4，5-双取代-1，8-萘酰亚胺类化合物及其应用 【技术领域】
本发明涉及一类4，5-芳(或杂环)氨基双取代-1，8萘酰亚胺类化合物及合成和作为比率荧光探针在缓冲液中对铜离子的高选择性光敏识别与比率检测。
背景技术
由于铜离子在化学、环境、医学以及生命科学中具有重要意义，近些年来针对铜离子的荧光探针的研究受到广泛关注。(Y.Zheng，et al，J.Am.Chem.Soc.2003，125，2680-2686)但是到目前为止，几乎所有已报道的铜离子荧光探针都是以荧光的增强或减弱作为光信号来实现对铜离子的响应。并且由于铜离子是众所周知的强荧光淬灭剂，只有少数几个荧光探针能够在识别铜离子时荧光增强。(S.Kaur，S.Kumar，Chem.Commun.2002，2840-2841；S.Banthia，A.Samanta，J，Phys.Chem.B.2002，106，5572-5577)而且值得注意的是，多数荧光增强探针是在纯有机溶液中检测的，这样就无法在环境和生命体系这样的水相环境中得到应用。近年来随着研究的深入，比率荧光探针成为热点。这类探针能够对底物产生两个或多个吸收波长或荧光发射波长处强度的变化。检测这些信号间的比率变化就可以排除诸如探针的光稳定性、探针的浓度、检测环境的温度和极性等多种因素的干扰，提高检测的选择性和灵敏度。这是荧光增强或减弱型探针所不具备的优良特性。但是到目前为止，未见有针对铜离子的比率荧光探针的报道。本发明的目地在于研制结构简单，能够具有高灵敏度、高选择性的检测铜离子的比率荧光探针。其将在细胞、膜等生物微环境以及环境科学、医药的分析检验中得到广泛应用。
【发明内容】
一类以具有荧光的萘酰亚胺作为发色团母体，在4，5-位引入芳(或杂环)胺取代基作为受体的4，5-双取代-1，8-萘酰亚胺荧光化合物，具有下列结构通式(I)：
其中X＝R1，R2，R3，R4，R5；Y＝R1，R2，R3，R4，R5；X和Y可以相同或不同；Z＝C1-C12直链或支链烷烃，-C2H4OH，-C2H4OC2H4OH，-C2H3(OC2H5)2，-C2H3N+(CH3)3。
该类化合物的合成路线和方法如下：
该类化合物是以4-溴-5-硝基-1，8-萘酐(II)为起始原料，在有机溶剂(1)中，与C1-C12直链或支链脂肪胺，H2NNC2H4OH，H2NC2H4OC2H4OH，H2NC2H3(OC2H5)2或H2NC2H3N+(CH3)3，按摩尔比1∶1，在回流温度下，反应3-10小时，先制得化合物(III)；然后，再将化合物(III)与X芳胺或杂环胺在有机溶剂(2)中，按摩尔比1∶1.1-1.8，在室温到回流温度下，使X与5位上的硝基先发生取代反应，反应时间0.5-10小时，制得化合物(IV)；最后，将化合物(IV)与Y芳胺或杂环胺在溶剂(2)中，按摩尔比1∶1.5-2.5，在回流温度下，使Y与4位上的溴发生取代反应，反应4-10小时，制得化合物(I)。
有机溶剂(1)是乙醇、甲醇、醋酸或甲苯；有机溶剂(2)是乙二醇单甲醚、乙二醇二甲醚、乙腈、吡啶或二甲基甲酰胺等极性溶剂。
当Z＝正丁基时，具体合成方法可见实施例1-3和表1制得15个化合物。
可以看出，利用4-位溴和5-位硝基的活泼性不同，合成出系列对称或不对称的化合物(I)。
本发明的构思在于萘酰亚胺类化合物是一类性能优良的荧光化合物，在其4，5位引入芳香性杂环取代基构造出特殊构型的有结合能力的空腔。由于位阻过大，在未结合金属离子时4，5位的基团相互排斥，方便离子的进入。由于空腔具有较强的刚性，底物一旦结合就很难离去。这种受体的柔性与刚性的完美结合，以及受体的特殊构型，提高了对金属离子识别的选择性。对于表1中化合物1-3，6-7，10而言，铜离子进入空腔与萘环上连接的两个氮原子发生弱键作用，导致了分子内电荷转移(ICT)，降低了其对萘环的供电能力。这种共轭体系中推-拉电子能力的改变必将导致吸收光谱和荧光光谱的变化。供电基团的供电能力下降将会使得吸收光谱和荧光光谱发生蓝移，这样就会产生不同波长处强度的变化，从而实现比率检测。如化合物(1)，未结合铜离子时最大荧光发射波长为525nm，一旦结合铜离子后波长蓝移至475nm，而且两波长处的荧光强度相当。而对于表1中化合物13-15等，未结合铜离子时由于发生光诱导电子转移(PET)，化合物荧光很弱。铜离子的结合将会抑制这一过程，从而使得荧光有增强的趋势。化合物13表现出非常优良的特性：结合铜离子后产生出590nm左右的长波荧光，这将十分有利于铜离子的检测。
本发明的荧光探针可以在缓冲液中高选择性的结合铜离子，荧光波长发生明显的位移(蓝移或红移)，从而实现比率荧光检测。
本发明的荧光探针对低pH有响应(pH＜4)，因此在弱酸、中性及碱性条件下可以排除质子的影响。
本发明的荧光探针合成简单，原料易得，而且具有很高的衍生性，比如酰胺部分可以非常容易的用包括水溶性的各种基团代替，4、5位的取代基也可以非常方便的更换成各种功能性受体。
本发明荧光化合物(I)能够在缓冲溶液中对铜离子作为比率荧光探针进行比率荧光检测，其应用条件是在乙醇∶水(体积比为4∶6，5mM HEPES，pH＝7.2)溶液中，探针浓度为1×10-5mol/L，铜离子浓度为0-5×10-5mol/L，未加铜离子前最大发射波长为525nm，随着铜离子的加入，475nm处的荧光强度I逐渐增大，而525nm处的荧光强度I逐渐减小，I475∶I525的比例与铜离子的加入量呈线性关系；当铜离子的浓度达到1×10-5mol/L时，变化趋于平衡，探针和铜离子呈1∶1结合；化合物(I)表现出作为比率荧光探针，对铜离子有高灵敏度和高选择性。Li1，Na1，K1，Mg11，Ca11，Zn11，Cd11，Hg11，Pb11离子的加入不能引起荧光的蓝移，Ag1的蓝移比Cu11小得多。
表1中表示Z为正丁基时，可以合成15个化合物。
【附图说明】
图1表示的是随着铜离子的加入探针(1)的荧光光谱变化，其中横坐标表示波长(nm)，纵坐标表示荧光强度；
图2表示的是475nm和525nm处荧光强度比率与加入铜离子浓度的关系，其中横坐标表示铜离子浓度，纵坐标表示475nm和525nm处荧光强度比率；
图3表示的是探针(1)对铜离子识别的选择性，其中横坐标表示其它竞争金属离子，纵坐标表示475nm和525nm处荧光强度比率。
本发明的创新点是：
1、设计、合成了能够比率检测铜离子的荧光探针系列化合物(I)，且具有很高的选择性和灵敏度，排除了诸如探针的光稳定性、探针的浓度、检测环境的温度和极性等多种因素的干扰，是未见报导的检测铜离子比率荧光探针。
2、该比率荧光探针是在缓冲溶液中实现了对铜离子的比率检测，可将其应用领域拓展到水相系统，在细胞、膜等生物微环境、环境科学、医药的分析检验中，具有重要实用价值。
3、该类化合物结构新颖，合成方法简单，性能优越，具有广泛的应用前景。
【具体实施方式】
实施例1
在一个25ml的烧瓶中加入0.1g(0.31mmol)4-溴-5-硝基-1，8-萘酐，加入10ml乙醇加热至回流，片刻后冷却到50℃，慢慢滴加入0.0227g丁胺(0.31mmol)的5ml乙醇溶液，原来还是有些混浊的溶液一下子变得澄清，颜色也加深，变为红色。加热继续回流，40min后TLC板跟踪反应结束。减压蒸馏掉乙醇后，硅胶柱分离，CHCl3洗脱。乙醇重结晶，最终得到产品为白色针状晶体，重47mg，收率为40.2％。溶点175.8-176.2℃。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ 0.99(t，J＝7.2Hz，3H)，1.45(m，J＝7.2Hz，2H)，1.71(m，J＝7.2Hz，2H)，4.18(t，J＝7.2Hz，2H)，7.93(d，J＝8.0Hz，1H)，8.21(d，J＝8.0Hz，1H)，8.51(d，J＝8.0Hz，1H)，8.71(d，J＝8.0Hz，1H).13C-NMR(CDCl3，100MHz)，δ13.95，20.49，30.21，40.92，122.69，123.72，124.26，125.99，131.37，132.49，136.14，162.21，162.98.IR(KBr，cm-1)：3057，2963，2935，2912，2860，1706，1568，1541，1230，658，586.HRMS(EI)calcd for C16H13BrN2O4，[M]376.0059，found 376.0075.
实施例2
在一个25ml的烧瓶中加入100mg(0.266mmol)N-丁基4-溴-5-硝基-1，8-萘酰亚胺，加入10ml乙二醇单甲醚溶解，滴加入N-苯基-乙二胺0.15ml(1.05mmol)，加热。4min后反应结束。倒入水中，二氯甲烷萃取，色谱柱提纯，得到黄色固体，收率为87％。熔点186.2-187.5℃。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：δ0.946-0.983(t，J＝7.6Hz，3H)，1.401-1.458(m，J＝7.6Hz，2H)，1.654-1.711(m，J＝7.6Hz，2H)，3.640(br，4H)，4.111-4.149(t，J＝7.6Hz，2H)，6.714-6.834(br，4H)，7.221-7.262(t，J＝8Hz，3H)，7.752-7.771(d，J＝7.6Hz，1H)，7.826(s，N-H)，8，264-8.284(d，J＝8Hz，1H)，8.425-8.446(d，J＝8Hz，1H)。
实施例3
将120mg以上的产品溶于10ml乙二醇单甲醚，再加入1ml N-苯基乙二胺，回流至反应结束。倒入水中，二氯甲烷萃取，色谱柱提纯，得到黄色固体，称重136mg，收率为74％。熔点203.5-204.1℃。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ0.936-0.972(t，J＝7.2Hz，3H)，1.395-1.450(m，J＝7.2Hz，2H)，1.669-1.704(m，J＝7.2Hz，2H)，3.351-3.425(dd，J＝5.2Hz，4H)4.104-4.140(t，J＝7.2Hz，2H)，6.195(s，N-H)，6.538-6.559(d，J＝8.4Hz，1H)，6.672-6.692(d，J＝8.4Hz，4H)，6.766-6.803(t，J＝7.6Hz，2H)，7.191-7.230(d，J＝7.6Hz，4H)，8.265-8.286(d，J＝8.4Hz，2H)。13C-NMR(CDCl3，400MHz)：δ14.060，20.671，30.608，40.028，43.474，44.036，107.252，113.590，119.010，129.797，132.26，133.615，147.893，152.205，164.661。HRMS(EI)calcd for C32H35N5O2[M]521.2791，found 521.2779。
实施例4
操作方法参见实施例3。熔点212.7-213.8℃。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：δ0.936-0.973(t，J＝7.2Hz，3H)，1.399-1.454(m，J＝7.2Hz，2H)，1.653-1.711(m，J＝7.2Hz，2H)，3.593(2H)，3.693-3.706(d，2H)，4.106-4.143(t，J＝7.6Hz，2H)，4.647(s，1H)，6.665-6.809(m，5H)，7.134-7.171(t，J＝7.6Hz，2H)，7.339-7.352(d，J＝5.2Hz，1H)，7.438-7.458，(d，J＝8Hz，1H)，7.816-7.853(t，J＝7.6Hz，1H)，8.397-8.435(t，J＝7.6Hz，2H)，8.631-8.643(d，J＝4.8Hz，1H)。APCI(Positive)[M+H]m/z＝494.5。
实施例5
在5ml的单口梨形瓶中加入3ml乙醇单甲醚，加入53mg N-丁基-4-溴-5-硝基-1，8-萘酰亚胺溶解，温热下加入0.3ml 2-胺甲基吡啶，回流至反应结束。倒入水中，二氯甲烷萃取，色谱柱提纯，得到黄色固体，重56mg，收率为85％。熔点179.5-179.9℃。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ 0.95(t，J＝7.6Hz，3H)，1.44(m，J＝7.6Hz，2H)，1.69(m，J＝7.6Hz，2H)，4.14(t，J＝7.6Hz，2H)，4.66(s，4H)，6.78(d，J＝8.4Hz，2H)，7.19(t，J＝7.2Hz，2H)，7.40(d，J＝7.6Hz，2H)，7.62(S，N-H)，7.69(t，J＝7.2Hz，2H)，8.32(d，J＝8.4Hz，2H)，8.42(d，J＝8.4Hz，2H)13C-NMR(CDCl3，100MHz)：δ14.09，20.65，30.55，39.97，49.36，105.98，107.24，112.38，122.16，122.77，133.87，137.24，147.75，149.06，151.93，156.31，164.83.IR(KBr，cm-1)：3328，3043，2953，2869，1673，1633，1592，1541，1508，1310，996.HRMS(ESI)calcd for C28H28N5O2[MH]466.2243，found 466.2247。
实施例6
操作方法同实施例5。熔点217.3-219.1℃。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：δ0.94(t，J＝7.6Hz，3H)，1.38(m，J＝7.6Hz，2H)，1.65(m，J＝7.6Hz，2H)，4.12(t，J＝7.6Hz，2H)，4.41(s，4H)，6.22(s，2H)，6.35(s，2H)，6.81(d，J＝8.4Hz，2H)，7.26(s，N-H)，7.37(s，2H)，8.41(d，J＝8.4Hz，2H)，8.42(d，J＝8.4Hz，2H)13C-NMR(CDCl3，100MHz)：δ13.906，20.465，30.325，39.867，42.509，107.987，108.579，110.507，110.591，113.475，132.101，133.454，142.616，150.480，151.217，164.470。IR(KBr，cm-1)：3329，3041，2951，2869，1673。HRMS(ESI)calcd for C26H25N3O4[MH]444.1923，found 444.1938。
实施例7
操作方法同实施例5。熔点112.4-114.1℃。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：δ0.94(t，J＝7.6Hz，3H)，1.40(m，J＝7.6Hz，2H)，1.66(m，J＝7.6Hz，2H)，4.11(t，J＝7.6Hz，2H)，4.58(s，4H)，6.82(d，J＝8.4Hz，2H)，6.96(m，4H)，7.22(m，2H)，8.41(d，J＝8.4Hz，2H)。13C-NMR(CDCl3，100MHz)：δ14.082，20.641，30.494，40.051，44.423，108.322，113.590，125.796，126.548，127.277，133.661，139.961，150.490，151.233，164.623。IR(KBr，cm-1)：3327，3043，2953，2869，1674，1635。HRMS(ESI)calcd for C26H25N2O2S2[MH]476.1466，found 476.1476。
实施例8
化合物(1)在乙醇∶水(体积比为4∶6，50mM HEPES，pH＝7.2)溶液中对铜离子可以做到比率荧光检测。探针浓度为1×10-5mol/L，铜离子浓度为0-5×10-5mol/L。未加铜离子时最大发射波长为525nm，随着铜离子的加入，475nm处的荧光强度逐渐增大，而525nm处的荧光强度逐渐减小，前者与后者的比例，即I475∶I525，与铜离子的加入量呈线性关系，从而可以实现比率检测。铜离子的浓度达到1×10-5mol/L以后，变化趋于平衡，这说明探针和铜离子呈1∶1结合。同时，探针(I)表现了很好的选择性：Li1，Na1，K1，Mg11，Ca11，Zn11，Cd11，Hg11和Pb11的加入并不能引起荧光的蓝移，Ag1的加入虽然也能引起荧光的蓝移，但是I475∶I525与加入Cu11相比要小得多。
需要说明的是：1、其他化合物均可参照上述方法合成；2、取代基Z为其中任何一种，便代表15种化合物。以Z为正丁基为例，15种化合物列于表1：
表1 化合物 X取代基 Y取代基 1 R1 R1 2 R1 R2 3 R1 R3 4 R1 R4 5 R1 R5 6 R2 R2 7 R2 R3 8 R2 R4 9 R2 R5 10 R3 R3 11 R3 R4
12 R3 R5 13 R4 R5 14 R4 R5 15 R5 R5