPDIST 4
本文中提及的全部核酸序列 ( 单链和双链 DNA 和 RNA 序列， 例如 cDNA 和 mRNA) 可 以按已知方式通过化学合成从核苷酸结构单元产生， 例如通过各个重叠的互补性双螺旋核 酸结构单元的片段缩合来产生。 寡核苷酸的化学合成可以例如以已知方式通过亚磷酸酰胺 (phosphoamidite) 法 (Voet， Voet， 第 2 版， Wiley Press， New York， 第 896-897 页 ) 进行。 合成性寡核苷酸的积聚和借助 DNA 聚合酶 Klenow 片段填补缺口和连接反应以及一般克隆 技术在 Sambrook 等人 (1989) 中描述， 见下文。
本发明也涉及编码以上多肽及其功能等同物之一的核酸序列 ( 单链和双链 DNA 和 RNA 序列， 例如 cDNA 和 mRNA)， 所述核酸序列可以例如使用人工核苷酸类似物获得。
本发明涉及编码本发明多肽或蛋白质或其生物学活性节段的分离的核酸分子， 并 且涉及可以用作例如鉴定或扩增本发明编码性核酸的杂交探针或引物的核酸片段。
本发明的核酸分子可以额外含有来自编码性基因区域 3’ 和 / 或 5’ 末端的非翻译 序列。
本发明还涉及与具体所述的核苷酸序列或其节段互补的核酸分子。
根据本发明的又一个实施方案， 因而提供了分离的核酸分子， 其选自 ：
(i) 由 SEQ ID NO ： 7 或 9 中任一者代表的核酸 ；
(ii) 由 SEQ ID NO ： 7 或 9 中任一者代表的核酸的互补物 ；
(iii) 核酸， 其编码如 SEQ ID NO ： 8 或 10 中任一者所代表、 优选地作为遗传密码 简并性结果的多肽， 所述分离的核酸可以从如 SEQ ID NO ： 8 或 10 中任一者代表的多肽序列 衍生 ；
(iv) 与 SEQ ID NO ： 7 或 9 的核酸序列任一者具有至少 30 ％、 31 ％、 32 ％、 33 ％、 34 ％、 35 ％、 36 ％、 37 ％、 38 ％、 39 ％、 40 ％、 41 ％、 42 ％、 43 ％、 44 ％、 45 ％、 46 ％、 47 ％、 48 ％、 49 ％、 50 ％、 51 ％、 52 ％、 53 ％、 54 ％、 55 ％、 56 ％、 57 ％、 58 ％、 59 ％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、 75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％序列同一性的核酸序列 ；
(v) 与 (i) 至 (iv) 的核酸分子在严格杂交条件下杂交的核酸分子 ；
(vi) 编码具有醛歧化酶活性的多肽的核酸， 所述多肽与 SEQ ID NO ： 8 或 10 任一者 所代表的氨基酸序列具有至少 50％、 51％、 52％、 53％、 54％、 55％、 56％、 57％、 58％、 59％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％序列同一性。
本发明的核苷酸序列使得产生可以用于鉴定和 / 或克隆其他细胞类型和生物中 同源序列的探针和引物成为可能。此类探针或引物一般包含在 “严格” 条件 ( 见下文 ) 与 本发明核酸序列的有义链或相应反义链的至少约 12 个、 优选至少约 25 个， 例如约 40、 50 或 75 个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域。
“分离的” 核酸分子与存在于该核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分开， 并且 如果该核酸分子通过重组技术产生， 还可以基本上不含其它细胞物质或培养基， 或如果它 被化学地合成， 可以不含化学前体或其它化学品。
本发明的核酸分子可以借助分子生物学标准技术和根据本发明提供的序列信 息予以分离。例如， 使用具体公开的完整序列之一或其节段作为杂交探针和 ( 如在例如 Sambrook， J.， Fritsch， E.F. 和 Maniatis， T.MolecularCloning ： A Laboratory Manual. 第 2 版， Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY， 1989 中描述的 ) 标准杂交技术， 可以从合适的 cDNA 文库分离 cDNA。此 外， 包含所公开序列之一或其节段的核酸分子可以使用基于这种序列所构建的寡核苷酸引 物， 通过聚合酶链反应分离。以这种方式扩增的核酸可以克隆在合适的载体中并可以通过 DNA 测序进行表征。 本发明的寡核苷酸也可以通过标准合成方法产生， 例如使用自动 DNA 合 成仪产生。
本发明的核酸序列或其衍生物、 这些序列的同源物或部分可以例如通过常规杂交 技术或 PCR 技术从其他细菌分离， 例如借助基因组文库或 cDNA 文库。这些 DNA 序列在标准 条件下与本发明的序列杂交。
“杂交” 意指多核苷酸或寡核苷酸在标准条件下与几乎互补的序列结合， 但是在这 些条件下非互补性配偶物之间不发生非特异性结合。 为此， 所述序列可以是 90-100％互补。 互补序列能够相互特异性结合的特性例如用于 RNA 印迹或 DNA 印迹中或用于 PCR 或 RT-PCR 的引物结合中。
保守区域的短寡核苷酸有利地用于杂交。但是， 也可以将本发明核酸的较长片段 或完整序列用于杂交。这些标准条件根据所用的核酸 ( 寡核苷酸、 较长片段或完整序列 ) 或根据何种类型的核酸 -DNA 或 RNA 用于杂交而变化。例如， DNA ∶ DNA 杂合体的解链温度 比相同长度的 DNA ∶ RNA 杂合体的解链温度低约 10℃。
例 如， 根 据 具 体 的 核 酸， 标 准 条 件 意 指 在 浓 度 0.1 至 5×SSC(1×SSC ＝ 0.15M NaCl， 15mM 柠檬酸钠， pH 7.2) 或额外存在 50 ％甲酰胺下的缓冲水溶液中 42 和 58 ℃之 间的温度， 例如 42 ℃在 5×SSC， 50 ％甲酰胺中。有利地， DNA ∶ DNA 杂合体的杂交条件是 0.1×SSC 和在约 20 ℃至 45 ℃之间、 优选约 30 ℃至 45 ℃之间的温度。对于 DNA ∶ RNA 杂 合体， 该杂交条件有利地是 0.1×SSC 和在约 30 ℃至 55 ℃之间、 优选约 45 ℃至 55 ℃之间 的温度。所述的这些杂交温度是对甲酰胺不存在下大约 100 个核苷酸长度及 50 ％ G+C 含量的核酸的计算解链温度值的实例。DNA 杂交的实验条件在相关的遗传学教材 ( 例如 Sambrook 等人， 1989) 中描述， 并且可以使用本领域技术人员已知的公式， 例如根据核酸的 长度、 杂合体类型或 G+C 含量计算。本领域技术人员可以从以下教材获得关于杂交的进一 步信息 ： Ausubel 等人 ( 编著 )， 1985， Current Protocols in Molecular Biology， JohnWiley & Sons， NewYork ； Hames 和 Higgins( 编著 )， 1985， Nucleic Acids Hybridization ： APractical Approach， IRL Press at Oxford University Press， Oxford ； Brown( 编著 )， 1991， Essential Molecular Biology ： A Practical Approach， IRL Press at Oxford University Press， Oxford。
“杂交” 尤其可以在严格条件下实施。 此类杂交条件例如在 Sambrook， J.， Fritsch， E.F.， Maniatis， T.，在 ： Molecular Cloning(A LaboratoryManual)， 2nd edition， Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989， 第 9.31-9.57 页中或在 Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley &Sons， N.Y.(1989)， 6.3.1-6.3.6. 中描述。
“严格” 杂交条件尤其意指 ： 在由 50％甲酰胺、 5×SSC(750mM NaCl， 75mM 柠檬酸三 钠 )， 50mM 磷酸钠 (pH 7.6)， 5×Denhardt 溶液， 10 ％硫酸葡聚糖和 20g/ml 变性剪切鲑精 DNA 组成的溶液中于 42℃过夜， 随后用 0.1x SSC 在 65℃洗涤滤膜。
本发明还涉及具体公开的或可衍生的核酸序列的衍生物。
因此， 本发明的其他核酸序列可以从本文中具体公开的序列衍生并且可以因添 加、 置换、 插入或缺失单个或几个核苷酸而与所公开的序列不同， 并且也编码具有所希望特 性特征的多肽。
本发明也包括这样的核酸序列， 其包含所谓沉默突变或根据特定来源或宿主生物 的密码子选择， 与具体所述序列相比， 已经被改变的序列， 以及其天然存在的变体 ( 例如剪 接变体或等位变体 )。
它也涉及可以通过保守性核苷酸置换 ( 即所讨论的氨基酸被具有相同电荷、 大 小、 极性和 / 或溶解度的氨基酸置换 ) 获得的序列。
本发明还涉及通过序列多态性从具体公开的核酸衍生的分子。 这些遗传多态性可 以因自然变异而存在于群体内部的个体之间。 这些天然的变异通常引起基因核苷酸序列的 1 至 5％变异。
本发明核酸序列的衍生物意指例如等位变体， 其在完整序列范围内在所衍生的氨 基酸水平上具有至少 60 ％同源性、 优选至少 80 ％同源性、 非常特别优选至少 90 ％同源性 ( 就氨基酸水平上的同源性而言， 应当参考上文对所述多肽给出的细节 )。有利地， 同源性 可以在序列的部分区域内较高。
另外， 衍生物也理解为是本发明核酸序列的同源物， 例如动物、 植物、 真菌或细菌 同源物、 编码性和非编码性 DNA 序列的缩短序列、 单链 DNA 或 RNA。例如在 DNA 水平， 同源物 在本文具体公开的序列中所给出的整个 DNA 区域范围内具有至少 40％、 优选地至少 60％、 特别优选至少 70％、 非常特别优选至少 80％的同源性。
另外， 衍生物理解为是例如带有启动子的融合物。添加至所述核苷酸序列的启动 子可以通过至少一个核苷酸交换、 至少一个插入、 倒位和 / 或缺失进行修饰， 但是不损害所 述启动子的功能性或效力。另外， 所述启动子的效力可以通过改变它们的序列而增加或者 可以完全以甚至不同属的生物的更有效启动子交换。
本发明的构建体
本发明也涉及表达构建体， 其含有处于调节性核酸序列的遗传控制下的编码本发 明多肽或融合蛋白的核酸序列 ； 以及包含这些表达构建体中至少之一者的载体。
根据本发明， “表达单元” 意指具有表达活性的核酸， 该核酸包含如本文中所定义的启动子， 并且与一种待表达的核酸或一种基因功能性连接后， 调节该核酸或该基因的表 达， 即调节其转录和翻译。因而在这种环境下， 它也称作 “调节性核酸序列” 。除启动子之 外， 也可以存在其他调节元件， 例如增强子。
根据本发明， “表达盒” 或 “表达构建体” 意指表达单元， 其与待表达的核酸或待表 达的基因功能性连接。 与表达单元相反， 表达盒因而不仅包含调节转录和翻译的核酸序列， 还包含应当因转录和翻译而表达为蛋白质的核酸序列。
在本发明的上下文中， 术语 “表达” 或 “过量表达” 描述在微生物中由相应 DNA 编 码的一种或多种酶的胞内活性的产生或提高。 为此， 例如可以在生物中插入基因、 由另一种 基因置换现存基因、 增加该一个基因或多个基因的拷贝数、 使用强启动子或使用编码具有 高活性的相应酶的基因， 并且任选地可以组合这些措施。 优选地， 本发明的此类构建体包含 在相应编码序列 5’ 上游的启动子和 3’ 下游的终止子序列， 并且任选地还包含常规调节元 件， 在每种情况下它们均与编码序列功能性连接。
根据本发明， “启动子” 、 “具有启动子活性的核酸” 或 “启动子序列” 意指与待转录 的核酸功能性连接时调节该核酸转录的核酸。
在这种情况下， “功能性” 或 “有效” 连接意指以如此方式依次连接例如具有启动子 活性的核酸之一和待转录的核酸序列和任选地其他调节元件 ( 例如能够使核酸转录的核 酸序列和例如终止子 )， 从而所述每种调节元件可以在该核酸序列的转录中履行其功能。 这 不必然需要化学意义上的直接连接。 遗传调控序列如增强子序列也能够从更远位置或甚至 从其它 DNA 分子上对靶序列发挥它们的作用。优选这样的排列， 其中待转录的核酸序列位 于启动子序列之后 ( 即在 3′端 )， 从而这两个序列彼此共价地结合。启动子序列与待转基 因表达的核酸序列之间的距离可以小于 200bp( 碱基对 ) 或小于 100bp 或小于 50bp。
除了启动子和终止子之外， 可以提及的其他调节元件的例子是靶向序列、 增强 子、 多腺苷酸化信号、 选择标记、 扩增信号、 复制起点等。合适的调节序列例如在 Goeddel， Gene Expression Technology ： Methods inEnzymology 185， Academic Press， San Diego， CA(1990) 中描述。
本发明的核酸构建体特别包含选自本文中具体所提及的那些序列或其衍生物和 同源物， 以及可以从本文中具体所提及的氨基酸序列中衍生的核酸序列， 其中所述的序列 有利地与控制 ( 例如增加 ) 基因表达的一种或多种调节信号有效地或功能性连接。
除这些调节序列之外， 对这些序列的天然调节作用仍可以在实际的结构基因之前 存在， 并且任选地可能已经遗传地改变， 从而关闭天然调节作用并且已经增加所述基因的 表达。 核酸构建体也可以具有更简单的设计， 即， 在编码序列之前不插入任何额外的调节信 号并且不消除天然启动子连同其调节作用。 取而代之的是， 使天然调节序列沉默， 从而调节 作用不再发生并且基因表达增加。
优选的核酸构建体还有利地含有与启动子功能性连接的引起核酸序列表达增 加的一个或多个前述增强子序列。也可以在 DNA 序列的 3 ′端插入额外的有利序列， 如其他调节元件或终止子。本发明核酸的一个或多个副本可以含于该构建体中。该构 建体也可以含有任选用于选择构建体的其他标记如抗生素抗性或互补营养缺陷的基因 (auxotrophy-complementinggene)。
在启动子如 cos-、 tac-、 trp-、 tet-、 trp-tet-、 lpp-、 lac-、 lpp-lac-、 laclq-、T7-、 T5-、 T3-、 gal-、 trc-、 ara-、 rhaP(rhaPBAD)SP6-、 λ-PR- 中或在有利地用于革兰氏阴性 细菌的 λ-PL 启动子中含有合适调节序列的实例。在例如革兰氏阳性细菌启动子 ace、 amy 和 SPO2， 在酵母或真菌启动子 ADC1、 MFα、 AC、 P-60、 CYC1、 GAPDH、 TEF、 rp28、 ADH 中含有其 他有利的调节序列。人工启动子也可以用于调节。
为了表达， 将核酸构建体插入宿主生物中， 其中所述的核酸构建体有利地位于允 许所述基因在该宿主中最佳表达的载体 ( 例如质粒或噬菌体 ) 中。除质粒和噬菌体外， 载 体也理解为意指本领域技术人员已知的全部其他载体， 例如， 病毒如 SV40、 CMV、 杆状病毒和 腺病毒、 转座子、 IS 元件、 噬菌粒、 粘粒和线性或环状 DNA。这些载体可以在宿主生物中自主 复制或可以按染色体方式复制。这些载体代表本发明的又一实施方案。
合适的质粒例如是大肠杆菌中的 pLG338、 pACYC184、 pBR322、 pUC18、 pUC19、 pKC30、 pRep4、 pHS1、 pKK223-3、 pDHE19.2、 pHS2、 pPLc236、 pMBL24、 pLG200、 pUR290、 pIN-III113-B1、 λgt11 或 pBdCI ； 诺卡氏菌型放线菌 (Nocardioform actinomycetes) 中的 pJAM2 ； 链霉菌 属 (Streptomyces) 中的 pIJ101、 pIJ364、 pIJ702 或 pIJ361 ； 芽孢杆菌中的 pUB110、 pC194 或 pBD214 ； 棒状杆菌属 (Corynebacterium) 中的 pSA77 或 pAJ667 ； 真菌中的 pALS1、 pIL2 或 pBB116 ； 酵母中的 2αM、 pAG-1、 YEp6、 YEp13 或 pEMBLYe23 或植物中的 pLGV23、 pGHlac+、 pBIN19、 pAK2004 或 pDH51。前述的质粒代表可能质粒的小部分选择。其它质粒是本领域技 术人员熟知的并且将会在例如书籍 Cloning Vectors( 编者 Pouwels P.H. 等人， Elsevier， Amsterdam-New York-Oxford， 1985， ISBN 0 444 904018) 中找到。
在载体的又一个实施方案中， 含有本发明核酸构建体或本发明核酸的载体可以有 利地以线性 DNA 形式插入微生物中并且通过异源或同源重组整合到宿主生物的基因组中。 这种线性 DNA 可以包含线性化载体如质粒或仅包含本发明的核酸构建体或核酸。
为了异源基因在生物中的最佳表达， 有利的是根据生物中所用的特定密码子选择 改变核酸序列。该密码子选择可以基于计算机评价所讨论生物的其他已知基因来轻易确 定。
本发明表达盒的产生基于合适启动子与合适的编码性核苷酸序列及终止子信号 或多腺苷酸化信号的融合。为此， 使用如在例如 T.Maniatis， E.F.Fritsch 和 J.Sambrook， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， ColdSpring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor， NY(1989) 以 及 在 T.J.Silhavy， M.L.Berman 和 L.W.Enquist， Experiments with Gene Fusions， Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor， NY(1984) 并且 在 Ausubel， F.M. 等人， Current Protocols in Molecular Biology， GreenePublishing Assoc. 和 Wiley Interscience(1987) 中所描述的常见重组和克隆技术。
将重组核酸构建体或基因构建体有利地插入用于合适宿主生物中表达的宿主 特异性载体内， 以允许所述基因在该宿主中最佳表达。载体是本领域技术人员熟知的并 且将在例如 “Cloning Vectors” (Pouwels P.H. 等 人， Publ.Elsevier， Amsterdam-New York-Oxford， 1985) 中找到。
根据本发明可以使用的宿主
根据上下文， 术语 “微生物” 意指起始微生物 ( 野生型 ) 或本发明的基因修饰微生 物或这两者。
根据本发明， 术语 “野生型” 意指相应的起始微生物并且不需要必然对应于天然存在的生物。
借助本发明的载体， 可以产生重组微生物， 所述重组微生物已经用例如至少一种 本发明载体转化并可以用于产生本发明的多肽。有利地， 将以上所述的本发明重组构建 体插入合适的宿主系统中并表达。优选地， 使用本领域技术人员熟悉的常见克隆与转染方 法， 例如共沉淀法、 原生质体融合法、 电穿孔法、 逆转录病毒转染法等， 旨在确保所述核酸在 相应表达系统中表达。合适的系统例如在 Current Protocols in Molecular Biology， F.Ausubel 等人， Publ.Wiley Interscience， New York 1997 或 Sambrook 等人 Molecular Cloning ： A Laboratory Manual. 第 2 版， Cold Spring HarborLaboratory， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY， 1989 中描述。
原则上， 可以考虑全部原核生物作为本发明核酸或核酸构建体的重组宿主生物。 将细菌有利地用作宿主生物。 虽然大肠杆菌是通常用来表达催化甲醛降解的酶的细菌宿主 细胞的一个实例， 但是其他细菌宿主细胞可以在本发明中用来表达外源 DNA， 所述的宿主细 胞包括例如埃希氏菌属、 肠杆菌属、 固氮菌属、 欧文氏菌属、 芽孢杆菌属、 假单胞菌属、 博德 特菌属、 红杆菌属、 苛养木杆菌属、 克雷伯氏菌属、 变形杆菌属、 沙门菌属、 沙雷菌属、 志贺菌 属、 根瘤菌属、 透明颤菌属和副球菌属。此外， 真核真菌宿主细胞可以在本发明中用来表达 外源 DNA， 它们包括例如曲霉属、 毕赤酵母属、 木霉属、 汉逊酵母属、 酵母属、 克鲁维酵母属、 裂殖酵母属、 金小孢子属、 假丝酵母属和球拟酵母属。
本发明的宿主生物或多种宿主生物则优选地含有本文发明中所描述的编码根据 上文定义的酶活性的核酸序列、 核酸构建体或载体至少之一。
根据宿主生物， 本发明方法中所用的生物以本领域技术人员熟悉的方式生长或培 育。原则上， 将微生物在液体培养基中于 0℃和 100℃之间、 优选 10℃和 60℃之间的温度在 氧通气的情况下培育， 其中所述液体培养基含有通常为糖形式的碳源、 通常为有机氮源形 式的氮源 ( 如酵母提取物 ) 或盐如硫酸铵、 痕量元素如铁、 锰和镁盐并且任选地含有维生 素。液体营养培养基的 pH 可以维持在固定值上， 即在培育期间进行调节或不予调节。可以 分批、 半分批或连续地实施生长。养分可以在发酵伊始供应或可以随后半连续或连续地供 应。
重组产生具有醛歧化酶活性的蛋白质
本发明也涉及通过培育表达本发明蛋白质的微生物并且从培养物中分离所希望 的产物来产生所述蛋白质的方法。
可以以分批法或以补料分批或重复补料分批法连续或间歇地培育如根据本发明 使用的微生物。对已知培育方法的综述存在于 Chmiel(Bioprocesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(GustavFischer Verlag， Stuttgart， 1991)) 教 材 中 或 Storhas(Bioreaktoren undperiphere Einrichtungen(Vieweg Verlag， Braunschweig/ Wiesbaden， 1994)) 教材中。
待使用的培养基必须以适宜的方式满足具体菌株的要求。对多种微生物的培养 基的描述在手册 “美国细菌学会通用细菌学方法手册 (Manual ofMethods for General Bacteriology)” (Washington D.C， USA， 1981) 中给出。
可以根据本发明使用的这些培养基通常包含一种或多种碳源、 氮源、 无机盐、 维生 素和 / 或痕量元素。优选的碳源是糖， 如单糖、 二糖或多糖。极好的碳源例如是葡萄糖、 果糖、 甘露糖、 半乳糖、 核糖、 山梨糖、 核酮糖、 乳糖、 麦芽糖、 蔗糖、 棉子糖、 淀粉或纤维素。 糖也可以以复杂 化合物如糖蜜或来自糖精炼的其他副产品添加至培养基。 也可以有利的是添加多种碳源的 混合物。 其他的可能碳源是油和脂肪， 如大豆油、 葵花籽油、 花生油或椰子油， 脂肪酸如棕榈 酸、 硬脂酸或亚麻酸、 醇如甘油、 甲醇或乙醇和有机酸如乙酸或乳酸。
氮源通常是有机或无机氮化合物或含有这些化合物的物质。 氮源的实例包括氨气 或铵盐， 如硫酸铵、 氯化铵、 磷酸铵、 碳酸铵或硝酸铵、 硝酸盐、 脲、 氨基酸或复杂氮源， 如玉 米浆、 大豆粉、 大豆蛋白、 酵母提取物、 肉浸汁和其他等。 氮源可以分开地使用或作为混合物 使用。 可以在培养基中存在的无机盐化合物包含钙、 镁、 钠、 钴、 钼、 钾、 锰、 锌、 铜和铁的氯化 物、 磷酸盐或硫酸盐。含硫无机化合物例如硫酸盐、 亚硫酸盐、 连二亚硫酸盐、 连四硫酸盐、 硫代硫酸盐、 硫化物以及有机硫化合物如硫醇和硫羟可以用作硫源。
磷酸、 磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐可以用作磷源。可以将螯合剂添 加至培养基， 旨在维持溶液中的金属离子。特别合适的螯合剂包含二羟基酚， 如儿茶酚或 原儿茶酸酯或有机酸如柠檬酸。根据本发明使用的发酵培养基也可以含有其他生长因子， 如维生素或生长促进剂， 它们包括例如生物素、 核黄素、 硫胺素、 叶酸、 烟酸、 泛酸酯和吡哆 醇。生长因子和盐经常来自培养基的复杂组分， 如酵母提取物、 糖蜜、 玉米浆等。此外， 可 以将合适的前体添加至培养基。 培养基中化合物的精确组成强烈取决于具体的实验并且必 须针对每种具体情况分别决定。关于培养基优化的信息可以在教材 “Applied Microbiol. Physiology， A Practical Approach” (Publ.P.M.Rhodes， P.F.Stanbury， IRL Press(1997) 第 53-73 页， ISBN 019 963577 3) 中找到。也可以从供应商处获得生长培养基， 如标准 1(Merck) 或 BHI( 心脑浸液， DIFCO) 等。通过加热 ( 在 1.5 巴和 121℃， 20 分钟 ) 或通过无 菌过滤， 将培养基的全部组分消毒。所述组分可以一起消毒或根据需要分别消毒。培养基 的全部组分可以在培养伊始存在或任选地可以连续地或通过分批补料添加。
培养物的温度通常是在 15℃和 45℃之间， 优选地是 25℃至 40℃并且在实验期间 可以保持恒定或可以变动。培养基的 pH 值应当在 5 至 8.5 的范围内， 优选地在 7.0 附近。 可以在培育期间通过添加碱性化合物如氢氧化钠、 氢氧化钾、 氨或氨水或酸性化合物如磷 酸或硫酸控制用于生长的 pH 值。消泡剂例如脂肪酸聚二醇酯可以用于控制起泡。为维持 质粒的稳定性， 可以将具有选择作用的合适物质例如抗生素添加至培养基。将氧或含氧的 气体混合物例如空气送入培养物以维持通气条件。培养物的温度通常是 20℃至 45℃。持 续培养直至最大量所希望的产物已经形成。这通常在 10 小时至 160 小时内实现。
可以任选地通过高频超声波、 通过高压例如在弗氏细胞压碎器中、 通过渗透作用、 通过去垢剂、 裂解酶或有机溶剂的作用、 借助均化器或通过所列几种方法的组合破坏细胞。
具有醛歧化酶活性的酶的具体用途
本发明也涉及分离的多肽用于降低在含醛制品中醛含量的用途， 所述分离的多肽 具有醛歧化酶活性并且包含 SEQ ID NO ： 2 的变体， 其中在 SEQID NO ： 2 第 93 位置处的苯丙 氨酸和 / 或在 SEQ ID NO ： 2 第 301 位置处的异亮氨酸和 / 或在 SEQ ID NO ： 2 第 337 位置处 的甲硫氨酸和 / 或在 SEQ IDNO ： 2 第 127 位置处的苯丙氨酸由任何其他氨基酸置换。
在一个优选的实施方案中， 醛是如定义部分中定义的乙醛。
在另一个优选的实施方案中， 醛是丙酮醛。以下实施例仅起到说明本发明的作用。 对于本领域技术人员显而易见的众多可能 变化也落入本发明的范围内。 实施例 实施例 1 ： FDM 表达和纯化
以下方法源自先前描述的方案 (Yanase， H.， Moriya， K.， Mukai， N.， Kawata， Y.， Okamoto， K.， Kato， N(2002)GroESL 共表达对来自恶臭假单胞菌 F61 的烟酰胺蛋白甲醛歧化 酶折叠的影响 (Effects of GroESLCoexpression on the Folding of Nicotinoprotein Formaldehyde Dismutasefrom Pseudomonas putida F61)Biosci.Bitechnol.Biochem.， 66(1)， 85-91) 并且已经进一步优化。 编码 FDM 的基因的密码子选择已经对大肠杆菌进行优 化。 新 DNA 序列已经合成并克隆到鼠李糖诱导型表达载体 pDHE(SEQ ID NO ： 4) 中。 对于可溶 性 FDM 产生所必需的 GroEL/S 伴侣蛋白克隆于 IPTG 诱导型 pAgro 载体 (SEQ ID NO ： 5) 中。 lac 阻抑蛋白由 pHSG 载体 (SEQ ID NO ： 6) 编码。 使用大肠杆菌 TG10( 一种无鼠李糖异构酶 的 TG1 衍生物 ) 进行 FDM 的表达。将含有 pAgro 和 pHSG 的 TG10 细胞 (TG10+) 用 pDHE-FDM 转化并且在 LB 中于 37 ℃在氨苄青霉素 (pDHE)、 壮观霉素 (pAgro) 和氯霉素 (pHSG) 存在 下培养 5 小时。将 5mL 这种培养物转移至含有 100μM IPTG 和 0.5g/L 鼠李糖的 500mL 相 同培养基中。诱导在 37℃进行约 18 小时。通过离心收集细胞并且将其重悬于裂解缓冲液 (10mMKH2PO4， pH 7， 0.5mM MgCl2， 140μM PMSF) 中。通过超声处理 (<1’ ， 1s/1s>x10， 70％振 幅 ) 诱导细胞裂解。在 37℃孵育 10 分钟并离心后， 将硫酸铵添加至清亮的裂解物至 50％ 饱和度。使得不想要的蛋白质 ( 例如伴侣蛋白 ) 在冰上沉淀 2-4 小时。
通过离心除去沉淀物并且将含有 FDM 的清亮溶液施加至苯基 - 琼脂糖凝胶柱 (HIC 层析 )。使用 “40％至 0％” 硫酸铵梯度 ( 缓冲液 ： 10mM KH2PO4， 0.5mM MgCl2， pH 7.2)， 洗脱 含有 FDM 的级分。FDM 的存在由快速比色测定法证实 ： 将 10μL 每一级分转移至 96 孔 MTP 平板并且与 250μL 甲醛溶液 ( 在 100mM KH2PO4， pH 7 中 12.5ppm， 30 分钟 ) 一起孵育。通 过添加 50μL Purpald- 试剂 (1M NaOH 中 10mg/mL， Sigma) 至 50μL 反应混合物检测未反 应的甲醛。显色表示酶在收集的级分中不存在。
在苯基琼脂糖凝胶纯化步骤后， 洗脱的级分通过超滤法 (10kDa 截止值 ) 浓缩并 且 通 过 大 小 排 阻 层 析 法 (HiPrep Desalting 26/10mL， Amersham) 脱 盐。1×PBS， 0.5mM MgCl2(pH 7.2) 用作运行缓冲液。通过超滤法 (10kDa 截止值 ) 浓缩蛋白质溶液并且将甘油 添加至 50％终浓度。FDM 原液 (2-5mg/mL) 在 -20℃贮存。从发酵物约 1g/L 中， 来自摇瓶的 一般产率是约 100mg/L。该方法允许纯化蛋白质至均一， 如考马斯染色的 SDS-PAGE 所判定 ( 数据未显示 )。
对于 FDM 突变体， 也可用以下方法。
以 下 方 法 源 自 先 前 描 述 的 方 案 (Yanase 等 人 2002， Biosci.Biotechnol. Biochem.， 66(1)， 85-91) 并且已经作进一步优化。编码 FDM( 或突变体 ) 的基因的密码子 选择已经对大肠杆菌进行优化 (SEQ ID NO ： 3)。新 DNA 序列已经合成并克隆到鼠李糖诱导 型表达载体 pDHE(SEQ ID NO ： 4) 中。对于可溶性 FDM 产生所必需的 GroEL/S 伴侣蛋白克隆 于 IPTG 诱导型 pAgro 载体 (SEQ ID NO ： 5) 中。lac 阻抑蛋白由 pHSG 载体 (SEQ ID NO ： 6) 编码。使用大肠杆菌 TG10( 一种无鼠李糖异构酶的 TG1 衍生物 ) 进行 FDM 的表达。将含有
pAgro 和 pHSG 的 TG10 细胞 (TG10+) 用 pDHE-FDM 转化并且在 LB 中于 37 ℃在氨苄青霉素 (pDHE)、 壮观霉素 (pAgro) 和氯霉素 (pHSG) 存在下培养 5 小时。将 5mL 这种培养物转移至 含有 100μM IPTG 和 0.5g/L 鼠李糖的 500mL 相同培养基中。诱导在 37℃进行约 18 小时。 通过离心收集细胞并且将其重悬于裂解缓冲液 (10mM KH2PO4， pH 7， 0.5mM MgCl2) 中。通过 超声处理 (<3’ ， 15s/15s>x3， 85％振幅 ) 诱导细胞裂解。在 37℃孵育 10 分钟并离心后， 将 硫酸铵添加至清亮的裂解物至 50％饱和度。 使得不想要的蛋白质 ( 例如伴侣蛋白 ) 在冰上 沉淀 1-2 小时。
通过离心除去沉淀物并且将含有 FDM 的清亮溶液施加至苯基 - 琼脂糖凝胶柱 (HIC 层析 )。使用 “40％至 0％硫酸铵梯度” ( 缓冲液 ： 10mM KH2PO4， 0.5mM MgCl2， pH 7.2)， 洗脱 含有 FDM 的级分。FDM 的存在由快速比色测定法证实 ： 将 10μL 每一级分转移至 96 孔 MTP 平板并且与 250μL 甲醛溶液 ( 在 100mM KH2PO4， pH 7 中 12.5ppm， 30 分钟 ) 一起孵育。过 添加 50μL Purpald- 试剂 (1M NaOH 中 10mg/mL， Sigma) 至 50μL 反应混合物检测未反应 的甲醛。显色表示酶在收集的级分中不存在。
在苯基 - 琼脂糖凝胶纯化步骤后， 洗脱的级分通过超滤法 (10kDa 截止值 ) 浓缩并 且通过大小排阻层析法 (HiPrep Desalting 26/10mL， Amersham) 脱盐。 10mM KH2PO4， 0.5mM MgCl2(pH 7) 用作运行缓冲液。通过超滤法 (10kDa 截止值 ) 浓缩蛋白质溶液并且将甘油添 加至 50％终浓度。FDM 原液 (2-5mg/mL) 在 -20℃贮存。该方法允许纯化蛋白质至均一， 如 考马斯染色的 SDS-PAGE 所判定 ( 数据未显示 )。
实施例 2 ： 通过 pH-stat 滴定法表征 FDM
在含有 20mM 甲醛， 100mM KCl， 0.25mM KH2PO4(pH 7) 的标准反应混合物中验定 FDM 活性。通过添加 5μL 酶溶液至 25mL 标准混合物在室温进行该反应。通过 pH-stat 滴定法 用 5mM NaOH 监测 5 分钟范围内的甲酸盐形成。一个单位定义为每分钟催化 1μmol 甲酸形 成所需要的酶量。TG10+ 中表达的 FDM 具有范围在 100-200U/mg 之间的比活性。
实施例 3 ： 甲醛的检测
LAW 112 法的检测原理依赖于甲醛与乙酰丙酮在氨存在下反应以形成黄色化合物 3， 5- 二乙酰基 -1， 4- 二氢卢剔啶 (Hantzsch 反应 )(Nash， T.(1953) 通过 Hantzsch 反应对 甲醛的比色估计， Biochem.J.， 55(3)， 416-421 和 Fregert， S.， Dahlquist， I.， Gruvberger， B.(1984) 用于检测甲醛接触性皮炎的简单方法 (Simple Method for the Detection of Formaldehyde ContactDermatitis)， 10， 132-134)。 对于定量性甲醛检测， 如下制备试剂溶 液： 将 15g 乙酸铵、 0.2mL 乙酰丙酮、 0.3mL 乙酸在 100mL 蒸馏水中混合 ( 在 4℃稳定 1 周 )。 为获得校准曲线， 制备范围从 5ppm 至 25ppm 的甲醛水溶液。通过混合 0.1mL 样品水溶液 ( 或作为空白的标准物或水 ) 与 0.15mL 试剂溶液启动该反应并且在 60℃孵育 10 分钟。在 溶液已经冷却至室温后， 添加蒸馏水至终体积 1mL。在 412nm 监测 3， 5- 二乙酰基 -1， 4- 二 氢卢剔啶的形成。
实施例 4 ： 酶的初步表征
为确定甲醛歧化酶对织物应用的效率， 将不同的酶浓度与 100mMKH2PO4， pH 8 中的 220ppm 甲醛在室温孵育 30 分钟。样品通过先前描述的乙酰丙酮法分析。酶原液的比活性 是 165U/mg。结果在表 1 中显示。
表1： 溶液 (220ppm 甲醛 ) 中的酶促甲醛移除。通过乙酰丙酮法进行检测。值显示了在室温孵育 30 分钟后溶液中的剩余甲醛。
FDM(mg/L) 0 7 17
甲醛 (ppm) 230 11 检测不到 ( ＜＜ 5ppm)甚至非常低的酶浓度对几乎彻底降低甲醛含量是绰绰有余的。对于技术应用而 言， 另一个有意思特性是对醇 ( 乙醇， 异丙醇 ) 或纯水而非缓冲液的耐受性。为此目的， 将 17mg/L 甲醛歧化酶在 30℃于 100mM KH2PO4(pH8)， 220ppm 甲醛和 10 或 20％ v/v 溶剂 ( 乙 醇或异丙醇 ) 中孵育。备选地， 使用 ddH2O 替代磷酸盐缓冲液。结果在表 2 中汇总。
表2： 乙醇、 异丙醇 ( ％ v/v) 和纯水对 FDM 活性的影响 (FDM 为 17mg/L， 甲醛为 220ppm)。值显示了在 30℃孵育 30 分钟后溶液中的剩余甲醛。通过乙酰丙酮法进行检测。
在 10％乙醇中的 FDM 160ppm 在 10％异丙醇中的 FDM 26ppm 在 ddH2O 中的 FDM 240ppm(90 分钟后 133ppm)
在 20％乙醇中的 FDM 196ppm 在 20％异丙醇中的 FDM 104ppm ddH2O 201ppm(90 分钟后 202ppm) 20％乙醇 227ppm 20％异丙醇 229ppm来自恶臭假单胞菌 F61 的甲醛歧化酶在大量乙醇存在下未与 FA 有效反应。 甚至在 10％ v/v， 针对 FA 的酶活性被强烈抑制。相对低浓度的异丙醇不造成问题， 但是多于 10％ v/v 对活性产生负面影响。纯水灭活该酶 ； 甲酸的产生诱导酸性 pH- 位移 (pH 从 7 降低至 约 4)。
实施例 5 ： 用 FDM 处理整理的织物
用二羟甲基二羟基亚乙基脲交联剂整理的棉纤维已经以 FDM 处理。在交联剂与棉 纤维缩合之后， 可以通过乙酰丙酮法测定出织物中约 114ppm 的游离甲醛。随后用不同浓度 的酶溶液 (100mM KH2PO4， pH 8， 0-150mg/L 酶 ) 浸渍该织物样品并且使其立即经过两个转动 的金属滚筒 ( 图 3)。湿样品在 30℃孵育 60 分钟。通过乙酰丙酮法 (LAW 112) 定量从 1g 织物样品提取的甲醛。表 3 汇总数据。
表3： 不同 FDM 浓度对用改性二羟甲基二羟基亚乙基脲交联剂交联的棉织品的影 响 ( 在酶促处理前织物中的甲醛是 114ppm)。
33CN 102459580 A
FDM(mg/L) 0 20 50 100 150
说明书来自干织物的甲醛 (ppm) 95 56 40 51 4931/39 页来自湿织物的甲醛 (ppm) 73 33 22 23 23甲醛含量在没有歧化酶情况下已经降低至约 70ppm( 来自干织物的甲醛含量是 95ppm)， 这可能因浸渍过程期间的某些 “洗出” 效应所致。通常， 甲醛歧化酶能够明显地降 低所提取甲醛的量至 20 和 40ppm 之间的水平。湿织物与干织物甲醛检测结果的不同可能 因织物含水量估计方面的不同所致。表 4 显示对织物进行的相同实验， 其中所述的织物用 含有较大量 FA 的替代性二羟甲基二羟基亚乙基脲交联物交联 ( 在酶促处理前织物中的甲 醛是 641ppm)。
表4： 不同 FDM 浓度对用二羟甲基二羟基亚乙基脲制品交联的棉织品的影响。
30 分钟孵育 60 分钟孵育
因为 “洗出” 效应， 样品在没有歧化酶情况下显示甲醛含量明显降低。然而， 应用 增加量歧化酶的酶导致来自整理的织物中释放的甲醛明显减少。约 70％的吸水率 (water uptake) 意味着每 kg 织物约 100mg 歧化酶对相当大程度地降低甲醛含量是绰绰有余的。
为降低酶促处理后干燥织物的时间及能源成本， 降低此类应用中的水含量将是有 益的。为此目的， 将交联的织物样品略有差异地处理 ： 将浓缩的酶溶液 (1xPBS， 25％甘油中 的 1350mg/L) 喷洒在该织物上。微调吸水率， 从而允许分析 0-50％范围的湿度 ( 表 5)。全 部织物探测物在 30℃孵育 60 分钟。
表5： 不同吸水率对用二羟甲基二羟基亚乙基脲制品交联的棉织品的影响 ( 在
酶促处理前织物中的甲醛是 641ppm)。将 FDM 以浓缩的原液喷洒 (1xPBS， 25 ％甘油中的 1350mg/L)。
即便通过施加作为喷雾剂的酶， 甲醛的某些 “洗出” 仍是不可避免的 (20％缓冲液 吸取率， 465ppm 释放的甲醛 )。 但是， 在相同吸水率的情况下， 酶施加 ( 每 kg 织物 270mg 酶 ) 仍引起释放的甲醛减少多于 50％。与织物含水量达到 70％的经金属滚筒施加酶相比， 喷洒 施加的效率是较不明显的。
实施例 6 ： FDM 对不同织物整理产品的 FA 含量的影响
降低织物中甲醛量的备选策略将是在织物缩合步骤之前将歧化酶直接应用至交 联剂溶液。为此目的， 已经用甲醛歧化酶测试了 3 种产品 ： 二羟甲基二羟基亚乙基脲制品 ( 制品 1)、 甲氧甲基化蜜胺制品 ( 制品 2) 和低 FA 含量的缩聚甲氧甲基化蜜胺制品 ( 制品 3)。交联剂制品 1 是高度浓缩的略微酸性的 (pH 5-6) 水溶液， 其含有 0.1 和 1％之间的甲 醛 (1000 至 10000ppm)。制品 2 是含有 1.5 和 2.5％之间甲醛的浓缩水溶液 (pH 8-9)。制 品 3 是含有 0.2 和 1％之间甲醛的略微碱性的水溶液 (pH 8-9)。
通常， 将 87μL 纯产品与 10μL 3M KH2PO4(pH 7) 和 3μL 50％甘油混合 ( 阴性对 照 )。在酶处理的样品中， 使用酶原液 (4.8mg/mL) 而不是甘油。产品溶液中的酶终浓度是 约 150mg/L。通过乙酰丙酮法检测甲醛。表 6 显示 FDM 对交联剂溶液的影响。
表6 ： FDM( 约 150mg/L) 对制品 1、 2 和 3 的影响。 反应混合物用大约 300mM KH2PO4(pH 7) 缓冲并且在 30℃孵育 60 分钟。值显示了浓缩产品中处理后的剩余甲醛 ( 单位为 ppm)。 通过乙酰丙酮法进行检测。
35CN 102459580 A交联剂 制品 1 制品 3 制品 2说明-FDM 5200 3500 38000书+FDM 1700 1700 2930033/39 页对制品 1 获得最好的结果， 甲醛含量降低大约 70％。 制品 3 的甲醛含量降低约 50％。 用 FDM 处理制品 2 仅降低高甲醛含量 20％。注意对 FDM 暴露延长可能导致产品降解。
总体而言， 这些初步结果表明 FDM 可以潜在地直接应用于产品溶液。
实施例 7 ： FDM 降低改性的二羟甲基二羟基亚乙基脲化合物中 FA 含量的用途
交联剂用于易于打理整理由纤维素纤维及它们与合成纤维的混纺物制成的织物。 这些化学品的一个重要类别是改性二羟甲基二羟基亚乙基脲化合物类。这里， 我们用甲醛 歧化酶 (FDM) 处理 4 种不同的产品配方 (product formulation) 并且测量产品中的剩余甲 醛。另外， 酶处理的产品用于棉织品整理中。织物 ( 棉织品 ) 的甲醛含量和整理的性能已 经定量。
产物制品如下处理 ： 17.4g 交联试剂 ( 作为浓缩的水溶液 ) 和 2mL 3MKH2PO4(pH 7) 与 0.6mL FDM(4.8mg/mL) 轻轻地混合。酶终浓度是约 140mg/L。酶促过程在室温实施约 3 小时。甲醛含量如先前描述那样测量 ( 乙酰丙酮法 )( 见表 7)。
表7：
交联剂 1 2 3 4 用 FDM 情况下的 FA(ppm) 1200 500 500 500 无 FDM 情况下的 FA(ppm) 4100 3100 2200 3500产品溶液中的甲醛含量降低了 70-80％。 产品 1( 未保护的羟甲基 ) 中甲醛移除可 以导致产品随时间降解。
酶处理和未处理的制品用于使用以下配方 ： 57.5g/ 交联试剂、 10g/LMgCl2·6H2O， pH 5.0( 通过添加乙酸调节 ) 的棉织品整理中 ( 织物 ： CO-Popelin)。使得棉织品样品 ( 吸 液率约 70％ ) 在 110℃干燥至终末湿度约 6％。以下的固化步骤 (curing step) 在 150℃ 进行 3 分钟。通过 LAW112 测量棉织品样品中的甲醛含量 ( 单位为 ppm 的值 )。额外的性 能指标是干态折皱回复角 (dcra)( 单位为° )、 抗张强度 ( 在 40 ＊ 100mm 上以 N 表示的张 力 )、 评价光滑度的耐久压烫 (DP 评价 )、 评价光滑度的孟山都法 ( 孟山都评价 )、 收缩 ( 以％ 表示的经 (w)/ 纬 (f) 缩比 )。下表 ( 表 8) 汇总结果 (1 ： 未整理的棉织品 2 ： 制品 13 ： 制品 1+FDM 4 ： 制品 25 ： 制品 2+FDM 6 ： 制品 37 ： 制品 3+FDM 8 ： 制品 49 ： 制品 4+FDM)。
表8
36CN 102459580 A 1 FA(LAW112) dcra 张力 DP 评价 孟山都评价 经缩 纬缩
1 123 399 1 1 4.0 0.2 2 196 198 361 2 3 1.4 0.4 3说明4 53 187 340 1.5 2 2.0 0.0书5 25 178 282 1.5 2 1.6 0.2 6 35 180 304 1.5 2.5 1.8 0.2 7 22 187 350 1.5 2.5 2 0 8 42 180 342 1.5 2.5 2 0.234/39 页 9 22 173 324 1.5 2.5 1.8 0.2168 187 356 2 3 1.4 0.4实施例 8 ： FDM 降低用作高分子分散剂 / 超塑化剂的磺化蜜胺 -FA 缩聚物中 FA 含量的用途 磺化的蜜胺 -FA 缩聚物尤其优化用于基于水泥和硫酸钙的混合物的塑化和减水。 一般， 这些产品作为 20％ w/v 水溶液使用并且 pH 值是约 9 至 11.4( 样品 1) 和 7 至 10( 样 品 2)。这里 ( 见表 9) 我们用 FDM( 终浓度 140mg/L) 处理两种样品的 20％ w/v 工作液并且 在不同孵育时间后使用先前描述的乙酰丙酮法定量剩余的甲醛 ( 以 ppm 表示的值 )。
表9
20％ w/v 样品 1 样品 2
无 FDM 5700 1700 FDM(1 小时 ) 3200 1200 FDM(3 小时 ) 2500 1000 FDM(24 小时 ) 1800 7001 小时酶促处理后的产品性能就定形时间 (set time)、 流动和强度而言没有不利 地受到影响。相似的结果可以通过使用 1/5 酶浓度那样的量获得。在这些产品中， 除去甲 醛可以导致聚合物分子量分布随时间的变化。
实施例 9 ： FDM 降低改性阴离子聚烷基二醇 - 酚 -FA 树脂中 FA 含量的用途
改性阴离子聚烷基酚醛树脂尤其优化用于基于水泥和硫酸钙的混合物的塑化和 减水。将该产品配制为浓缩的水溶液 (pH 5-8)。通过直接添加 FDM 至该产品进行酶处理。 未处理的产品含有约 250ppm 甲醛， 如通过乙酰丙酮法所确定。下表 ( 表 10) 显示与 FDM 孵 育 0.5 小时、 3 小时和 24 小时后的剩余甲醛 ( 单位为 ppm)。
表 10 ：
37CN 102459580 A说FDM(30 分钟 )明书FDM(3 小时 ) 6.8 26.1 FDM(24 小时 ) 3.5 2.435/39 页FDM(100mg/L) FDM(10mg/L)
10.2 125.51 小时酶促处理后的产品性能就定形时间、 流动和强度而言没有不利地受到影响。
相似的结果可以使用未纯化的细胞提取物或产生 FDM 的完整细胞获得。
实施例 10 ： 为扩展的底物特异性合理设计 FDM
FDM 的活性部位显示了在相对狭窄、 主要是疏水的口袋内结合的甲醛分子。策略 性安置的锌离子充当路易斯酸并且激活底物用于紧密结合的 NADH 辅因子分子所供给的氢 负离子亲核攻击。歧化反应的假定反应机制由两个偶联的半反应组成。在第一个半反应 中， 一个甲醛分子被酶 (E)-NAD+ 复合物不可逆氧化以形成甲酸和 (E)-NADH 复合物。在第 二个半反应中， 另一个甲醛分子与该 (E)-NADH 复合物结合并且不可逆地还原成甲醇， 留下 + (E)-NAD 复合物用于下一个反应。 在 Tanaka 等人 (2002)， Journal of Molecular Biology， 324， 519-533 中描述和展示了由 FDM 催化的歧化反应的假定反应机制。来自恶臭假单胞 菌 F61 的 FDM 在 2.3A 分辨率下的活性部位由 Hasegawa 等人 (2002)， Acta Crystallogr.， Sect.A， 58， C102-C102 描述和展示。甲醛紧密地填塞于疏水口袋中 (Met 337、 Ile 301、 Phe 93 和 Phe 127) 并且与锌离子及 NAD(H)- 辅因子密切接近。
来自恶臭假单胞菌 F61 的 FDM 已经显示具有限程度的底物混杂性 (Kato 等人 Agric.， 1983， Biol.Chem.， 47(1)， 39-46)。野生型酶针对乙醛显示微弱活性 (5-10％， 我们 的结果显示甚至更低 ) 并且针对甲基 - 乙二醛显示微弱活性 (22％ )， 针对甲醛的相对活 性是 100％， 但是针对立体化学上更多要求的底物如丙醛、 丁醛、 庚醛、 甘油醛、 乙醇醛、 苯甲 醛、 乙二醛或戊二醛不显示活性。为改善针对体积较大醛类、 尤其乙醛的底物特异性， 我们 决定通过在第 337、 301、 127 和 93 位置处将内衬活性部位的大体积疏水残基置换为较小的 对应物来修饰 FDM 的活性口袋。因此已经制备并表征了以下的单突变体 ：
FDM M337A FDM I301L FDM F127V FDM F93L
FDM I301A FDM F127A FDM F93I
FDM I301V FDM F93G
FDM I301G FDM F93A
FDM I301S FDM F93V
实施例 11 ： 通过 pH-stat 滴定法并通过 HPLC 确定的 FDM 突变体的活性
在含有 20mM 甲醛， 100mM KCl， 0.25mM KH2PO4(pH 7) 的标准反应混合物中通过 pH-stat 滴定法验定 FDM 及其变体的活性。 通过添加 5μL 酶溶液至 25mL 标准混合物 ( 一般 而言 0.1-0.5μg/mL 酶， 这取决于活性 ) 在室温进行该反应。 通过用 5mM NaOH 监测 5 分钟范 围内的甲酸盐形成。一个单位定义为每分钟催化 1μmol 甲酸形成所需要的酶量。FDMF93A/ I301L(0.7μg/mL) 是由 pH-stat 滴定法以 20mM 乙醛替代甲醛在 pH 7 所测试的唯一突变体。 鉴于 FDM 和全部单一突变对乙醛的活性太弱以至于不能通过 pH-stat 滴定法追踪， 我们决 定通过 HPLC(Aminex HPX-87H 柱， 在 5mM H2SO4 中， 由通过 RI 检测， 0.5mL/ 分钟 ) 比较 FDM 及其变体。酶促反应在 50mM KH2PO4(pH 8)， 100mM KCl 和 20mM 乙醛中进行。通过添加 FDM或添加其变体 (50μg/ml) 启动反应。乙醛、 乙醇和乙酸是以 30 分钟间隔定量 ( 保留时间 ： 乙醛 21.2 分钟 ； 乙醇 25.2 分钟 ； 乙酸 18.9 分钟 )。确定反应初速度 (30 分钟值 ) 并且将 单位计算为在 1 分钟内生成 1μmol 乙酸所需要的酶量。
结果清楚地显示大部分突变不利地影响针对两种醛的比活性。仅 I301L 和 F93A 证 明具有有意义的特性。在第 300 位置处导入亮氨酸导致乙醛活性提高 2.5 倍， 同时对甲醛 92 的比活性提高约 10 至 20％。F A 变体几乎完全丧失甲醛活性， 而与野生型酶相比， 对乙醛 301 的比活性提高约 3 倍并且与 FDM I L 突变体的活性相似 ( 表 11)。
表 11 ：
表 11 显示不同活性部位突变体针对甲醛 (FA) 和乙醛 (AA) 的比活性。如上所述， FA 活性由 pH-stat 滴定法确定 ； AA 活性由 HPLC 确定。＊该值符合由 pH-stat 滴定法测量的 活性。n.a. 无活性。
已经组合了第 301 和 93 位置处的突变以产生 FDM I301L/F93A 变体。这种双突变体 对甲醛没有任何活性， 但是针对乙醛具有提高 5 倍的活性。两种置换在增强对乙醛的活性 方面具有协同效应 ( 图 2)。
尽管突变体 I301L 显示扩展的底物特异性， 然而 FDM F93A 变体并且尤其双突变体显
示底物特异性从甲醛至乙醛的转变。图 3 显示通过 HPLC 测定的 FDM I301L 的活性曲线。
实施例 12 ： FDM、 FDM I301L 和 FDM I301L/F93A 的热稳定性
FDM 及其变体的重要特性是对酶纯化 ( 灭菌 ) 期间和技术应用期间升高温度的耐 受。 我们通过将 FDM、 FDM I301L 和 FDM I301L/F93A 在不同温度 (25-65℃ ) 预孵育 20 分钟并随 后通过用乙醛或甲醛测试样品而比较这些酶的热稳定。 如上所述， 通过 HPLC 测试 FDM I301L 和 FDM I301L/F93A 样品的乙醛活性。数据显示为与室温下所获得值相比较的相对活性 ( 图 4)。
如上所述， 通过 pH-stat 滴定法测试 FDM 和 FDM I30 样品的甲醛活性。数据显示为 与室温下所获得值相比较的相对活性 ( 见图 5)。令人感兴趣的是， FDM I301L 突变体显示与 野生型蛋白相比热稳定明显增加 (+5℃， 图 5)。F301L 和 F301L/F93A 突变体对乙醛显示相同的 热稳定曲线 (T50 大约 55℃ )。
实施例 13 ： FDM、 FDM I301L 和 FDM I301L/F93A 的晶体结构
在瑞士 Villingen 的 Synchrotron SLS 测量 FDM I301L/F93A 和 FDMI301L 的晶体 ( 表 12)。
表 12X 射线数据汇集的统计学
使用野生型结构作为结构模板 (pdb 代码 ： 2DPH)， 通过分子替换方法测定 FDM I L/F A 的结构。 作为数据质量的实例， 用于确定结构的第 93 位置处的野生型苯丙氨酸残 301 93 基连同 FDM I L/F A 突变体的密度图一起显示 ( 图 6)。红色差异电子密度表明应当将苯 丙氨酸作为丙氨酸建模并且水分子位于苯基环 Cε- 位置处。 完整酶的总体结构不因突变而
301 93改变。突变的影响限于诱变的位置及其近旁邻居。图 7 显示野生型 FDM 的活性部位的特写 图。该蛋白质以丝带式样描述。后续的氨基酸显示为球和棍 ： Cys 46、 His 67 和 Asp 170 配位催化性锌 ； Ile 301 和 Phe 93 是导入突变的位点 ； Met 337 和 Phe 127 是在突变影响下 改变其构象的氨基酸。也显示了锌离子和辅因子 (NADH)。
FDM I301L 突变体的结构 ：
在电子密度图中清楚地见到异亮氨酸 301 突变成亮氨酸。该侧链采取从活性部位 伸出的取向， 从而导致与 Val 303、 Phe 265 和 Phe 57 的更强烈疏水接触。这种增强的相互 作用可以代表提高的温度稳定性。该突变也对苯丙氨酸 127 产生影响。与野生型酶相比， 完整侧链略微移动并且苯环转动约 70° ( 图 8)。苯环是底物结合口袋的部分并且该侧链的新位置以如此方式约束结合口袋， 从而甲醛和乙醛的羰基处于从 NADH 辅因子转移氢负 离子的更有利位置。另外， 异亮氨酸 301 至亮氨酸的突变打开对面位点上的结合口袋， 从而 与野生型酶相比允许更好地接受立体化学上要求更多的乙醛作为底物。
FDM I301L/F93A 的结构 ：
异亮氨酸 301 至亮氨酸的突变对 Leu301 和对 Phe 127 产生与单突变体结构中相 同的影响。第二突变 (Phe 93 至 Ala) 为野生型的苯环 Cε- 位置附近存在的水分子 (H2O 339) 腾出空间。这个水分子与 NADH 的烟酰胺氧形成氢键并且与作为催化性锌的配体之一 的 Asp170 的羧基氧形成氢键。第三个微弱氢键与 Ala 338 的主链羰基氧形成。该水分子 与 Asp 170 的强氢键扭曲了该侧链的构象， 因而削弱锌配位作用。为产生氢键， Asp 170 的 侧链不得不转动约 14° ( 图 9)。 由于这个转动， 锌离子与其羧基氧之间的距离从 至 增加 最适锌配位作用的丧失可以解释双突变体总体降低的活性。另外， 与野生型酶或I301L 突变体相比， 较大的活性部位似乎阻止甲醛可以采取用于催化作用的有效取向。这 可以解释观察到的特异性从甲醛至乙醛的转变。该突变的第二种影响是改变的 Met 337 构 象。Met 337 的 Cε 原子朝前一个苯环的位置转动 90°。这种构象是一种极低能量构象， 因为它是蛋白质中甲硫氨酸的最优选旋转异构体。
总之， 这些结果表明 FDM I301L 单突变体是技术应用的最优选候选物。
实施例 14 ： FDM I301L 突变体的干燥制剂降低改性阴离子聚烷基二醇 - 酚 -FA 树脂 中 FA 含量的用途
又一种具有约 120ppm 残留 FA 含量的改性阴离子聚烷基二醇 - 酚 -FA 树脂用干燥 301 FDM I L 制剂 ( 制剂比活性 ： 大约 50U/mg) 处理。通过添加 50mg/L 酶粉末至该树脂随后 在室温孵育来进行此试验。下表 ( 表 13) 显示 5 小时后和 42 日后的剩余甲醛 ( 以 ppm 表 示 )。
5 小时后 无酶 FDM I301L(50mg/L)
126ppm 2ppm 42 日后 119ppm 1ppm如实施例 3 中所描述， 通过乙酰丙酮法确定甲醛含量。 301 实施例 15 ： FDM I L 突变体的干燥制剂降低改性 β 萘 -FA 磺化树脂中 FA 含量的用途 水溶性聚合物溶液 ( 改性 β 萘 -FA 磺化树脂 ) 用不同量的 FDM I301L 干燥制剂处 理 (20 至 200mg 制剂 /L 聚合物溶液 ) 并且在室温孵育 5 小时。此时， 添加相同量的酶并且 继续孵育直至 11 日。下表 ( 表 14) 显示使用 2×50mg/L 干燥酶制剂 5 小时、 24 小时、 4 日、 7 日和 11 日后的剩余甲醛 ( 单位为 ppm)。
如实施例 3 中描述， 通过乙酰丙酮法确定甲醛含量。 301
实施例 16 ： FDM I L 突变体的干燥制剂降低稳定化阴离子丙烯酸酯共聚物分散体 中 FA 含量的用途
水中的稳定化阴离子丙烯酸酯共聚物分散体 (54％固形物含量 ) 已经用 10mg/L 301 FDM I L 干制剂在室温处理。在离心 (2-4 小时， 以 14000 转 / 分钟， 室温 ) 后， 测定清亮水 相中甲醛的含量。下表 ( 表 15) 显示酶促处理 5 小时、 24 小时和 96 小时后分散体的甲醛含 量 ( 单位为 ppm)。
5 小时 无酶 FDM I301L(10mg/L)
发明背景
甲醛 ( 出于方便目的， 下文中常称作 “FA” ) 是一种由工业广泛用来制造建筑材料 和众多家用产品的重要化学品。FA 例如用于纺织工业中抗皱整理， 用于木材加工业中生产 和涂覆粗纸板并且用于化学工业中生产合成树脂如酚醛塑料或氨基塑料。 由于其高度挥发 性， FA 在生产过程期间释放至空气中并且认为对健康和环境造成重大影响。
FA 具有四项基本用途 ： 作为树脂生产中的中间体 ； 作为工业化学品生产中的中间 体； 作为杀生物剂 ； 和作为终端消费品 (end-use consumeritem) 的制品中的组分。树脂制 造占总消耗量的约 65％。 约三分之一用于合成大量化学衍生物， 包括季戊四醇、 六亚甲基四 胺和丁二醇。2％用于织物处理并且少量的 FA 作为防腐剂或杀生物剂在消费品和工业产品 如化妆品、 洗发剂和胶水中存在。最大数量的 FA 用于与脲、 蜜胺、 萘磺酸盐和苯酚并且在较 少程度上与它们的衍生物产生缩合物 ( 即树脂 )。这些树脂的主要部分用于产生粘合剂和 填充性树脂， 所述的粘合剂和填充性树脂用于制造刨花板、 胶合板和家具。 这些缩合物也用 于产生可固化模塑材料 (curable molding material) ； 用作表面涂料的原料和用作控释氮 肥。它们也作为纺织、 皮革、 橡胶和水泥工业中的辅料使用。其他用途包括绝缘材料、 砂纸 和制动衬片中铸造用砂、 褐块石棉和玻璃绒毡的粘合剂。极少量的脲 -FA 缩合物用于泡沫 树脂的制造中， 其中所述的泡沫树脂用于采矿领域和用于建筑物以及运输车辆的绝缘中。
一些基于 FA 的产品含有过量的未反应 FA， 所述的未反应 FA 可以从产品释放或通 过后继水解释放。一个实例是脲 -FA 树脂。脲 -FA 树脂是实际上代表一整类相关制品的 通用名称。约 60％的脲 -FA 树脂产量由其中该树脂用作胶的刨花板和胶合板制造业消耗。 脲 -FA 树脂也用于装饰性层压板、 纺织品、 纸张和铸造用砂模中。
最后， FA 树脂用来处理纺织品以赋予衣物抗皱性。树脂或化学整理在大多数情况 下是现代纺织品生产的终末阶段。目的是将由机械和化学处理的漂白、 染色或印花的织物 转变成适于销售的状态。最重要的工艺之一是由棉、 其他纤维素纤维及它们与合成纤维的 混纺物 (blend) 组成的机织物和针织物的耐洗整理 (washfast finishing)。
起初， 开发树脂整理剂以改善粘胶的常用织物的收缩。这些化合物通常衍生自甲 醛和脲。 为改善棉在纺织品市场上的竞争性， 已经开发了基于甲醛、 脲和乙二醛的杂环交联 剂并且它们一般用于易于护理和无皱整理。由于疑似在人类中有害， 不得不使产品中和工 业过程中的 FA 水平尽可能地低。
现有技术公开了目的在于除去 FA 的多项技术， 其中所述的 FA 例如是从产品释放 时或直接从如上文所介绍的熟知和广泛使用的树脂释放时存在于空气中的 FA。美国专利 5,352,274 公开了利用多个波纹状基板的空气滤器， 其中所述的波纹状基板被堆叠或贴紧 并且具有用于吸附杂质如 FA、 乙醛和丙烯醛的截留碳尘。 此项技术提供了物理吸附 FA 分子 但未通过化学或生物化学反应降解的方法。US 5,830,414 公开了用活性小分子如强酸、 强 碱或强氧化剂处理碳纤维。 这些化学品仅可以用来处理具有高度化学抗性的纤维如活性碳
纤维。另外， 如此处理过的纤维对操作潜在有害。在 JP2001340436 中描述了甲醛降解酶在 空气滤器中的用途。
就纺织工业和建筑材料而言， FA 还原剂不应当不利地影响织物特性， 如手感、 收缩率、 强度保持和色调或白度或者刨花板的机械性能。并且， 它当然必须是在生产中 使用时经济并且在合理的水平上有效。在纺织工业中， 具有活性亚甲基的化合物已经用 作 FA 还原剂以减少从耐久压烫处理的织物中释放的 FA 的量， 如 Textile Chemist and Colorist， 第 16 卷， 第 12 期， 第 33 页， 1984 年 12 月 ( 由美国纺织化学师与印染师协会 (AmericanAssociation of Textile Chemists and Colorists) 发表 ) 所述。含有活性亚 甲基氢的 FA 还原剂也可以添加至含有脲 / 甲醛或蜜胺 / 甲醛树脂的涂层组合物以降低甲 醛浓度 ( 例如， 美国专利 5,795,933 中描述 )。另外， 已知脲及其衍生物的添加清除甲醛。
现有技术未曾公开这样的 FA 还原剂， 它们有效减少释放的 FA 至目前希望的低水 平而未不利影响待用所述树脂处理的材料的特性。目前， 在耐久压烫整理组合物 (durable press finishing composition) 中最广泛使用的 FA 还原剂是多元醇， 如二甘醇和山梨醇， 并且在刨花板的制造中最广泛使用的 FA 还原剂是含氮化合物如脲、 蜜胺、 二嗪、 三嗪和胺 化合物 ( 美国专利号 4,559,097)。 但是， 化合物如这些化合物在降低 FA 水平以产生目前希 望的低水平方面不是充分有效。另外， 它们仅结合 FA 并且不催化它降解。另外， 一些甲醛 清除剂如脲延缓织物交联剂的反应性， 从而降低它们的效率。 甲醛歧化酶 ( 此后称作 “FDM” ) 活性首先由 Kato 和合作者在 1983 年描述 (Kato 等人， 1983， Agric.Biol.Chem.， 47(1)， 第 39-46 页 )， 但是直至 1995 年才鉴定到相应的基 因 (Yanase 等人 1995， Biosci.Biotechnol.Biochem.， 59(2)， 197-202)。用于重组产生和 纯化可溶性 FDM 的首个方案已经于 2002 年发表 (Yanase 等人， 2002， Biosci.Biotechnol. Biochem.， 66(1)， 85-91)。FDM(Hasegawa 等 人， 2002， Acta Crystallogr.， Sect.A， 58， C102-C102) 和其他相关酶的晶体结构自 2002 年以来是可获得的 (Tanaka 等人， 2002， Journal of Molecular Biology， 324， 519-533)。
发明概述
因此， 作为本发明基础的技术问题是提供有效方法和手段以降低来自例如纺织或 建筑工业中用来处理多种材料的制品中的 FA 含量， 克服现有技术的缺点。该问题由本发明 的主题解决， 即， 发明人已经惊讶地发现用来处理此类材料的树脂中的甲醛含量可以使用 催化甲醛降解的酶有效地降低。
此外， 本发明描述了 FDM 突变体的设计、 表征和晶体结构， 其中所述的 FDM 突变体 具有针对甲醛的改善特异性、 针对乙醛的增强活性和提高的热稳定性。 特别地， 与野生型蛋 301 白相比， FDM I L 突变体对甲醛显示提高的活性并且是更为热稳定的。这种酶可以轻易地 通过发酵以高产量产生并且制剂为喷雾干燥的粉剂。
因此， 本发明的一个目的涉及催化甲醛降解的酶制剂用于降低含甲醛制品中甲醛 含量的用途。
在一个优选的实施方案中， 酶制剂含有包含 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列的酶或其 变体。在又一个实施方案中， 该酶是来自细菌菌株的甲醛歧化酶 (FDM)， 优选地是 E.C 分 类 EC 1.2.99.4. 或 EC 1.2.1.46. 的甲醛歧化酶， 其衍生自恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida) 菌株。
发明概述
因此， 作为本发明基础的技术问题是提供有效方法和手段以降低来自例如纺织或 建筑工业中用来处理多种材料的制品中的 FA 含量， 克服现有技术的缺点。该问题由本发明 的主题解决， 即， 发明人已经惊讶地发现用来处理此类材料的树脂中的甲醛含量可以使用 催化甲醛降解的酶有效地降低。
此外， 本发明描述了 FDM 突变体的设计、 表征和晶体结构， 其中所述的 FDM 突变体 具有针对甲醛的改善特异性、 针对乙醛的增强活性和提高的热稳定性。 特别地， 与野生型蛋 301 白相比， FDM I L 突变体对甲醛显示提高的活性并且是更为热稳定的。这种酶可以轻易地 通过发酵以高产量产生并且制剂为喷雾干燥的粉剂。
因此， 本发明的一个目的涉及催化甲醛降解的酶制剂用于降低含甲醛制品中甲醛 含量的用途。
在一个优选的实施方案中， 酶制剂含有包含 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列的酶或其 变体。在又一个实施方案中， 该酶是来自细菌菌株的甲醛歧化酶 (FDM)， 优选地是 E.C 分 类 EC 1.2.99.4. 或 EC 1.2.1.46. 的甲醛歧化酶， 其衍生自恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida) 菌株。
在一个特别优选的实施方案中， 酶制剂含有包含 SEQ ID NO ： 8 或 SEQID NO ： 10 的 氨基酸序列的酶。
在又一个优选的实施方案中， 所述制品是树脂。该树脂可以是用于织物的交联剂 或用来生成聚合物分散体的高分子分散剂。在一个优选的实施方案中， 交联剂用于含有纤 维素纤维如棉或粘胶纤维或其混合物和与合成纤维的混纺物的织物。
所得的聚合物分散体适于处理材料例如构筑或建筑材料、 皮革和兽皮、 纤维板、 刨 花板、 胶合板和 / 或毛毯和适于涂覆应用或造纸。
在另一个实施方案中， 本发明涉及用于降低含甲醛制品中甲醛含量的方法， 包括 使该制品与催化甲醛降解的酶制剂接触。
本发明也涉及用于降低织物中甲醛含量的方法， 包括用催化甲醛降解的酶制剂接 触该织物。此外， 它涉及包含织物用交联剂或高分子分散剂和催化甲醛降解的酶制剂的制 品。
本发明的其他实施方案涉及密码子优化的编码歧化酶的核酸、 含有该核酸的载体 和表达宿主。
另外， 本发明涉及编码新 FDM 变体的分离的核酸， 所述 FDM 变体的氨基酸序列， 以 及其具体用途。
附图描述
图1： 几种基于甲醛的交联试剂。(A) 脲 -FA、 (B) 蜜胺 -FA、 (C) 二羟甲基二羟基 亚乙基脲 (DMDHEU)。
图2： 通过 HPLC 确定的 FDM、 FDM I301L、 FDM F93A 和 FDMI301L/F93A 的乙醛歧化初速 度 (50mM K2HPO4pH 8， 100mM KCl 中的 20mM)。酶浓度 50μg/mL。
图3： 通过 HPLC 使用 FDM I301L 变体， 甲醛 ( 上图 ) 和乙醛 ( 下图 ) 随时间的酶促 转化。反应混合物以 30 分钟间隔历经 2 小时分析。反应以 50mMK2HPO4( 对于甲醛， pH 7.3 并且对于乙醛， pH 8)， 100mM KCl 和 20mM 醛进行。 酶浓度对于乙醛是 50μg/mL 并且对于甲 醛是 2.4μg/mL。保留时间甲醛 ： 16.6 分钟 ； 甲酸 ： 17.5 分钟 ； 甲醇 ： 22.9 分钟 ； 乙醛 ： 21.2 分钟 ； 乙酸 ： 18.9 分钟 ； 乙醇 ： 25.2 分钟。产物等摩尔生成。通过 RI 检测。 301
图4： FDM I L 和 FDM I301L/F93A 的温度 - 活性曲线。底物 ： 乙醛 301
图5： FDM 和 FDM I L 的温度 - 活性曲线。底物 ： 甲醛 301 93
图6： 以 FDM I L/F A 突变体的电子密度图所示的野生型 Phe 93。
图7： 与甲醛 (FA) 复合的野生型 FDM 的活性部位的特写图
图8： 与甲醛 (FA) 复合的 FDM I301L 的活性部位的特写图
图9： 与乙醛 (AA) 复合的 FDM I301L/F93A 的活性部位的特写图。
序列描述
SEQ ID NO ： 1
甲醛歧化酶的核酸序列， Genebank 登录号 L25862(CDS 323..1522)
SEQ ID NO ： 2
甲醛歧化酶的蛋白质序列， Genebank 登录号 L25862
SEQ ID NO ： 3
来自恶臭假单胞菌 F61 的 FDM 的优化 DNA 序列 (1197bp)SEQ ID NO ： 4 pDHE-FDM 的核苷酸序列 SEQ ID NO ： 5 pAgro 的核苷酸序列 SEQ ID NO ： 6 pHSG 的核苷酸序列 SEQ ID NO ： 7 甲醛歧化酶 Ile-301-Leu 的核酸序列 SEQ ID NO ： 8 甲醛歧化酶 Ile-301-Leu 的蛋白质序列 SEQ ID NO ： 9 甲醛歧化酶 Phe-93-Ala/Ile-301-Leu 的核酸序列 SEQ ID NO ： 10 甲醛歧化酶 Phe-93-Ala/Ile-301-Leu 的蛋白质序列 定义应当理解本发明不限于如描述那样的具体方法学、 方案、 细胞系、 植物物种或属、 构建体和试剂。还应当理解本文所用的术语目的仅在于描述具体实施方案， 并且不意图限 制本发明的范围， 本发明的范围将仅受所附权利要求书限制。 必须指出， 如本文中并且所附 权利要求中所用， 单数形式 “一个 (a)” 、 “一种 (an)” 和 “该 (the)” 包括复数指称， 除非上下 文另外明确地指明并非如此。因此， 例如， 对 “一种载体” 的提及是对一种或多种载体的提 及并且包括本领域技术人员已知的其等同物等。术语 “约” 在本文中用来指大约、 大致、 左 右和在……范围内。当术语 “约” 与一个数字范围联合使用时， 它通过扩展界限值高于和低 于所述数值而修饰该范围。通常而言， 术语 “约” 在本文中用来通过 20％、 优选 10％之上或 之下 ( 更高或更低 ) 变异而修饰高于和低于所述值的数值。如本文中所用， 用语 “或” 意指 特定表单的任何一员并且还包括该表单的成员的任意组合。
术语 “甲醛” 或 “FA” 是指通式 CH2O 的化合物， 其具有 CAS 编号 50-00-0。它也由 技术人员称作福尔马林 (formalin)、 蚁醛 (methylene oxide)、 甲醛 (methyl aldehyde)、 甲 醛 (methanal)、 HCHO、 甲醛 (formic aldehyde)、 甲醛 (oxomethane)、 福尔马林 (formol)、 甲 醛 (oxymethylene)、 morbicid、 veracur、 甲二醇、 福尔马林 40、 BFV、 fannoform、 formalith、 FYDE、 HOCH、 karsan、 lysoform、 superlysoform、 methan 21。在纯形式下， 甲醛是气体， 但 是经常在用水稀释后作为水合物 HO-(CH2O)n-H( 称作甲二醇 (methandiol)) 以液体形式使 用。甲醛的水溶液称作福尔马林。它是一种无色、 高度可燃液体或气体， 具有百万分之一份 (ppm) 时可觉察的刺激气味。为本发明的目的， 也包括甲醛混合物 ( 例如与水、 丙酮、 苯、 二 乙醚、 氯仿和乙醇的混合物 )。由本定义包括的甲醛聚合物包括低和高分子量聚合物， 特别 是低聚甲醛以及直链和环状聚甲醛。
术语 “乙醛” 或 “AA” 是指通式 CH3CHO 的化合物， 其具有 CAS 编号 75-07-0。它也 由技术人员称作醋醛 (ethanal) 并且是一种具有刺激性、 窒息性气味的无色液体， 其稀释 时略有果香味。乙醛是植物和动物有机体代谢中的中间体， 在所述代谢中可以少量检测到 乙醛。较大量的乙醛干扰生物过程。作为醇发酵过程中的中间体， 乙醛以微小量存在于全部酒精饮料中， 如啤酒、 葡萄酒和烈酒。也已在植物汁液和精油、 焙烘咖啡和烟草烟雾中检 测到乙醛。在较高浓度 ( 直至 1000ppm)， 乙醛刺激黏膜。空气中乙醛的感知限处于 0.07 和 0.25ppm 之间的范围内。在此浓度， 乙醛水果气味明显。在暴露于 25 和 50ppm 浓度 15 分钟 后， 已经观察到结膜刺激作用， 但是在暴露于 200ppm 乙醛 15 分钟后， 已经报道了短暂结膜 炎和对呼吸道的刺激作用。
术语 “丙酮醛” 指通式 (CH3-CO-CH ＝ O) 的化合物， 其具有 CAS 编号 78-98-8(Kato 等 人， 1983， Agric.Biol.Chem.， 47(1)， 第 39-46 页 )。 它 也 由 技 术 人 员 称 作 丙 酮 醛 (pyruvaldehyde)、 2- 氧代丙醛 (2-oxopopanal)、 2- 氧代丙醛 (2-oxopropionaldehyde)， 并 且是几条代谢途径的副产物。
“制品 (formulation)” ， 如本文中所用， 意指特定公式和 / 或配方制造的化学组合 物。因此， 它区别于天然存在的含 FA 源。该制品通过采用 FA 添加来制造。在一些情况下， 该制品也称作 “FA 缩合物” 。
如本文中所用， 短语 “树脂” 意指随后会发生反应以形成高分子量聚合物或交联功 能高分子链 ( 如纤维素 ) 的低分子量物质。特别地， 术语树脂指 “合成树脂” ， 其中将所述的 合成树脂定义为由本身没有树脂特征的充分定义的反应物 ( 包括甲醛 ) 之间受控化学反应 如聚加成反应或缩聚反应而产生的树脂。 合成树脂也可以意指通过聚合不饱和单体所获得 的树脂。该术语包括 (i) 烃树脂， 即， 从煤焦油、 石油和松节油流中通过聚合作用产生的合 成树脂。 这些树脂如天然树脂那样使用， 例如， 与其他聚合物组合以向材料赋予特定特性如 粘着性、 流动性和硬度， 和 (ii) 在甲醛存在下主要通过加聚和缩聚所获得的合成树脂， 它 们是更高分子量塑料合成过程中的中间体。 此类树脂的实例和优选实施方案在下文更详细 地公开。
如本文中所用， 术语 “酶制剂” 意图涵盖处于任意纯度水平的任意酶制剂 ( 无论怎 样获得 )( 包括使用表达该酶的宿主即大肠杆菌 (E.coli)， 只要该制剂是有酶促活性的。 本 发明的酶制剂包括显示多种不同比活性的制剂， 并且以带有一种或多种载体的混合物中或 多或少粗制的酶提取物形式便利地使用。
如本文中所用， 术语 “交联剂” 或 “交联物 (crosslinker)” 意指如上文定义的含 FA 树脂， 其可以用来交联织物中的纤维素分子以特别对纤维素织物赋予抗皱性和耐久压烫特 性。此类交联剂的实例和优选实施方案在下文更详细地公开。
如本文中所用， 术语 “织物” 或 “织物 (fabric)” 意指从天然织物如黄麻纤维、 剑麻、 苎麻纤维、 大麻和棉以及多种合成纤维如粘胶纤维、 人造丝、 纤维素酯、 乙烯基树脂纤维、 聚 丙烯腈及其共聚合物、 烯烃如乙烯、 聚酰亚胺或尼龙型的聚合物和共聚合物、 聚酯等制成的 产物和物品。所用的织物可以是具有单一组成或纤维混合物的那些织物。
术语 “高分子分散剂” 指在水中轻易可溶解的高分子电解质。 最常见的代表是碱金 属聚碳酸盐、 聚磺酸盐或聚磷酸盐， 通常是钠盐。 优选的分散剂通过芳香族化合物与甲醛缩 合来产生。芳香族磺酸与甲醛的缩合产物的用途是极广泛的。一般而言， 它们是基于萘磺 酸盐、 蜜胺磺酸盐或苯酚或其衍生物的阴离子甲醛树脂。其他的高分子分散剂包括基于阴 离子主链和非阴离子侧链的接枝聚合物。 因此， 通常， 使用聚羧酸酯作为主链并且使用聚烷 撑二醇作为侧链。 所述高分子分散剂允许降低水硬粘合剂混合物如基于水泥和硫酸钙的体 系中的含水量， 而不分别降低可加工性、 流变学特性。 它们进一步可以用来改善水硬粘合剂(hydraulic binder) 的可加工性或用来增加强度发展。 高分子分散剂在本领域也称作″超 级塑化剂″。此类高分子分散剂也用于织物染色液中以稳定染料分散体。
术语 “变体” 相对于某序列 ( 例如， 多肽或核酸序列如， 例如本发明的转录调节性 核苷酸序列 ) 而言意图指基本上相似的序列。对于包含可读框的核苷酸序列， 变体包括因 为遗传密码的简并性而编码与天然蛋白相同的氨基酸序列的那些序列。 如可以使用熟知的 分子生物学技术鉴定天然存在的等位基因变体， 例如用聚合酶链反应 (PCR) 和杂交技术。 变体核苷酸序列也包括合成衍生的核苷酸序列， 如通过例如使用位点定向诱变法产生的那 些核苷酸序列， 并且对于可读框而言， 编码天然蛋白， 以及编码相对于天然蛋白而言具有氨 基酸置换的多肽的那些核苷酸序列。通常， 本发明的核苷酸序列变体将对 SEQ ID NO ： 1的 核苷酸序列具有至少 30、 40、 50、 60 至 70％， 例如优选地 71％、 72％、 73％、 74％、 75％、 76％、 77 ％、 78 ％至 79 ％、 通常至少 80 ％、 例如、 81 ％ -84 ％、 至少 85 ％， 例如 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％至 98％和 99％核苷酸 “序列同一性” 。 “变体” 多肽意指从 SEQ ID NO ： 2 的蛋白质中通过对该天然蛋白的 N- 末端和 / 或 C 末端缺 失 ( 所谓截短 ) 或添加一个或多个氨基酸 ； 在该天然蛋白中一个或多个位点处缺失或添加 一个或多个氨基酸， 或置换该天然蛋白中一个或多个位点处的一个或多个氨基酸所衍生的 多肽。此类变体可以例如因遗传多态性或因人操作产生。用于此类操作的方法通常是本领 域已知的。 “序列同一性” 指两个最佳比对的 DNA 或氨基酸序列在组分 ( 例如核苷酸或氨基 酸 ) 比对窗口范围内不变的程度。受检序列和参比序列的比对节段的 “同一性分数” 是由 两个比对序列所共有的相同组分的数目除以参比序列节段 ( 即完整的参比序列或参比序 列的较小限定的部分 ) 中组分的总数目。 “％同一性” 是同一性分数乘以 100。用于比对比 较窗口的最佳序列比对是本领域技术人员熟知的并且可以通过工具如 Smith 和 Waterman 的局部同源性算法、 Needleman 和 Wunsch 的同源性比对算法、 Pearson 和 Lipman 的相似性 搜索方法并且优选地通过这些算法的计算机化执行如作为 GCG.RTM.Wisconsin Package. RTM.(Accelrys Inc.Burlington， Mass.) 的部分可获得的 GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 TFASTA 来实施。
术语 “ppm” ( 每百万分之 ... 份 ) 指质量份额并且等同于 “mg/kg” 。
多肽 / 蛋白质
术语 “多肽” 和 “蛋白质” 在本文中可互换地使用并且指由肽键连接在一起的聚合 形式的任意长度的氨基酸。
多核苷酸 / 核酸 / 核酸序列 / 核苷酸序列
术语 “多核苷酸” 、 “核酸序列” 、 “核苷酸序列” 、 “核酸” 、 “核酸分子” 在本文中可互 换地使用并且指任意长度的聚合非分支形式的核苷酸， 所述核苷酸是核糖核苷酸或脱氧核 糖核苷酸， 或这二者的组合。
同源物
蛋白质的 “同源物” 包括这样的肽、 寡肽、 多肽、 蛋白质和酶， 它们相对于所讨论的 未修饰蛋白具有氨基酸替换、 缺失和 / 或插入并且与从中衍生它们的未修饰蛋白具有相似 的生物学活性和功能活性。
缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
插入指将一个或多个氨基酸残基导入蛋白质中的预定位点。 插入可以包含氨基端 融合和 / 或羧基端融合以及序列内插入单个或多个氨基酸。通常， 在氨基酸序列内部的插 入将比 N 端融合物或 C 端融合物小， 为约 1 至 10 个残基级别。氨基端或羧基端融合蛋白或 融合肽的实例包括如酵母双杂交系统中所用的转录激活物的结合结构域或激活结构域、 噬 菌体外壳蛋白、 ( 组氨酸 )-6- 标签、 谷胱甘肽 S- 转移酶 - 标签、 蛋白 A、 麦芽糖结合蛋白、 二氢叶酸还原酶、 Tag·100 表位、 c-myc 表位、 肽 )、 HA 表位、 蛋白 C 表位和 VSV 表位。 置换指蛋白质的氨基酸以具有相似特性 ( 如相似的疏水性、 亲水性、 抗原性、 形成 或破坏 α- 螺旋结构或 β- 折叠结构的倾向性 ) 的其他氨基酸替换。氨基酸置换一般是 单残基的， 但是根据对多肽所设置的功能性约束条件， 可以聚簇， 可以从 1 个至 10 个氨基 酸变动 ； 插入通常是约 1 个至 10 个氨基酸残基级别。氨基酸置换优选地是保守性氨基酸 替换。保守性置换表是本领域熟知的 ( 见例如 Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman andCompany( 编著 ))。
氨基酸置换、 缺失和 / 或插入可以使用本领域熟知的肽合成技术如固相肽合成法 等或通过重组 DNA 操作轻易地进行。用于操作 DNA 序列以产生蛋白质的置换、 插入或缺 失变体的方法是本领域熟知的。例如， 用于在 DNA 的预定位点处产生置换突变的技术是 本领域技术人员熟知的并且包括 M13 诱变法、 T7-Gen 体外诱变法 (USB， Cleveland， OH)、
- 表位、 lacZ、 CMP( 钙调蛋白结合QuickChange 位点定向诱变法 (Stratagene， San Diego， CA)、 PCR 介导的位点定向诱变或其 他位点定向诱变法。
衍生物
“衍生物” 包括这样的肽、 寡肽、 多肽， 其中与天然存在形式的蛋白质 ( 如目的蛋 白 ) 的氨基酸序列相比， 它们包含以非天然存在氨基酸残基置换氨基酸或者添加非天然存 在的氨基酸残基。蛋白质的 “衍生物” 也包括这样的肽、 寡肽、 多肽， 其中与所述多肽的天然 存在形式的氨基酸序列相比， 它们包含天然存在改变 ( 糖基化、 酰化、 异戊二烯化、 磷酸化、 肉豆蔻酰化、 硫酸化等 ) 的氨基酸残基或非天然改变的氨基酸残基。与从中衍生衍生物的 氨基酸序列相比， 该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个 非氨基酸替代或添加 ( 例如报道分子或其他配体 )， 如结合的以促进检测该衍生物的报道 分子， 和相对于天然存在蛋白的氨基酸序列而言， 包含非天然存在的氨基酸残基。 此外， “衍 生物” 也包括天然存在形式的蛋白质与标签肽如 FLAG、 HIS6 或硫氧还蛋白 ( 对于标签肽的 综述， 见 Terpe， Appl.Microbiol.Biotechnol.60， 523-533， 2003) 的融合物。
发明详述
本发明涉及催化甲醛降解的酶制品用于降低含甲醛制剂中甲醛含量的用途。
催 化 甲 醛 降 解 的 酶 是 本 领 域 已 知 的。 例 如， Bystrykh 等 人 (1993)J.Gen. Microbiol.139， 1979-1985 ； Sakai， Y. 等人 (1995)FEMS Microbiol.Lett.127， 229-234 ； 或 Ito 等人 (1994)J.Bacteriol.176， 2483-2491 或 Gonzalez 等人， J.Biol.Chem.， Vol.281， NO.20， 第 14514-14522 页， 2006 年 5 月 19 日描述了可以用于降解 FA 的酶， 如 S- 甲酰谷胱 甘肽水解酶、 甲醛歧化酶、 甲酸甲酯合酶或谷胱甘肽非依赖性甲醛脱氢酶。
属于含锌中等链长的醇脱氢酶家族的酶特别适用于本发明 ( 也参见 Tanaka 等人， J.Mol.Biol.(2002)324， 519-533)。在一个优选的实施方案中， 与常见醇脱氢酶中的辅酶( 作为共底物 ) 区别的吡啶核苷酸 NAD(H) 与该酶紧密但不共价地结合并且充当辅因子。
“紧密地结合” 意指辅因子通过相互作用如离子键、 分子间力、 氢键、 范德华力、 疏 水相互作用与酶结合。由于该辅因子在歧化反应期间循环 ( 相同的酶还原 FA 成甲醇和氧 化 FA 成甲酸 )， 故本发明的方法具有使成本最小化的特有优点， 因为不必持续向反应混合 物提供该辅因子以维持酶活性。
特别适用于本发明用途的是作用于供体的醛或氧化基的氧化还原酶 (E.C 分类 1.2.)。优选具有除 NAD 或 NADP、 细胞色素、 氧、 二硫化物、 铁硫蛋白 (E.C. 分类 1.2.99) 之 外的受体的氧化还原酶。 优选地， 该酶是来自细菌菌株的甲醛歧化酶 ( 下文常称作 “FDM” )， 更优选地是 E.C 分类 EC1.2.99.4. 或 EC 1.2.1.46. 的甲醛歧化酶， 其衍生自恶臭假单胞 菌菌株。该酶在 Kato， N.， 等人 (1983)Agric.Biol.Chem.， 47(1)， 39-46， Yanase， H.， 等人 (1995)Biosci.Biotechnol.Biochem.， 59(2)， 197-202 和 Yanase， H.， 等人 (2002)Biosci. Biotechnol.Biochem.， 66(1)， 85-91 中进一步描述。
在一个优选的实施方案中， 酶制剂含有包含 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列的酶或其 变体。 在一个进一步优选的实施方案中， 酶制剂含有由 SEQ IDNO ： 1 的核酸编码的酶或其变 体。 在一个特别优选的实施方案中， 如下文以更多细节所述， 酶制剂含有这样的酶， 其 包含 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列的变体或衍生物， 其中第 93 位置处的苯丙氨酸和 / 或第 301 位置处的异亮氨酸和 / 或第 337 位置处的甲硫氨酸和 / 或第 127 位置处的苯丙氨酸已 经由任何的其他氨基酸置换。
对于本发明的用途， 酶制剂可以纯化以具有多个纯度水平的情况下或作为未纯化 的提取物使用， 例如作为细菌提取物， 即来自天然产生所需酶的细菌的或作为表达宿主使 用的细菌中的提取物。备选地， 也可以使用正在生长的细胞， 其中所述的细胞包含编码 FDM 的核酸、 携带所述核酸的核酸构建体或载体， 而不包括任何蛋白质纯化步骤。 也可以使用休 眠的或破裂的细胞。 破裂的细胞理解为意指例如通过用例如溶剂处理使之可通透的细胞或 已经通过酶处理、 通过机械处理 ( 例如弗氏压碎器或超声波 ) 或通过另一种方法破裂的细 胞。如此获得的粗提物以有利方式适合本发明的用途。也可以对该过程使用纯化或部分纯 化的酶。可以在该反应中有利使用的固定微生物或酶是同样适合的。当游离的生物或酶用 于本发明方法时， 在提取之前适当地移出它们， 例如通过过滤或离心。
取决于待接触的含 FA 制品， 酶制剂可以以游离 ( 可溶性或固态 ) 或固定的形式 使用。固定的酶意指被固定至惰性支持物的酶。适合的支持材料和固定于其上的酶在 EP-A-1149849， EP-A-1 069 183 和 DE-A 100193773 中公开和在其中所引用的参考文献中 公开。以这种方式， 参考这些出版物的全部公开内容。合适支持材料的实例是粘土、 粘土矿 物如高岭石、 硅藻土、 珍珠岩、 二氧化硅、 氧化铝、 碳酸钠、 碳酸钙、 纤维素粉、 阴离子交换材 料、 合成聚合物如聚苯乙烯、 丙烯酸树脂、 酚醛树脂、 聚氨酯、 聚烯烃如聚乙烯和聚丙烯。支 持材料通常以用于制备所支持酶的精细分开的颗粒形式使用， 优选多孔形式。支持材料的 粒径通常不大于 5mm， 尤其不大于 2mm( 筛目等级 )。类似地， 当使用作为完整细胞催化剂 的 FDM 时， 可以选择游离或固定的形式。支持材料的实例是藻酸钙和角叉菜胶。酶及细胞 也可以用戊二醛直接连接 ( 产生 CLEA 的交联 )。相应和其他的固定方法例如在 K.Drauz 和 H.Waldmann， Enzyme Catalysis in Organic Synthesis2002， 第 III 卷， 991-1032，
Wiley-VCH， Weinheim 中的 J.Lalonde 和 A.Margolin“Immobilization of Enzymes” 中描 述。
待使用的酶量取决于酶制剂的纯度水平。 本发明方法的常见量在每克处理的含 FA 制品 0.1 至 1000 单位之间变动， 优选地在每克处理的含 FA 制品 1 至 500 单位之间、 更优选 地 5 至 100 单位之间、 甚至更优选地 8 至 30 单位之间， 最优选地 9 至 15 单位之间变动。一 个单位定义为每分钟催化 1μmol 甲酸形成所需要的酶量。 纯化的 FDM 具有约 100-200U/mg 比活性。酶量仅是可以根据反应条件如温度和孵育时间变动的近似值。可以通过开展常规 实验轻易地确定最适酶量。
本发明可以应用于已经用甲醛整饰过的全部制品。 最大类别的含甲醛制品是含有 脲、 蜜胺、 萘和酚的树脂类别及其衍生物如 DMDHEU。喷雾干燥添加剂和流变性调节剂在产 生分散体 ( 如 FA 与酚磺酸或萘磺酸的缩聚物 ) 中使用。其他制品包括绝缘材料、 砂纸和 制动衬片中铸造用砂、 石棉和玻璃绒毡的粘合剂或在制造泡沫树脂中使用的脲 - 甲醛缩合 物。含有甲醛的其他制品包括季戊四醇 ( 主要以原料用于表面涂料中和安全炸药中 ) 和作 为酚 - 甲醛缩合物和安全炸药的交联剂使用的六亚甲基四胺。在化妆品工业中， 甲醛作为 防腐剂用于数百种产品， 例如， 皂类、 除臭剂、 洗发剂和指甲硬化制剂。 本领域也已知使用甲 醛溶液作为鞣皮液防腐剂、 分散体、 作物保护剂和木材防腐剂。另外， 糖工业中需要甲醛来 防止在糖浆回收期间的细菌生长。 因此， 在一个优选的实施方案中， 待与催化甲醛降解的酶制剂接触的含甲醛制品 是树脂。上文给出了树脂、 尤其是合成树脂的一般定义。
优选地， 本发明可以应用于通过加聚和缩聚获得的 FA 树脂。实例包括呋喃树脂、 酮与醛树脂， 如苯乙酮甲醛树脂或丙酮甲醛树脂、 酚树脂如线型酚醛清漆和可熔酚醛树脂、 环氧树脂如液态环氧树脂 (DGEBA)、 基于 DGEBA 的固态环氧树脂、 卤代环氧树脂、 环氧酚醛 清漆树脂、 磺酰胺树脂或苯胺树脂。
例如， 广泛用于胶粘木材的酚树脂是不同酚类化合物和醛类的缩合物。酚类化合 物可以是苯酚本身、 多羟基酚和脂族或芳香族取代的酚。酚类化合物的实例是烷基酚如间 苯二酚、 烷基间苯二酚、 甲酚类、 乙基酚和二甲酚， 并且还有天然来源的酚类化合物如单宁 类、 Cardenol 和强心酚。 酚树脂组合物中的基于甲醛的酚树脂包括间苯二酚 - 甲醛、 酚-间 苯二酚 - 甲醛和单宁 - 甲醛树脂。
在一个特别优选的实施方案中， FA 树脂是氨基树脂， 如脲树脂、 聚氨酯树脂、 蜜胺 树脂、 氨腈和双氰胺树脂。
氨基树脂通常用做粘合剂 ； 填充性树脂 ； 模塑材料 ； 制造表面涂料的原料 ； 纸张、 织物、 皮革和浮选法的辅料 ； 建筑材料的加强物 ； 超塑化剂 ； 玻璃纤维和铸造用砂铸件的粘 合剂 ； 打火机 ； 金刚砂纸 ； 阻燃涂料 ； 防火的易燃物品 ； 用于多种目的的泡沫树脂 ； 砂轮 ； 离 子交换树脂 ； 污水絮凝剂 ； 和微胶囊生产。
如本文中所用， 短语 “粘合剂” 意指将材料固定在一起的胶、 将材料固定在一起的 层压树脂和基质树脂。 胶和填充性树脂是从脲、 蜜胺和 / 或酚与甲醛制得的水质粘合剂。 本 领域已知的胶用于制造木基板材例如刨花板、 中密度纤维板 MDF、 定向刨花板 OSB、 胶合板、 芯板或夹芯板 (sheeting)。填充性树脂用于浸渍纸， 所述的浸渍纸用于木基板材的装饰性 涂层， 例如在家具和层压地板的表面上。填充性树脂用作刨花板、 胶合板、 纤维板和家具工
业中的树脂胶。填充性树脂也用来浸渍装饰性层压制品用纸和用于涂覆木刨花板。
目 前 通 常 在 一 般 用 来 交 联 纤 维 素 分 子 的 称 作 轧 烘 焙 工 艺 (pad-dry-cure process) 的方法中使纺织材料抗皱或免烫。 纤维素的这种交联赋予织物恢复其原始形状和 平滑的倾向。如上文所述， 一些类别的 DMDHEU 树脂已经在过去广泛用作这种工艺中的交联 剂。
因此， 在本发明的另一个实施方案中， 待与催化甲醛降解的酶制剂接触的交联物 是适于整理织物的交联剂。
已经在现有技术中广泛描述了织物整理工业中所用的交联剂 ( 见， 例如， Ullmann 第四版， 第 23 卷 )。本领域技术人员已知的交联剂包括 “自交联” 剂 ( 具有氮原子上的活泼 氢原子 ) 和 “反应物交联” 剂 ( 氮是杂环的部分 )。
脲、 取代脲或蜜胺的多功能羟甲基衍生物是商用易于打理用整理剂的优选交联 剂， 其中所述的多功能羟甲基衍生物通过甲醛与这些化合物反应产生。一个重要类别是由 环状脲衍生物的羟甲基化合物构成 ； 实例是二羟甲基乙撑脲、 二羟甲基丙撑脲和二羟甲基 脲酮 (dihydroxymethylurone)。 非环状化合物如多种烷基氨甲酸酯也是常见的整理剂。 与 纯的脲 - 甲醛化合物相反， 这些整理剂显示形成自交联树脂的微小倾向并且主要与纤维素 反应以使纤维交联。 脲自身的羟甲基衍生物特别地用于人造丝织物。实例包括二羟甲基脲、 N， N” -双 ( 羟甲基 ) 脲、 三羟甲基蜜胺的二甲醚、 脲酮类 (urons) 即四氢 -3， 5- 双 ( 羟甲基 )-4H-1， 3， 5- 氧二氮杂苯 -4- 酮、 环状脲产物、 氨甲酸酯的羟甲基衍生物、 尤其氨甲酸甲酯和氨甲酸 甲氧乙酯。
优选地， 使用通过乙二醛与脲反应产生的二羟乙撑脲的羟甲基衍生物作为易于 打理用整理剂中的交联剂， 例如 WO98/029393 中所述的二羟甲基二羟乙撑脲 (DMDHEU)、 1， 3- 二甲氧基甲基 DHEU 和完全甲基化产物。乙二醛 - 脲型产物的多种修饰法均为商用。已 经甲基化并含有羟基化合物的产品提供羟甲基型的市售易于打理用整理剂的最低甲醛散 出潜能。Ullmann 第四版第 23 卷第 7 章中描述了多种交联物。
由于所描述的交联剂主要用来交联纤维素分子， 故待处理的织物优选地含有纤维 素或纤维素纤维。
本发明适合处理含有至少 10 ％、 优选地至少 20 ％、 至少 30 ％、 至少 40 ％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 至少 80％、 至少 90％、 最优选直到 100％纤维素纤维的纤维状 纤维素材料。实例包括黄麻纤维、 亚麻、 麻布、 大麻、 粘胶纤维、 再生纤维素如人造丝和优选 地棉。纤维素材料可以是机织、 非机织或针织的或处于纤维、 棉短绒、 粗纱、 丝条、 稀纱布或 纸的形式。 纤维状纤维素材料可以完全由棉组成或由与合成纤维如聚酯或尼龙混纺的棉组 成。
如上文所述， 树脂， 特别地蜜胺树脂或任一其他氨基 -s- 三嗪如胍胺广泛地用作 建筑材料或超塑化剂 ( 也称作混凝土液化剂 )。出于这些目的， 所述树脂通常通过与其他 化合物反应进行改性。特别有用的是基于蜜胺、 甲醛和亚硫酸盐的缩合产物 ( 见例如 EP 0 336 165)。
这些聚合物可以在自由基引发剂、 乳化剂和 / 或保护性胶体 ( 此处称作调节剂和 其他添加剂 ) 存在下通过如定义部分中定义的高分子分散剂引发的乳液聚合常规地制备
为分散体。
因此， 在本发明的又一个优选的实施方案中， 树脂是使用来制备聚合物分散体的 含有 FA 的高分子分散剂或 FA- 缩合物。
术语 “聚合物分散体” 指用于建造化学领域的原料。产品包括丙烯酸分散体以及 丙烯酸粉末和苯乙烯 / 丁二烯分散体。它们增强建造化学品、 建筑用粘合剂和密封胶的可 加工性和技术性能。使用高级聚合物分散体和添加物作为建筑涂料原料， 与其他组分组合 以产生即用型产物如油漆、 木染料或织物整饰剂。 特别地， 该术语指含有甲基丙烯酸 (MAS)、 羟甲基甲基丙烯酰胺 (MAMol) 和 / 或羟甲基丙烯酰胺 (AMol) ； 丙烯酰胺、 丙烯酸、 丙烯腈、 丙烯酸酯和苯乙烯之均聚物和共聚物的分散体， 所述的分散体也用作织物涂料印花和 / 或 涂敷中的粘合剂。此类聚合物分散体的进一步的实例和优选实施方案在下文公开。
术语 “涂料印花 (pigment printing)”指片状纺织材料色彩提花 (coloristic patterning) 的方法， 所述方法是本领域的常识并且已经在世界各地长时间实施。 在涂料印 花中， 特定的涂料通常从含水印花浆中连同粘合剂系统一起施加至纤维网并且随后干燥。 用于固化所述优选的合成性树脂粘合剂系统并因而固定所施加着色剂的后续干热处理终 止该印花过程。
此外， 对于作为建筑材料的用途， 缩合产物如亚硫酸盐改性的蜜胺树脂、 萘磺酸盐 与水溶性乙烯基或丙烯酰基聚合物组合。适宜聚合物的实例是醋酸乙烯酯、 丙酸乙烯酯、 月桂酸乙烯酯、 氯乙烯、 偏二氯乙烯、 具有 3 至 18 个 C 原子的直链或支链乙烯酯、 聚 ( 乙烯 醇 )、 聚 ( 乙烯硫酸酯 )、 丙烯酰基和甲基丙烯酰基单体、 特别是酯类的产物， 也是可能以其 均聚物、 共聚物、 四聚物形式和作为接枝聚合物存在的苯乙烯和乙烷、 马来酸 - 苯乙烯共聚 物。
应用此类聚合物分散体的优选领域是油漆、 装饰性和保护性涂料和漆、 建筑用化 学品， 作为水泥砂浆中的添加物和填料、 造纸用辅助材料和纸张涂料、 织物涂料和塑料着色 剂。
而且， 本发明的发明人已经建立了不同方法以根据用途应用催化降解 FA 的酶制 剂。
因此， 本发明的另一个目的涉及用于降低含甲醛制品中甲醛含量的方法， 包括使 该制品与催化甲醛降解的酶制剂接触。
“接触” 可以在该制品的预期使用之前或期间发生。接触可以意指添加至和 / 或 ( 如果含 FA 制品为液体 ) 混合或 ( 如果该制品是相当粘稠或坚固的材料 ) 施加至某表面。
在一个实例中， 酶制剂可以直接地添加至刨花板制造中所用的脲 - 甲醛树脂或用 水稀释并在刨花板压制之前喷洒到其表面上。 应用或添加的酶取决于添加至刨花板的树脂 的性质和固化条件。但是， 可以通过测试多种酶量并且评价由板材释放的甲醛的量来确定 任意具体情况的恰当量。
本发明人也已经发现当直接应用催化甲醛降解的酶制剂至织物本身时可以降低 织物中的甲醛含量。
因此， 本发明的另一个目的涉及用于降低织物中甲醛含量的方法， 包括将催化甲 醛降解的酶制剂接触该织物。
优选地， 织物是已经在湿条件和干燥条件下通过用如上文所述的整理剂如乙二醛树脂、 福尔马林、 脲甲醛树脂、 二羟甲基脲、 脲甲醛的二甲醚、 蜜胺甲醛树脂、 环状乙撑脲甲 醛树脂例如二羟甲基脲、 三嗪 - 甲醛树脂、 三嗪酮甲醛树脂等加热、 干燥和固化而赋予抗折 和抗皱特性的 “交联织物” 。
简而言之， 用如上文所定义交联剂处理的织物以如实施例部分中所描述的酶制剂 浸渍。可以用湿或干燥的织物实施与酶制剂孵育之后残留 FA 的检测。优选地， 用湿织物进 行。
本发明中所指的含 FA 制品显示约 1 至 50000ppm 的甲醛浓度。常见量是 10 至 5000ppm。本发明的方法允许明显降低甲醛含量。
适当地， 与制品， 即与该酶制剂不接触的成品， 相比较， FA 含量降低了 10、 20、 30、 40、 50、 60 至 70％， 例如优选 71％、 72％、 73％、 74％、 75％、 76％、 77％、 78％至 79％， 通常至 少 80 ％， 例如 81 ％ -84 ％， 至少 85 ％例如 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94％、 95％、 96％、 97％至 98％和 99％和 100％。
确定残留 FA 含量的方法是现有技术中熟知的。甲醛可以通过物理或化学方法定 量地测定。甲醛的纯水溶液的定量测定可以通过测量其比重迅速实施。气相层析和高压液 相色谱法 (HPLC) 也可以用于直接测定。用于测定甲醛的最重要化学方法在 H.Petersen， N.Petri， Melliand Textilber.66(1985)217-222、 285-295、 363-369 中总结。最常使用亚 硫酸钠法。该方法基于甲醛与过量亚硫酸钠反应时所产生碱的定量释放。通过用酸滴定 测定以化学计量方式形成的碱。可以借助气体采样装置测定空气中的甲醛低至 μL/m3 范 围的浓度。Verein Deutscher Ingenieure(VDI) ； 1， Messen Immissionen， Bestimmen der Formaldehydkonzentration nachdem Sulfit-Pararosanilin-Verfahren， Richtlinie VDI 3484， Blatt 1， Düsseldorf 1979 中描述了通过亚硫酸盐 / 副品红法定量 测定空气中的甲醛。 存在用于织物中甲醛释放分析的众多其他检验方法， 如日本 LAW112( 即， 乙酰丙 酮法 )、 AATCC-112( 即， 变色酸法 )、 Shirley I 和 II 方法和其他方法。用于检测织物中 FA 的优选方法是由 “欧盟标准化委员会” 在 EN ISO 14184 第 1 部分和第 2 部分中使用的 LAW112 和 AATCC112 方法。就本发明的方法而言， 可以降低残留甲醛含量至少于 250、 优选 少于 100、 更优选少于 50、 甚至更优选少于 20 并且最优选少于 10ppm。
实施本发明方法所需要的温度范围可以在 10℃至 100℃、 优选 20℃至 40℃、 更优 选 25℃至 35℃之间变动， 最优选在 30℃。本发明的方法通常在 3 和 12 之间、 优选在 5 和 9 之间、 更优选在 7 和 8 之间变动的 pH 条件下实施。最适 pH 值可以通过本领域技术人员熟 知的手段确定和调整。
孵育时间可以根据所选的酶量、 反应温度和制品中的 FA 含量， 以及根据制品本身 的性质变动。通常， 孵育时间是在分钟或小时范围内， 优选地是 5 分钟至 10 小时， 更优选地 是 20 分钟至 5 小时， 更优选地是 30 分钟至 2 小时。最适孵育时间可以由本领域技术人员 根据所处理的产品轻易地确定和调整。
本发明方法可以在常规生物反应器中分批、 半连续或连续地实施。适合的方案
和生物反应器是技术工人熟悉的并且例如在通过引用方式并入本文的ChemieLexikon 第 9 版， Thieme Verlag， 条目标题 “Bioreactors” 或 Ullmann’ s Encyclopedia of Industrial Chemistry， 第 5 版， 第 B4 卷， 第 381ff 页中描述。反应器的运行和工艺方案可以针对想要的 FA 降解反应的具体要求适应于技术人员。如果该方法以分批模式进行， 则在 合成、 聚合、 分离后和任选地纯化该制品之后直接添加酶制剂。在使用 FA 歧化酶成功降解 甲醛之后， 酶可以与该制品分离。备选地， 该酶可以留在此制品中并且根据需要灭活， 例如 通过加热或酸化， 并且条件是这种灭活不有损于此制品。 如果该方法连续地进行， 则酶制剂 优选地固定在可以充填例如至特定柱中的载体上。一般地， 将制品在适合的条件下泵送经 过该柱。为进一步增强 FA 减低效果， 可以依次串联连接几个酶反应器。
为了本发明的目的， 酶制剂可以以本领域技术人员已知的任意形式、 配方和组成 添加。本领域技术人员将轻易理解适用于本发明的酶制剂将取决于几个因素， 包括但不 限于含 FA 制品的精确组成。他们还会理解存在用于配制酶制剂的几种方法。酶制剂可 以使用酶颗粒和 / 或液体制剂的标准方法配制。对与酶颗粒和 / 或酶的液体制剂有关的 步骤的描述存在于 1988 年 Helmut Uhlig， John Wiley and Sons 的 “ 《工业酶及其应用》 (IndustrialEnzymes and their Application)” 中。
适合的酶制剂例如是通过酶溶液的造粒、 挤出、 喷雾干燥、 或冻干可获得的固态酶 制剂以及优选地是酶的浓缩溶液， 其任选地含有稳定剂。 备选地， 处于固态或液态形式的酶 制剂可以吸附于固体载体上和 / 或胶囊化。已经提出用于制备固定化酶类的方法包括底物 结合法、 交联聚合法、 凝胶包含法等。 在一些实施方案中， 当用于本发明的酶制剂在颗粒组合物或液体中使用时， 希望 酶制剂处于包封粒子的形式以保护该酶在贮藏期间免受颗粒组合物的其他组分影响。此 外， 包封也是控制 FA 降解过程期间酶制剂可获得性的手段并且可以增强酶制剂的性能。构 思了在本发明中将使用任意合适的包封材料。包封材料一般包封酶制剂的至少部分。一般 地， 包封材料是水溶性和 / 或水可分散的。简而言之， 酶制剂与化合物如藻酸钠、 琼脂糖或 交联葡聚糖凝胶混合并且随后根据本领域已知的方法沉淀。备选地， 可通过喷雾干燥或挤 出酶制剂实施包封。
所述酶颗粒的保护性包衣材料的实例包括天然材料如糖类、 多糖、 多肽如胶原蛋 白、 白蛋白或明胶、 油、 脂肪酸、 蜡。作为包衣材料， 也包括半合成性材料如化学改性的纤维 素化合物、 淀粉衍生物或合成性包衣材料如聚丙烯酸酯、 聚酰胺。 包衣可以进一步包括通过 聚阳离子和聚阴离子相互作用所生成的聚合电解质络合物。 常见的聚阳离子包括天然化合 物如环磷酰胺 (cytosan) 以及合成性聚合物。
酶制剂可以与化学惰性载体材料或粘合材料一起造粒。载体材料包括硅酸盐、 碳 酸盐或硫酸盐。 粘合材料例如是非交联的聚合物组分如聚丙烯酸酯、 聚甲基丙烯酸酯、 聚乙 烯吡咯烷酮、 多糖。
备选地， 为了保护酶制剂免遭灭活或变性， 添加稳定化合物可能是合适的。 稳定化 合物的实例包括蛋白酶抑制剂， 如硼酸及其衍生物、 氨基醇和低级脂族醇。 酶制剂可以用化 合物如聚酰胺低聚物 (polyamid oligomer) 或高分子组分如木质素、 水溶性乙烯基共聚物 保护免受物理效应或 pH 变动的影响。此外， 抗氧化剂如二硫苏糖醇 (DTT) 是通常使用的酶 稳定剂。
如果催化甲醛降解的酶制剂应当直接并入含 FA 制品中， 则在一些实施方案中要 求酶以干燥的形式存在。如果仅在含 FA 制品的应用期间添加催化甲醛降解的酶制剂， 则酶 制剂可以以液态、 凝胶或糊膏样形式存在。 在本领域熟知的蛋白质纯化和分离方法后， 酶制
剂可以作为浓缩的水溶液、 混悬液或乳液添加。可以用来获得适合酶制剂的溶剂的实例包 括醇类、 烷醇胺或甘醇或二甘醇、 甘油、 山梨醇、 葡萄糖、 糖精。 为了提高黏度， 酶制剂可以含 有一种或多种增稠剂， 也称作溶胀剂。 适合的增稠剂包括例如藻酸盐、 果胶、 淀粉、 糊精或合 成性增稠剂聚碳酸、 聚乙二醇、 聚丙烯酰组合物、 聚酰胺或聚醚。
对于一些制制品， 希望酶制剂已经含于所述制品内， 保持这些制品中 FA 含量尽可 能低。
在一个优选的实施方案中， 本发明的酶制剂包含 (a)0.1-10％的 FA 降解酶， 优选 FDM， 和 (b)1-80％的一种或几种多元醇 ( 甘醇、 甘油、 山梨醇、 葡萄糖、 蔗糖、 聚乙二醇等 ) 和 (c)1-99％的水。
在本发明的另一个实施方案中， 将干 ( 固态 ) 酶制剂添加至固态产品配方。一旦 添加水至该固体制品， 则启动减低 FA 的活性。
因此， 本发明的另一个目的涉及适于织物整理的制品， 该制品包含交联剂和催化 甲醛降解的酶制剂。
酶制剂可以按照类似于已知的降低甲醛剂的方式使用。例如， 酶制剂可以并入包 含 N- 羟甲基交联系统的耐久压烫整理交联剂如 DMDHEU 中。完全或部分地由纤维素纤维组 成的织物可以用耐久压的整理组合物浸轧 (pad)、 泡沫整理或浸渍。 优选地， 该交联剂选择自由蜜胺 -FA、 脲 -FA 或脲 - 乙二醛 -FA 化合物组成的组。
本发明的另一个目的涉及适用于处理建造材料、 特别是水硬粘合剂如水泥、 石膏、 砂浆或贫石灰、 纤维板、 刨花板、 胶合板、 木材、 皮革和 / 或毛毯的制品， 该制剂包含如上文 所述的高分子分散剂和催化甲醛降解的酶制剂。
在一个优选的实施方案中， 聚合物分散剂选自由萘甲醛缩合物、 酚甲醛缩合物、 脲 甲醛缩合物和蜜胺甲醛缩合物组成的组。
可以提供交联剂或聚合物分散剂已经与酶制剂混合或可以提供为试剂盒， 其中将 酶制剂在上文所述的交联剂或聚合物分散体预期用途之前添加至交联剂或聚合物分散体， 旨在降低最终产品的 FA 含量。在一些情况下， 必须优化孵育时间以避免最终产品的过度降 解。
为了本发明的目的， 希望酶易于大量获得。 适当地， 该酶在允许大规模产生异源表 达蛋白质的细菌中表达。 为了优化表达， 即增加所表达酶的产量， 本发明的发明人已经构建 了编码催化甲醛降解的酶的核酸。
因此， 本发明的另一个目的涉及编码催化甲醛降解的酶的分离核酸， 其中该核酸 的序列为了在表达宿主中的表达而进行了密码子优化。
优选地， 表达宿主是大肠杆菌 (Escherichia coli)。
虽然大肠杆菌是通常用来表达催化甲醛降解的酶的细菌宿主细胞的一个实例， 但是其他细菌宿主细胞可以在本发明中用来表达外源 DNA， 所述的细菌宿主细胞包括例 如 埃 希 氏 菌 属 (Escherichia)、 肠 杆 菌 属 (Enterobacter)、 固 氮 菌 属 (Azotobacter)、 欧 文 氏 菌 属 (Erwinia)、 芽 孢 杆 菌 属 (Bacillus)、 假 单 胞 菌 属 (Pseudomonas)、 博德特 菌 属 (Bordetella)、 红 杆 菌 属 (Rhodobacter)、 苛 养 木 杆 菌 属 (Xyella)、 克雷伯氏菌属 (Klebsielia)、 变 形 杆 菌 属 (Proteus)、 沙 门 菌 属 (Salmonella)、 沙 雷 菌 属 (Serratia)、 志 贺 菌 属 (Shigella)、 根 瘤 菌 属 (Rhizobium)、 透 明 颤 菌 属 (Vitreoscilla) 和 副 球 菌
属 (Paracoccus)， 以 及 真 菌 宿 主 细 胞， 包 括 例 如 曲 霉 属 (Aspergillus)、 毕赤酵母属 (Pichia)、 木 霉 属 (Trichoderma)、 汉 逊 酵 母 属 (Hansenula)、 酵 母 属 (Saccharomyces)、 克 鲁 维 酵 母 属 (Kluyveromyces)、 裂 殖 酵 母 属 (Schizosaccharomyces)、 金小孢子属 (Chrysosporium)、 假丝酵母属 (Candida) 和球拟酵母属 (Torulopsis)
Burgess-Brown 等人， Protein Expr Purif.， 2008 年 5 月 ； 59(1) ： 94-102 中充分 描述了用于大肠杆菌中表达的密码子优化的特征和优点。
在一个优选的实施方案中， 该核酸的序列包含 SEQ ID NO ： 3 的序列或其变体。
本发明的另一个目的涉及含有本发明核酸的表达载体。
适合的载体包括噬菌体、 质粒、 病毒或逆转录病毒载体以及人工染色体， 如细菌或 酵母人工染色体。另外， 该术语还涉及靶向构建体， 允许靶向构建体随机或位点定向整合 至基因组 DNA 中。此类靶向构建体优选地包含用于如下文详述的同源或异源重组的长度 足够的 DNA。包含本发明多核苷酸的载体优选地还包含用于宿主中增殖和 / 或选择的选择 标记。载体可以通过本领域熟知的多项技术并入宿主细胞中。如果被导入宿主细胞中， 载 体可以停留在细胞质中或可以并入基因组中。在后一种情况下， 可以理解载体可以进一步 包含允许同源重组或异源插入的核酸序列。 载体可以通过常规转化或转染技术导入原核或 真核细胞中。如本上下文中所用， 术语 “转化” 和 “转染” 、 接合和转导， 意图包括用于将外 源核酸 ( 例如 DNA) 导入宿主细胞中的多种现有技术方法， 包括磷酸钙、 氯化铷或氯化钙共 沉淀法、 DEAE- 葡聚糖介导转染法、 脂质转染法、 天然感受态法、 碳基团簇法 (carbon-based cluster)、 化学介导的转移法、 电穿孔法或粒子轰击法 ( 例如 “基因枪法” )。
在一个优选的实施方案中， 适用于本发明的载体是包含 SEQ IDNO ： 4、 5 和或 6 的序 列的核酸。
本发明的另一个方面涉及催化乙醛 (AA) 降解的酶制剂用于降低含乙醛制品中乙 醛含量的用途。
如定义部分中所描述， AA 存在于多种液体和化合物中并且对人有害。此外， 已知 乙醛是聚乙烯醇中的残留化合物。聚乙烯醇是乙烯醇的聚合物。由于后者不能以游离形式 存在， 故迄今全部聚乙烯醇通过聚合醋酸乙烯酯来制造， 其中不像乙烯醇那样， 所述的醋酸 乙烯酯是稳定的。如此产生的聚醋酸乙烯酯随后接受醇解。由于聚乙烯醇的技术特性首先 取决于摩尔质量和残留乙酰基含量， 故设计工业制造工艺旨在确保精确地符合这些参数。
在一个特别优选的实施方案中， 如下文以更多细节所述， 酶制剂含有具备醛歧化 酶活性的酶， 其包含 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列的变体或衍生物， 其中第 93 位置处的苯丙 氨酸和 / 或第 301 位置处的异亮氨酸和 / 或第 337 位置处的甲硫氨酸和 / 或第 127 位置处 的苯丙氨酸被任何的其他氨基酸置换。
如附图进一步所说明， 对恶臭假单胞菌甲醛歧化酶酶 (SEQ ID NO ： 2) 的晶体结构 的分析允许鉴定到参与形成该酶反应中心的各个氨基酸残基或氨基酸序列部分， 从而可以 建立针对具有醛歧化酶活性、 尤其甲醛歧化酶或乙醛歧化酶活性的其他合适酶的模型系统 或参比酶。
特别地， 对于所述的特定参比酶， 可以鉴定某些关键氨基酸残基， 其中预测所述的 关键氨基酸残基参与形成底物袋的功能独特部分。所述的功能独特部分命名为催化位点 1(CS1)、 催化位点 2(CS2)、 催化位点 3(CS3)、 催化位点 4(CS4)。第一功能部分是 CS1 并且关键氨基酸残基是 Ile301。
另外， 发现在一级氨基酸序列中彼此不相邻的序列部分通过有助于结合口袋的相 同功能部分反而是功能相关的。因此， 观察到功能部分 CS2 包含关键氨基酸残基 Met337。
也观察到所述的参考酶形成结合口袋区域 CS3 和 CS4， 并且与其相关的氨基酸残 基可以根据它们相对与该酶结合的底物的偏好进一步细分。CS3 和 CS4 包含关键氨基酸残 基 Phe127 和 Phe93。
本发明的发明人已经惊讶地发现与具有 SEQ ID NO ： 2 的野生型恶臭假单胞菌酶的 活性相比， 通过置换一个或多个关键氨基酸残基， 该酶的活性可以提高至少 5％、 优选至少 7％、 更优选至少 10％、 最优选 10 至 20％。此外， 通过置换一个或多个关键氨基酸残基， 该 酶的热稳定可以提高， 导致如此温度下的稳定性， 其中所述的温度比具有 SEQ ID NO ： 2 的野 生型恶臭假单胞菌酶稳定的温度高至少 1、 2、 3、 4、 5 摄氏度。这使得本发明的酶就纯化和表 达条件而言特别有利。
因此， 本发明的另一个目的涉及分离的多肽， 其具有醛歧化酶活性并且包含 SEQ ID NO ： 2 的变体， 其中在 SEQ ID NO ： 2 第 93 位置处的苯丙氨酸和 / 或在 SEQ ID NO ： 2第 301 位置处的异亮氨酸和 / 或在 SEQ ID NO ： 2 第 337 位置处的甲硫氨酸和 / 或在 SEQ ID NO ： 2 第 127 位置处的苯丙氨酸由任何其他氨基酸置换。
本领域技术人员将理解也可以置换紧密靠近上文所提及氨基酸位置的氨基酸。 因 此， 另一个实施方案涉及分离的多肽， 其具有醛歧化酶活性并且包含 SEQ ID NO ： 2 的变体， 其中距 SEQ ID NO ： 2 第 93 位置处的苯丙氨酸 ±3、 ±2 或 ±1 个氨基酸位置的氨基酸和 / 或距 SEQ ID NO ： 2 第 301 位置处的异亮氨酸 ±3、 ±2 或 ±1 个氨基酸位置的氨基酸和 / 或 距 SEQ ID NO ： 2 第 337 位置处的甲硫氨酸 ±3、 ±2 或 ±1 个氨基酸位置的氨基酸和 / 或距 SEQ IDNO ： 2 第 127 位置处的苯丙氨酸 ±3、 ±2 或 ±1 个氨基酸位置的氨基酸被任何其他 氨基酸置换。
基于这种分析， 可以开发一种高度特征性序列模式， 借助所述序列模式可以搜索 具有所希望酶活性的其他候选蛋白。
通过使用所述序列模式搜索其他候选酶也将由本发明包括。 熟练的读者将理解以 上序列模式不受该模式的两个相邻氨基酸残基之间的确切距离限制。 以上序列模式中两个 相邻者之间的每个距离例如可以彼此独立地变动直至 ±10、 ±5、 ±3、 ±2 或 ±1 个氨基酸 位置， 而没有明显影响想要的酶活性。
与基于如根据本发明所获得的结晶学数据对各个氨基酸残基的上述功能性和空 间分析相一致， 可以鉴定作为本发明具有醛歧化酶活性的潜在有用酶的特征的独特部分氨 基酸序列。
根据又一个优选的实施方案， 歧化反应用分离或纯化的、 任选固定的醛歧化酶或 如上文更详细描述那样通过培养表达醛歧化酶酶活性的微生物进行。
对酶活性仅潜在具有微小影响的突变体的实例是对上文所提及结构元件 (CS1、 2、 3 或 4) 的底物口袋的几何学或运动性影响小或无影响的那些突变体。
对酶活性具有更明显影响的突变体的实例可以是对上文所提及结构元件 (CS1、 2、 3 或 4) 的底物口袋的几何学或运动性影响更强的那些突变体。
就 SEQ ID NO ： 2 的恶臭假单胞菌蛋白而言， 下文列出可以促成至少一种所述类型突变的关键氨基酸置换的非限制性实例。
技术人员将理解除上表中提到的氨基酸之外， 任意氨基酸也可以用作置换物。检 验此类突变体功能的测定法是本领域轻易可获得的并且在本发明的实施例部分分别描述。
本发明也涉及如下文进一步定义的核酸， 其编码具有如上文定义的醛歧化酶活性 的蛋白质。
本发明也涉及表达盒， 其包含与至少一个调节性核酸序列有效连接的如上文定义的核酸。 本发明也涉及包含如上文定义的至少一种表达盒或核酸的重组表达载体。
本发明也涉及携带如上文定义的至少一种表达载体的重组微生物。
本发明也涉及生物反应器， 所述生物反应器包含具有如上文定义的醛歧化酶活性 的至少一种蛋白质或如上文定义的重组微生物， 其任选地处于固定形式。
本发明也涉及制备具有醛歧化酶活性的酶的方法， 所述方法包括培育如上文定义 的重组微生物和任选地从培养物分离该醛歧化酶。
本发明也涉及具有醛歧化酶活性的蛋白质的晶形， 尤其那些形式， 其中具有醛歧 化酶活性的蛋白质如上文定义。
本发明也涉及制备如上文所定义具有醛歧化酶活性的蛋白质的晶形的方法， 所述 方法包括添加具有 8.3 至 8.7 范围例内 ( 例如 8.5) 的 pH、 优选以 Tris 缓冲液缓冲的结晶 剂 (3M 至 3.5M 硫酸铵， 优选 3.2M 硫酸铵， 或聚亚烷基二醇， 如聚乙二醇， 尤其 PEG 400 至 3500， 如 PEG 400) 至含有 ( 浓度约 1 至 50 或 5 至 20mg/ml 的 ) 所述蛋白质的溶液。
本发明的其他实施方案
本发明的蛋白质
本发明不限于具体公开的 “具有醛歧化酶活性的蛋白质” ， 还扩展至其功能等同 物。
在本发明的范围内， 具体公开的酶的 “功能等同物” 或类似物是其各种多肽， 它们 也具有所希望的生物学功能或活性， 例如酶活性。
例如， “功能等同物” 意指这些酶， 它们在用于酶活性的试验中显示至少 1 至 10％、 或至少 20％、 或至少 50％、 或至少 75％或、 至少 90％更高或更低的如本文中所定义的酶活 性。
根据本发明， “功能等同物” 尤其也意指突变体， 其中在上述的氨基酸序列的至少
一个序列位置中， 所述突变体具有与具体所述氨基酸不同的氨基酸， 但是拥有前述生物学 活性之一。 “功能等同物” 因而包含通过一个或多个氨基酸添加、 置换、 插入、 缺失和 / 倒位 可获得的突变体， 其中所述的变化可以出现于任意的序列位置内， 条件是它们导致具有本 发明特征曲线的突变体。如果突变体与未改变的多肽之间的反应性模式定量地重合， 即如 果相同底物例如以不同的速率被转化， 则特别地也提供了功能等同性。下表中显示适宜的 氨基酸置换的实例。
以上意义的 “功能等同物” 在也是所述多肽的 “前体” ， 以及所述多肽 “功能性衍生 物” 和 “盐” 。
在这种情况下， “前体” 是所述多肽的具有或没有所希望生物学活性的天然或合成 前体。
表述 “盐” 意指本发明蛋白质分子的羧基的盐以及氨基的酸加成盐。羧基的盐可
以按照已知方式产生并且包含无机盐， 例如钠、 钙、 铵、 铁和锌盐， 和与有机碱 ( 例如， 胺， 如 三乙醇胺、 精氨酸、 赖氨酸、 哌啶等 ) 的盐。本发明也涵盖酸加成盐， 例如与无机酸 ( 如氢氯 酸、 或硫酸 ) 的盐和与有机酸 ( 如乙酸和草酸 ) 的盐。
使用已知技术， 本发明多肽的 “功能等同物” 也可以在功能性氢基酸侧基团上或在 它们的 N 末端或 C 末端产生。此类衍生物包括例如羧酸基的脂族酯、 通过与氨或者与伯胺 或仲胺反应可获得的羧酸基的酰胺 ； 通过与酰基反应产生的游离氨基的 N- 酰基衍生物 ； 或 通过与酰基反应产生的游离羟基的 O- 酰基衍生物。
“功能等同物” 自然也包含可以从其他生物获得的多肽以及天然存在的变体。例 如， 同源序列区的区域可以通过序列比较来建立， 并且可以基于本发明的具体参数确定等 同酶。
“功能等同物” 也包含本发明多肽的片段， 优选地各个结构域或序列基序， 它们例 如显示所希望的生物学功能。
另外， “功能等同物” 是融合蛋白， 所述融合蛋白具有上文所述的多肽序列或从中 衍生的功能等同物之一和处于功能性 N 末端或 C 末端接合的至少一个功能不同的其他异源 序列 ( 即不存在融合蛋白诸部分的基本的相互功能妨碍 )。这些异源序列的非限制性例子 例如是信号肽、 组氨酸锚或酶。
根据本发明也包括的 “功能等同物” 是具体所公开蛋白质的同源物。 这些同源物拥 有如上文所述的百分数同一性值。所述值指与具体所公开氨基酸序列的同一性， 并可以根 据 Pearson 和 Lipman， Proc.Natl.Acad， Sci.(USA)85(8)， 1988， 2444-2448 的算法计算。也 可以从 BLAST 比对、 算法 blastp( 蛋白质 - 蛋白质 BLAST) 或通过使用如下文给出的 Clustal 设置计算出百分数同一性值。
本发明同源多肽的同一性百分数尤其意指氨基酸残基相对于本文中具体所述氨 基酸序列之一的总长度而言的同一性百分数。
在蛋白质可能糖基化的情况下， 本发明的 “功能等同物” 包含上文所述类型的蛋白 质， 所述蛋白质处于去糖基化和糖基化形式以及可以通过改变糖基化模式来获得的修饰形 式。本发明蛋白质或多肽的此类功能等同物或同源物可以通过诱变产生， 例如通过蛋白质 的点突变、 加长或缩短产生。
本发明蛋白质的此类功能等同物或同源物可以通过筛选突变体 ( 例如短缩突变 体 ) 的组合数据库鉴定。例如， 可以通过在核酸水平组合诱变 ( 例如通过酶促连接合成性 寡核苷酸的混合物 ) 产生蛋白质变体的多样化数据库。存在可以用于从简并的寡核苷酸 序列产生潜在同源物数据库的众多方法。可以在自动 DNA 合成仪上实施简并基因序列的 化学合成， 并且可以将合成性基因随后连接于合适的表达载体中。简并基因组的使用使得 在一种混合物中供应全部序列成为可能， 其中所述的全部序列编码所希望的潜在蛋白质序 列集合。合成简并寡核苷酸的方法是本领域技术人员已知的 ( 例如 Narang， S.A.(1983) Tetrahedron 39 ： 3； Itakura 等 人 (1984)Annu.Rev.Biochem.53 ： 323 ； Itakura 等 人， (1984)Science 198 ： 1056 ； Ike 等人 (1983)Nucleic Acids Res.11 ： 477)。
在现有技术中， 几项技术已知用于筛选通过点突变或缩短法产生的组合数据库的 基因产物并且用于筛选 cDNA 文库中具有所选特性的基因产物。这些技术可以适应于快速 筛选通过组合诱变本发明同源物所产生的基因库。基于高通量分析的最常用于筛选大基因库的技术包括在可以复制的表达载体中克隆基因库、 用所得的载体数据库转化合适细 胞并在下述条件表达组合基因， 在所述条件下对所希望活性的检测有助于分离编码其产 物被检测的基因的载体。递归总体诱变 (REM) 是一项提高数据库中功能性突变体频率的 技术， 它可以与筛选试验组合地使用， 旨在鉴定同源物 (Arkin 和 Yourvan(1992)PNAS 89 ： 7811-7815 ； Delgrave 等人 (1993)ProteinEngineering 6(3) ： 327-331)。
根据本发明的又一个实施方案， 提供了分离的多肽， 其选自 ：
(i) 由 SEQ ID NO ： 8 或 10 任一者代表的氨基酸序列 ；
(ii) 与 SEQ ID NO ： 8 或 10 任一者所代表的氨基酸序列具有至少 50％、 51％、 52％、 53 ％、 54 ％、 55 ％、 56 ％、 57 ％、 58 ％、 59 ％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、 75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98％或 99％序列同一性的氨基酸序列 ；
(iii) 以上 (i) 或 (ii) 中给出的任意氨基酸序列的衍生物。
编码性核酸序列
本发明也涉及编码如本文中所定义酶的核酸序列。 本发明也涉及与本文中具体公开的序列具有某种 “同一性” 程度的核酸。两种核 酸之间的 “同一性” 意指每种情况下在该核酸的全长范围内核苷酸的同一性。
例如， 同一性可以借助 Informax(USA) 公司 Vector NTI 软件包 7.1 程序， 使用 Clustal 方法 (Higgins DG， Sharp PM. 在微型计算机上快速和灵敏的多重序列比对 (Fast and sensitive multiple sequence alignments on amicrocomputer).Comput Appl. Biosci.1989 年 4 月 ； 5(2) ： 151-1) 用以下设置计算 ：
多重比对参数 ：
空位开口罚分 10
空位延伸罚分 10
空位分离罚分范围 8
空位分离罚分 关闭
比对延迟的同一性％ 40
残基特异性空位 关闭
亲水性残基空位 关闭
转换权重 0
配对比对参数 ：
FAST 算法 开启
K-tuple 大小 1
空位罚分 3
窗口大小 5
最佳对角线的数目 5
备 选 地， 同 一 性 可 以 根 据 Chenna， Ramu， Sugawara， Hideaki， Koike， Tadashi， Lopez， Rodrigo， Gibson， Toby J， Higgins， Desmond G， Thompson， Julie D. 采用 Clustal 系列程序的多重序列比对 (Multiple sequencealignment with the Clustal series of
programs).(2003)Nucleic Acids Res 31(13) ： 3497-500， 网页 ： http://www.ebi.ac.Uk/ Tools/clustalw/index.html 和以下设置来确定 ：
DNA 空位开口罚分 15.0
DNA 空位延伸罚分 6.66
DNA 矩阵 同一性
蛋白质空位开口罚分 10.0
蛋白质空位延伸罚分 0.2
蛋白质矩阵 Gonnet
蛋白质 /DNA ENDGAP -1
蛋白质 /DNA GAPDIST 4
本文中提及的全部核酸序列 ( 单链和双链 DNA 和 RNA 序列， 例如 cDNA 和 mRNA) 可 以按已知方式通过化学合成从核苷酸结构单元产生， 例如通过各个重叠的互补性双螺旋核 酸结构单元的片段缩合来产生。 寡核苷酸的化学合成可以例如以已知方式通过亚磷酸酰胺 (phosphoamidite) 法 (Voet， Voet， 第 2 版， Wiley Press， New York， 第 896-897 页 ) 进行。 合成性寡核苷酸的积聚和借助 DNA 聚合酶 Klenow 片段填补缺口和连接反应以及一般克隆 技术在 Sambrook 等人 (1989) 中描述， 见下文。
本发明也涉及编码以上多肽及其功能等同物之一的核酸序列 ( 单链和双链 DNA 和 RNA 序列， 例如 cDNA 和 mRNA)， 所述核酸序列可以例如使用人工核苷酸类似物获得。
本发明涉及编码本发明多肽或蛋白质或其生物学活性节段的分离的核酸分子， 并 且涉及可以用作例如鉴定或扩增本发明编码性核酸的杂交探针或引物的核酸片段。
本发明的核酸分子可以额外含有来自编码性基因区域 3’ 和 / 或 5’ 末端的非翻译 序列。
本发明还涉及与具体所述的核苷酸序列或其节段互补的核酸分子。
根据本发明的又一个实施方案， 因而提供了分离的核酸分子， 其选自 ：
(i) 由 SEQ ID NO ： 7 或 9 中任一者代表的核酸 ；
(ii) 由 SEQ ID NO ： 7 或 9 中任一者代表的核酸的互补物 ；
(iii) 核酸， 其编码如 SEQ ID NO ： 8 或 10 中任一者所代表、 优选地作为遗传密码 简并性结果的多肽， 所述分离的核酸可以从如 SEQ ID NO ： 8 或 10 中任一者代表的多肽序列 衍生 ；
(iv) 与 SEQ ID NO ： 7 或 9 的核酸序列任一者具有至少 30 ％、 31 ％、 32 ％、 33 ％、 34 ％、 35 ％、 36 ％、 37 ％、 38 ％、 39 ％、 40 ％、 41 ％、 42 ％、 43 ％、 44 ％、 45 ％、 46 ％、 47 ％、 48 ％、 49 ％、 50 ％、 51 ％、 52 ％、 53 ％、 54 ％、 55 ％、 56 ％、 57 ％、 58 ％、 59 ％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、 75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％序列同一性的核酸序列 ；
(v) 与 (i) 至 (iv) 的核酸分子在严格杂交条件下杂交的核酸分子 ；
(vi) 编码具有醛歧化酶活性的多肽的核酸， 所述多肽与 SEQ ID NO ： 8 或 10 任一者 所代表的氨基酸序列具有至少 50％、 51％、 52％、 53％、 54％、 55％、 56％、 57％、 58％、 59％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％序列同一性。
本发明的核苷酸序列使得产生可以用于鉴定和 / 或克隆其他细胞类型和生物中 同源序列的探针和引物成为可能。此类探针或引物一般包含在 “严格” 条件 ( 见下文 ) 与 本发明核酸序列的有义链或相应反义链的至少约 12 个、 优选至少约 25 个， 例如约 40、 50 或 75 个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域。
“分离的” 核酸分子与存在于该核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分开， 并且 如果该核酸分子通过重组技术产生， 还可以基本上不含其它细胞物质或培养基， 或如果它 被化学地合成， 可以不含化学前体或其它化学品。
本发明的核酸分子可以借助分子生物学标准技术和根据本发明提供的序列信 息予以分离。例如， 使用具体公开的完整序列之一或其节段作为杂交探针和 ( 如在例如 Sambrook， J.， Fritsch， E.F. 和 Maniatis， T.MolecularCloning ： A Laboratory Manual. 第 2 版， Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY， 1989 中描述的 ) 标准杂交技术， 可以从合适的 cDNA 文库分离 cDNA。此 外， 包含所公开序列之一或其节段的核酸分子可以使用基于这种序列所构建的寡核苷酸引 物， 通过聚合酶链反应分离。以这种方式扩增的核酸可以克隆在合适的载体中并可以通过 DNA 测序进行表征。 本发明的寡核苷酸也可以通过标准合成方法产生， 例如使用自动 DNA 合 成仪产生。
本发明的核酸序列或其衍生物、 这些序列的同源物或部分可以例如通过常规杂交 技术或 PCR 技术从其他细菌分离， 例如借助基因组文库或 cDNA 文库。这些 DNA 序列在标准 条件下与本发明的序列杂交。
“杂交” 意指多核苷酸或寡核苷酸在标准条件下与几乎互补的序列结合， 但是在这 些条件下非互补性配偶物之间不发生非特异性结合。 为此， 所述序列可以是 90-100％互补。 互补序列能够相互特异性结合的特性例如用于 RNA 印迹或 DNA 印迹中或用于 PCR 或 RT-PCR 的引物结合中。
保守区域的短寡核苷酸有利地用于杂交。但是， 也可以将本发明核酸的较长片段 或完整序列用于杂交。这些标准条件根据所用的核酸 ( 寡核苷酸、 较长片段或完整序列 ) 或根据何种类型的核酸 -DNA 或 RNA 用于杂交而变化。例如， DNA ∶ DNA 杂合体的解链温度 比相同长度的 DNA ∶ RNA 杂合体的解链温度低约 10℃。
例 如， 根 据 具 体 的 核 酸， 标 准 条 件 意 指 在 浓 度 0.1 至 5×SSC(1×SSC ＝ 0.15M NaCl， 15mM 柠檬酸钠， pH 7.2) 或额外存在 50 ％甲酰胺下的缓冲水溶液中 42 和 58 ℃之 间的温度， 例如 42 ℃在 5×SSC， 50 ％甲酰胺中。有利地， DNA ∶ DNA 杂合体的杂交条件是 0.1×SSC 和在约 20 ℃至 45 ℃之间、 优选约 30 ℃至 45 ℃之间的温度。对于 DNA ∶ RNA 杂 合体， 该杂交条件有利地是 0.1×SSC 和在约 30 ℃至 55 ℃之间、 优选约 45 ℃至 55 ℃之间 的温度。所述的这些杂交温度是对甲酰胺不存在下大约 100 个核苷酸长度及 50 ％ G+C 含量的核酸的计算解链温度值的实例。DNA 杂交的实验条件在相关的遗传学教材 ( 例如 Sambrook 等人， 1989) 中描述， 并且可以使用本领域技术人员已知的公式， 例如根据核酸的 长度、 杂合体类型或 G+C 含量计算。本领域技术人员可以从以下教材获得关于杂交的进一 步信息 ： Ausubel 等人 ( 编著 )， 1985， Current Protocols in Molecular Biology， JohnWiley & Sons， NewYork ； Hames 和 Higgins( 编著 )， 1985， Nucleic Acids Hybridization ： APractical Approach， IRL Press at Oxford University Press， Oxford ； Brown( 编著 )， 1991， Essential Molecular Biology ： A Practical Approach， IRL Press at Oxford University Press， Oxford。
“杂交” 尤其可以在严格条件下实施。 此类杂交条件例如在 Sambrook， J.， Fritsch， E.F.， Maniatis， T.，在 ： Molecular Cloning(A LaboratoryManual)， 2nd edition， Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989， 第 9.31-9.57 页中或在 Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley &Sons， N.Y.(1989)， 6.3.1-6.3.6. 中描述。
“严格” 杂交条件尤其意指 ： 在由 50％甲酰胺、 5×SSC(750mM NaCl， 75mM 柠檬酸三 钠 )， 50mM 磷酸钠 (pH 7.6)， 5×Denhardt 溶液， 10 ％硫酸葡聚糖和 20g/ml 变性剪切鲑精 DNA 组成的溶液中于 42℃过夜， 随后用 0.1x SSC 在 65℃洗涤滤膜。
本发明还涉及具体公开的或可衍生的核酸序列的衍生物。
因此， 本发明的其他核酸序列可以从本文中具体公开的序列衍生并且可以因添 加、 置换、 插入或缺失单个或几个核苷酸而与所公开的序列不同， 并且也编码具有所希望特 性特征的多肽。
本发明也包括这样的核酸序列， 其包含所谓沉默突变或根据特定来源或宿主生物 的密码子选择， 与具体所述序列相比， 已经被改变的序列， 以及其天然存在的变体 ( 例如剪 接变体或等位变体 )。
它也涉及可以通过保守性核苷酸置换 ( 即所讨论的氨基酸被具有相同电荷、 大 小、 极性和 / 或溶解度的氨基酸置换 ) 获得的序列。
本发明还涉及通过序列多态性从具体公开的核酸衍生的分子。 这些遗传多态性可 以因自然变异而存在于群体内部的个体之间。 这些天然的变异通常引起基因核苷酸序列的 1 至 5％变异。
本发明核酸序列的衍生物意指例如等位变体， 其在完整序列范围内在所衍生的氨 基酸水平上具有至少 60 ％同源性、 优选至少 80 ％同源性、 非常特别优选至少 90 ％同源性 ( 就氨基酸水平上的同源性而言， 应当参考上文对所述多肽给出的细节 )。有利地， 同源性 可以在序列的部分区域内较高。
另外， 衍生物也理解为是本发明核酸序列的同源物， 例如动物、 植物、 真菌或细菌 同源物、 编码性和非编码性 DNA 序列的缩短序列、 单链 DNA 或 RNA。例如在 DNA 水平， 同源物 在本文具体公开的序列中所给出的整个 DNA 区域范围内具有至少 40％、 优选地至少 60％、 特别优选至少 70％、 非常特别优选至少 80％的同源性。
另外， 衍生物理解为是例如带有启动子的融合物。添加至所述核苷酸序列的启动 子可以通过至少一个核苷酸交换、 至少一个插入、 倒位和 / 或缺失进行修饰， 但是不损害所 述启动子的功能性或效力。另外， 所述启动子的效力可以通过改变它们的序列而增加或者 可以完全以甚至不同属的生物的更有效启动子交换。
本发明的构建体
本发明也涉及表达构建体， 其含有处于调节性核酸序列的遗传控制下的编码本发 明多肽或融合蛋白的核酸序列 ； 以及包含这些表达构建体中至少之一者的载体。
根据本发明， “表达单元” 意指具有表达活性的核酸， 该核酸包含如本文中所定义的启动子， 并且与一种待表达的核酸或一种基因功能性连接后， 调节该核酸或该基因的表 达， 即调节其转录和翻译。因而在这种环境下， 它也称作 “调节性核酸序列” 。除启动子之 外， 也可以存在其他调节元件， 例如增强子。
根据本发明， “表达盒” 或 “表达构建体” 意指表达单元， 其与待表达的核酸或待表 达的基因功能性连接。 与表达单元相反， 表达盒因而不仅包含调节转录和翻译的核酸序列， 还包含应当因转录和翻译而表达为蛋白质的核酸序列。
在本发明的上下文中， 术语 “表达” 或 “过量表达” 描述在微生物中由相应 DNA 编 码的一种或多种酶的胞内活性的产生或提高。 为此， 例如可以在生物中插入基因、 由另一种 基因置换现存基因、 增加该一个基因或多个基因的拷贝数、 使用强启动子或使用编码具有 高活性的相应酶的基因， 并且任选地可以组合这些措施。 优选地， 本发明的此类构建体包含 在相应编码序列 5’ 上游的启动子和 3’ 下游的终止子序列， 并且任选地还包含常规调节元 件， 在每种情况下它们均与编码序列功能性连接。
根据本发明， “启动子” 、 “具有启动子活性的核酸” 或 “启动子序列” 意指与待转录 的核酸功能性连接时调节该核酸转录的核酸。
在这种情况下， “功能性” 或 “有效” 连接意指以如此方式依次连接例如具有启动子 活性的核酸之一和待转录的核酸序列和任选地其他调节元件 ( 例如能够使核酸转录的核 酸序列和例如终止子 )， 从而所述每种调节元件可以在该核酸序列的转录中履行其功能。 这 不必然需要化学意义上的直接连接。 遗传调控序列如增强子序列也能够从更远位置或甚至 从其它 DNA 分子上对靶序列发挥它们的作用。优选这样的排列， 其中待转录的核酸序列位 于启动子序列之后 ( 即在 3′端 )， 从而这两个序列彼此共价地结合。启动子序列与待转基 因表达的核酸序列之间的距离可以小于 200bp( 碱基对 ) 或小于 100bp 或小于 50bp。
除了启动子和终止子之外， 可以提及的其他调节元件的例子是靶向序列、 增强 子、 多腺苷酸化信号、 选择标记、 扩增信号、 复制起点等。合适的调节序列例如在 Goeddel， Gene Expression Technology ： Methods inEnzymology 185， Academic Press， San Diego， CA(1990) 中描述。
本发明的核酸构建体特别包含选自本文中具体所提及的那些序列或其衍生物和 同源物， 以及可以从本文中具体所提及的氨基酸序列中衍生的核酸序列， 其中所述的序列 有利地与控制 ( 例如增加 ) 基因表达的一种或多种调节信号有效地或功能性连接。
除这些调节序列之外， 对这些序列的天然调节作用仍可以在实际的结构基因之前 存在， 并且任选地可能已经遗传地改变， 从而关闭天然调节作用并且已经增加所述基因的 表达。 核酸构建体也可以具有更简单的设计， 即， 在编码序列之前不插入任何额外的调节信 号并且不消除天然启动子连同其调节作用。 取而代之的是， 使天然调节序列沉默， 从而调节 作用不再发生并且基因表达增加。
优选的核酸构建体还有利地含有与启动子功能性连接的引起核酸序列表达增 加的一个或多个前述增强子序列。也可以在 DNA 序列的 3 ′端插入额外的有利序列， 如其他调节元件或终止子。本发明核酸的一个或多个副本可以含于该构建体中。该构 建体也可以含有任选用于选择构建体的其他标记如抗生素抗性或互补营养缺陷的基因 (auxotrophy-complementinggene)。
在启动子如 cos-、 tac-、 trp-、 tet-、 trp-tet-、 lpp-、 lac-、 lpp-lac-、 laclq-、T7-、 T5-、 T3-、 gal-、 trc-、 ara-、 rhaP(rhaPBAD)SP6-、 λ-PR- 中或在有利地用于革兰氏阴性 细菌的 λ-PL 启动子中含有合适调节序列的实例。在例如革兰氏阳性细菌启动子 ace、 amy 和 SPO2， 在酵母或真菌启动子 ADC1、 MFα、 AC、 P-60、 CYC1、 GAPDH、 TEF、 rp28、 ADH 中含有其 他有利的调节序列。人工启动子也可以用于调节。
为了表达， 将核酸构建体插入宿主生物中， 其中所述的核酸构建体有利地位于允 许所述基因在该宿主中最佳表达的载体 ( 例如质粒或噬菌体 ) 中。除质粒和噬菌体外， 载 体也理解为意指本领域技术人员已知的全部其他载体， 例如， 病毒如 SV40、 CMV、 杆状病毒和 腺病毒、 转座子、 IS 元件、 噬菌粒、 粘粒和线性或环状 DNA。这些载体可以在宿主生物中自主 复制或可以按染色体方式复制。这些载体代表本发明的又一实施方案。
合适的质粒例如是大肠杆菌中的 pLG338、 pACYC184、 pBR322、 pUC18、 pUC19、 pKC30、 pRep4、 pHS1、 pKK223-3、 pDHE19.2、 pHS2、 pPLc236、 pMBL24、 pLG200、 pUR290、 pIN-III113-B1、 λgt11 或 pBdCI ； 诺卡氏菌型放线菌 (Nocardioform actinomycetes) 中的 pJAM2 ； 链霉菌 属 (Streptomyces) 中的 pIJ101、 pIJ364、 pIJ702 或 pIJ361 ； 芽孢杆菌中的 pUB110、 pC194 或 pBD214 ； 棒状杆菌属 (Corynebacterium) 中的 pSA77 或 pAJ667 ； 真菌中的 pALS1、 pIL2 或 pBB116 ； 酵母中的 2αM、 pAG-1、 YEp6、 YEp13 或 pEMBLYe23 或植物中的 pLGV23、 pGHlac+、 pBIN19、 pAK2004 或 pDH51。前述的质粒代表可能质粒的小部分选择。其它质粒是本领域技 术人员熟知的并且将会在例如书籍 Cloning Vectors( 编者 Pouwels P.H. 等人， Elsevier， Amsterdam-New York-Oxford， 1985， ISBN 0 444 904018) 中找到。
在载体的又一个实施方案中， 含有本发明核酸构建体或本发明核酸的载体可以有 利地以线性 DNA 形式插入微生物中并且通过异源或同源重组整合到宿主生物的基因组中。 这种线性 DNA 可以包含线性化载体如质粒或仅包含本发明的核酸构建体或核酸。
为了异源基因在生物中的最佳表达， 有利的是根据生物中所用的特定密码子选择 改变核酸序列。该密码子选择可以基于计算机评价所讨论生物的其他已知基因来轻易确 定。
本发明表达盒的产生基于合适启动子与合适的编码性核苷酸序列及终止子信号 或多腺苷酸化信号的融合。为此， 使用如在例如 T.Maniatis， E.F.Fritsch 和 J.Sambrook， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， ColdSpring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor， NY(1989) 以 及 在 T.J.Silhavy， M.L.Berman 和 L.W.Enquist， Experiments with Gene Fusions， Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor， NY(1984) 并且 在 Ausubel， F.M. 等人， Current Protocols in Molecular Biology， GreenePublishing Assoc. 和 Wiley Interscience(1987) 中所描述的常见重组和克隆技术。
将重组核酸构建体或基因构建体有利地插入用于合适宿主生物中表达的宿主 特异性载体内， 以允许所述基因在该宿主中最佳表达。载体是本领域技术人员熟知的并 且将在例如 “Cloning Vectors” (Pouwels P.H. 等 人， Publ.Elsevier， Amsterdam-New York-Oxford， 1985) 中找到。
根据本发明可以使用的宿主
根据上下文， 术语 “微生物” 意指起始微生物 ( 野生型 ) 或本发明的基因修饰微生 物或这两者。
根据本发明， 术语 “野生型” 意指相应的起始微生物并且不需要必然对应于天然存在的生物。
借助本发明的载体， 可以产生重组微生物， 所述重组微生物已经用例如至少一种 本发明载体转化并可以用于产生本发明的多肽。有利地， 将以上所述的本发明重组构建 体插入合适的宿主系统中并表达。优选地， 使用本领域技术人员熟悉的常见克隆与转染方 法， 例如共沉淀法、 原生质体融合法、 电穿孔法、 逆转录病毒转染法等， 旨在确保所述核酸在 相应表达系统中表达。合适的系统例如在 Current Protocols in Molecular Biology， F.Ausubel 等人， Publ.Wiley Interscience， New York 1997 或 Sambrook 等人 Molecular Cloning ： A Laboratory Manual. 第 2 版， Cold Spring HarborLaboratory， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY， 1989 中描述。
原则上， 可以考虑全部原核生物作为本发明核酸或核酸构建体的重组宿主生物。 将细菌有利地用作宿主生物。 虽然大肠杆菌是通常用来表达催化甲醛降解的酶的细菌宿主 细胞的一个实例， 但是其他细菌宿主细胞可以在本发明中用来表达外源 DNA， 所述的宿主细 胞包括例如埃希氏菌属、 肠杆菌属、 固氮菌属、 欧文氏菌属、 芽孢杆菌属、 假单胞菌属、 博德 特菌属、 红杆菌属、 苛养木杆菌属、 克雷伯氏菌属、 变形杆菌属、 沙门菌属、 沙雷菌属、 志贺菌 属、 根瘤菌属、 透明颤菌属和副球菌属。此外， 真核真菌宿主细胞可以在本发明中用来表达 外源 DNA， 它们包括例如曲霉属、 毕赤酵母属、 木霉属、 汉逊酵母属、 酵母属、 克鲁维酵母属、 裂殖酵母属、 金小孢子属、 假丝酵母属和球拟酵母属。
本发明的宿主生物或多种宿主生物则优选地含有本文发明中所描述的编码根据 上文定义的酶活性的核酸序列、 核酸构建体或载体至少之一。
根据宿主生物， 本发明方法中所用的生物以本领域技术人员熟悉的方式生长或培 育。原则上， 将微生物在液体培养基中于 0℃和 100℃之间、 优选 10℃和 60℃之间的温度在 氧通气的情况下培育， 其中所述液体培养基含有通常为糖形式的碳源、 通常为有机氮源形 式的氮源 ( 如酵母提取物 ) 或盐如硫酸铵、 痕量元素如铁、 锰和镁盐并且任选地含有维生 素。液体营养培养基的 pH 可以维持在固定值上， 即在培育期间进行调节或不予调节。可以 分批、 半分批或连续地实施生长。养分可以在发酵伊始供应或可以随后半连续或连续地供 应。
重组产生具有醛歧化酶活性的蛋白质
本发明也涉及通过培育表达本发明蛋白质的微生物并且从培养物中分离所希望 的产物来产生所述蛋白质的方法。
可以以分批法或以补料分批或重复补料分批法连续或间歇地培育如根据本发明 使用的微生物。对已知培育方法的综述存在于 Chmiel(Bioprocesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(GustavFischer Verlag， Stuttgart， 1991)) 教 材 中 或 Storhas(Bioreaktoren undperiphere Einrichtungen(Vieweg Verlag， Braunschweig/ Wiesbaden， 1994)) 教材中。
待使用的培养基必须以适宜的方式满足具体菌株的要求。对多种微生物的培养 基的描述在手册 “美国细菌学会通用细菌学方法手册 (Manual ofMethods for General Bacteriology)” (Washington D.C， USA， 1981) 中给出。
可以根据本发明使用的这些培养基通常包含一种或多种碳源、 氮源、 无机盐、 维生 素和 / 或痕量元素。优选的碳源是糖， 如单糖、 二糖或多糖。极好的碳源例如是葡萄糖、 果糖、 甘露糖、 半乳糖、 核糖、 山梨糖、 核酮糖、 乳糖、 麦芽糖、 蔗糖、 棉子糖、 淀粉或纤维素。 糖也可以以复杂 化合物如糖蜜或来自糖精炼的其他副产品添加至培养基。 也可以有利的是添加多种碳源的 混合物。 其他的可能碳源是油和脂肪， 如大豆油、 葵花籽油、 花生油或椰子油， 脂肪酸如棕榈 酸、 硬脂酸或亚麻酸、 醇如甘油、 甲醇或乙醇和有机酸如乙酸或乳酸。
氮源通常是有机或无机氮化合物或含有这些化合物的物质。 氮源的实例包括氨气 或铵盐， 如硫酸铵、 氯化铵、 磷酸铵、 碳酸铵或硝酸铵、 硝酸盐、 脲、 氨基酸或复杂氮源， 如玉 米浆、 大豆粉、 大豆蛋白、 酵母提取物、 肉浸汁和其他等。 氮源可以分开地使用或作为混合物 使用。 可以在培养基中存在的无机盐化合物包含钙、 镁、 钠、 钴、 钼、 钾、 锰、 锌、 铜和铁的氯化 物、 磷酸盐或硫酸盐。含硫无机化合物例如硫酸盐、 亚硫酸盐、 连二亚硫酸盐、 连四硫酸盐、 硫代硫酸盐、 硫化物以及有机硫化合物如硫醇和硫羟可以用作硫源。
磷酸、 磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐可以用作磷源。可以将螯合剂添 加至培养基， 旨在维持溶液中的金属离子。特别合适的螯合剂包含二羟基酚， 如儿茶酚或 原儿茶酸酯或有机酸如柠檬酸。根据本发明使用的发酵培养基也可以含有其他生长因子， 如维生素或生长促进剂， 它们包括例如生物素、 核黄素、 硫胺素、 叶酸、 烟酸、 泛酸酯和吡哆 醇。生长因子和盐经常来自培养基的复杂组分， 如酵母提取物、 糖蜜、 玉米浆等。此外， 可 以将合适的前体添加至培养基。 培养基中化合物的精确组成强烈取决于具体的实验并且必 须针对每种具体情况分别决定。关于培养基优化的信息可以在教材 “Applied Microbiol. Physiology， A Practical Approach” (Publ.P.M.Rhodes， P.F.Stanbury， IRL Press(1997) 第 53-73 页， ISBN 019 963577 3) 中找到。也可以从供应商处获得生长培养基， 如标准 1(Merck) 或 BHI( 心脑浸液， DIFCO) 等。通过加热 ( 在 1.5 巴和 121℃， 20 分钟 ) 或通过无 菌过滤， 将培养基的全部组分消毒。所述组分可以一起消毒或根据需要分别消毒。培养基 的全部组分可以在培养伊始存在或任选地可以连续地或通过分批补料添加。
培养物的温度通常是在 15℃和 45℃之间， 优选地是 25℃至 40℃并且在实验期间 可以保持恒定或可以变动。培养基的 pH 值应当在 5 至 8.5 的范围内， 优选地在 7.0 附近。 可以在培育期间通过添加碱性化合物如氢氧化钠、 氢氧化钾、 氨或氨水或酸性化合物如磷 酸或硫酸控制用于生长的 pH 值。消泡剂例如脂肪酸聚二醇酯可以用于控制起泡。为维持 质粒的稳定性， 可以将具有选择作用的合适物质例如抗生素添加至培养基。将氧或含氧的 气体混合物例如空气送入培养物以维持通气条件。培养物的温度通常是 20℃至 45℃。持 续培养直至最大量所希望的产物已经形成。这通常在 10 小时至 160 小时内实现。
可以任选地通过高频超声波、 通过高压例如在弗氏细胞压碎器中、 通过渗透作用、 通过去垢剂、 裂解酶或有机溶剂的作用、 借助均化器或通过所列几种方法的组合破坏细胞。
具有醛歧化酶活性的酶的具体用途
本发明也涉及分离的多肽用于降低在含醛制品中醛含量的用途， 所述分离的多肽 具有醛歧化酶活性并且包含 SEQ ID NO ： 2 的变体， 其中在 SEQID NO ： 2 第 93 位置处的苯丙 氨酸和 / 或在 SEQ ID NO ： 2 第 301 位置处的异亮氨酸和 / 或在 SEQ ID NO ： 2 第 337 位置处 的甲硫氨酸和 / 或在 SEQ IDNO ： 2 第 127 位置处的苯丙氨酸由任何其他氨基酸置换。
在一个优选的实施方案中， 醛是如定义部分中定义的乙醛。
在另一个优选的实施方案中， 醛是丙酮醛。以下实施例仅起到说明本发明的作用。 对于本领域技术人员显而易见的众多可能 变化也落入本发明的范围内。 实施例 实施例 1 ： FDM 表达和纯化
以下方法源自先前描述的方案 (Yanase， H.， Moriya， K.， Mukai， N.， Kawata， Y.， Okamoto， K.， Kato， N(2002)GroESL 共表达对来自恶臭假单胞菌 F61 的烟酰胺蛋白甲醛歧化 酶折叠的影响 (Effects of GroESLCoexpression on the Folding of Nicotinoprotein Formaldehyde Dismutasefrom Pseudomonas putida F61)Biosci.Bitechnol.Biochem.， 66(1)， 85-91) 并且已经进一步优化。 编码 FDM 的基因的密码子选择已经对大肠杆菌进行优 化。 新 DNA 序列已经合成并克隆到鼠李糖诱导型表达载体 pDHE(SEQ ID NO ： 4) 中。 对于可溶 性 FDM 产生所必需的 GroEL/S 伴侣蛋白克隆于 IPTG 诱导型 pAgro 载体 (SEQ ID NO ： 5) 中。 lac 阻抑蛋白由 pHSG 载体 (SEQ ID NO ： 6) 编码。 使用大肠杆菌 TG10( 一种无鼠李糖异构酶 的 TG1 衍生物 ) 进行 FDM 的表达。将含有 pAgro 和 pHSG 的 TG10 细胞 (TG10+) 用 pDHE-FDM 转化并且在 LB 中于 37 ℃在氨苄青霉素 (pDHE)、 壮观霉素 (pAgro) 和氯霉素 (pHSG) 存在 下培养 5 小时。将 5mL 这种培养物转移至含有 100μM IPTG 和 0.5g/L 鼠李糖的 500mL 相 同培养基中。诱导在 37℃进行约 18 小时。通过离心收集细胞并且将其重悬于裂解缓冲液 (10mMKH2PO4， pH 7， 0.5mM MgCl2， 140μM PMSF) 中。通过超声处理 (<1’ ， 1s/1s>x10， 70％振 幅 ) 诱导细胞裂解。在 37℃孵育 10 分钟并离心后， 将硫酸铵添加至清亮的裂解物至 50％ 饱和度。使得不想要的蛋白质 ( 例如伴侣蛋白 ) 在冰上沉淀 2-4 小时。
通过离心除去沉淀物并且将含有 FDM 的清亮溶液施加至苯基 - 琼脂糖凝胶柱 (HIC 层析 )。使用 “40％至 0％” 硫酸铵梯度 ( 缓冲液 ： 10mM KH2PO4， 0.5mM MgCl2， pH 7.2)， 洗脱 含有 FDM 的级分。FDM 的存在由快速比色测定法证实 ： 将 10μL 每一级分转移至 96 孔 MTP 平板并且与 250μL 甲醛溶液 ( 在 100mM KH2PO4， pH 7 中 12.5ppm， 30 分钟 ) 一起孵育。通 过添加 50μL Purpald- 试剂 (1M NaOH 中 10mg/mL， Sigma) 至 50μL 反应混合物检测未反 应的甲醛。显色表示酶在收集的级分中不存在。
在苯基琼脂糖凝胶纯化步骤后， 洗脱的级分通过超滤法 (10kDa 截止值 ) 浓缩并 且 通 过 大 小 排 阻 层 析 法 (HiPrep Desalting 26/10mL， Amersham) 脱 盐。1×PBS， 0.5mM MgCl2(pH 7.2) 用作运行缓冲液。通过超滤法 (10kDa 截止值 ) 浓缩蛋白质溶液并且将甘油 添加至 50％终浓度。FDM 原液 (2-5mg/mL) 在 -20℃贮存。从发酵物约 1g/L 中， 来自摇瓶的 一般产率是约 100mg/L。该方法允许纯化蛋白质至均一， 如考马斯染色的 SDS-PAGE 所判定 ( 数据未显示 )。
对于 FDM 突变体， 也可用以下方法。
以 下 方 法 源 自 先 前 描 述 的 方 案 (Yanase 等 人 2002， Biosci.Biotechnol. Biochem.， 66(1)， 85-91) 并且已经作进一步优化。编码 FDM( 或突变体 ) 的基因的密码子 选择已经对大肠杆菌进行优化 (SEQ ID NO ： 3)。新 DNA 序列已经合成并克隆到鼠李糖诱导 型表达载体 pDHE(SEQ ID NO ： 4) 中。对于可溶性 FDM 产生所必需的 GroEL/S 伴侣蛋白克隆 于 IPTG 诱导型 pAgro 载体 (SEQ ID NO ： 5) 中。lac 阻抑蛋白由 pHSG 载体 (SEQ ID NO ： 6) 编码。使用大肠杆菌 TG10( 一种无鼠李糖异构酶的 TG1 衍生物 ) 进行 FDM 的表达。将含有
pAgro 和 pHSG 的 TG10 细胞 (TG10+) 用 pDHE-FDM 转化并且在 LB 中于 37 ℃在氨苄青霉素 (pDHE)、 壮观霉素 (pAgro) 和氯霉素 (pHSG) 存在下培养 5 小时。将 5mL 这种培养物转移至 含有 100μM IPTG 和 0.5g/L 鼠李糖的 500mL 相同培养基中。诱导在 37℃进行约 18 小时。 通过离心收集细胞并且将其重悬于裂解缓冲液 (10mM KH2PO4， pH 7， 0.5mM MgCl2) 中。通过 超声处理 (<3’ ， 15s/15s>x3， 85％振幅 ) 诱导细胞裂解。在 37℃孵育 10 分钟并离心后， 将 硫酸铵添加至清亮的裂解物至 50％饱和度。 使得不想要的蛋白质 ( 例如伴侣蛋白 ) 在冰上 沉淀 1-2 小时。
通过离心除去沉淀物并且将含有 FDM 的清亮溶液施加至苯基 - 琼脂糖凝胶柱 (HIC 层析 )。使用 “40％至 0％硫酸铵梯度” ( 缓冲液 ： 10mM KH2PO4， 0.5mM MgCl2， pH 7.2)， 洗脱 含有 FDM 的级分。FDM 的存在由快速比色测定法证实 ： 将 10μL 每一级分转移至 96 孔 MTP 平板并且与 250μL 甲醛溶液 ( 在 100mM KH2PO4， pH 7 中 12.5ppm， 30 分钟 ) 一起孵育。过 添加 50μL Purpald- 试剂 (1M NaOH 中 10mg/mL， Sigma) 至 50μL 反应混合物检测未反应 的甲醛。显色表示酶在收集的级分中不存在。
在苯基 - 琼脂糖凝胶纯化步骤后， 洗脱的级分通过超滤法 (10kDa 截止值 ) 浓缩并 且通过大小排阻层析法 (HiPrep Desalting 26/10mL， Amersham) 脱盐。 10mM KH2PO4， 0.5mM MgCl2(pH 7) 用作运行缓冲液。通过超滤法 (10kDa 截止值 ) 浓缩蛋白质溶液并且将甘油添 加至 50％终浓度。FDM 原液 (2-5mg/mL) 在 -20℃贮存。该方法允许纯化蛋白质至均一， 如 考马斯染色的 SDS-PAGE 所判定 ( 数据未显示 )。
实施例 2 ： 通过 pH-stat 滴定法表征 FDM
在含有 20mM 甲醛， 100mM KCl， 0.25mM KH2PO4(pH 7) 的标准反应混合物中验定 FDM 活性。通过添加 5μL 酶溶液至 25mL 标准混合物在室温进行该反应。通过 pH-stat 滴定法 用 5mM NaOH 监测 5 分钟范围内的甲酸盐形成。一个单位定义为每分钟催化 1μmol 甲酸形 成所需要的酶量。TG10+ 中表达的 FDM 具有范围在 100-200U/mg 之间的比活性。
实施例 3 ： 甲醛的检测
LAW 112 法的检测原理依赖于甲醛与乙酰丙酮在氨存在下反应以形成黄色化合物 3， 5- 二乙酰基 -1， 4- 二氢卢剔啶 (Hantzsch 反应 )(Nash， T.(1953) 通过 Hantzsch 反应对 甲醛的比色估计， Biochem.J.， 55(3)， 416-421 和 Fregert， S.， Dahlquist， I.， Gruvberger， B.(1984) 用于检测甲醛接触性皮炎的简单方法 (Simple Method for the Detection of Formaldehyde ContactDermatitis)， 10， 132-134)。 对于定量性甲醛检测， 如下制备试剂溶 液： 将 15g 乙酸铵、 0.2mL 乙酰丙酮、 0.3mL 乙酸在 100mL 蒸馏水中混合 ( 在 4℃稳定 1 周 )。 为获得校准曲线， 制备范围从 5ppm 至 25ppm 的甲醛水溶液。通过混合 0.1mL 样品水溶液 ( 或作为空白的标准物或水 ) 与 0.15mL 试剂溶液启动该反应并且在 60℃孵育 10 分钟。在 溶液已经冷却至室温后， 添加蒸馏水至终体积 1mL。在 412nm 监测 3， 5- 二乙酰基 -1， 4- 二 氢卢剔啶的形成。
实施例 4 ： 酶的初步表征
为确定甲醛歧化酶对织物应用的效率， 将不同的酶浓度与 100mMKH2PO4， pH 8 中的 220ppm 甲醛在室温孵育 30 分钟。样品通过先前描述的乙酰丙酮法分析。酶原液的比活性 是 165U/mg。结果在表 1 中显示。
表1： 溶液 (220ppm 甲醛 ) 中的酶促甲醛移除。通过乙酰丙酮法进行检测。值显示了在室温孵育 30 分钟后溶液中的剩余甲醛。
FDM(mg/L) 0 7 17
甲醛 (ppm) 230 11 检测不到 ( ＜＜ 5ppm)甚至非常低的酶浓度对几乎彻底降低甲醛含量是绰绰有余的。对于技术应用而 言， 另一个有意思特性是对醇 ( 乙醇， 异丙醇 ) 或纯水而非缓冲液的耐受性。为此目的， 将 17mg/L 甲醛歧化酶在 30℃于 100mM KH2PO4(pH8)， 220ppm 甲醛和 10 或 20％ v/v 溶剂 ( 乙 醇或异丙醇 ) 中孵育。备选地， 使用 ddH2O 替代磷酸盐缓冲液。结果在表 2 中汇总。
表2： 乙醇、 异丙醇 ( ％ v/v) 和纯水对 FDM 活性的影响 (FDM 为 17mg/L， 甲醛为 220ppm)。值显示了在 30℃孵育 30 分钟后溶液中的剩余甲醛。通过乙酰丙酮法进行检测。
在 10％乙醇中的 FDM 160ppm 在 10％异丙醇中的 FDM 26ppm 在 ddH2O 中的 FDM 240ppm(90 分钟后 133ppm)
在 20％乙醇中的 FDM 196ppm 在 20％异丙醇中的 FDM 104ppm ddH2O 201ppm(90 分钟后 202ppm) 20％乙醇 227ppm 20％异丙醇 229ppm来自恶臭假单胞菌 F61 的甲醛歧化酶在大量乙醇存在下未与 FA 有效反应。 甚至在 10％ v/v， 针对 FA 的酶活性被强烈抑制。相对低浓度的异丙醇不造成问题， 但是多于 10％ v/v 对活性产生负面影响。纯水灭活该酶 ； 甲酸的产生诱导酸性 pH- 位移 (pH 从 7 降低至 约 4)。
实施例 5 ： 用 FDM 处理整理的织物
用二羟甲基二羟基亚乙基脲交联剂整理的棉纤维已经以 FDM 处理。在交联剂与棉 纤维缩合之后， 可以通过乙酰丙酮法测定出织物中约 114ppm 的游离甲醛。随后用不同浓度 的酶溶液 (100mM KH2PO4， pH 8， 0-150mg/L 酶 ) 浸渍该织物样品并且使其立即经过两个转动 的金属滚筒 ( 图 3)。湿样品在 30℃孵育 60 分钟。通过乙酰丙酮法 (LAW 112) 定量从 1g 织物样品提取的甲醛。表 3 汇总数据。
表3： 不同 FDM 浓度对用改性二羟甲基二羟基亚乙基脲交联剂交联的棉织品的影 响 ( 在酶促处理前织物中的甲醛是 114ppm)。
33CN 102459580 A
FDM(mg/L) 0 20 50 100 150
说明书来自干织物的甲醛 (ppm) 95 56 40 51 4931/39 页来自湿织物的甲醛 (ppm) 73 33 22 23 23甲醛含量在没有歧化酶情况下已经降低至约 70ppm( 来自干织物的甲醛含量是 95ppm)， 这可能因浸渍过程期间的某些 “洗出” 效应所致。通常， 甲醛歧化酶能够明显地降 低所提取甲醛的量至 20 和 40ppm 之间的水平。湿织物与干织物甲醛检测结果的不同可能 因织物含水量估计方面的不同所致。表 4 显示对织物进行的相同实验， 其中所述的织物用 含有较大量 FA 的替代性二羟甲基二羟基亚乙基脲交联物交联 ( 在酶促处理前织物中的甲 醛是 641ppm)。
表4： 不同 FDM 浓度对用二羟甲基二羟基亚乙基脲制品交联的棉织品的影响。
30 分钟孵育 60 分钟孵育
因为 “洗出” 效应， 样品在没有歧化酶情况下显示甲醛含量明显降低。然而， 应用 增加量歧化酶的酶导致来自整理的织物中释放的甲醛明显减少。约 70％的吸水率 (water uptake) 意味着每 kg 织物约 100mg 歧化酶对相当大程度地降低甲醛含量是绰绰有余的。
为降低酶促处理后干燥织物的时间及能源成本， 降低此类应用中的水含量将是有 益的。为此目的， 将交联的织物样品略有差异地处理 ： 将浓缩的酶溶液 (1xPBS， 25％甘油中 的 1350mg/L) 喷洒在该织物上。微调吸水率， 从而允许分析 0-50％范围的湿度 ( 表 5)。全 部织物探测物在 30℃孵育 60 分钟。
表5： 不同吸水率对用二羟甲基二羟基亚乙基脲制品交联的棉织品的影响 ( 在
酶促处理前织物中的甲醛是 641ppm)。将 FDM 以浓缩的原液喷洒 (1xPBS， 25 ％甘油中的 1350mg/L)。
即便通过施加作为喷雾剂的酶， 甲醛的某些 “洗出” 仍是不可避免的 (20％缓冲液 吸取率， 465ppm 释放的甲醛 )。 但是， 在相同吸水率的情况下， 酶施加 ( 每 kg 织物 270mg 酶 ) 仍引起释放的甲醛减少多于 50％。与织物含水量达到 70％的经金属滚筒施加酶相比， 喷洒 施加的效率是较不明显的。
实施例 6 ： FDM 对不同织物整理产品的 FA 含量的影响
降低织物中甲醛量的备选策略将是在织物缩合步骤之前将歧化酶直接应用至交 联剂溶液。为此目的， 已经用甲醛歧化酶测试了 3 种产品 ： 二羟甲基二羟基亚乙基脲制品 ( 制品 1)、 甲氧甲基化蜜胺制品 ( 制品 2) 和低 FA 含量的缩聚甲氧甲基化蜜胺制品 ( 制品 3)。交联剂制品 1 是高度浓缩的略微酸性的 (pH 5-6) 水溶液， 其含有 0.1 和 1％之间的甲 醛 (1000 至 10000ppm)。制品 2 是含有 1.5 和 2.5％之间甲醛的浓缩水溶液 (pH 8-9)。制 品 3 是含有 0.2 和 1％之间甲醛的略微碱性的水溶液 (pH 8-9)。
通常， 将 87μL 纯产品与 10μL 3M KH2PO4(pH 7) 和 3μL 50％甘油混合 ( 阴性对 照 )。在酶处理的样品中， 使用酶原液 (4.8mg/mL) 而不是甘油。产品溶液中的酶终浓度是 约 150mg/L。通过乙酰丙酮法检测甲醛。表 6 显示 FDM 对交联剂溶液的影响。
表6 ： FDM( 约 150mg/L) 对制品 1、 2 和 3 的影响。 反应混合物用大约 300mM KH2PO4(pH 7) 缓冲并且在 30℃孵育 60 分钟。值显示了浓缩产品中处理后的剩余甲醛 ( 单位为 ppm)。 通过乙酰丙酮法进行检测。
35CN 102459580 A交联剂 制品 1 制品 3 制品 2说明-FDM 5200 3500 38000书+FDM 1700 1700 2930033/39 页对制品 1 获得最好的结果， 甲醛含量降低大约 70％。 制品 3 的甲醛含量降低约 50％。 用 FDM 处理制品 2 仅降低高甲醛含量 20％。注意对 FDM 暴露延长可能导致产品降解。
总体而言， 这些初步结果表明 FDM 可以潜在地直接应用于产品溶液。
实施例 7 ： FDM 降低改性的二羟甲基二羟基亚乙基脲化合物中 FA 含量的用途
交联剂用于易于打理整理由纤维素纤维及它们与合成纤维的混纺物制成的织物。 这些化学品的一个重要类别是改性二羟甲基二羟基亚乙基脲化合物类。这里， 我们用甲醛 歧化酶 (FDM) 处理 4 种不同的产品配方 (product formulation) 并且测量产品中的剩余甲 醛。另外， 酶处理的产品用于棉织品整理中。织物 ( 棉织品 ) 的甲醛含量和整理的性能已 经定量。
产物制品如下处理 ： 17.4g 交联试剂 ( 作为浓缩的水溶液 ) 和 2mL 3MKH2PO4(pH 7) 与 0.6mL FDM(4.8mg/mL) 轻轻地混合。酶终浓度是约 140mg/L。酶促过程在室温实施约 3 小时。甲醛含量如先前描述那样测量 ( 乙酰丙酮法 )( 见表 7)。
表7：
交联剂 1 2 3 4 用 FDM 情况下的 FA(ppm) 1200 500 500 500 无 FDM 情况下的 FA(ppm) 4100 3100 2200 3500产品溶液中的甲醛含量降低了 70-80％。 产品 1( 未保护的羟甲基 ) 中甲醛移除可 以导致产品随时间降解。
酶处理和未处理的制品用于使用以下配方 ： 57.5g/ 交联试剂、 10g/LMgCl2·6H2O， pH 5.0( 通过添加乙酸调节 ) 的棉织品整理中 ( 织物 ： CO-Popelin)。使得棉织品样品 ( 吸 液率约 70％ ) 在 110℃干燥至终末湿度约 6％。以下的固化步骤 (curing step) 在 150℃ 进行 3 分钟。通过 LAW112 测量棉织品样品中的甲醛含量 ( 单位为 ppm 的值 )。额外的性 能指标是干态折皱回复角 (dcra)( 单位为° )、 抗张强度 ( 在 40 ＊ 100mm 上以 N 表示的张 力 )、 评价光滑度的耐久压烫 (DP 评价 )、 评价光滑度的孟山都法 ( 孟山都评价 )、 收缩 ( 以％ 表示的经 (w)/ 纬 (f) 缩比 )。下表 ( 表 8) 汇总结果 (1 ： 未整理的棉织品 2 ： 制品 13 ： 制品 1+FDM 4 ： 制品 25 ： 制品 2+FDM 6 ： 制品 37 ： 制品 3+FDM 8 ： 制品 49 ： 制品 4+FDM)。
表8
36CN 102459580 A 1 FA(LAW112) dcra 张力 DP 评价 孟山都评价 经缩 纬缩
1 123 399 1 1 4.0 0.2 2 196 198 361 2 3 1.4 0.4 3说明4 53 187 340 1.5 2 2.0 0.0书5 25 178 282 1.5 2 1.6 0.2 6 35 180 304 1.5 2.5 1.8 0.2 7 22 187 350 1.5 2.5 2 0 8 42 180 342 1.5 2.5 2 0.234/39 页 9 22 173 324 1.5 2.5 1.8 0.2168 187 356 2 3 1.4 0.4实施例 8 ： FDM 降低用作高分子分散剂 / 超塑化剂的磺化蜜胺 -FA 缩聚物中 FA 含量的用途 磺化的蜜胺 -FA 缩聚物尤其优化用于基于水泥和硫酸钙的混合物的塑化和减水。 一般， 这些产品作为 20％ w/v 水溶液使用并且 pH 值是约 9 至 11.4( 样品 1) 和 7 至 10( 样 品 2)。这里 ( 见表 9) 我们用 FDM( 终浓度 140mg/L) 处理两种样品的 20％ w/v 工作液并且 在不同孵育时间后使用先前描述的乙酰丙酮法定量剩余的甲醛 ( 以 ppm 表示的值 )。
表9
20％ w/v 样品 1 样品 2
无 FDM 5700 1700 FDM(1 小时 ) 3200 1200 FDM(3 小时 ) 2500 1000 FDM(24 小时 ) 1800 7001 小时酶促处理后的产品性能就定形时间 (set time)、 流动和强度而言没有不利 地受到影响。相似的结果可以通过使用 1/5 酶浓度那样的量获得。在这些产品中， 除去甲 醛可以导致聚合物分子量分布随时间的变化。
实施例 9 ： FDM 降低改性阴离子聚烷基二醇 - 酚 -FA 树脂中 FA 含量的用途
改性阴离子聚烷基酚醛树脂尤其优化用于基于水泥和硫酸钙的混合物的塑化和 减水。将该产品配制为浓缩的水溶液 (pH 5-8)。通过直接添加 FDM 至该产品进行酶处理。 未处理的产品含有约 250ppm 甲醛， 如通过乙酰丙酮法所确定。下表 ( 表 10) 显示与 FDM 孵 育 0.5 小时、 3 小时和 24 小时后的剩余甲醛 ( 单位为 ppm)。
表 10 ：
37CN 102459580 A说FDM(30 分钟 )明书FDM(3 小时 ) 6.8 26.1 FDM(24 小时 ) 3.5 2.435/39 页FDM(100mg/L) FDM(10mg/L)
10.2 125.51 小时酶促处理后的产品性能就定形时间、 流动和强度而言没有不利地受到影响。
相似的结果可以使用未纯化的细胞提取物或产生 FDM 的完整细胞获得。
实施例 10 ： 为扩展的底物特异性合理设计 FDM
FDM 的活性部位显示了在相对狭窄、 主要是疏水的口袋内结合的甲醛分子。策略 性安置的锌离子充当路易斯酸并且激活底物用于紧密结合的 NADH 辅因子分子所供给的氢 负离子亲核攻击。歧化反应的假定反应机制由两个偶联的半反应组成。在第一个半反应 中， 一个甲醛分子被酶 (E)-NAD+ 复合物不可逆氧化以形成甲酸和 (E)-NADH 复合物。在第 二个半反应中， 另一个甲醛分子与该 (E)-NADH 复合物结合并且不可逆地还原成甲醇， 留下 + (E)-NAD 复合物用于下一个反应。 在 Tanaka 等人 (2002)， Journal of Molecular Biology， 324， 519-533 中描述和展示了由 FDM 催化的歧化反应的假定反应机制。来自恶臭假单胞 菌 F61 的 FDM 在 2.3A 分辨率下的活性部位由 Hasegawa 等人 (2002)， Acta Crystallogr.， Sect.A， 58， C102-C102 描述和展示。甲醛紧密地填塞于疏水口袋中 (Met 337、 Ile 301、 Phe 93 和 Phe 127) 并且与锌离子及 NAD(H)- 辅因子密切接近。
来自恶臭假单胞菌 F61 的 FDM 已经显示具有限程度的底物混杂性 (Kato 等人 Agric.， 1983， Biol.Chem.， 47(1)， 39-46)。野生型酶针对乙醛显示微弱活性 (5-10％， 我们 的结果显示甚至更低 ) 并且针对甲基 - 乙二醛显示微弱活性 (22％ )， 针对甲醛的相对活 性是 100％， 但是针对立体化学上更多要求的底物如丙醛、 丁醛、 庚醛、 甘油醛、 乙醇醛、 苯甲 醛、 乙二醛或戊二醛不显示活性。为改善针对体积较大醛类、 尤其乙醛的底物特异性， 我们 决定通过在第 337、 301、 127 和 93 位置处将内衬活性部位的大体积疏水残基置换为较小的 对应物来修饰 FDM 的活性口袋。因此已经制备并表征了以下的单突变体 ：
FDM M337A FDM I301L FDM F127V FDM F93L
FDM I301A FDM F127A FDM F93I
FDM I301V FDM F93G
FDM I301G FDM F93A
FDM I301S FDM F93V
实施例 11 ： 通过 pH-stat 滴定法并通过 HPLC 确定的 FDM 突变体的活性
在含有 20mM 甲醛， 100mM KCl， 0.25mM KH2PO4(pH 7) 的标准反应混合物中通过 pH-stat 滴定法验定 FDM 及其变体的活性。 通过添加 5μL 酶溶液至 25mL 标准混合物 ( 一般 而言 0.1-0.5μg/mL 酶， 这取决于活性 ) 在室温进行该反应。 通过用 5mM NaOH 监测 5 分钟范 围内的甲酸盐形成。一个单位定义为每分钟催化 1μmol 甲酸形成所需要的酶量。FDMF93A/ I301L(0.7μg/mL) 是由 pH-stat 滴定法以 20mM 乙醛替代甲醛在 pH 7 所测试的唯一突变体。 鉴于 FDM 和全部单一突变对乙醛的活性太弱以至于不能通过 pH-stat 滴定法追踪， 我们决 定通过 HPLC(Aminex HPX-87H 柱， 在 5mM H2SO4 中， 由通过 RI 检测， 0.5mL/ 分钟 ) 比较 FDM 及其变体。酶促反应在 50mM KH2PO4(pH 8)， 100mM KCl 和 20mM 乙醛中进行。通过添加 FDM或添加其变体 (50μg/ml) 启动反应。乙醛、 乙醇和乙酸是以 30 分钟间隔定量 ( 保留时间 ： 乙醛 21.2 分钟 ； 乙醇 25.2 分钟 ； 乙酸 18.9 分钟 )。确定反应初速度 (30 分钟值 ) 并且将 单位计算为在 1 分钟内生成 1μmol 乙酸所需要的酶量。
结果清楚地显示大部分突变不利地影响针对两种醛的比活性。仅 I301L 和 F93A 证 明具有有意义的特性。在第 300 位置处导入亮氨酸导致乙醛活性提高 2.5 倍， 同时对甲醛 92 的比活性提高约 10 至 20％。F A 变体几乎完全丧失甲醛活性， 而与野生型酶相比， 对乙醛 301 的比活性提高约 3 倍并且与 FDM I L 突变体的活性相似 ( 表 11)。
表 11 ：
表 11 显示不同活性部位突变体针对甲醛 (FA) 和乙醛 (AA) 的比活性。如上所述， FA 活性由 pH-stat 滴定法确定 ； AA 活性由 HPLC 确定。＊该值符合由 pH-stat 滴定法测量的 活性。n.a. 无活性。
已经组合了第 301 和 93 位置处的突变以产生 FDM I301L/F93A 变体。这种双突变体 对甲醛没有任何活性， 但是针对乙醛具有提高 5 倍的活性。两种置换在增强对乙醛的活性 方面具有协同效应 ( 图 2)。
尽管突变体 I301L 显示扩展的底物特异性， 然而 FDM F93A 变体并且尤其双突变体显
示底物特异性从甲醛至乙醛的转变。图 3 显示通过 HPLC 测定的 FDM I301L 的活性曲线。
实施例 12 ： FDM、 FDM I301L 和 FDM I301L/F93A 的热稳定性
FDM 及其变体的重要特性是对酶纯化 ( 灭菌 ) 期间和技术应用期间升高温度的耐 受。 我们通过将 FDM、 FDM I301L 和 FDM I301L/F93A 在不同温度 (25-65℃ ) 预孵育 20 分钟并随 后通过用乙醛或甲醛测试样品而比较这些酶的热稳定。 如上所述， 通过 HPLC 测试 FDM I301L 和 FDM I301L/F93A 样品的乙醛活性。数据显示为与室温下所获得值相比较的相对活性 ( 图 4)。
如上所述， 通过 pH-stat 滴定法测试 FDM 和 FDM I30 样品的甲醛活性。数据显示为 与室温下所获得值相比较的相对活性 ( 见图 5)。令人感兴趣的是， FDM I301L 突变体显示与 野生型蛋白相比热稳定明显增加 (+5℃， 图 5)。F301L 和 F301L/F93A 突变体对乙醛显示相同的 热稳定曲线 (T50 大约 55℃ )。
实施例 13 ： FDM、 FDM I301L 和 FDM I301L/F93A 的晶体结构
在瑞士 Villingen 的 Synchrotron SLS 测量 FDM I301L/F93A 和 FDMI301L 的晶体 ( 表 12)。
表 12X 射线数据汇集的统计学
使用野生型结构作为结构模板 (pdb 代码 ： 2DPH)， 通过分子替换方法测定 FDM I L/F A 的结构。 作为数据质量的实例， 用于确定结构的第 93 位置处的野生型苯丙氨酸残 301 93 基连同 FDM I L/F A 突变体的密度图一起显示 ( 图 6)。红色差异电子密度表明应当将苯 丙氨酸作为丙氨酸建模并且水分子位于苯基环 Cε- 位置处。 完整酶的总体结构不因突变而
301 93改变。突变的影响限于诱变的位置及其近旁邻居。图 7 显示野生型 FDM 的活性部位的特写 图。该蛋白质以丝带式样描述。后续的氨基酸显示为球和棍 ： Cys 46、 His 67 和 Asp 170 配位催化性锌 ； Ile 301 和 Phe 93 是导入突变的位点 ； Met 337 和 Phe 127 是在突变影响下 改变其构象的氨基酸。也显示了锌离子和辅因子 (NADH)。
FDM I301L 突变体的结构 ：
在电子密度图中清楚地见到异亮氨酸 301 突变成亮氨酸。该侧链采取从活性部位 伸出的取向， 从而导致与 Val 303、 Phe 265 和 Phe 57 的更强烈疏水接触。这种增强的相互 作用可以代表提高的温度稳定性。该突变也对苯丙氨酸 127 产生影响。与野生型酶相比， 完整侧链略微移动并且苯环转动约 70° ( 图 8)。苯环是底物结合口袋的部分并且该侧链的新位置以如此方式约束结合口袋， 从而甲醛和乙醛的羰基处于从 NADH 辅因子转移氢负 离子的更有利位置。另外， 异亮氨酸 301 至亮氨酸的突变打开对面位点上的结合口袋， 从而 与野生型酶相比允许更好地接受立体化学上要求更多的乙醛作为底物。
FDM I301L/F93A 的结构 ：
异亮氨酸 301 至亮氨酸的突变对 Leu301 和对 Phe 127 产生与单突变体结构中相 同的影响。第二突变 (Phe 93 至 Ala) 为野生型的苯环 Cε- 位置附近存在的水分子 (H2O 339) 腾出空间。这个水分子与 NADH 的烟酰胺氧形成氢键并且与作为催化性锌的配体之一 的 Asp170 的羧基氧形成氢键。第三个微弱氢键与 Ala 338 的主链羰基氧形成。该水分子 与 Asp 170 的强氢键扭曲了该侧链的构象， 因而削弱锌配位作用。为产生氢键， Asp 170 的 侧链不得不转动约 14° ( 图 9)。 由于这个转动， 锌离子与其羧基氧之间的距离从 至 增加 最适锌配位作用的丧失可以解释双突变体总体降低的活性。另外， 与野生型酶或I301L 突变体相比， 较大的活性部位似乎阻止甲醛可以采取用于催化作用的有效取向。这 可以解释观察到的特异性从甲醛至乙醛的转变。该突变的第二种影响是改变的 Met 337 构 象。Met 337 的 Cε 原子朝前一个苯环的位置转动 90°。这种构象是一种极低能量构象， 因为它是蛋白质中甲硫氨酸的最优选旋转异构体。
总之， 这些结果表明 FDM I301L 单突变体是技术应用的最优选候选物。
实施例 14 ： FDM I301L 突变体的干燥制剂降低改性阴离子聚烷基二醇 - 酚 -FA 树脂 中 FA 含量的用途
又一种具有约 120ppm 残留 FA 含量的改性阴离子聚烷基二醇 - 酚 -FA 树脂用干燥 301 FDM I L 制剂 ( 制剂比活性 ： 大约 50U/mg) 处理。通过添加 50mg/L 酶粉末至该树脂随后 在室温孵育来进行此试验。下表 ( 表 13) 显示 5 小时后和 42 日后的剩余甲醛 ( 以 ppm 表 示 )。
5 小时后 无酶 FDM I301L(50mg/L)
126ppm 2ppm 42 日后 119ppm 1ppm如实施例 3 中所描述， 通过乙酰丙酮法确定甲醛含量。 301 实施例 15 ： FDM I L 突变体的干燥制剂降低改性 β 萘 -FA 磺化树脂中 FA 含量的用途 水溶性聚合物溶液 ( 改性 β 萘 -FA 磺化树脂 ) 用不同量的 FDM I301L 干燥制剂处 理 (20 至 200mg 制剂 /L 聚合物溶液 ) 并且在室温孵育 5 小时。此时， 添加相同量的酶并且 继续孵育直至 11 日。下表 ( 表 14) 显示使用 2×50mg/L 干燥酶制剂 5 小时、 24 小时、 4 日、 7 日和 11 日后的剩余甲醛 ( 单位为 ppm)。
如实施例 3 中描述， 通过乙酰丙酮法确定甲醛含量。 301
实施例 16 ： FDM I L 突变体的干燥制剂降低稳定化阴离子丙烯酸酯共聚物分散体 中 FA 含量的用途
水中的稳定化阴离子丙烯酸酯共聚物分散体 (54％固形物含量 ) 已经用 10mg/L 301 FDM I L 干制剂在室温处理。在离心 (2-4 小时， 以 14000 转 / 分钟， 室温 ) 后， 测定清亮水 相中甲醛的含量。下表 ( 表 15) 显示酶促处理 5 小时、 24 小时和 96 小时后分散体的甲醛含 量 ( 单位为 ppm)。
5 小时 无酶 FDM I301L(10mg/L)
370ppm 304ppm 24 小时 310ppm 170ppm 96 小时 260ppm 150ppm如实施例 3 中描述， 通过乙酰丙酮法确定甲醛含量。42CN 102459580 A
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在又一个优选的实施方案中， 所述制品是树脂。该树脂可以是用于织物的交联剂 或用来生成聚合物分散体的高分子分散剂。在一个优选的实施方案中， 交联剂用于含有纤 维素纤维如棉或粘胶纤维或其混合物和与合成纤维的混纺物的织物。
所得的聚合物分散体适于处理材料例如构筑或建筑材料、 皮革和兽皮、 纤维板、 刨 花板、 胶合板和 / 或毛毯和适于涂覆应用或造纸。
在另一个实施方案中， 本发明涉及用于降低含甲醛制品中甲醛含量的方法， 包括 使该制品与催化甲醛降解的酶制剂接触。
本发明也涉及用于降低织物中甲醛含量的方法， 包括用催化甲醛降解的酶制剂接 触该织物。此外， 它涉及包含织物用交联剂或高分子分散剂和催化甲醛降解的酶制剂的制 品。
本发明的其他实施方案涉及密码子优化的编码歧化酶的核酸、 含有该核酸的载体 和表达宿主。
另外， 本发明涉及编码新 FDM 变体的分离的核酸， 所述 FDM 变体的氨基酸序列， 以 及其具体用途。
附图描述
图1： 几种基于甲醛的交联试剂。(A) 脲 -FA、 (B) 蜜胺 -FA、 (C) 二羟甲基二羟基 亚乙基脲 (DMDHEU)。
图2： 通过 HPLC 确定的 FDM、 FDM I301L、 FDM F93A 和 FDMI301L/F93A 的乙醛歧化初速 度 (50mM K2HPO4pH 8， 100mM KCl 中的 20mM)。酶浓度 50μg/mL。
图3： 通过 HPLC 使用 FDM I301L 变体， 甲醛 ( 上图 ) 和乙醛 ( 下图 ) 随时间的酶促 转化。反应混合物以 30 分钟间隔历经 2 小时分析。反应以 50mMK2HPO4( 对于甲醛， pH 7.3 并且对于乙醛， pH 8)， 100mM KCl 和 20mM 醛进行。 酶浓度对于乙醛是 50μg/mL 并且对于甲 醛是 2.4μg/mL。保留时间甲醛 ： 16.6 分钟 ； 甲酸 ： 17.5 分钟 ； 甲醇 ： 22.9 分钟 ； 乙醛 ： 21.2 分钟 ； 乙酸 ： 18.9 分钟 ； 乙醇 ： 25.2 分钟。产物等摩尔生成。通过 RI 检测。 301
图4： FDM I L 和 FDM I301L/F93A 的温度 - 活性曲线。底物 ： 乙醛 301
图5： FDM 和 FDM I L 的温度 - 活性曲线。底物 ： 甲醛 301 93
图6： 以 FDM I L/F A 突变体的电子密度图所示的野生型 Phe 93。
图7： 与甲醛 (FA) 复合的野生型 FDM 的活性部位的特写图
图8： 与甲醛 (FA) 复合的 FDM I301L 的活性部位的特写图
图9： 与乙醛 (AA) 复合的 FDM I301L/F93A 的活性部位的特写图。
序列描述
SEQ ID NO ： 1
甲醛歧化酶的核酸序列， Genebank 登录号 L25862(CDS 323..1522)
SEQ ID NO ： 2
甲醛歧化酶的蛋白质序列， Genebank 登录号 L25862
SEQ ID NO ： 3
来自恶臭假单胞菌 F61 的 FDM 的优化 DNA 序列 (1197bp)SEQ ID NO ： 4 pDHE-FDM 的核苷酸序列 SEQ ID NO ： 5 pAgro 的核苷酸序列 SEQ ID NO ： 6 pHSG 的核苷酸序列 SEQ ID NO ： 7 甲醛歧化酶 Ile-301-Leu 的核酸序列 SEQ ID NO ： 8 甲醛歧化酶 Ile-301-Leu 的蛋白质序列 SEQ ID NO ： 9 甲醛歧化酶 Phe-93-Ala/Ile-301-Leu 的核酸序列 SEQ ID NO ： 10 甲醛歧化酶 Phe-93-Ala/Ile-301-Leu 的蛋白质序列 定义应当理解本发明不限于如描述那样的具体方法学、 方案、 细胞系、 植物物种或属、 构建体和试剂。还应当理解本文所用的术语目的仅在于描述具体实施方案， 并且不意图限 制本发明的范围， 本发明的范围将仅受所附权利要求书限制。 必须指出， 如本文中并且所附 权利要求中所用， 单数形式 “一个 (a)” 、 “一种 (an)” 和 “该 (the)” 包括复数指称， 除非上下 文另外明确地指明并非如此。因此， 例如， 对 “一种载体” 的提及是对一种或多种载体的提 及并且包括本领域技术人员已知的其等同物等。术语 “约” 在本文中用来指大约、 大致、 左 右和在……范围内。当术语 “约” 与一个数字范围联合使用时， 它通过扩展界限值高于和低 于所述数值而修饰该范围。通常而言， 术语 “约” 在本文中用来通过 20％、 优选 10％之上或 之下 ( 更高或更低 ) 变异而修饰高于和低于所述值的数值。如本文中所用， 用语 “或” 意指 特定表单的任何一员并且还包括该表单的成员的任意组合。
术语 “甲醛” 或 “FA” 是指通式 CH2O 的化合物， 其具有 CAS 编号 50-00-0。它也由 技术人员称作福尔马林 (formalin)、 蚁醛 (methylene oxide)、 甲醛 (methyl aldehyde)、 甲 醛 (methanal)、 HCHO、 甲醛 (formic aldehyde)、 甲醛 (oxomethane)、 福尔马林 (formol)、 甲 醛 (oxymethylene)、 morbicid、 veracur、 甲二醇、 福尔马林 40、 BFV、 fannoform、 formalith、 FYDE、 HOCH、 karsan、 lysoform、 superlysoform、 methan 21。在纯形式下， 甲醛是气体， 但 是经常在用水稀释后作为水合物 HO-(CH2O)n-H( 称作甲二醇 (methandiol)) 以液体形式使 用。甲醛的水溶液称作福尔马林。它是一种无色、 高度可燃液体或气体， 具有百万分之一份 (ppm) 时可觉察的刺激气味。为本发明的目的， 也包括甲醛混合物 ( 例如与水、 丙酮、 苯、 二 乙醚、 氯仿和乙醇的混合物 )。由本定义包括的甲醛聚合物包括低和高分子量聚合物， 特别 是低聚甲醛以及直链和环状聚甲醛。
术语 “乙醛” 或 “AA” 是指通式 CH3CHO 的化合物， 其具有 CAS 编号 75-07-0。它也 由技术人员称作醋醛 (ethanal) 并且是一种具有刺激性、 窒息性气味的无色液体， 其稀释 时略有果香味。乙醛是植物和动物有机体代谢中的中间体， 在所述代谢中可以少量检测到 乙醛。较大量的乙醛干扰生物过程。作为醇发酵过程中的中间体， 乙醛以微小量存在于全部酒精饮料中， 如啤酒、 葡萄酒和烈酒。也已在植物汁液和精油、 焙烘咖啡和烟草烟雾中检 测到乙醛。在较高浓度 ( 直至 1000ppm)， 乙醛刺激黏膜。空气中乙醛的感知限处于 0.07 和 0.25ppm 之间的范围内。在此浓度， 乙醛水果气味明显。在暴露于 25 和 50ppm 浓度 15 分钟 后， 已经观察到结膜刺激作用， 但是在暴露于 200ppm 乙醛 15 分钟后， 已经报道了短暂结膜 炎和对呼吸道的刺激作用。
术语 “丙酮醛” 指通式 (CH3-CO-CH ＝ O) 的化合物， 其具有 CAS 编号 78-98-8(Kato 等 人， 1983， Agric.Biol.Chem.， 47(1)， 第 39-46 页 )。 它 也 由 技 术 人 员 称 作 丙 酮 醛 (pyruvaldehyde)、 2- 氧代丙醛 (2-oxopopanal)、 2- 氧代丙醛 (2-oxopropionaldehyde)， 并 且是几条代谢途径的副产物。
“制品 (formulation)” ， 如本文中所用， 意指特定公式和 / 或配方制造的化学组合 物。因此， 它区别于天然存在的含 FA 源。该制品通过采用 FA 添加来制造。在一些情况下， 该制品也称作 “FA 缩合物” 。
如本文中所用， 短语 “树脂” 意指随后会发生反应以形成高分子量聚合物或交联功 能高分子链 ( 如纤维素 ) 的低分子量物质。特别地， 术语树脂指 “合成树脂” ， 其中将所述的 合成树脂定义为由本身没有树脂特征的充分定义的反应物 ( 包括甲醛 ) 之间受控化学反应 如聚加成反应或缩聚反应而产生的树脂。 合成树脂也可以意指通过聚合不饱和单体所获得 的树脂。该术语包括 (i) 烃树脂， 即， 从煤焦油、 石油和松节油流中通过聚合作用产生的合 成树脂。 这些树脂如天然树脂那样使用， 例如， 与其他聚合物组合以向材料赋予特定特性如 粘着性、 流动性和硬度， 和 (ii) 在甲醛存在下主要通过加聚和缩聚所获得的合成树脂， 它 们是更高分子量塑料合成过程中的中间体。 此类树脂的实例和优选实施方案在下文更详细 地公开。
如本文中所用， 术语 “酶制剂” 意图涵盖处于任意纯度水平的任意酶制剂 ( 无论怎 样获得 )( 包括使用表达该酶的宿主即大肠杆菌 (E.coli)， 只要该制剂是有酶促活性的。 本 发明的酶制剂包括显示多种不同比活性的制剂， 并且以带有一种或多种载体的混合物中或 多或少粗制的酶提取物形式便利地使用。
如本文中所用， 术语 “交联剂” 或 “交联物 (crosslinker)” 意指如上文定义的含 FA 树脂， 其可以用来交联织物中的纤维素分子以特别对纤维素织物赋予抗皱性和耐久压烫特 性。此类交联剂的实例和优选实施方案在下文更详细地公开。
如本文中所用， 术语 “织物” 或 “织物 (fabric)” 意指从天然织物如黄麻纤维、 剑麻、 苎麻纤维、 大麻和棉以及多种合成纤维如粘胶纤维、 人造丝、 纤维素酯、 乙烯基树脂纤维、 聚 丙烯腈及其共聚合物、 烯烃如乙烯、 聚酰亚胺或尼龙型的聚合物和共聚合物、 聚酯等制成的 产物和物品。所用的织物可以是具有单一组成或纤维混合物的那些织物。
术语 “高分子分散剂” 指在水中轻易可溶解的高分子电解质。 最常见的代表是碱金 属聚碳酸盐、 聚磺酸盐或聚磷酸盐， 通常是钠盐。 优选的分散剂通过芳香族化合物与甲醛缩 合来产生。芳香族磺酸与甲醛的缩合产物的用途是极广泛的。一般而言， 它们是基于萘磺 酸盐、 蜜胺磺酸盐或苯酚或其衍生物的阴离子甲醛树脂。其他的高分子分散剂包括基于阴 离子主链和非阴离子侧链的接枝聚合物。 因此， 通常， 使用聚羧酸酯作为主链并且使用聚烷 撑二醇作为侧链。 所述高分子分散剂允许降低水硬粘合剂混合物如基于水泥和硫酸钙的体 系中的含水量， 而不分别降低可加工性、 流变学特性。 它们进一步可以用来改善水硬粘合剂(hydraulic binder) 的可加工性或用来增加强度发展。 高分子分散剂在本领域也称作″超 级塑化剂″。此类高分子分散剂也用于织物染色液中以稳定染料分散体。
术语 “变体” 相对于某序列 ( 例如， 多肽或核酸序列如， 例如本发明的转录调节性 核苷酸序列 ) 而言意图指基本上相似的序列。对于包含可读框的核苷酸序列， 变体包括因 为遗传密码的简并性而编码与天然蛋白相同的氨基酸序列的那些序列。 如可以使用熟知的 分子生物学技术鉴定天然存在的等位基因变体， 例如用聚合酶链反应 (PCR) 和杂交技术。 变体核苷酸序列也包括合成衍生的核苷酸序列， 如通过例如使用位点定向诱变法产生的那 些核苷酸序列， 并且对于可读框而言， 编码天然蛋白， 以及编码相对于天然蛋白而言具有氨 基酸置换的多肽的那些核苷酸序列。通常， 本发明的核苷酸序列变体将对 SEQ ID NO ： 1的 核苷酸序列具有至少 30、 40、 50、 60 至 70％， 例如优选地 71％、 72％、 73％、 74％、 75％、 76％、 77 ％、 78 ％至 79 ％、 通常至少 80 ％、 例如、 81 ％ -84 ％、 至少 85 ％， 例如 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％至 98％和 99％核苷酸 “序列同一性” 。 “变体” 多肽意指从 SEQ ID NO ： 2 的蛋白质中通过对该天然蛋白的 N- 末端和 / 或 C 末端缺 失 ( 所谓截短 ) 或添加一个或多个氨基酸 ； 在该天然蛋白中一个或多个位点处缺失或添加 一个或多个氨基酸， 或置换该天然蛋白中一个或多个位点处的一个或多个氨基酸所衍生的 多肽。此类变体可以例如因遗传多态性或因人操作产生。用于此类操作的方法通常是本领 域已知的。 “序列同一性” 指两个最佳比对的 DNA 或氨基酸序列在组分 ( 例如核苷酸或氨基 酸 ) 比对窗口范围内不变的程度。受检序列和参比序列的比对节段的 “同一性分数” 是由 两个比对序列所共有的相同组分的数目除以参比序列节段 ( 即完整的参比序列或参比序 列的较小限定的部分 ) 中组分的总数目。 “％同一性” 是同一性分数乘以 100。用于比对比 较窗口的最佳序列比对是本领域技术人员熟知的并且可以通过工具如 Smith 和 Waterman 的局部同源性算法、 Needleman 和 Wunsch 的同源性比对算法、 Pearson 和 Lipman 的相似性 搜索方法并且优选地通过这些算法的计算机化执行如作为 GCG.RTM.Wisconsin Package. RTM.(Accelrys Inc.Burlington， Mass.) 的部分可获得的 GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 TFASTA 来实施。
术语 “ppm” ( 每百万分之 ... 份 ) 指质量份额并且等同于 “mg/kg” 。
多肽 / 蛋白质
术语 “多肽” 和 “蛋白质” 在本文中可互换地使用并且指由肽键连接在一起的聚合 形式的任意长度的氨基酸。
多核苷酸 / 核酸 / 核酸序列 / 核苷酸序列
术语 “多核苷酸” 、 “核酸序列” 、 “核苷酸序列” 、 “核酸” 、 “核酸分子” 在本文中可互 换地使用并且指任意长度的聚合非分支形式的核苷酸， 所述核苷酸是核糖核苷酸或脱氧核 糖核苷酸， 或这二者的组合。
同源物
蛋白质的 “同源物” 包括这样的肽、 寡肽、 多肽、 蛋白质和酶， 它们相对于所讨论的 未修饰蛋白具有氨基酸替换、 缺失和 / 或插入并且与从中衍生它们的未修饰蛋白具有相似 的生物学活性和功能活性。
缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
插入指将一个或多个氨基酸残基导入蛋白质中的预定位点。 插入可以包含氨基端 融合和 / 或羧基端融合以及序列内插入单个或多个氨基酸。通常， 在氨基酸序列内部的插 入将比 N 端融合物或 C 端融合物小， 为约 1 至 10 个残基级别。氨基端或羧基端融合蛋白或 融合肽的实例包括如酵母双杂交系统中所用的转录激活物的结合结构域或激活结构域、 噬 菌体外壳蛋白、 ( 组氨酸 )-6- 标签、 谷胱甘肽 S- 转移酶 - 标签、 蛋白 A、 麦芽糖结合蛋白、 二氢叶酸还原酶、 Tag·100 表位、 c-myc 表位、 肽 )、 HA 表位、 蛋白 C 表位和 VSV 表位。 置换指蛋白质的氨基酸以具有相似特性 ( 如相似的疏水性、 亲水性、 抗原性、 形成 或破坏 α- 螺旋结构或 β- 折叠结构的倾向性 ) 的其他氨基酸替换。氨基酸置换一般是 单残基的， 但是根据对多肽所设置的功能性约束条件， 可以聚簇， 可以从 1 个至 10 个氨基 酸变动 ； 插入通常是约 1 个至 10 个氨基酸残基级别。氨基酸置换优选地是保守性氨基酸 替换。保守性置换表是本领域熟知的 ( 见例如 Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman andCompany( 编著 ))。
氨基酸置换、 缺失和 / 或插入可以使用本领域熟知的肽合成技术如固相肽合成法 等或通过重组 DNA 操作轻易地进行。用于操作 DNA 序列以产生蛋白质的置换、 插入或缺 失变体的方法是本领域熟知的。例如， 用于在 DNA 的预定位点处产生置换突变的技术是 本领域技术人员熟知的并且包括 M13 诱变法、 T7-Gen 体外诱变法 (USB， Cleveland， OH)、
- 表位、 lacZ、 CMP( 钙调蛋白结合QuickChange 位点定向诱变法 (Stratagene， San Diego， CA)、 PCR 介导的位点定向诱变或其 他位点定向诱变法。
衍生物
“衍生物” 包括这样的肽、 寡肽、 多肽， 其中与天然存在形式的蛋白质 ( 如目的蛋 白 ) 的氨基酸序列相比， 它们包含以非天然存在氨基酸残基置换氨基酸或者添加非天然存 在的氨基酸残基。蛋白质的 “衍生物” 也包括这样的肽、 寡肽、 多肽， 其中与所述多肽的天然 存在形式的氨基酸序列相比， 它们包含天然存在改变 ( 糖基化、 酰化、 异戊二烯化、 磷酸化、 肉豆蔻酰化、 硫酸化等 ) 的氨基酸残基或非天然改变的氨基酸残基。与从中衍生衍生物的 氨基酸序列相比， 该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个 非氨基酸替代或添加 ( 例如报道分子或其他配体 )， 如结合的以促进检测该衍生物的报道 分子， 和相对于天然存在蛋白的氨基酸序列而言， 包含非天然存在的氨基酸残基。 此外， “衍 生物” 也包括天然存在形式的蛋白质与标签肽如 FLAG、 HIS6 或硫氧还蛋白 ( 对于标签肽的 综述， 见 Terpe， Appl.Microbiol.Biotechnol.60， 523-533， 2003) 的融合物。
发明详述
本发明涉及催化甲醛降解的酶制品用于降低含甲醛制剂中甲醛含量的用途。
催 化 甲 醛 降 解 的 酶 是 本 领 域 已 知 的。 例 如， Bystrykh 等 人 (1993)J.Gen. Microbiol.139， 1979-1985 ； Sakai， Y. 等人 (1995)FEMS Microbiol.Lett.127， 229-234 ； 或 Ito 等人 (1994)J.Bacteriol.176， 2483-2491 或 Gonzalez 等人， J.Biol.Chem.， Vol.281， NO.20， 第 14514-14522 页， 2006 年 5 月 19 日描述了可以用于降解 FA 的酶， 如 S- 甲酰谷胱 甘肽水解酶、 甲醛歧化酶、 甲酸甲酯合酶或谷胱甘肽非依赖性甲醛脱氢酶。
属于含锌中等链长的醇脱氢酶家族的酶特别适用于本发明 ( 也参见 Tanaka 等人， J.Mol.Biol.(2002)324， 519-533)。在一个优选的实施方案中， 与常见醇脱氢酶中的辅酶( 作为共底物 ) 区别的吡啶核苷酸 NAD(H) 与该酶紧密但不共价地结合并且充当辅因子。
“紧密地结合” 意指辅因子通过相互作用如离子键、 分子间力、 氢键、 范德华力、 疏 水相互作用与酶结合。由于该辅因子在歧化反应期间循环 ( 相同的酶还原 FA 成甲醇和氧 化 FA 成甲酸 )， 故本发明的方法具有使成本最小化的特有优点， 因为不必持续向反应混合 物提供该辅因子以维持酶活性。
特别适用于本发明用途的是作用于供体的醛或氧化基的氧化还原酶 (E.C 分类 1.2.)。优选具有除 NAD 或 NADP、 细胞色素、 氧、 二硫化物、 铁硫蛋白 (E.C. 分类 1.2.99) 之 外的受体的氧化还原酶。 优选地， 该酶是来自细菌菌株的甲醛歧化酶 ( 下文常称作 “FDM” )， 更优选地是 E.C 分类 EC1.2.99.4. 或 EC 1.2.1.46. 的甲醛歧化酶， 其衍生自恶臭假单胞 菌菌株。该酶在 Kato， N.， 等人 (1983)Agric.Biol.Chem.， 47(1)， 39-46， Yanase， H.， 等人 (1995)Biosci.Biotechnol.Biochem.， 59(2)， 197-202 和 Yanase， H.， 等人 (2002)Biosci. Biotechnol.Biochem.， 66(1)， 85-91 中进一步描述。
在一个优选的实施方案中， 酶制剂含有包含 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列的酶或其 变体。 在一个进一步优选的实施方案中， 酶制剂含有由 SEQ IDNO ： 1 的核酸编码的酶或其变 体。 在一个特别优选的实施方案中， 如下文以更多细节所述， 酶制剂含有这样的酶， 其 包含 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列的变体或衍生物， 其中第 93 位置处的苯丙氨酸和 / 或第 301 位置处的异亮氨酸和 / 或第 337 位置处的甲硫氨酸和 / 或第 127 位置处的苯丙氨酸已 经由任何的其他氨基酸置换。
对于本发明的用途， 酶制剂可以纯化以具有多个纯度水平的情况下或作为未纯化 的提取物使用， 例如作为细菌提取物， 即来自天然产生所需酶的细菌的或作为表达宿主使 用的细菌中的提取物。备选地， 也可以使用正在生长的细胞， 其中所述的细胞包含编码 FDM 的核酸、 携带所述核酸的核酸构建体或载体， 而不包括任何蛋白质纯化步骤。 也可以使用休 眠的或破裂的细胞。 破裂的细胞理解为意指例如通过用例如溶剂处理使之可通透的细胞或 已经通过酶处理、 通过机械处理 ( 例如弗氏压碎器或超声波 ) 或通过另一种方法破裂的细 胞。如此获得的粗提物以有利方式适合本发明的用途。也可以对该过程使用纯化或部分纯 化的酶。可以在该反应中有利使用的固定微生物或酶是同样适合的。当游离的生物或酶用 于本发明方法时， 在提取之前适当地移出它们， 例如通过过滤或离心。
取决于待接触的含 FA 制品， 酶制剂可以以游离 ( 可溶性或固态 ) 或固定的形式 使用。固定的酶意指被固定至惰性支持物的酶。适合的支持材料和固定于其上的酶在 EP-A-1149849， EP-A-1 069 183 和 DE-A 100193773 中公开和在其中所引用的参考文献中 公开。以这种方式， 参考这些出版物的全部公开内容。合适支持材料的实例是粘土、 粘土矿 物如高岭石、 硅藻土、 珍珠岩、 二氧化硅、 氧化铝、 碳酸钠、 碳酸钙、 纤维素粉、 阴离子交换材 料、 合成聚合物如聚苯乙烯、 丙烯酸树脂、 酚醛树脂、 聚氨酯、 聚烯烃如聚乙烯和聚丙烯。支 持材料通常以用于制备所支持酶的精细分开的颗粒形式使用， 优选多孔形式。支持材料的 粒径通常不大于 5mm， 尤其不大于 2mm( 筛目等级 )。类似地， 当使用作为完整细胞催化剂 的 FDM 时， 可以选择游离或固定的形式。支持材料的实例是藻酸钙和角叉菜胶。酶及细胞 也可以用戊二醛直接连接 ( 产生 CLEA 的交联 )。相应和其他的固定方法例如在 K.Drauz 和 H.Waldmann， Enzyme Catalysis in Organic Synthesis2002， 第 III 卷， 991-1032，
Wiley-VCH， Weinheim 中的 J.Lalonde 和 A.Margolin“Immobilization of Enzymes” 中描 述。
待使用的酶量取决于酶制剂的纯度水平。 本发明方法的常见量在每克处理的含 FA 制品 0.1 至 1000 单位之间变动， 优选地在每克处理的含 FA 制品 1 至 500 单位之间、 更优选 地 5 至 100 单位之间、 甚至更优选地 8 至 30 单位之间， 最优选地 9 至 15 单位之间变动。一 个单位定义为每分钟催化 1μmol 甲酸形成所需要的酶量。 纯化的 FDM 具有约 100-200U/mg 比活性。酶量仅是可以根据反应条件如温度和孵育时间变动的近似值。可以通过开展常规 实验轻易地确定最适酶量。
本发明可以应用于已经用甲醛整饰过的全部制品。 最大类别的含甲醛制品是含有 脲、 蜜胺、 萘和酚的树脂类别及其衍生物如 DMDHEU。喷雾干燥添加剂和流变性调节剂在产 生分散体 ( 如 FA 与酚磺酸或萘磺酸的缩聚物 ) 中使用。其他制品包括绝缘材料、 砂纸和 制动衬片中铸造用砂、 石棉和玻璃绒毡的粘合剂或在制造泡沫树脂中使用的脲 - 甲醛缩合 物。含有甲醛的其他制品包括季戊四醇 ( 主要以原料用于表面涂料中和安全炸药中 ) 和作 为酚 - 甲醛缩合物和安全炸药的交联剂使用的六亚甲基四胺。在化妆品工业中， 甲醛作为 防腐剂用于数百种产品， 例如， 皂类、 除臭剂、 洗发剂和指甲硬化制剂。 本领域也已知使用甲 醛溶液作为鞣皮液防腐剂、 分散体、 作物保护剂和木材防腐剂。另外， 糖工业中需要甲醛来 防止在糖浆回收期间的细菌生长。 因此， 在一个优选的实施方案中， 待与催化甲醛降解的酶制剂接触的含甲醛制品 是树脂。上文给出了树脂、 尤其是合成树脂的一般定义。
优选地， 本发明可以应用于通过加聚和缩聚获得的 FA 树脂。实例包括呋喃树脂、 酮与醛树脂， 如苯乙酮甲醛树脂或丙酮甲醛树脂、 酚树脂如线型酚醛清漆和可熔酚醛树脂、 环氧树脂如液态环氧树脂 (DGEBA)、 基于 DGEBA 的固态环氧树脂、 卤代环氧树脂、 环氧酚醛 清漆树脂、 磺酰胺树脂或苯胺树脂。
例如， 广泛用于胶粘木材的酚树脂是不同酚类化合物和醛类的缩合物。酚类化合 物可以是苯酚本身、 多羟基酚和脂族或芳香族取代的酚。酚类化合物的实例是烷基酚如间 苯二酚、 烷基间苯二酚、 甲酚类、 乙基酚和二甲酚， 并且还有天然来源的酚类化合物如单宁 类、 Cardenol 和强心酚。 酚树脂组合物中的基于甲醛的酚树脂包括间苯二酚 - 甲醛、 酚-间 苯二酚 - 甲醛和单宁 - 甲醛树脂。
在一个特别优选的实施方案中， FA 树脂是氨基树脂， 如脲树脂、 聚氨酯树脂、 蜜胺 树脂、 氨腈和双氰胺树脂。
氨基树脂通常用做粘合剂 ； 填充性树脂 ； 模塑材料 ； 制造表面涂料的原料 ； 纸张、 织物、 皮革和浮选法的辅料 ； 建筑材料的加强物 ； 超塑化剂 ； 玻璃纤维和铸造用砂铸件的粘 合剂 ； 打火机 ； 金刚砂纸 ； 阻燃涂料 ； 防火的易燃物品 ； 用于多种目的的泡沫树脂 ； 砂轮 ； 离 子交换树脂 ； 污水絮凝剂 ； 和微胶囊生产。
如本文中所用， 短语 “粘合剂” 意指将材料固定在一起的胶、 将材料固定在一起的 层压树脂和基质树脂。 胶和填充性树脂是从脲、 蜜胺和 / 或酚与甲醛制得的水质粘合剂。 本 领域已知的胶用于制造木基板材例如刨花板、 中密度纤维板 MDF、 定向刨花板 OSB、 胶合板、 芯板或夹芯板 (sheeting)。填充性树脂用于浸渍纸， 所述的浸渍纸用于木基板材的装饰性 涂层， 例如在家具和层压地板的表面上。填充性树脂用作刨花板、 胶合板、 纤维板和家具工
业中的树脂胶。填充性树脂也用来浸渍装饰性层压制品用纸和用于涂覆木刨花板。
目 前 通 常 在 一 般 用 来 交 联 纤 维 素 分 子 的 称 作 轧 烘 焙 工 艺 (pad-dry-cure process) 的方法中使纺织材料抗皱或免烫。 纤维素的这种交联赋予织物恢复其原始形状和 平滑的倾向。如上文所述， 一些类别的 DMDHEU 树脂已经在过去广泛用作这种工艺中的交联 剂。
因此， 在本发明的另一个实施方案中， 待与催化甲醛降解的酶制剂接触的交联物 是适于整理织物的交联剂。
已经在现有技术中广泛描述了织物整理工业中所用的交联剂 ( 见， 例如， Ullmann 第四版， 第 23 卷 )。本领域技术人员已知的交联剂包括 “自交联” 剂 ( 具有氮原子上的活泼 氢原子 ) 和 “反应物交联” 剂 ( 氮是杂环的部分 )。
脲、 取代脲或蜜胺的多功能羟甲基衍生物是商用易于打理用整理剂的优选交联 剂， 其中所述的多功能羟甲基衍生物通过甲醛与这些化合物反应产生。一个重要类别是由 环状脲衍生物的羟甲基化合物构成 ； 实例是二羟甲基乙撑脲、 二羟甲基丙撑脲和二羟甲基 脲酮 (dihydroxymethylurone)。 非环状化合物如多种烷基氨甲酸酯也是常见的整理剂。 与 纯的脲 - 甲醛化合物相反， 这些整理剂显示形成自交联树脂的微小倾向并且主要与纤维素 反应以使纤维交联。 脲自身的羟甲基衍生物特别地用于人造丝织物。实例包括二羟甲基脲、 N， N” -双 ( 羟甲基 ) 脲、 三羟甲基蜜胺的二甲醚、 脲酮类 (urons) 即四氢 -3， 5- 双 ( 羟甲基 )-4H-1， 3， 5- 氧二氮杂苯 -4- 酮、 环状脲产物、 氨甲酸酯的羟甲基衍生物、 尤其氨甲酸甲酯和氨甲酸 甲氧乙酯。
优选地， 使用通过乙二醛与脲反应产生的二羟乙撑脲的羟甲基衍生物作为易于 打理用整理剂中的交联剂， 例如 WO98/029393 中所述的二羟甲基二羟乙撑脲 (DMDHEU)、 1， 3- 二甲氧基甲基 DHEU 和完全甲基化产物。乙二醛 - 脲型产物的多种修饰法均为商用。已 经甲基化并含有羟基化合物的产品提供羟甲基型的市售易于打理用整理剂的最低甲醛散 出潜能。Ullmann 第四版第 23 卷第 7 章中描述了多种交联物。
由于所描述的交联剂主要用来交联纤维素分子， 故待处理的织物优选地含有纤维 素或纤维素纤维。
本发明适合处理含有至少 10 ％、 优选地至少 20 ％、 至少 30 ％、 至少 40 ％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 至少 80％、 至少 90％、 最优选直到 100％纤维素纤维的纤维状 纤维素材料。实例包括黄麻纤维、 亚麻、 麻布、 大麻、 粘胶纤维、 再生纤维素如人造丝和优选 地棉。纤维素材料可以是机织、 非机织或针织的或处于纤维、 棉短绒、 粗纱、 丝条、 稀纱布或 纸的形式。 纤维状纤维素材料可以完全由棉组成或由与合成纤维如聚酯或尼龙混纺的棉组 成。
如上文所述， 树脂， 特别地蜜胺树脂或任一其他氨基 -s- 三嗪如胍胺广泛地用作 建筑材料或超塑化剂 ( 也称作混凝土液化剂 )。出于这些目的， 所述树脂通常通过与其他 化合物反应进行改性。特别有用的是基于蜜胺、 甲醛和亚硫酸盐的缩合产物 ( 见例如 EP 0 336 165)。
这些聚合物可以在自由基引发剂、 乳化剂和 / 或保护性胶体 ( 此处称作调节剂和 其他添加剂 ) 存在下通过如定义部分中定义的高分子分散剂引发的乳液聚合常规地制备
为分散体。
因此， 在本发明的又一个优选的实施方案中， 树脂是使用来制备聚合物分散体的 含有 FA 的高分子分散剂或 FA- 缩合物。
术语 “聚合物分散体” 指用于建造化学领域的原料。产品包括丙烯酸分散体以及 丙烯酸粉末和苯乙烯 / 丁二烯分散体。它们增强建造化学品、 建筑用粘合剂和密封胶的可 加工性和技术性能。使用高级聚合物分散体和添加物作为建筑涂料原料， 与其他组分组合 以产生即用型产物如油漆、 木染料或织物整饰剂。 特别地， 该术语指含有甲基丙烯酸 (MAS)、 羟甲基甲基丙烯酰胺 (MAMol) 和 / 或羟甲基丙烯酰胺 (AMol) ； 丙烯酰胺、 丙烯酸、 丙烯腈、 丙烯酸酯和苯乙烯之均聚物和共聚物的分散体， 所述的分散体也用作织物涂料印花和 / 或 涂敷中的粘合剂。此类聚合物分散体的进一步的实例和优选实施方案在下文公开。
术语 “涂料印花 (pigment printing)”指片状纺织材料色彩提花 (coloristic patterning) 的方法， 所述方法是本领域的常识并且已经在世界各地长时间实施。 在涂料印 花中， 特定的涂料通常从含水印花浆中连同粘合剂系统一起施加至纤维网并且随后干燥。 用于固化所述优选的合成性树脂粘合剂系统并因而固定所施加着色剂的后续干热处理终 止该印花过程。
此外， 对于作为建筑材料的用途， 缩合产物如亚硫酸盐改性的蜜胺树脂、 萘磺酸盐 与水溶性乙烯基或丙烯酰基聚合物组合。适宜聚合物的实例是醋酸乙烯酯、 丙酸乙烯酯、 月桂酸乙烯酯、 氯乙烯、 偏二氯乙烯、 具有 3 至 18 个 C 原子的直链或支链乙烯酯、 聚 ( 乙烯 醇 )、 聚 ( 乙烯硫酸酯 )、 丙烯酰基和甲基丙烯酰基单体、 特别是酯类的产物， 也是可能以其 均聚物、 共聚物、 四聚物形式和作为接枝聚合物存在的苯乙烯和乙烷、 马来酸 - 苯乙烯共聚 物。
应用此类聚合物分散体的优选领域是油漆、 装饰性和保护性涂料和漆、 建筑用化 学品， 作为水泥砂浆中的添加物和填料、 造纸用辅助材料和纸张涂料、 织物涂料和塑料着色 剂。
而且， 本发明的发明人已经建立了不同方法以根据用途应用催化降解 FA 的酶制 剂。
因此， 本发明的另一个目的涉及用于降低含甲醛制品中甲醛含量的方法， 包括使 该制品与催化甲醛降解的酶制剂接触。
“接触” 可以在该制品的预期使用之前或期间发生。接触可以意指添加至和 / 或 ( 如果含 FA 制品为液体 ) 混合或 ( 如果该制品是相当粘稠或坚固的材料 ) 施加至某表面。
在一个实例中， 酶制剂可以直接地添加至刨花板制造中所用的脲 - 甲醛树脂或用 水稀释并在刨花板压制之前喷洒到其表面上。 应用或添加的酶取决于添加至刨花板的树脂 的性质和固化条件。但是， 可以通过测试多种酶量并且评价由板材释放的甲醛的量来确定 任意具体情况的恰当量。
本发明人也已经发现当直接应用催化甲醛降解的酶制剂至织物本身时可以降低 织物中的甲醛含量。
因此， 本发明的另一个目的涉及用于降低织物中甲醛含量的方法， 包括将催化甲 醛降解的酶制剂接触该织物。
优选地， 织物是已经在湿条件和干燥条件下通过用如上文所述的整理剂如乙二醛树脂、 福尔马林、 脲甲醛树脂、 二羟甲基脲、 脲甲醛的二甲醚、 蜜胺甲醛树脂、 环状乙撑脲甲 醛树脂例如二羟甲基脲、 三嗪 - 甲醛树脂、 三嗪酮甲醛树脂等加热、 干燥和固化而赋予抗折 和抗皱特性的 “交联织物” 。
简而言之， 用如上文所定义交联剂处理的织物以如实施例部分中所描述的酶制剂 浸渍。可以用湿或干燥的织物实施与酶制剂孵育之后残留 FA 的检测。优选地， 用湿织物进 行。
本发明中所指的含 FA 制品显示约 1 至 50000ppm 的甲醛浓度。常见量是 10 至 5000ppm。本发明的方法允许明显降低甲醛含量。
适当地， 与制品， 即与该酶制剂不接触的成品， 相比较， FA 含量降低了 10、 20、 30、 40、 50、 60 至 70％， 例如优选 71％、 72％、 73％、 74％、 75％、 76％、 77％、 78％至 79％， 通常至 少 80 ％， 例如 81 ％ -84 ％， 至少 85 ％例如 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94％、 95％、 96％、 97％至 98％和 99％和 100％。
确定残留 FA 含量的方法是现有技术中熟知的。甲醛可以通过物理或化学方法定 量地测定。甲醛的纯水溶液的定量测定可以通过测量其比重迅速实施。气相层析和高压液 相色谱法 (HPLC) 也可以用于直接测定。用于测定甲醛的最重要化学方法在 H.Petersen， N.Petri， Melliand Textilber.66(1985)217-222、 285-295、 363-369 中总结。最常使用亚 硫酸钠法。该方法基于甲醛与过量亚硫酸钠反应时所产生碱的定量释放。通过用酸滴定 测定以化学计量方式形成的碱。可以借助气体采样装置测定空气中的甲醛低至 μL/m3 范 围的浓度。Verein Deutscher Ingenieure(VDI) ； 1， Messen Immissionen， Bestimmen der Formaldehydkonzentration nachdem Sulfit-Pararosanilin-Verfahren， Richtlinie VDI 3484， Blatt 1， Düsseldorf 1979 中描述了通过亚硫酸盐 / 副品红法定量 测定空气中的甲醛。 存在用于织物中甲醛释放分析的众多其他检验方法， 如日本 LAW112( 即， 乙酰丙 酮法 )、 AATCC-112( 即， 变色酸法 )、 Shirley I 和 II 方法和其他方法。用于检测织物中 FA 的优选方法是由 “欧盟标准化委员会” 在 EN ISO 14184 第 1 部分和第 2 部分中使用的 LAW112 和 AATCC112 方法。就本发明的方法而言， 可以降低残留甲醛含量至少于 250、 优选 少于 100、 更优选少于 50、 甚至更优选少于 20 并且最优选少于 10ppm。
实施本发明方法所需要的温度范围可以在 10℃至 100℃、 优选 20℃至 40℃、 更优 选 25℃至 35℃之间变动， 最优选在 30℃。本发明的方法通常在 3 和 12 之间、 优选在 5 和 9 之间、 更优选在 7 和 8 之间变动的 pH 条件下实施。最适 pH 值可以通过本领域技术人员熟 知的手段确定和调整。
孵育时间可以根据所选的酶量、 反应温度和制品中的 FA 含量， 以及根据制品本身 的性质变动。通常， 孵育时间是在分钟或小时范围内， 优选地是 5 分钟至 10 小时， 更优选地 是 20 分钟至 5 小时， 更优选地是 30 分钟至 2 小时。最适孵育时间可以由本领域技术人员 根据所处理的产品轻易地确定和调整。
本发明方法可以在常规生物反应器中分批、 半连续或连续地实施。适合的方案
和生物反应器是技术工人熟悉的并且例如在通过引用方式并入本文的ChemieLexikon 第 9 版， Thieme Verlag， 条目标题 “Bioreactors” 或 Ullmann’ s Encyclopedia of Industrial Chemistry， 第 5 版， 第 B4 卷， 第 381ff 页中描述。反应器的运行和工艺方案可以针对想要的 FA 降解反应的具体要求适应于技术人员。如果该方法以分批模式进行， 则在 合成、 聚合、 分离后和任选地纯化该制品之后直接添加酶制剂。在使用 FA 歧化酶成功降解 甲醛之后， 酶可以与该制品分离。备选地， 该酶可以留在此制品中并且根据需要灭活， 例如 通过加热或酸化， 并且条件是这种灭活不有损于此制品。 如果该方法连续地进行， 则酶制剂 优选地固定在可以充填例如至特定柱中的载体上。一般地， 将制品在适合的条件下泵送经 过该柱。为进一步增强 FA 减低效果， 可以依次串联连接几个酶反应器。
为了本发明的目的， 酶制剂可以以本领域技术人员已知的任意形式、 配方和组成 添加。本领域技术人员将轻易理解适用于本发明的酶制剂将取决于几个因素， 包括但不 限于含 FA 制品的精确组成。他们还会理解存在用于配制酶制剂的几种方法。酶制剂可 以使用酶颗粒和 / 或液体制剂的标准方法配制。对与酶颗粒和 / 或酶的液体制剂有关的 步骤的描述存在于 1988 年 Helmut Uhlig， John Wiley and Sons 的 “ 《工业酶及其应用》 (IndustrialEnzymes and their Application)” 中。
适合的酶制剂例如是通过酶溶液的造粒、 挤出、 喷雾干燥、 或冻干可获得的固态酶 制剂以及优选地是酶的浓缩溶液， 其任选地含有稳定剂。 备选地， 处于固态或液态形式的酶 制剂可以吸附于固体载体上和 / 或胶囊化。已经提出用于制备固定化酶类的方法包括底物 结合法、 交联聚合法、 凝胶包含法等。 在一些实施方案中， 当用于本发明的酶制剂在颗粒组合物或液体中使用时， 希望 酶制剂处于包封粒子的形式以保护该酶在贮藏期间免受颗粒组合物的其他组分影响。此 外， 包封也是控制 FA 降解过程期间酶制剂可获得性的手段并且可以增强酶制剂的性能。构 思了在本发明中将使用任意合适的包封材料。包封材料一般包封酶制剂的至少部分。一般 地， 包封材料是水溶性和 / 或水可分散的。简而言之， 酶制剂与化合物如藻酸钠、 琼脂糖或 交联葡聚糖凝胶混合并且随后根据本领域已知的方法沉淀。备选地， 可通过喷雾干燥或挤 出酶制剂实施包封。
所述酶颗粒的保护性包衣材料的实例包括天然材料如糖类、 多糖、 多肽如胶原蛋 白、 白蛋白或明胶、 油、 脂肪酸、 蜡。作为包衣材料， 也包括半合成性材料如化学改性的纤维 素化合物、 淀粉衍生物或合成性包衣材料如聚丙烯酸酯、 聚酰胺。 包衣可以进一步包括通过 聚阳离子和聚阴离子相互作用所生成的聚合电解质络合物。 常见的聚阳离子包括天然化合 物如环磷酰胺 (cytosan) 以及合成性聚合物。
酶制剂可以与化学惰性载体材料或粘合材料一起造粒。载体材料包括硅酸盐、 碳 酸盐或硫酸盐。 粘合材料例如是非交联的聚合物组分如聚丙烯酸酯、 聚甲基丙烯酸酯、 聚乙 烯吡咯烷酮、 多糖。
备选地， 为了保护酶制剂免遭灭活或变性， 添加稳定化合物可能是合适的。 稳定化 合物的实例包括蛋白酶抑制剂， 如硼酸及其衍生物、 氨基醇和低级脂族醇。 酶制剂可以用化 合物如聚酰胺低聚物 (polyamid oligomer) 或高分子组分如木质素、 水溶性乙烯基共聚物 保护免受物理效应或 pH 变动的影响。此外， 抗氧化剂如二硫苏糖醇 (DTT) 是通常使用的酶 稳定剂。
如果催化甲醛降解的酶制剂应当直接并入含 FA 制品中， 则在一些实施方案中要 求酶以干燥的形式存在。如果仅在含 FA 制品的应用期间添加催化甲醛降解的酶制剂， 则酶 制剂可以以液态、 凝胶或糊膏样形式存在。 在本领域熟知的蛋白质纯化和分离方法后， 酶制
剂可以作为浓缩的水溶液、 混悬液或乳液添加。可以用来获得适合酶制剂的溶剂的实例包 括醇类、 烷醇胺或甘醇或二甘醇、 甘油、 山梨醇、 葡萄糖、 糖精。 为了提高黏度， 酶制剂可以含 有一种或多种增稠剂， 也称作溶胀剂。 适合的增稠剂包括例如藻酸盐、 果胶、 淀粉、 糊精或合 成性增稠剂聚碳酸、 聚乙二醇、 聚丙烯酰组合物、 聚酰胺或聚醚。
对于一些制制品， 希望酶制剂已经含于所述制品内， 保持这些制品中 FA 含量尽可 能低。
在一个优选的实施方案中， 本发明的酶制剂包含 (a)0.1-10％的 FA 降解酶， 优选 FDM， 和 (b)1-80％的一种或几种多元醇 ( 甘醇、 甘油、 山梨醇、 葡萄糖、 蔗糖、 聚乙二醇等 ) 和 (c)1-99％的水。
在本发明的另一个实施方案中， 将干 ( 固态 ) 酶制剂添加至固态产品配方。一旦 添加水至该固体制品， 则启动减低 FA 的活性。
因此， 本发明的另一个目的涉及适于织物整理的制品， 该制品包含交联剂和催化 甲醛降解的酶制剂。
酶制剂可以按照类似于已知的降低甲醛剂的方式使用。例如， 酶制剂可以并入包 含 N- 羟甲基交联系统的耐久压烫整理交联剂如 DMDHEU 中。完全或部分地由纤维素纤维组 成的织物可以用耐久压的整理组合物浸轧 (pad)、 泡沫整理或浸渍。 优选地， 该交联剂选择自由蜜胺 -FA、 脲 -FA 或脲 - 乙二醛 -FA 化合物组成的组。
本发明的另一个目的涉及适用于处理建造材料、 特别是水硬粘合剂如水泥、 石膏、 砂浆或贫石灰、 纤维板、 刨花板、 胶合板、 木材、 皮革和 / 或毛毯的制品， 该制剂包含如上文 所述的高分子分散剂和催化甲醛降解的酶制剂。
在一个优选的实施方案中， 聚合物分散剂选自由萘甲醛缩合物、 酚甲醛缩合物、 脲 甲醛缩合物和蜜胺甲醛缩合物组成的组。
可以提供交联剂或聚合物分散剂已经与酶制剂混合或可以提供为试剂盒， 其中将 酶制剂在上文所述的交联剂或聚合物分散体预期用途之前添加至交联剂或聚合物分散体， 旨在降低最终产品的 FA 含量。在一些情况下， 必须优化孵育时间以避免最终产品的过度降 解。
为了本发明的目的， 希望酶易于大量获得。 适当地， 该酶在允许大规模产生异源表 达蛋白质的细菌中表达。 为了优化表达， 即增加所表达酶的产量， 本发明的发明人已经构建 了编码催化甲醛降解的酶的核酸。
因此， 本发明的另一个目的涉及编码催化甲醛降解的酶的分离核酸， 其中该核酸 的序列为了在表达宿主中的表达而进行了密码子优化。
优选地， 表达宿主是大肠杆菌 (Escherichia coli)。
虽然大肠杆菌是通常用来表达催化甲醛降解的酶的细菌宿主细胞的一个实例， 但是其他细菌宿主细胞可以在本发明中用来表达外源 DNA， 所述的细菌宿主细胞包括例 如 埃 希 氏 菌 属 (Escherichia)、 肠 杆 菌 属 (Enterobacter)、 固 氮 菌 属 (Azotobacter)、 欧 文 氏 菌 属 (Erwinia)、 芽 孢 杆 菌 属 (Bacillus)、 假 单 胞 菌 属 (Pseudomonas)、 博德特 菌 属 (Bordetella)、 红 杆 菌 属 (Rhodobacter)、 苛 养 木 杆 菌 属 (Xyella)、 克雷伯氏菌属 (Klebsielia)、 变 形 杆 菌 属 (Proteus)、 沙 门 菌 属 (Salmonella)、 沙 雷 菌 属 (Serratia)、 志 贺 菌 属 (Shigella)、 根 瘤 菌 属 (Rhizobium)、 透 明 颤 菌 属 (Vitreoscilla) 和 副 球 菌
属 (Paracoccus)， 以 及 真 菌 宿 主 细 胞， 包 括 例 如 曲 霉 属 (Aspergillus)、 毕赤酵母属 (Pichia)、 木 霉 属 (Trichoderma)、 汉 逊 酵 母 属 (Hansenula)、 酵 母 属 (Saccharomyces)、 克 鲁 维 酵 母 属 (Kluyveromyces)、 裂 殖 酵 母 属 (Schizosaccharomyces)、 金小孢子属 (Chrysosporium)、 假丝酵母属 (Candida) 和球拟酵母属 (Torulopsis)
Burgess-Brown 等人， Protein Expr Purif.， 2008 年 5 月 ； 59(1) ： 94-102 中充分 描述了用于大肠杆菌中表达的密码子优化的特征和优点。
在一个优选的实施方案中， 该核酸的序列包含 SEQ ID NO ： 3 的序列或其变体。
本发明的另一个目的涉及含有本发明核酸的表达载体。
适合的载体包括噬菌体、 质粒、 病毒或逆转录病毒载体以及人工染色体， 如细菌或 酵母人工染色体。另外， 该术语还涉及靶向构建体， 允许靶向构建体随机或位点定向整合 至基因组 DNA 中。此类靶向构建体优选地包含用于如下文详述的同源或异源重组的长度 足够的 DNA。包含本发明多核苷酸的载体优选地还包含用于宿主中增殖和 / 或选择的选择 标记。载体可以通过本领域熟知的多项技术并入宿主细胞中。如果被导入宿主细胞中， 载 体可以停留在细胞质中或可以并入基因组中。在后一种情况下， 可以理解载体可以进一步 包含允许同源重组或异源插入的核酸序列。 载体可以通过常规转化或转染技术导入原核或 真核细胞中。如本上下文中所用， 术语 “转化” 和 “转染” 、 接合和转导， 意图包括用于将外 源核酸 ( 例如 DNA) 导入宿主细胞中的多种现有技术方法， 包括磷酸钙、 氯化铷或氯化钙共 沉淀法、 DEAE- 葡聚糖介导转染法、 脂质转染法、 天然感受态法、 碳基团簇法 (carbon-based cluster)、 化学介导的转移法、 电穿孔法或粒子轰击法 ( 例如 “基因枪法” )。
在一个优选的实施方案中， 适用于本发明的载体是包含 SEQ IDNO ： 4、 5 和或 6 的序 列的核酸。
本发明的另一个方面涉及催化乙醛 (AA) 降解的酶制剂用于降低含乙醛制品中乙 醛含量的用途。
如定义部分中所描述， AA 存在于多种液体和化合物中并且对人有害。此外， 已知 乙醛是聚乙烯醇中的残留化合物。聚乙烯醇是乙烯醇的聚合物。由于后者不能以游离形式 存在， 故迄今全部聚乙烯醇通过聚合醋酸乙烯酯来制造， 其中不像乙烯醇那样， 所述的醋酸 乙烯酯是稳定的。如此产生的聚醋酸乙烯酯随后接受醇解。由于聚乙烯醇的技术特性首先 取决于摩尔质量和残留乙酰基含量， 故设计工业制造工艺旨在确保精确地符合这些参数。
在一个特别优选的实施方案中， 如下文以更多细节所述， 酶制剂含有具备醛歧化 酶活性的酶， 其包含 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列的变体或衍生物， 其中第 93 位置处的苯丙 氨酸和 / 或第 301 位置处的异亮氨酸和 / 或第 337 位置处的甲硫氨酸和 / 或第 127 位置处 的苯丙氨酸被任何的其他氨基酸置换。
如附图进一步所说明， 对恶臭假单胞菌甲醛歧化酶酶 (SEQ ID NO ： 2) 的晶体结构 的分析允许鉴定到参与形成该酶反应中心的各个氨基酸残基或氨基酸序列部分， 从而可以 建立针对具有醛歧化酶活性、 尤其甲醛歧化酶或乙醛歧化酶活性的其他合适酶的模型系统 或参比酶。
特别地， 对于所述的特定参比酶， 可以鉴定某些关键氨基酸残基， 其中预测所述的 关键氨基酸残基参与形成底物袋的功能独特部分。所述的功能独特部分命名为催化位点 1(CS1)、 催化位点 2(CS2)、 催化位点 3(CS3)、 催化位点 4(CS4)。第一功能部分是 CS1 并且关键氨基酸残基是 Ile301。
另外， 发现在一级氨基酸序列中彼此不相邻的序列部分通过有助于结合口袋的相 同功能部分反而是功能相关的。因此， 观察到功能部分 CS2 包含关键氨基酸残基 Met337。
也观察到所述的参考酶形成结合口袋区域 CS3 和 CS4， 并且与其相关的氨基酸残 基可以根据它们相对与该酶结合的底物的偏好进一步细分。CS3 和 CS4 包含关键氨基酸残 基 Phe127 和 Phe93。
本发明的发明人已经惊讶地发现与具有 SEQ ID NO ： 2 的野生型恶臭假单胞菌酶的 活性相比， 通过置换一个或多个关键氨基酸残基， 该酶的活性可以提高至少 5％、 优选至少 7％、 更优选至少 10％、 最优选 10 至 20％。此外， 通过置换一个或多个关键氨基酸残基， 该 酶的热稳定可以提高， 导致如此温度下的稳定性， 其中所述的温度比具有 SEQ ID NO ： 2 的野 生型恶臭假单胞菌酶稳定的温度高至少 1、 2、 3、 4、 5 摄氏度。这使得本发明的酶就纯化和表 达条件而言特别有利。
因此， 本发明的另一个目的涉及分离的多肽， 其具有醛歧化酶活性并且包含 SEQ ID NO ： 2 的变体， 其中在 SEQ ID NO ： 2 第 93 位置处的苯丙氨酸和 / 或在 SEQ ID NO ： 2第 301 位置处的异亮氨酸和 / 或在 SEQ ID NO ： 2 第 337 位置处的甲硫氨酸和 / 或在 SEQ ID NO ： 2 第 127 位置处的苯丙氨酸由任何其他氨基酸置换。
本领域技术人员将理解也可以置换紧密靠近上文所提及氨基酸位置的氨基酸。 因 此， 另一个实施方案涉及分离的多肽， 其具有醛歧化酶活性并且包含 SEQ ID NO ： 2 的变体， 其中距 SEQ ID NO ： 2 第 93 位置处的苯丙氨酸 ±3、 ±2 或 ±1 个氨基酸位置的氨基酸和 / 或距 SEQ ID NO ： 2 第 301 位置处的异亮氨酸 ±3、 ±2 或 ±1 个氨基酸位置的氨基酸和 / 或 距 SEQ ID NO ： 2 第 337 位置处的甲硫氨酸 ±3、 ±2 或 ±1 个氨基酸位置的氨基酸和 / 或距 SEQ IDNO ： 2 第 127 位置处的苯丙氨酸 ±3、 ±2 或 ±1 个氨基酸位置的氨基酸被任何其他 氨基酸置换。
基于这种分析， 可以开发一种高度特征性序列模式， 借助所述序列模式可以搜索 具有所希望酶活性的其他候选蛋白。
通过使用所述序列模式搜索其他候选酶也将由本发明包括。 熟练的读者将理解以 上序列模式不受该模式的两个相邻氨基酸残基之间的确切距离限制。 以上序列模式中两个 相邻者之间的每个距离例如可以彼此独立地变动直至 ±10、 ±5、 ±3、 ±2 或 ±1 个氨基酸 位置， 而没有明显影响想要的酶活性。
与基于如根据本发明所获得的结晶学数据对各个氨基酸残基的上述功能性和空 间分析相一致， 可以鉴定作为本发明具有醛歧化酶活性的潜在有用酶的特征的独特部分氨 基酸序列。
根据又一个优选的实施方案， 歧化反应用分离或纯化的、 任选固定的醛歧化酶或 如上文更详细描述那样通过培养表达醛歧化酶酶活性的微生物进行。
对酶活性仅潜在具有微小影响的突变体的实例是对上文所提及结构元件 (CS1、 2、 3 或 4) 的底物口袋的几何学或运动性影响小或无影响的那些突变体。
对酶活性具有更明显影响的突变体的实例可以是对上文所提及结构元件 (CS1、 2、 3 或 4) 的底物口袋的几何学或运动性影响更强的那些突变体。
就 SEQ ID NO ： 2 的恶臭假单胞菌蛋白而言， 下文列出可以促成至少一种所述类型突变的关键氨基酸置换的非限制性实例。
技术人员将理解除上表中提到的氨基酸之外， 任意氨基酸也可以用作置换物。检 验此类突变体功能的测定法是本领域轻易可获得的并且在本发明的实施例部分分别描述。
本发明也涉及如下文进一步定义的核酸， 其编码具有如上文定义的醛歧化酶活性 的蛋白质。
本发明也涉及表达盒， 其包含与至少一个调节性核酸序列有效连接的如上文定义的核酸。 本发明也涉及包含如上文定义的至少一种表达盒或核酸的重组表达载体。
本发明也涉及携带如上文定义的至少一种表达载体的重组微生物。
本发明也涉及生物反应器， 所述生物反应器包含具有如上文定义的醛歧化酶活性 的至少一种蛋白质或如上文定义的重组微生物， 其任选地处于固定形式。
本发明也涉及制备具有醛歧化酶活性的酶的方法， 所述方法包括培育如上文定义 的重组微生物和任选地从培养物分离该醛歧化酶。
本发明也涉及具有醛歧化酶活性的蛋白质的晶形， 尤其那些形式， 其中具有醛歧 化酶活性的蛋白质如上文定义。
本发明也涉及制备如上文所定义具有醛歧化酶活性的蛋白质的晶形的方法， 所述 方法包括添加具有 8.3 至 8.7 范围例内 ( 例如 8.5) 的 pH、 优选以 Tris 缓冲液缓冲的结晶 剂 (3M 至 3.5M 硫酸铵， 优选 3.2M 硫酸铵， 或聚亚烷基二醇， 如聚乙二醇， 尤其 PEG 400 至 3500， 如 PEG 400) 至含有 ( 浓度约 1 至 50 或 5 至 20mg/ml 的 ) 所述蛋白质的溶液。
本发明的其他实施方案
本发明的蛋白质
本发明不限于具体公开的 “具有醛歧化酶活性的蛋白质” ， 还扩展至其功能等同 物。
在本发明的范围内， 具体公开的酶的 “功能等同物” 或类似物是其各种多肽， 它们 也具有所希望的生物学功能或活性， 例如酶活性。
例如， “功能等同物” 意指这些酶， 它们在用于酶活性的试验中显示至少 1 至 10％、 或至少 20％、 或至少 50％、 或至少 75％或、 至少 90％更高或更低的如本文中所定义的酶活 性。
根据本发明， “功能等同物” 尤其也意指突变体， 其中在上述的氨基酸序列的至少
一个序列位置中， 所述突变体具有与具体所述氨基酸不同的氨基酸， 但是拥有前述生物学 活性之一。 “功能等同物” 因而包含通过一个或多个氨基酸添加、 置换、 插入、 缺失和 / 倒位 可获得的突变体， 其中所述的变化可以出现于任意的序列位置内， 条件是它们导致具有本 发明特征曲线的突变体。如果突变体与未改变的多肽之间的反应性模式定量地重合， 即如 果相同底物例如以不同的速率被转化， 则特别地也提供了功能等同性。下表中显示适宜的 氨基酸置换的实例。
以上意义的 “功能等同物” 在也是所述多肽的 “前体” ， 以及所述多肽 “功能性衍生 物” 和 “盐” 。
在这种情况下， “前体” 是所述多肽的具有或没有所希望生物学活性的天然或合成 前体。
表述 “盐” 意指本发明蛋白质分子的羧基的盐以及氨基的酸加成盐。羧基的盐可
以按照已知方式产生并且包含无机盐， 例如钠、 钙、 铵、 铁和锌盐， 和与有机碱 ( 例如， 胺， 如 三乙醇胺、 精氨酸、 赖氨酸、 哌啶等 ) 的盐。本发明也涵盖酸加成盐， 例如与无机酸 ( 如氢氯 酸、 或硫酸 ) 的盐和与有机酸 ( 如乙酸和草酸 ) 的盐。
使用已知技术， 本发明多肽的 “功能等同物” 也可以在功能性氢基酸侧基团上或在 它们的 N 末端或 C 末端产生。此类衍生物包括例如羧酸基的脂族酯、 通过与氨或者与伯胺 或仲胺反应可获得的羧酸基的酰胺 ； 通过与酰基反应产生的游离氨基的 N- 酰基衍生物 ； 或 通过与酰基反应产生的游离羟基的 O- 酰基衍生物。
“功能等同物” 自然也包含可以从其他生物获得的多肽以及天然存在的变体。例 如， 同源序列区的区域可以通过序列比较来建立， 并且可以基于本发明的具体参数确定等 同酶。
“功能等同物” 也包含本发明多肽的片段， 优选地各个结构域或序列基序， 它们例 如显示所希望的生物学功能。
另外， “功能等同物” 是融合蛋白， 所述融合蛋白具有上文所述的多肽序列或从中 衍生的功能等同物之一和处于功能性 N 末端或 C 末端接合的至少一个功能不同的其他异源 序列 ( 即不存在融合蛋白诸部分的基本的相互功能妨碍 )。这些异源序列的非限制性例子 例如是信号肽、 组氨酸锚或酶。
根据本发明也包括的 “功能等同物” 是具体所公开蛋白质的同源物。 这些同源物拥 有如上文所述的百分数同一性值。所述值指与具体所公开氨基酸序列的同一性， 并可以根 据 Pearson 和 Lipman， Proc.Natl.Acad， Sci.(USA)85(8)， 1988， 2444-2448 的算法计算。也 可以从 BLAST 比对、 算法 blastp( 蛋白质 - 蛋白质 BLAST) 或通过使用如下文给出的 Clustal 设置计算出百分数同一性值。
本发明同源多肽的同一性百分数尤其意指氨基酸残基相对于本文中具体所述氨 基酸序列之一的总长度而言的同一性百分数。
在蛋白质可能糖基化的情况下， 本发明的 “功能等同物” 包含上文所述类型的蛋白 质， 所述蛋白质处于去糖基化和糖基化形式以及可以通过改变糖基化模式来获得的修饰形 式。本发明蛋白质或多肽的此类功能等同物或同源物可以通过诱变产生， 例如通过蛋白质 的点突变、 加长或缩短产生。
本发明蛋白质的此类功能等同物或同源物可以通过筛选突变体 ( 例如短缩突变 体 ) 的组合数据库鉴定。例如， 可以通过在核酸水平组合诱变 ( 例如通过酶促连接合成性 寡核苷酸的混合物 ) 产生蛋白质变体的多样化数据库。存在可以用于从简并的寡核苷酸 序列产生潜在同源物数据库的众多方法。可以在自动 DNA 合成仪上实施简并基因序列的 化学合成， 并且可以将合成性基因随后连接于合适的表达载体中。简并基因组的使用使得 在一种混合物中供应全部序列成为可能， 其中所述的全部序列编码所希望的潜在蛋白质序 列集合。合成简并寡核苷酸的方法是本领域技术人员已知的 ( 例如 Narang， S.A.(1983) Tetrahedron 39 ： 3； Itakura 等 人 (1984)Annu.Rev.Biochem.53 ： 323 ； Itakura 等 人， (1984)Science 198 ： 1056 ； Ike 等人 (1983)Nucleic Acids Res.11 ： 477)。
在现有技术中， 几项技术已知用于筛选通过点突变或缩短法产生的组合数据库的 基因产物并且用于筛选 cDNA 文库中具有所选特性的基因产物。这些技术可以适应于快速 筛选通过组合诱变本发明同源物所产生的基因库。基于高通量分析的最常用于筛选大基因库的技术包括在可以复制的表达载体中克隆基因库、 用所得的载体数据库转化合适细 胞并在下述条件表达组合基因， 在所述条件下对所希望活性的检测有助于分离编码其产 物被检测的基因的载体。递归总体诱变 (REM) 是一项提高数据库中功能性突变体频率的 技术， 它可以与筛选试验组合地使用， 旨在鉴定同源物 (Arkin 和 Yourvan(1992)PNAS 89 ： 7811-7815 ； Delgrave 等人 (1993)ProteinEngineering 6(3) ： 327-331)。
根据本发明的又一个实施方案， 提供了分离的多肽， 其选自 ：
(i) 由 SEQ ID NO ： 8 或 10 任一者代表的氨基酸序列 ；
(ii) 与 SEQ ID NO ： 8 或 10 任一者所代表的氨基酸序列具有至少 50％、 51％、 52％、 53 ％、 54 ％、 55 ％、 56 ％、 57 ％、 58 ％、 59 ％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、 75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98％或 99％序列同一性的氨基酸序列 ；
(iii) 以上 (i) 或 (ii) 中给出的任意氨基酸序列的衍生物。
编码性核酸序列
本发明也涉及编码如本文中所定义酶的核酸序列。 本发明也涉及与本文中具体公开的序列具有某种 “同一性” 程度的核酸。两种核 酸之间的 “同一性” 意指每种情况下在该核酸的全长范围内核苷酸的同一性。
例如， 同一性可以借助 Informax(USA) 公司 Vector NTI 软件包 7.1 程序， 使用 Clustal 方法 (Higgins DG， Sharp PM. 在微型计算机上快速和灵敏的多重序列比对 (Fast and sensitive multiple sequence alignments on amicrocomputer).Comput Appl. Biosci.1989 年 4 月 ； 5(2) ： 151-1) 用以下设置计算 ：
多重比对参数 ：
空位开口罚分 10
空位延伸罚分 10
空位分离罚分范围 8
空位分离罚分 关闭
比对延迟的同一性％ 40
残基特异性空位 关闭
亲水性残基空位 关闭
转换权重 0
配对比对参数 ：
FAST 算法 开启
K-tuple 大小 1
空位罚分 3
窗口大小 5
最佳对角线的数目 5
备 选 地， 同 一 性 可 以 根 据 Chenna， Ramu， Sugawara， Hideaki， Koike， Tadashi， Lopez， Rodrigo， Gibson， Toby J， Higgins， Desmond G， Thompson， Julie D. 采用 Clustal 系列程序的多重序列比对 (Multiple sequencealignment with the Clustal series of
programs).(2003)Nucleic Acids Res 31(13) ： 3497-500， 网页 ： http://www.ebi.ac.Uk/ Tools/clustalw/index.html 和以下设置来确定 ：
DNA 空位开口罚分 15.0
DNA 空位延伸罚分 6.66
DNA 矩阵 同一性
蛋白质空位开口罚分 10.0
蛋白质空位延伸罚分 0.2
蛋白质矩阵 Gonnet
蛋白质 /DNA ENDGAP -1
蛋白质 /DNA GAPDIST 4
本文中提及的全部核酸序列 ( 单链和双链 DNA 和 RNA 序列， 例如 cDNA 和 mRNA) 可 以按已知方式通过化学合成从核苷酸结构单元产生， 例如通过各个重叠的互补性双螺旋核 酸结构单元的片段缩合来产生。 寡核苷酸的化学合成可以例如以已知方式通过亚磷酸酰胺 (phosphoamidite) 法 (Voet， Voet， 第 2 版， Wiley Press， New York， 第 896-897 页 ) 进行。 合成性寡核苷酸的积聚和借助 DNA 聚合酶 Klenow 片段填补缺口和连接反应以及一般克隆 技术在 Sambrook 等人 (1989) 中描述， 见下文。
本发明也涉及编码以上多肽及其功能等同物之一的核酸序列 ( 单链和双链 DNA 和 RNA 序列， 例如 cDNA 和 mRNA)， 所述核酸序列可以例如使用人工核苷酸类似物获得。
本发明涉及编码本发明多肽或蛋白质或其生物学活性节段的分离的核酸分子， 并 且涉及可以用作例如鉴定或扩增本发明编码性核酸的杂交探针或引物的核酸片段。
本发明的核酸分子可以额外含有来自编码性基因区域 3’ 和 / 或 5’ 末端的非翻译 序列。
本发明还涉及与具体所述的核苷酸序列或其节段互补的核酸分子。
根据本发明的又一个实施方案， 因而提供了分离的核酸分子， 其选自 ：
(i) 由 SEQ ID NO ： 7 或 9 中任一者代表的核酸 ；
(ii) 由 SEQ ID NO ： 7 或 9 中任一者代表的核酸的互补物 ；
(iii) 核酸， 其编码如 SEQ ID NO ： 8 或 10 中任一者所代表、 优选地作为遗传密码 简并性结果的多肽， 所述分离的核酸可以从如 SEQ ID NO ： 8 或 10 中任一者代表的多肽序列 衍生 ；
(iv) 与 SEQ ID NO ： 7 或 9 的核酸序列任一者具有至少 30 ％、 31 ％、 32 ％、 33 ％、 34 ％、 35 ％、 36 ％、 37 ％、 38 ％、 39 ％、 40 ％、 41 ％、 42 ％、 43 ％、 44 ％、 45 ％、 46 ％、 47 ％、 48 ％、 49 ％、 50 ％、 51 ％、 52 ％、 53 ％、 54 ％、 55 ％、 56 ％、 57 ％、 58 ％、 59 ％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、 75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％序列同一性的核酸序列 ；
(v) 与 (i) 至 (iv) 的核酸分子在严格杂交条件下杂交的核酸分子 ；
(vi) 编码具有醛歧化酶活性的多肽的核酸， 所述多肽与 SEQ ID NO ： 8 或 10 任一者 所代表的氨基酸序列具有至少 50％、 51％、 52％、 53％、 54％、 55％、 56％、 57％、 58％、 59％、 60 ％、 61 ％、 62 ％、 63 ％、 64 ％、 65 ％、 66 ％、 67 ％、 68 ％、 69 ％、 70 ％、 71 ％、 72 ％、 73 ％、 74 ％、75 ％、 76 ％、 77 ％、 78 ％、 79 ％、 80 ％、 81 ％、 82 ％、 83 ％、 84 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％序列同一性。
本发明的核苷酸序列使得产生可以用于鉴定和 / 或克隆其他细胞类型和生物中 同源序列的探针和引物成为可能。此类探针或引物一般包含在 “严格” 条件 ( 见下文 ) 与 本发明核酸序列的有义链或相应反义链的至少约 12 个、 优选至少约 25 个， 例如约 40、 50 或 75 个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域。
“分离的” 核酸分子与存在于该核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分开， 并且 如果该核酸分子通过重组技术产生， 还可以基本上不含其它细胞物质或培养基， 或如果它 被化学地合成， 可以不含化学前体或其它化学品。
本发明的核酸分子可以借助分子生物学标准技术和根据本发明提供的序列信 息予以分离。例如， 使用具体公开的完整序列之一或其节段作为杂交探针和 ( 如在例如 Sambrook， J.， Fritsch， E.F. 和 Maniatis， T.MolecularCloning ： A Laboratory Manual. 第 2 版， Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY， 1989 中描述的 ) 标准杂交技术， 可以从合适的 cDNA 文库分离 cDNA。此 外， 包含所公开序列之一或其节段的核酸分子可以使用基于这种序列所构建的寡核苷酸引 物， 通过聚合酶链反应分离。以这种方式扩增的核酸可以克隆在合适的载体中并可以通过 DNA 测序进行表征。 本发明的寡核苷酸也可以通过标准合成方法产生， 例如使用自动 DNA 合 成仪产生。
本发明的核酸序列或其衍生物、 这些序列的同源物或部分可以例如通过常规杂交 技术或 PCR 技术从其他细菌分离， 例如借助基因组文库或 cDNA 文库。这些 DNA 序列在标准 条件下与本发明的序列杂交。
“杂交” 意指多核苷酸或寡核苷酸在标准条件下与几乎互补的序列结合， 但是在这 些条件下非互补性配偶物之间不发生非特异性结合。 为此， 所述序列可以是 90-100％互补。 互补序列能够相互特异性结合的特性例如用于 RNA 印迹或 DNA 印迹中或用于 PCR 或 RT-PCR 的引物结合中。
保守区域的短寡核苷酸有利地用于杂交。但是， 也可以将本发明核酸的较长片段 或完整序列用于杂交。这些标准条件根据所用的核酸 ( 寡核苷酸、 较长片段或完整序列 ) 或根据何种类型的核酸 -DNA 或 RNA 用于杂交而变化。例如， DNA ∶ DNA 杂合体的解链温度 比相同长度的 DNA ∶ RNA 杂合体的解链温度低约 10℃。
例 如， 根 据 具 体 的 核 酸， 标 准 条 件 意 指 在 浓 度 0.1 至 5×SSC(1×SSC ＝ 0.15M NaCl， 15mM 柠檬酸钠， pH 7.2) 或额外存在 50 ％甲酰胺下的缓冲水溶液中 42 和 58 ℃之 间的温度， 例如 42 ℃在 5×SSC， 50 ％甲酰胺中。有利地， DNA ∶ DNA 杂合体的杂交条件是 0.1×SSC 和在约 20 ℃至 45 ℃之间、 优选约 30 ℃至 45 ℃之间的温度。对于 DNA ∶ RNA 杂 合体， 该杂交条件有利地是 0.1×SSC 和在约 30 ℃至 55 ℃之间、 优选约 45 ℃至 55 ℃之间 的温度。所述的这些杂交温度是对甲酰胺不存在下大约 100 个核苷酸长度及 50 ％ G+C 含量的核酸的计算解链温度值的实例。DNA 杂交的实验条件在相关的遗传学教材 ( 例如 Sambrook 等人， 1989) 中描述， 并且可以使用本领域技术人员已知的公式， 例如根据核酸的 长度、 杂合体类型或 G+C 含量计算。本领域技术人员可以从以下教材获得关于杂交的进一 步信息 ： Ausubel 等人 ( 编著 )， 1985， Current Protocols in Molecular Biology， JohnWiley & Sons， NewYork ； Hames 和 Higgins( 编著 )， 1985， Nucleic Acids Hybridization ： APractical Approach， IRL Press at Oxford University Press， Oxford ； Brown( 编著 )， 1991， Essential Molecular Biology ： A Practical Approach， IRL Press at Oxford University Press， Oxford。
“杂交” 尤其可以在严格条件下实施。 此类杂交条件例如在 Sambrook， J.， Fritsch， E.F.， Maniatis， T.，在 ： Molecular Cloning(A LaboratoryManual)， 2nd edition， Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989， 第 9.31-9.57 页中或在 Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley &Sons， N.Y.(1989)， 6.3.1-6.3.6. 中描述。
“严格” 杂交条件尤其意指 ： 在由 50％甲酰胺、 5×SSC(750mM NaCl， 75mM 柠檬酸三 钠 )， 50mM 磷酸钠 (pH 7.6)， 5×Denhardt 溶液， 10 ％硫酸葡聚糖和 20g/ml 变性剪切鲑精 DNA 组成的溶液中于 42℃过夜， 随后用 0.1x SSC 在 65℃洗涤滤膜。
本发明还涉及具体公开的或可衍生的核酸序列的衍生物。
因此， 本发明的其他核酸序列可以从本文中具体公开的序列衍生并且可以因添 加、 置换、 插入或缺失单个或几个核苷酸而与所公开的序列不同， 并且也编码具有所希望特 性特征的多肽。
本发明也包括这样的核酸序列， 其包含所谓沉默突变或根据特定来源或宿主生物 的密码子选择， 与具体所述序列相比， 已经被改变的序列， 以及其天然存在的变体 ( 例如剪 接变体或等位变体 )。
它也涉及可以通过保守性核苷酸置换 ( 即所讨论的氨基酸被具有相同电荷、 大 小、 极性和 / 或溶解度的氨基酸置换 ) 获得的序列。
本发明还涉及通过序列多态性从具体公开的核酸衍生的分子。 这些遗传多态性可 以因自然变异而存在于群体内部的个体之间。 这些天然的变异通常引起基因核苷酸序列的 1 至 5％变异。
本发明核酸序列的衍生物意指例如等位变体， 其在完整序列范围内在所衍生的氨 基酸水平上具有至少 60 ％同源性、 优选至少 80 ％同源性、 非常特别优选至少 90 ％同源性 ( 就氨基酸水平上的同源性而言， 应当参考上文对所述多肽给出的细节 )。有利地， 同源性 可以在序列的部分区域内较高。
另外， 衍生物也理解为是本发明核酸序列的同源物， 例如动物、 植物、 真菌或细菌 同源物、 编码性和非编码性 DNA 序列的缩短序列、 单链 DNA 或 RNA。例如在 DNA 水平， 同源物 在本文具体公开的序列中所给出的整个 DNA 区域范围内具有至少 40％、 优选地至少 60％、 特别优选至少 70％、 非常特别优选至少 80％的同源性。
另外， 衍生物理解为是例如带有启动子的融合物。添加至所述核苷酸序列的启动 子可以通过至少一个核苷酸交换、 至少一个插入、 倒位和 / 或缺失进行修饰， 但是不损害所 述启动子的功能性或效力。另外， 所述启动子的效力可以通过改变它们的序列而增加或者 可以完全以甚至不同属的生物的更有效启动子交换。
本发明的构建体
本发明也涉及表达构建体， 其含有处于调节性核酸序列的遗传控制下的编码本发 明多肽或融合蛋白的核酸序列 ； 以及包含这些表达构建体中至少之一者的载体。
根据本发明， “表达单元” 意指具有表达活性的核酸， 该核酸包含如本文中所定义的启动子， 并且与一种待表达的核酸或一种基因功能性连接后， 调节该核酸或该基因的表 达， 即调节其转录和翻译。因而在这种环境下， 它也称作 “调节性核酸序列” 。除启动子之 外， 也可以存在其他调节元件， 例如增强子。
根据本发明， “表达盒” 或 “表达构建体” 意指表达单元， 其与待表达的核酸或待表 达的基因功能性连接。 与表达单元相反， 表达盒因而不仅包含调节转录和翻译的核酸序列， 还包含应当因转录和翻译而表达为蛋白质的核酸序列。
在本发明的上下文中， 术语 “表达” 或 “过量表达” 描述在微生物中由相应 DNA 编 码的一种或多种酶的胞内活性的产生或提高。 为此， 例如可以在生物中插入基因、 由另一种 基因置换现存基因、 增加该一个基因或多个基因的拷贝数、 使用强启动子或使用编码具有 高活性的相应酶的基因， 并且任选地可以组合这些措施。 优选地， 本发明的此类构建体包含 在相应编码序列 5’ 上游的启动子和 3’ 下游的终止子序列， 并且任选地还包含常规调节元 件， 在每种情况下它们均与编码序列功能性连接。
根据本发明， “启动子” 、 “具有启动子活性的核酸” 或 “启动子序列” 意指与待转录 的核酸功能性连接时调节该核酸转录的核酸。
在这种情况下， “功能性” 或 “有效” 连接意指以如此方式依次连接例如具有启动子 活性的核酸之一和待转录的核酸序列和任选地其他调节元件 ( 例如能够使核酸转录的核 酸序列和例如终止子 )， 从而所述每种调节元件可以在该核酸序列的转录中履行其功能。 这 不必然需要化学意义上的直接连接。 遗传调控序列如增强子序列也能够从更远位置或甚至 从其它 DNA 分子上对靶序列发挥它们的作用。优选这样的排列， 其中待转录的核酸序列位 于启动子序列之后 ( 即在 3′端 )， 从而这两个序列彼此共价地结合。启动子序列与待转基 因表达的核酸序列之间的距离可以小于 200bp( 碱基对 ) 或小于 100bp 或小于 50bp。
除了启动子和终止子之外， 可以提及的其他调节元件的例子是靶向序列、 增强 子、 多腺苷酸化信号、 选择标记、 扩增信号、 复制起点等。合适的调节序列例如在 Goeddel， Gene Expression Technology ： Methods inEnzymology 185， Academic Press， San Diego， CA(1990) 中描述。
本发明的核酸构建体特别包含选自本文中具体所提及的那些序列或其衍生物和 同源物， 以及可以从本文中具体所提及的氨基酸序列中衍生的核酸序列， 其中所述的序列 有利地与控制 ( 例如增加 ) 基因表达的一种或多种调节信号有效地或功能性连接。
除这些调节序列之外， 对这些序列的天然调节作用仍可以在实际的结构基因之前 存在， 并且任选地可能已经遗传地改变， 从而关闭天然调节作用并且已经增加所述基因的 表达。 核酸构建体也可以具有更简单的设计， 即， 在编码序列之前不插入任何额外的调节信 号并且不消除天然启动子连同其调节作用。 取而代之的是， 使天然调节序列沉默， 从而调节 作用不再发生并且基因表达增加。
优选的核酸构建体还有利地含有与启动子功能性连接的引起核酸序列表达增 加的一个或多个前述增强子序列。也可以在 DNA 序列的 3 ′端插入额外的有利序列， 如其他调节元件或终止子。本发明核酸的一个或多个副本可以含于该构建体中。该构 建体也可以含有任选用于选择构建体的其他标记如抗生素抗性或互补营养缺陷的基因 (auxotrophy-complementinggene)。
在启动子如 cos-、 tac-、 trp-、 tet-、 trp-tet-、 lpp-、 lac-、 lpp-lac-、 laclq-、T7-、 T5-、 T3-、 gal-、 trc-、 ara-、 rhaP(rhaPBAD)SP6-、 λ-PR- 中或在有利地用于革兰氏阴性 细菌的 λ-PL 启动子中含有合适调节序列的实例。在例如革兰氏阳性细菌启动子 ace、 amy 和 SPO2， 在酵母或真菌启动子 ADC1、 MFα、 AC、 P-60、 CYC1、 GAPDH、 TEF、 rp28、 ADH 中含有其 他有利的调节序列。人工启动子也可以用于调节。
为了表达， 将核酸构建体插入宿主生物中， 其中所述的核酸构建体有利地位于允 许所述基因在该宿主中最佳表达的载体 ( 例如质粒或噬菌体 ) 中。除质粒和噬菌体外， 载 体也理解为意指本领域技术人员已知的全部其他载体， 例如， 病毒如 SV40、 CMV、 杆状病毒和 腺病毒、 转座子、 IS 元件、 噬菌粒、 粘粒和线性或环状 DNA。这些载体可以在宿主生物中自主 复制或可以按染色体方式复制。这些载体代表本发明的又一实施方案。
合适的质粒例如是大肠杆菌中的 pLG338、 pACYC184、 pBR322、 pUC18、 pUC19、 pKC30、 pRep4、 pHS1、 pKK223-3、 pDHE19.2、 pHS2、 pPLc236、 pMBL24、 pLG200、 pUR290、 pIN-III113-B1、 λgt11 或 pBdCI ； 诺卡氏菌型放线菌 (Nocardioform actinomycetes) 中的 pJAM2 ； 链霉菌 属 (Streptomyces) 中的 pIJ101、 pIJ364、 pIJ702 或 pIJ361 ； 芽孢杆菌中的 pUB110、 pC194 或 pBD214 ； 棒状杆菌属 (Corynebacterium) 中的 pSA77 或 pAJ667 ； 真菌中的 pALS1、 pIL2 或 pBB116 ； 酵母中的 2αM、 pAG-1、 YEp6、 YEp13 或 pEMBLYe23 或植物中的 pLGV23、 pGHlac+、 pBIN19、 pAK2004 或 pDH51。前述的质粒代表可能质粒的小部分选择。其它质粒是本领域技 术人员熟知的并且将会在例如书籍 Cloning Vectors( 编者 Pouwels P.H. 等人， Elsevier， Amsterdam-New York-Oxford， 1985， ISBN 0 444 904018) 中找到。
在载体的又一个实施方案中， 含有本发明核酸构建体或本发明核酸的载体可以有 利地以线性 DNA 形式插入微生物中并且通过异源或同源重组整合到宿主生物的基因组中。 这种线性 DNA 可以包含线性化载体如质粒或仅包含本发明的核酸构建体或核酸。
为了异源基因在生物中的最佳表达， 有利的是根据生物中所用的特定密码子选择 改变核酸序列。该密码子选择可以基于计算机评价所讨论生物的其他已知基因来轻易确 定。
本发明表达盒的产生基于合适启动子与合适的编码性核苷酸序列及终止子信号 或多腺苷酸化信号的融合。为此， 使用如在例如 T.Maniatis， E.F.Fritsch 和 J.Sambrook， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， ColdSpring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor， NY(1989) 以 及 在 T.J.Silhavy， M.L.Berman 和 L.W.Enquist， Experiments with Gene Fusions， Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor， NY(1984) 并且 在 Ausubel， F.M. 等人， Current Protocols in Molecular Biology， GreenePublishing Assoc. 和 Wiley Interscience(1987) 中所描述的常见重组和克隆技术。
将重组核酸构建体或基因构建体有利地插入用于合适宿主生物中表达的宿主 特异性载体内， 以允许所述基因在该宿主中最佳表达。载体是本领域技术人员熟知的并 且将在例如 “Cloning Vectors” (Pouwels P.H. 等 人， Publ.Elsevier， Amsterdam-New York-Oxford， 1985) 中找到。
根据本发明可以使用的宿主
根据上下文， 术语 “微生物” 意指起始微生物 ( 野生型 ) 或本发明的基因修饰微生 物或这两者。
根据本发明， 术语 “野生型” 意指相应的起始微生物并且不需要必然对应于天然存在的生物。
借助本发明的载体， 可以产生重组微生物， 所述重组微生物已经用例如至少一种 本发明载体转化并可以用于产生本发明的多肽。有利地， 将以上所述的本发明重组构建 体插入合适的宿主系统中并表达。优选地， 使用本领域技术人员熟悉的常见克隆与转染方 法， 例如共沉淀法、 原生质体融合法、 电穿孔法、 逆转录病毒转染法等， 旨在确保所述核酸在 相应表达系统中表达。合适的系统例如在 Current Protocols in Molecular Biology， F.Ausubel 等人， Publ.Wiley Interscience， New York 1997 或 Sambrook 等人 Molecular Cloning ： A Laboratory Manual. 第 2 版， Cold Spring HarborLaboratory， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY， 1989 中描述。
原则上， 可以考虑全部原核生物作为本发明核酸或核酸构建体的重组宿主生物。 将细菌有利地用作宿主生物。 虽然大肠杆菌是通常用来表达催化甲醛降解的酶的细菌宿主 细胞的一个实例， 但是其他细菌宿主细胞可以在本发明中用来表达外源 DNA， 所述的宿主细 胞包括例如埃希氏菌属、 肠杆菌属、 固氮菌属、 欧文氏菌属、 芽孢杆菌属、 假单胞菌属、 博德 特菌属、 红杆菌属、 苛养木杆菌属、 克雷伯氏菌属、 变形杆菌属、 沙门菌属、 沙雷菌属、 志贺菌 属、 根瘤菌属、 透明颤菌属和副球菌属。此外， 真核真菌宿主细胞可以在本发明中用来表达 外源 DNA， 它们包括例如曲霉属、 毕赤酵母属、 木霉属、 汉逊酵母属、 酵母属、 克鲁维酵母属、 裂殖酵母属、 金小孢子属、 假丝酵母属和球拟酵母属。
本发明的宿主生物或多种宿主生物则优选地含有本文发明中所描述的编码根据 上文定义的酶活性的核酸序列、 核酸构建体或载体至少之一。
根据宿主生物， 本发明方法中所用的生物以本领域技术人员熟悉的方式生长或培 育。原则上， 将微生物在液体培养基中于 0℃和 100℃之间、 优选 10℃和 60℃之间的温度在 氧通气的情况下培育， 其中所述液体培养基含有通常为糖形式的碳源、 通常为有机氮源形 式的氮源 ( 如酵母提取物 ) 或盐如硫酸铵、 痕量元素如铁、 锰和镁盐并且任选地含有维生 素。液体营养培养基的 pH 可以维持在固定值上， 即在培育期间进行调节或不予调节。可以 分批、 半分批或连续地实施生长。养分可以在发酵伊始供应或可以随后半连续或连续地供 应。
重组产生具有醛歧化酶活性的蛋白质
本发明也涉及通过培育表达本发明蛋白质的微生物并且从培养物中分离所希望 的产物来产生所述蛋白质的方法。
可以以分批法或以补料分批或重复补料分批法连续或间歇地培育如根据本发明 使用的微生物。对已知培育方法的综述存在于 Chmiel(Bioprocesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(GustavFischer Verlag， Stuttgart， 1991)) 教 材 中 或 Storhas(Bioreaktoren undperiphere Einrichtungen(Vieweg Verlag， Braunschweig/ Wiesbaden， 1994)) 教材中。
待使用的培养基必须以适宜的方式满足具体菌株的要求。对多种微生物的培养 基的描述在手册 “美国细菌学会通用细菌学方法手册 (Manual ofMethods for General Bacteriology)” (Washington D.C， USA， 1981) 中给出。
可以根据本发明使用的这些培养基通常包含一种或多种碳源、 氮源、 无机盐、 维生 素和 / 或痕量元素。优选的碳源是糖， 如单糖、 二糖或多糖。极好的碳源例如是葡萄糖、 果糖、 甘露糖、 半乳糖、 核糖、 山梨糖、 核酮糖、 乳糖、 麦芽糖、 蔗糖、 棉子糖、 淀粉或纤维素。 糖也可以以复杂 化合物如糖蜜或来自糖精炼的其他副产品添加至培养基。 也可以有利的是添加多种碳源的 混合物。 其他的可能碳源是油和脂肪， 如大豆油、 葵花籽油、 花生油或椰子油， 脂肪酸如棕榈 酸、 硬脂酸或亚麻酸、 醇如甘油、 甲醇或乙醇和有机酸如乙酸或乳酸。
氮源通常是有机或无机氮化合物或含有这些化合物的物质。 氮源的实例包括氨气 或铵盐， 如硫酸铵、 氯化铵、 磷酸铵、 碳酸铵或硝酸铵、 硝酸盐、 脲、 氨基酸或复杂氮源， 如玉 米浆、 大豆粉、 大豆蛋白、 酵母提取物、 肉浸汁和其他等。 氮源可以分开地使用或作为混合物 使用。 可以在培养基中存在的无机盐化合物包含钙、 镁、 钠、 钴、 钼、 钾、 锰、 锌、 铜和铁的氯化 物、 磷酸盐或硫酸盐。含硫无机化合物例如硫酸盐、 亚硫酸盐、 连二亚硫酸盐、 连四硫酸盐、 硫代硫酸盐、 硫化物以及有机硫化合物如硫醇和硫羟可以用作硫源。
磷酸、 磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐可以用作磷源。可以将螯合剂添 加至培养基， 旨在维持溶液中的金属离子。特别合适的螯合剂包含二羟基酚， 如儿茶酚或 原儿茶酸酯或有机酸如柠檬酸。根据本发明使用的发酵培养基也可以含有其他生长因子， 如维生素或生长促进剂， 它们包括例如生物素、 核黄素、 硫胺素、 叶酸、 烟酸、 泛酸酯和吡哆 醇。生长因子和盐经常来自培养基的复杂组分， 如酵母提取物、 糖蜜、 玉米浆等。此外， 可 以将合适的前体添加至培养基。 培养基中化合物的精确组成强烈取决于具体的实验并且必 须针对每种具体情况分别决定。关于培养基优化的信息可以在教材 “Applied Microbiol. Physiology， A Practical Approach” (Publ.P.M.Rhodes， P.F.Stanbury， IRL Press(1997) 第 53-73 页， ISBN 019 963577 3) 中找到。也可以从供应商处获得生长培养基， 如标准 1(Merck) 或 BHI( 心脑浸液， DIFCO) 等。通过加热 ( 在 1.5 巴和 121℃， 20 分钟 ) 或通过无 菌过滤， 将培养基的全部组分消毒。所述组分可以一起消毒或根据需要分别消毒。培养基 的全部组分可以在培养伊始存在或任选地可以连续地或通过分批补料添加。
培养物的温度通常是在 15℃和 45℃之间， 优选地是 25℃至 40℃并且在实验期间 可以保持恒定或可以变动。培养基的 pH 值应当在 5 至 8.5 的范围内， 优选地在 7.0 附近。 可以在培育期间通过添加碱性化合物如氢氧化钠、 氢氧化钾、 氨或氨水或酸性化合物如磷 酸或硫酸控制用于生长的 pH 值。消泡剂例如脂肪酸聚二醇酯可以用于控制起泡。为维持 质粒的稳定性， 可以将具有选择作用的合适物质例如抗生素添加至培养基。将氧或含氧的 气体混合物例如空气送入培养物以维持通气条件。培养物的温度通常是 20℃至 45℃。持 续培养直至最大量所希望的产物已经形成。这通常在 10 小时至 160 小时内实现。
可以任选地通过高频超声波、 通过高压例如在弗氏细胞压碎器中、 通过渗透作用、 通过去垢剂、 裂解酶或有机溶剂的作用、 借助均化器或通过所列几种方法的组合破坏细胞。
具有醛歧化酶活性的酶的具体用途
本发明也涉及分离的多肽用于降低在含醛制品中醛含量的用途， 所述分离的多肽 具有醛歧化酶活性并且包含 SEQ ID NO ： 2 的变体， 其中在 SEQID NO ： 2 第 93 位置处的苯丙 氨酸和 / 或在 SEQ ID NO ： 2 第 301 位置处的异亮氨酸和 / 或在 SEQ ID NO ： 2 第 337 位置处 的甲硫氨酸和 / 或在 SEQ IDNO ： 2 第 127 位置处的苯丙氨酸由任何其他氨基酸置换。
在一个优选的实施方案中， 醛是如定义部分中定义的乙醛。
在另一个优选的实施方案中， 醛是丙酮醛。以下实施例仅起到说明本发明的作用。 对于本领域技术人员显而易见的众多可能 变化也落入本发明的范围内。 实施例 实施例 1 ： FDM 表达和纯化
以下方法源自先前描述的方案 (Yanase， H.， Moriya， K.， Mukai， N.， Kawata， Y.， Okamoto， K.， Kato， N(2002)GroESL 共表达对来自恶臭假单胞菌 F61 的烟酰胺蛋白甲醛歧化 酶折叠的影响 (Effects of GroESLCoexpression on the Folding of Nicotinoprotein Formaldehyde Dismutasefrom Pseudomonas putida F61)Biosci.Bitechnol.Biochem.， 66(1)， 85-91) 并且已经进一步优化。 编码 FDM 的基因的密码子选择已经对大肠杆菌进行优 化。 新 DNA 序列已经合成并克隆到鼠李糖诱导型表达载体 pDHE(SEQ ID NO ： 4) 中。 对于可溶 性 FDM 产生所必需的 GroEL/S 伴侣蛋白克隆于 IPTG 诱导型 pAgro 载体 (SEQ ID NO ： 5) 中。 lac 阻抑蛋白由 pHSG 载体 (SEQ ID NO ： 6) 编码。 使用大肠杆菌 TG10( 一种无鼠李糖异构酶 的 TG1 衍生物 ) 进行 FDM 的表达。将含有 pAgro 和 pHSG 的 TG10 细胞 (TG10+) 用 pDHE-FDM 转化并且在 LB 中于 37 ℃在氨苄青霉素 (pDHE)、 壮观霉素 (pAgro) 和氯霉素 (pHSG) 存在 下培养 5 小时。将 5mL 这种培养物转移至含有 100μM IPTG 和 0.5g/L 鼠李糖的 500mL 相 同培养基中。诱导在 37℃进行约 18 小时。通过离心收集细胞并且将其重悬于裂解缓冲液 (10mMKH2PO4， pH 7， 0.5mM MgCl2， 140μM PMSF) 中。通过超声处理 (<1’ ， 1s/1s>x10， 70％振 幅 ) 诱导细胞裂解。在 37℃孵育 10 分钟并离心后， 将硫酸铵添加至清亮的裂解物至 50％ 饱和度。使得不想要的蛋白质 ( 例如伴侣蛋白 ) 在冰上沉淀 2-4 小时。
通过离心除去沉淀物并且将含有 FDM 的清亮溶液施加至苯基 - 琼脂糖凝胶柱 (HIC 层析 )。使用 “40％至 0％” 硫酸铵梯度 ( 缓冲液 ： 10mM KH2PO4， 0.5mM MgCl2， pH 7.2)， 洗脱 含有 FDM 的级分。FDM 的存在由快速比色测定法证实 ： 将 10μL 每一级分转移至 96 孔 MTP 平板并且与 250μL 甲醛溶液 ( 在 100mM KH2PO4， pH 7 中 12.5ppm， 30 分钟 ) 一起孵育。通 过添加 50μL Purpald- 试剂 (1M NaOH 中 10mg/mL， Sigma) 至 50μL 反应混合物检测未反 应的甲醛。显色表示酶在收集的级分中不存在。
在苯基琼脂糖凝胶纯化步骤后， 洗脱的级分通过超滤法 (10kDa 截止值 ) 浓缩并 且 通 过 大 小 排 阻 层 析 法 (HiPrep Desalting 26/10mL， Amersham) 脱 盐。1×PBS， 0.5mM MgCl2(pH 7.2) 用作运行缓冲液。通过超滤法 (10kDa 截止值 ) 浓缩蛋白质溶液并且将甘油 添加至 50％终浓度。FDM 原液 (2-5mg/mL) 在 -20℃贮存。从发酵物约 1g/L 中， 来自摇瓶的 一般产率是约 100mg/L。该方法允许纯化蛋白质至均一， 如考马斯染色的 SDS-PAGE 所判定 ( 数据未显示 )。
对于 FDM 突变体， 也可用以下方法。
以 下 方 法 源 自 先 前 描 述 的 方 案 (Yanase 等 人 2002， Biosci.Biotechnol. Biochem.， 66(1)， 85-91) 并且已经作进一步优化。编码 FDM( 或突变体 ) 的基因的密码子 选择已经对大肠杆菌进行优化 (SEQ ID NO ： 3)。新 DNA 序列已经合成并克隆到鼠李糖诱导 型表达载体 pDHE(SEQ ID NO ： 4) 中。对于可溶性 FDM 产生所必需的 GroEL/S 伴侣蛋白克隆 于 IPTG 诱导型 pAgro 载体 (SEQ ID NO ： 5) 中。lac 阻抑蛋白由 pHSG 载体 (SEQ ID NO ： 6) 编码。使用大肠杆菌 TG10( 一种无鼠李糖异构酶的 TG1 衍生物 ) 进行 FDM 的表达。将含有
pAgro 和 pHSG 的 TG10 细胞 (TG10+) 用 pDHE-FDM 转化并且在 LB 中于 37 ℃在氨苄青霉素 (pDHE)、 壮观霉素 (pAgro) 和氯霉素 (pHSG) 存在下培养 5 小时。将 5mL 这种培养物转移至 含有 100μM IPTG 和 0.5g/L 鼠李糖的 500mL 相同培养基中。诱导在 37℃进行约 18 小时。 通过离心收集细胞并且将其重悬于裂解缓冲液 (10mM KH2PO4， pH 7， 0.5mM MgCl2) 中。通过 超声处理 (<3’ ， 15s/15s>x3， 85％振幅 ) 诱导细胞裂解。在 37℃孵育 10 分钟并离心后， 将 硫酸铵添加至清亮的裂解物至 50％饱和度。 使得不想要的蛋白质 ( 例如伴侣蛋白 ) 在冰上 沉淀 1-2 小时。
通过离心除去沉淀物并且将含有 FDM 的清亮溶液施加至苯基 - 琼脂糖凝胶柱 (HIC 层析 )。使用 “40％至 0％硫酸铵梯度” ( 缓冲液 ： 10mM KH2PO4， 0.5mM MgCl2， pH 7.2)， 洗脱 含有 FDM 的级分。FDM 的存在由快速比色测定法证实 ： 将 10μL 每一级分转移至 96 孔 MTP 平板并且与 250μL 甲醛溶液 ( 在 100mM KH2PO4， pH 7 中 12.5ppm， 30 分钟 ) 一起孵育。过 添加 50μL Purpald- 试剂 (1M NaOH 中 10mg/mL， Sigma) 至 50μL 反应混合物检测未反应 的甲醛。显色表示酶在收集的级分中不存在。
在苯基 - 琼脂糖凝胶纯化步骤后， 洗脱的级分通过超滤法 (10kDa 截止值 ) 浓缩并 且通过大小排阻层析法 (HiPrep Desalting 26/10mL， Amersham) 脱盐。 10mM KH2PO4， 0.5mM MgCl2(pH 7) 用作运行缓冲液。通过超滤法 (10kDa 截止值 ) 浓缩蛋白质溶液并且将甘油添 加至 50％终浓度。FDM 原液 (2-5mg/mL) 在 -20℃贮存。该方法允许纯化蛋白质至均一， 如 考马斯染色的 SDS-PAGE 所判定 ( 数据未显示 )。
实施例 2 ： 通过 pH-stat 滴定法表征 FDM
在含有 20mM 甲醛， 100mM KCl， 0.25mM KH2PO4(pH 7) 的标准反应混合物中验定 FDM 活性。通过添加 5μL 酶溶液至 25mL 标准混合物在室温进行该反应。通过 pH-stat 滴定法 用 5mM NaOH 监测 5 分钟范围内的甲酸盐形成。一个单位定义为每分钟催化 1μmol 甲酸形 成所需要的酶量。TG10+ 中表达的 FDM 具有范围在 100-200U/mg 之间的比活性。
实施例 3 ： 甲醛的检测
LAW 112 法的检测原理依赖于甲醛与乙酰丙酮在氨存在下反应以形成黄色化合物 3， 5- 二乙酰基 -1， 4- 二氢卢剔啶 (Hantzsch 反应 )(Nash， T.(1953) 通过 Hantzsch 反应对 甲醛的比色估计， Biochem.J.， 55(3)， 416-421 和 Fregert， S.， Dahlquist， I.， Gruvberger， B.(1984) 用于检测甲醛接触性皮炎的简单方法 (Simple Method for the Detection of Formaldehyde ContactDermatitis)， 10， 132-134)。 对于定量性甲醛检测， 如下制备试剂溶 液： 将 15g 乙酸铵、 0.2mL 乙酰丙酮、 0.3mL 乙酸在 100mL 蒸馏水中混合 ( 在 4℃稳定 1 周 )。 为获得校准曲线， 制备范围从 5ppm 至 25ppm 的甲醛水溶液。通过混合 0.1mL 样品水溶液 ( 或作为空白的标准物或水 ) 与 0.15mL 试剂溶液启动该反应并且在 60℃孵育 10 分钟。在 溶液已经冷却至室温后， 添加蒸馏水至终体积 1mL。在 412nm 监测 3， 5- 二乙酰基 -1， 4- 二 氢卢剔啶的形成。
实施例 4 ： 酶的初步表征
为确定甲醛歧化酶对织物应用的效率， 将不同的酶浓度与 100mMKH2PO4， pH 8 中的 220ppm 甲醛在室温孵育 30 分钟。样品通过先前描述的乙酰丙酮法分析。酶原液的比活性 是 165U/mg。结果在表 1 中显示。
表1： 溶液 (220ppm 甲醛 ) 中的酶促甲醛移除。通过乙酰丙酮法进行检测。值显示了在室温孵育 30 分钟后溶液中的剩余甲醛。
FDM(mg/L) 0 7 17
甲醛 (ppm) 230 11 检测不到 ( ＜＜ 5ppm)甚至非常低的酶浓度对几乎彻底降低甲醛含量是绰绰有余的。对于技术应用而 言， 另一个有意思特性是对醇 ( 乙醇， 异丙醇 ) 或纯水而非缓冲液的耐受性。为此目的， 将 17mg/L 甲醛歧化酶在 30℃于 100mM KH2PO4(pH8)， 220ppm 甲醛和 10 或 20％ v/v 溶剂 ( 乙 醇或异丙醇 ) 中孵育。备选地， 使用 ddH2O 替代磷酸盐缓冲液。结果在表 2 中汇总。
表2： 乙醇、 异丙醇 ( ％ v/v) 和纯水对 FDM 活性的影响 (FDM 为 17mg/L， 甲醛为 220ppm)。值显示了在 30℃孵育 30 分钟后溶液中的剩余甲醛。通过乙酰丙酮法进行检测。
在 10％乙醇中的 FDM 160ppm 在 10％异丙醇中的 FDM 26ppm 在 ddH2O 中的 FDM 240ppm(90 分钟后 133ppm)
在 20％乙醇中的 FDM 196ppm 在 20％异丙醇中的 FDM 104ppm ddH2O 201ppm(90 分钟后 202ppm) 20％乙醇 227ppm 20％异丙醇 229ppm来自恶臭假单胞菌 F61 的甲醛歧化酶在大量乙醇存在下未与 FA 有效反应。 甚至在 10％ v/v， 针对 FA 的酶活性被强烈抑制。相对低浓度的异丙醇不造成问题， 但是多于 10％ v/v 对活性产生负面影响。纯水灭活该酶 ； 甲酸的产生诱导酸性 pH- 位移 (pH 从 7 降低至 约 4)。
实施例 5 ： 用 FDM 处理整理的织物
用二羟甲基二羟基亚乙基脲交联剂整理的棉纤维已经以 FDM 处理。在交联剂与棉 纤维缩合之后， 可以通过乙酰丙酮法测定出织物中约 114ppm 的游离甲醛。随后用不同浓度 的酶溶液 (100mM KH2PO4， pH 8， 0-150mg/L 酶 ) 浸渍该织物样品并且使其立即经过两个转动 的金属滚筒 ( 图 3)。湿样品在 30℃孵育 60 分钟。通过乙酰丙酮法 (LAW 112) 定量从 1g 织物样品提取的甲醛。表 3 汇总数据。
表3： 不同 FDM 浓度对用改性二羟甲基二羟基亚乙基脲交联剂交联的棉织品的影 响 ( 在酶促处理前织物中的甲醛是 114ppm)。
33CN 102459580 A
FDM(mg/L) 0 20 50 100 150
说明书来自干织物的甲醛 (ppm) 95 56 40 51 4931/39 页来自湿织物的甲醛 (ppm) 73 33 22 23 23甲醛含量在没有歧化酶情况下已经降低至约 70ppm( 来自干织物的甲醛含量是 95ppm)， 这可能因浸渍过程期间的某些 “洗出” 效应所致。通常， 甲醛歧化酶能够明显地降 低所提取甲醛的量至 20 和 40ppm 之间的水平。湿织物与干织物甲醛检测结果的不同可能 因织物含水量估计方面的不同所致。表 4 显示对织物进行的相同实验， 其中所述的织物用 含有较大量 FA 的替代性二羟甲基二羟基亚乙基脲交联物交联 ( 在酶促处理前织物中的甲 醛是 641ppm)。
表4： 不同 FDM 浓度对用二羟甲基二羟基亚乙基脲制品交联的棉织品的影响。
30 分钟孵育 60 分钟孵育
因为 “洗出” 效应， 样品在没有歧化酶情况下显示甲醛含量明显降低。然而， 应用 增加量歧化酶的酶导致来自整理的织物中释放的甲醛明显减少。约 70％的吸水率 (water uptake) 意味着每 kg 织物约 100mg 歧化酶对相当大程度地降低甲醛含量是绰绰有余的。
为降低酶促处理后干燥织物的时间及能源成本， 降低此类应用中的水含量将是有 益的。为此目的， 将交联的织物样品略有差异地处理 ： 将浓缩的酶溶液 (1xPBS， 25％甘油中 的 1350mg/L) 喷洒在该织物上。微调吸水率， 从而允许分析 0-50％范围的湿度 ( 表 5)。全 部织物探测物在 30℃孵育 60 分钟。
表5： 不同吸水率对用二羟甲基二羟基亚乙基脲制品交联的棉织品的影响 ( 在
酶促处理前织物中的甲醛是 641ppm)。将 FDM 以浓缩的原液喷洒 (1xPBS， 25 ％甘油中的 1350mg/L)。
即便通过施加作为喷雾剂的酶， 甲醛的某些 “洗出” 仍是不可避免的 (20％缓冲液 吸取率， 465ppm 释放的甲醛 )。 但是， 在相同吸水率的情况下， 酶施加 ( 每 kg 织物 270mg 酶 ) 仍引起释放的甲醛减少多于 50％。与织物含水量达到 70％的经金属滚筒施加酶相比， 喷洒 施加的效率是较不明显的。
实施例 6 ： FDM 对不同织物整理产品的 FA 含量的影响
降低织物中甲醛量的备选策略将是在织物缩合步骤之前将歧化酶直接应用至交 联剂溶液。为此目的， 已经用甲醛歧化酶测试了 3 种产品 ： 二羟甲基二羟基亚乙基脲制品 ( 制品 1)、 甲氧甲基化蜜胺制品 ( 制品 2) 和低 FA 含量的缩聚甲氧甲基化蜜胺制品 ( 制品 3)。交联剂制品 1 是高度浓缩的略微酸性的 (pH 5-6) 水溶液， 其含有 0.1 和 1％之间的甲 醛 (1000 至 10000ppm)。制品 2 是含有 1.5 和 2.5％之间甲醛的浓缩水溶液 (pH 8-9)。制 品 3 是含有 0.2 和 1％之间甲醛的略微碱性的水溶液 (pH 8-9)。
通常， 将 87μL 纯产品与 10μL 3M KH2PO4(pH 7) 和 3μL 50％甘油混合 ( 阴性对 照 )。在酶处理的样品中， 使用酶原液 (4.8mg/mL) 而不是甘油。产品溶液中的酶终浓度是 约 150mg/L。通过乙酰丙酮法检测甲醛。表 6 显示 FDM 对交联剂溶液的影响。
表6 ： FDM( 约 150mg/L) 对制品 1、 2 和 3 的影响。 反应混合物用大约 300mM KH2PO4(pH 7) 缓冲并且在 30℃孵育 60 分钟。值显示了浓缩产品中处理后的剩余甲醛 ( 单位为 ppm)。 通过乙酰丙酮法进行检测。
35CN 102459580 A交联剂 制品 1 制品 3 制品 2说明-FDM 5200 3500 38000书+FDM 1700 1700 2930033/39 页对制品 1 获得最好的结果， 甲醛含量降低大约 70％。 制品 3 的甲醛含量降低约 50％。 用 FDM 处理制品 2 仅降低高甲醛含量 20％。注意对 FDM 暴露延长可能导致产品降解。
总体而言， 这些初步结果表明 FDM 可以潜在地直接应用于产品溶液。
实施例 7 ： FDM 降低改性的二羟甲基二羟基亚乙基脲化合物中 FA 含量的用途
交联剂用于易于打理整理由纤维素纤维及它们与合成纤维的混纺物制成的织物。 这些化学品的一个重要类别是改性二羟甲基二羟基亚乙基脲化合物类。这里， 我们用甲醛 歧化酶 (FDM) 处理 4 种不同的产品配方 (product formulation) 并且测量产品中的剩余甲 醛。另外， 酶处理的产品用于棉织品整理中。织物 ( 棉织品 ) 的甲醛含量和整理的性能已 经定量。
产物制品如下处理 ： 17.4g 交联试剂 ( 作为浓缩的水溶液 ) 和 2mL 3MKH2PO4(pH 7) 与 0.6mL FDM(4.8mg/mL) 轻轻地混合。酶终浓度是约 140mg/L。酶促过程在室温实施约 3 小时。甲醛含量如先前描述那样测量 ( 乙酰丙酮法 )( 见表 7)。
表7：
交联剂 1 2 3 4 用 FDM 情况下的 FA(ppm) 1200 500 500 500 无 FDM 情况下的 FA(ppm) 4100 3100 2200 3500产品溶液中的甲醛含量降低了 70-80％。 产品 1( 未保护的羟甲基 ) 中甲醛移除可 以导致产品随时间降解。
酶处理和未处理的制品用于使用以下配方 ： 57.5g/ 交联试剂、 10g/LMgCl2·6H2O， pH 5.0( 通过添加乙酸调节 ) 的棉织品整理中 ( 织物 ： CO-Popelin)。使得棉织品样品 ( 吸 液率约 70％ ) 在 110℃干燥至终末湿度约 6％。以下的固化步骤 (curing step) 在 150℃ 进行 3 分钟。通过 LAW112 测量棉织品样品中的甲醛含量 ( 单位为 ppm 的值 )。额外的性 能指标是干态折皱回复角 (dcra)( 单位为° )、 抗张强度 ( 在 40 ＊ 100mm 上以 N 表示的张 力 )、 评价光滑度的耐久压烫 (DP 评价 )、 评价光滑度的孟山都法 ( 孟山都评价 )、 收缩 ( 以％ 表示的经 (w)/ 纬 (f) 缩比 )。下表 ( 表 8) 汇总结果 (1 ： 未整理的棉织品 2 ： 制品 13 ： 制品 1+FDM 4 ： 制品 25 ： 制品 2+FDM 6 ： 制品 37 ： 制品 3+FDM 8 ： 制品 49 ： 制品 4+FDM)。
表8
36CN 102459580 A 1 FA(LAW112) dcra 张力 DP 评价 孟山都评价 经缩 纬缩
1 123 399 1 1 4.0 0.2 2 196 198 361 2 3 1.4 0.4 3说明4 53 187 340 1.5 2 2.0 0.0书5 25 178 282 1.5 2 1.6 0.2 6 35 180 304 1.5 2.5 1.8 0.2 7 22 187 350 1.5 2.5 2 0 8 42 180 342 1.5 2.5 2 0.234/39 页 9 22 173 324 1.5 2.5 1.8 0.2168 187 356 2 3 1.4 0.4实施例 8 ： FDM 降低用作高分子分散剂 / 超塑化剂的磺化蜜胺 -FA 缩聚物中 FA 含量的用途 磺化的蜜胺 -FA 缩聚物尤其优化用于基于水泥和硫酸钙的混合物的塑化和减水。 一般， 这些产品作为 20％ w/v 水溶液使用并且 pH 值是约 9 至 11.4( 样品 1) 和 7 至 10( 样 品 2)。这里 ( 见表 9) 我们用 FDM( 终浓度 140mg/L) 处理两种样品的 20％ w/v 工作液并且 在不同孵育时间后使用先前描述的乙酰丙酮法定量剩余的甲醛 ( 以 ppm 表示的值 )。
表9
20％ w/v 样品 1 样品 2
无 FDM 5700 1700 FDM(1 小时 ) 3200 1200 FDM(3 小时 ) 2500 1000 FDM(24 小时 ) 1800 7001 小时酶促处理后的产品性能就定形时间 (set time)、 流动和强度而言没有不利 地受到影响。相似的结果可以通过使用 1/5 酶浓度那样的量获得。在这些产品中， 除去甲 醛可以导致聚合物分子量分布随时间的变化。
实施例 9 ： FDM 降低改性阴离子聚烷基二醇 - 酚 -FA 树脂中 FA 含量的用途
改性阴离子聚烷基酚醛树脂尤其优化用于基于水泥和硫酸钙的混合物的塑化和 减水。将该产品配制为浓缩的水溶液 (pH 5-8)。通过直接添加 FDM 至该产品进行酶处理。 未处理的产品含有约 250ppm 甲醛， 如通过乙酰丙酮法所确定。下表 ( 表 10) 显示与 FDM 孵 育 0.5 小时、 3 小时和 24 小时后的剩余甲醛 ( 单位为 ppm)。
表 10 ：
37CN 102459580 A说FDM(30 分钟 )明书FDM(3 小时 ) 6.8 26.1 FDM(24 小时 ) 3.5 2.435/39 页FDM(100mg/L) FDM(10mg/L)
10.2 125.51 小时酶促处理后的产品性能就定形时间、 流动和强度而言没有不利地受到影响。
相似的结果可以使用未纯化的细胞提取物或产生 FDM 的完整细胞获得。
实施例 10 ： 为扩展的底物特异性合理设计 FDM
FDM 的活性部位显示了在相对狭窄、 主要是疏水的口袋内结合的甲醛分子。策略 性安置的锌离子充当路易斯酸并且激活底物用于紧密结合的 NADH 辅因子分子所供给的氢 负离子亲核攻击。歧化反应的假定反应机制由两个偶联的半反应组成。在第一个半反应 中， 一个甲醛分子被酶 (E)-NAD+ 复合物不可逆氧化以形成甲酸和 (E)-NADH 复合物。在第 二个半反应中， 另一个甲醛分子与该 (E)-NADH 复合物结合并且不可逆地还原成甲醇， 留下 + (E)-NAD 复合物用于下一个反应。 在 Tanaka 等人 (2002)， Journal of Molecular Biology， 324， 519-533 中描述和展示了由 FDM 催化的歧化反应的假定反应机制。来自恶臭假单胞 菌 F61 的 FDM 在 2.3A 分辨率下的活性部位由 Hasegawa 等人 (2002)， Acta Crystallogr.， Sect.A， 58， C102-C102 描述和展示。甲醛紧密地填塞于疏水口袋中 (Met 337、 Ile 301、 Phe 93 和 Phe 127) 并且与锌离子及 NAD(H)- 辅因子密切接近。
来自恶臭假单胞菌 F61 的 FDM 已经显示具有限程度的底物混杂性 (Kato 等人 Agric.， 1983， Biol.Chem.， 47(1)， 39-46)。野生型酶针对乙醛显示微弱活性 (5-10％， 我们 的结果显示甚至更低 ) 并且针对甲基 - 乙二醛显示微弱活性 (22％ )， 针对甲醛的相对活 性是 100％， 但是针对立体化学上更多要求的底物如丙醛、 丁醛、 庚醛、 甘油醛、 乙醇醛、 苯甲 醛、 乙二醛或戊二醛不显示活性。为改善针对体积较大醛类、 尤其乙醛的底物特异性， 我们 决定通过在第 337、 301、 127 和 93 位置处将内衬活性部位的大体积疏水残基置换为较小的 对应物来修饰 FDM 的活性口袋。因此已经制备并表征了以下的单突变体 ：
FDM M337A FDM I301L FDM F127V FDM F93L
FDM I301A FDM F127A FDM F93I
FDM I301V FDM F93G
FDM I301G FDM F93A
FDM I301S FDM F93V
实施例 11 ： 通过 pH-stat 滴定法并通过 HPLC 确定的 FDM 突变体的活性
在含有 20mM 甲醛， 100mM KCl， 0.25mM KH2PO4(pH 7) 的标准反应混合物中通过 pH-stat 滴定法验定 FDM 及其变体的活性。 通过添加 5μL 酶溶液至 25mL 标准混合物 ( 一般 而言 0.1-0.5μg/mL 酶， 这取决于活性 ) 在室温进行该反应。 通过用 5mM NaOH 监测 5 分钟范 围内的甲酸盐形成。一个单位定义为每分钟催化 1μmol 甲酸形成所需要的酶量。FDMF93A/ I301L(0.7μg/mL) 是由 pH-stat 滴定法以 20mM 乙醛替代甲醛在 pH 7 所测试的唯一突变体。 鉴于 FDM 和全部单一突变对乙醛的活性太弱以至于不能通过 pH-stat 滴定法追踪， 我们决 定通过 HPLC(Aminex HPX-87H 柱， 在 5mM H2SO4 中， 由通过 RI 检测， 0.5mL/ 分钟 ) 比较 FDM 及其变体。酶促反应在 50mM KH2PO4(pH 8)， 100mM KCl 和 20mM 乙醛中进行。通过添加 FDM或添加其变体 (50μg/ml) 启动反应。乙醛、 乙醇和乙酸是以 30 分钟间隔定量 ( 保留时间 ： 乙醛 21.2 分钟 ； 乙醇 25.2 分钟 ； 乙酸 18.9 分钟 )。确定反应初速度 (30 分钟值 ) 并且将 单位计算为在 1 分钟内生成 1μmol 乙酸所需要的酶量。
结果清楚地显示大部分突变不利地影响针对两种醛的比活性。仅 I301L 和 F93A 证 明具有有意义的特性。在第 300 位置处导入亮氨酸导致乙醛活性提高 2.5 倍， 同时对甲醛 92 的比活性提高约 10 至 20％。F A 变体几乎完全丧失甲醛活性， 而与野生型酶相比， 对乙醛 301 的比活性提高约 3 倍并且与 FDM I L 突变体的活性相似 ( 表 11)。
表 11 ：
表 11 显示不同活性部位突变体针对甲醛 (FA) 和乙醛 (AA) 的比活性。如上所述， FA 活性由 pH-stat 滴定法确定 ； AA 活性由 HPLC 确定。＊该值符合由 pH-stat 滴定法测量的 活性。n.a. 无活性。
已经组合了第 301 和 93 位置处的突变以产生 FDM I301L/F93A 变体。这种双突变体 对甲醛没有任何活性， 但是针对乙醛具有提高 5 倍的活性。两种置换在增强对乙醛的活性 方面具有协同效应 ( 图 2)。
尽管突变体 I301L 显示扩展的底物特异性， 然而 FDM F93A 变体并且尤其双突变体显
示底物特异性从甲醛至乙醛的转变。图 3 显示通过 HPLC 测定的 FDM I301L 的活性曲线。
实施例 12 ： FDM、 FDM I301L 和 FDM I301L/F93A 的热稳定性
FDM 及其变体的重要特性是对酶纯化 ( 灭菌 ) 期间和技术应用期间升高温度的耐 受。 我们通过将 FDM、 FDM I301L 和 FDM I301L/F93A 在不同温度 (25-65℃ ) 预孵育 20 分钟并随 后通过用乙醛或甲醛测试样品而比较这些酶的热稳定。 如上所述， 通过 HPLC 测试 FDM I301L 和 FDM I301L/F93A 样品的乙醛活性。数据显示为与室温下所获得值相比较的相对活性 ( 图 4)。
如上所述， 通过 pH-stat 滴定法测试 FDM 和 FDM I30 样品的甲醛活性。数据显示为 与室温下所获得值相比较的相对活性 ( 见图 5)。令人感兴趣的是， FDM I301L 突变体显示与 野生型蛋白相比热稳定明显增加 (+5℃， 图 5)。F301L 和 F301L/F93A 突变体对乙醛显示相同的 热稳定曲线 (T50 大约 55℃ )。
实施例 13 ： FDM、 FDM I301L 和 FDM I301L/F93A 的晶体结构
在瑞士 Villingen 的 Synchrotron SLS 测量 FDM I301L/F93A 和 FDMI301L 的晶体 ( 表 12)。
表 12X 射线数据汇集的统计学
使用野生型结构作为结构模板 (pdb 代码 ： 2DPH)， 通过分子替换方法测定 FDM I L/F A 的结构。 作为数据质量的实例， 用于确定结构的第 93 位置处的野生型苯丙氨酸残 301 93 基连同 FDM I L/F A 突变体的密度图一起显示 ( 图 6)。红色差异电子密度表明应当将苯 丙氨酸作为丙氨酸建模并且水分子位于苯基环 Cε- 位置处。 完整酶的总体结构不因突变而
301 93改变。突变的影响限于诱变的位置及其近旁邻居。图 7 显示野生型 FDM 的活性部位的特写 图。该蛋白质以丝带式样描述。后续的氨基酸显示为球和棍 ： Cys 46、 His 67 和 Asp 170 配位催化性锌 ； Ile 301 和 Phe 93 是导入突变的位点 ； Met 337 和 Phe 127 是在突变影响下 改变其构象的氨基酸。也显示了锌离子和辅因子 (NADH)。
FDM I301L 突变体的结构 ：
在电子密度图中清楚地见到异亮氨酸 301 突变成亮氨酸。该侧链采取从活性部位 伸出的取向， 从而导致与 Val 303、 Phe 265 和 Phe 57 的更强烈疏水接触。这种增强的相互 作用可以代表提高的温度稳定性。该突变也对苯丙氨酸 127 产生影响。与野生型酶相比， 完整侧链略微移动并且苯环转动约 70° ( 图 8)。苯环是底物结合口袋的部分并且该侧链的新位置以如此方式约束结合口袋， 从而甲醛和乙醛的羰基处于从 NADH 辅因子转移氢负 离子的更有利位置。另外， 异亮氨酸 301 至亮氨酸的突变打开对面位点上的结合口袋， 从而 与野生型酶相比允许更好地接受立体化学上要求更多的乙醛作为底物。
FDM I301L/F93A 的结构 ：
异亮氨酸 301 至亮氨酸的突变对 Leu301 和对 Phe 127 产生与单突变体结构中相 同的影响。第二突变 (Phe 93 至 Ala) 为野生型的苯环 Cε- 位置附近存在的水分子 (H2O 339) 腾出空间。这个水分子与 NADH 的烟酰胺氧形成氢键并且与作为催化性锌的配体之一 的 Asp170 的羧基氧形成氢键。第三个微弱氢键与 Ala 338 的主链羰基氧形成。该水分子 与 Asp 170 的强氢键扭曲了该侧链的构象， 因而削弱锌配位作用。为产生氢键， Asp 170 的 侧链不得不转动约 14° ( 图 9)。 由于这个转动， 锌离子与其羧基氧之间的距离从 至 增加 最适锌配位作用的丧失可以解释双突变体总体降低的活性。另外， 与野生型酶或I301L 突变体相比， 较大的活性部位似乎阻止甲醛可以采取用于催化作用的有效取向。这 可以解释观察到的特异性从甲醛至乙醛的转变。该突变的第二种影响是改变的 Met 337 构 象。Met 337 的 Cε 原子朝前一个苯环的位置转动 90°。这种构象是一种极低能量构象， 因为它是蛋白质中甲硫氨酸的最优选旋转异构体。
总之， 这些结果表明 FDM I301L 单突变体是技术应用的最优选候选物。
实施例 14 ： FDM I301L 突变体的干燥制剂降低改性阴离子聚烷基二醇 - 酚 -FA 树脂 中 FA 含量的用途
又一种具有约 120ppm 残留 FA 含量的改性阴离子聚烷基二醇 - 酚 -FA 树脂用干燥 301 FDM I L 制剂 ( 制剂比活性 ： 大约 50U/mg) 处理。通过添加 50mg/L 酶粉末至该树脂随后 在室温孵育来进行此试验。下表 ( 表 13) 显示 5 小时后和 42 日后的剩余甲醛 ( 以 ppm 表 示 )。
5 小时后 无酶 FDM I301L(50mg/L)
126ppm 2ppm 42 日后 119ppm 1ppm如实施例 3 中所描述， 通过乙酰丙酮法确定甲醛含量。 301 实施例 15 ： FDM I L 突变体的干燥制剂降低改性 β 萘 -FA 磺化树脂中 FA 含量的用途 水溶性聚合物溶液 ( 改性 β 萘 -FA 磺化树脂 ) 用不同量的 FDM I301L 干燥制剂处 理 (20 至 200mg 制剂 /L 聚合物溶液 ) 并且在室温孵育 5 小时。此时， 添加相同量的酶并且 继续孵育直至 11 日。下表 ( 表 14) 显示使用 2×50mg/L 干燥酶制剂 5 小时、 24 小时、 4 日、 7 日和 11 日后的剩余甲醛 ( 单位为 ppm)。
如实施例 3 中描述， 通过乙酰丙酮法确定甲醛含量。 301
实施例 16 ： FDM I L 突变体的干燥制剂降低稳定化阴离子丙烯酸酯共聚物分散体 中 FA 含量的用途
水中的稳定化阴离子丙烯酸酯共聚物分散体 (54％固形物含量 ) 已经用 10mg/L 301 FDM I L 干制剂在室温处理。在离心 (2-4 小时， 以 14000 转 / 分钟， 室温 ) 后， 测定清亮水 相中甲醛的含量。下表 ( 表 15) 显示酶促处理 5 小时、 24 小时和 96 小时后分散体的甲醛含 量 ( 单位为 ppm)。
5 小时 无酶 FDM I301L(10mg/L)
370ppm 304ppm 24 小时 310ppm 170ppm 96 小时 260ppm 150ppm如实施例 3 中描述， 通过乙酰丙酮法确定甲醛含量。42CN 102459580 A
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