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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610010187.2 (22)申请日 2016.01.07 (83)生物保藏信息 CGMCC No.11723 2015.11.23 (71)申请人 南京农业大学 地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇 国家农业科技园南京农业大学基地 (72)发明人 别小妹高玲陆兆新吕凤霞 张充赵海珍 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 傅婷婷徐冬涛 (51)Int.Cl. C12N 1/21(2006.01) C12N 15/75(2006.。
2、01) C12P 21/02(2006.01) C07K 7/06(2006.01) A01N 63/02(2006.01) A01P 3/00(2006.01) A23L 3/3463(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称 一种Plipastatin衍生环五脂肽及其产生菌 和应用 (57)摘要 本发明公开了一种Plipastatin衍生环五脂 肽及其产生菌和应用。 产Plipastatin衍生环五 脂肽的枯草芽孢杆菌Best2， 通过同源重组的方 法靶向缺失枯草芽孢杆菌pB2-L基因组中的ppsC 和ppsD基因， 获得缺失ppsC和ppsD基因的枯草芽。
3、 孢杆菌Best2。 在改良的Landy培养基中对枯草芽 孢杆菌Best2进行发酵， 获得含Plipastatin衍生 环五脂肽的发酵液， 对发酵液进行分离纯化， 获 得含Plipastatin衍生环五脂肽粗提物。 该新型 的plipastatin衍生环五脂肽不仅对丝状真菌仍 然具有一定的抑菌活性， 并且对革兰氏阳性菌的 抑菌活性有所提高。 权利要求书2页 说明书6页 序列表4页 附图3页 CN 105754917 A 2016.07.13 CN 105754917 A 1.一种产Plipastatin衍生环五脂肽的枯草芽孢杆菌Best2， 其特征在于通过同源重组 的方法靶向缺失保藏号为CGM。
4、CCNo.11723的枯草芽孢杆菌pB2-L基因组中的ppsC和ppsD基 因， 获得缺失ppsC和ppsD基因产Plipastatin衍生环五脂肽的枯草芽孢杆菌Best2。 2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Best2， 其特征在于通过以下方法构建： (1)构建缺失ppsC和ppsD基因的敲除质粒pKS-CD： a.根据NCBI数据库设计如下引物： P1： SEQIDNO.1， P2： SEQIDNO.2， P3： SEQIDNO.3， P4： SEQIDNO.4； b.以B.subtilispB2-L基因组为模板， 用引物P1、 P2和引物P3、 P4分别扩增上下游片 段， 再以上、 下。
5、游片段为模板， 在反应体系中加入P1、 P4进行融合PCR反应， 获得敲除基因片 段CD； c.用限制性内切酶对敲除基因片段CD和质粒pKS2进行酶切， 并通过连接反应将敲除基 因片段插入质粒pKS2获得pKS-CD； (2)重组质粒pKS-CD转化保藏号为CGMCCNo.11723的枯草芽孢杆菌pB2-L感受态细胞， 获得含有敲除质粒pKS-CD的枯草芽孢杆菌； (3)缺失了ppsC和ppsD基因的敲除菌株的筛选和鉴定： 用经转化的含敲除质粒pKS-CD 的枯草芽孢杆菌进行37温度诱导重组， 筛选出LB固体培养基平板上红霉素敏感的单菌 落， 提取其基因组， 运用PCR方法验证敲除基因片段， 。
6、并通过测序进一步确认为敲除菌株， 该 敲除菌株即为所述的产Plipastatin衍生环五脂肽的枯草芽孢杆菌Best2。 3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Best2在制备Plipastatin衍生环五脂肽中的应用。 4.一种利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Best2制备Plipastatin衍生环五脂肽的方 法， 其特征在于包含在改良的Landy培养基中对枯草芽孢杆菌Best2进行发酵， 获得含 Plipastatin衍生环五脂肽的发酵液， 对发酵液进行分离纯化， 获得含Plipastatin衍生环 五脂肽粗提物。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于包含以下步骤： a.将枯草芽孢杆菌Be。
7、st2进行培养， 得到抗菌物质发酵液； b.抗菌物质发酵液离心， 收集上清液， 酸沉， 将沉淀进行甲醇抽提， 得抗菌提取物； c.抗菌提取物通过LC-ESI-MS/MS分离鉴定Plipastatin衍生环五脂肽。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于包括下列步骤： a.将枯草芽孢杆菌Best2进行培养， 得到抗菌物质发酵液 将枯草芽孢杆菌Best2接种于试管斜面PDA琼脂培养基上， 37培养24h， 将菌种活化； 再将试管斜面活化的枯草芽孢杆菌Best2菌种接种于LB液体培养基， 337， 180rmin-1培 养18h至对数生长期， 得到发酵种子液； 将枯草芽孢杆菌Best2种子液以5。
8、浓度接种至改良 的Landy培养基中， 33， 180rmin-1培养72h， 得到发酵液； 其中， 改良的Landy培养基组分 40.0gL-1葡萄糖， 14.0gL-1L-谷氨酸钠， 2.3gL-1(NH4)2SO4， 1.0gL-1K2HPO4， 0.5gL- 1MgSO4， 0.5gL-1KCl， 1.6mgL-1CuSO4， 1.2mgL-1Fe2(SO4)3， 0.4mgL-1MnSO4， 100mM3-N- 玛啡啉丙磺酸(MOPS)构成的， pH7.07.2； b.抗菌物质发酵液离心， 收集上清液， 酸沉， 将沉淀进行甲醇抽提， 得抗菌提取物： 取上述发酵液在5000r/min下。
9、离心15min除去菌体， 上清液调pH至2.0， 低温过夜， 5000r/min离心20min取沉淀， 用甲醇溶解， 调节pH至7.0， 于磁力搅拌器上低温搅拌5h， 权利要求书 1/2 页 2 CN 105754917 A 2 10000r/min离心10min后得到的上清液即为Plipastatin衍生环五脂肽粗提物； c.抗菌提取物通过LC-ESI-MS/MS分离鉴定Plipastatin衍生环五脂肽： 枯草芽孢杆菌Best2产抗菌物质采用液相色谱-傅里叶变换离子回旋共振高分辨质谱 仪测定其分子量和鉴定其结构， 其条件为： 质谱柱： C18-MS-2.6mm250mm， TSK； 柱温：。
10、 25； 进样体积： 10 L； 流动相为A相： 乙腈+0.1甲酸和B相： 水+0.1甲酸， 流速为0.2mL/ min， 梯度洗脱条件为： 0-20min， A相5-95， B相95-5； 20-22min， A相95-100， B相5-0， ESI离子源， 采用正离子检测模式， 喷雾电压3.5kV； 毛细管温度275； 鞘气(N2)流速35arb； 辅助气(N2)流速10arb； 扫尾气(N2)流速3arb； 管状透镜： 110V； 碰撞能量35V； 扫描范围100 2000u； 扫描方式： LTQ采用全扫描方式； m/z903.58和m/z875.55、 m/z889.56对应的物质即 。
11、为Plipastatin衍生环五脂肽及同系物。 7.按照权利要求46中任一项所述的方法获得的Plipastatin衍生环五脂肽或其粗提 物。 8.根据权利要求7所述的Plipastatin衍生环五脂肽或其粗提物， 其特征在于所述的 Plipastatin衍生环五脂肽包括分子量为875.55、 889.56和903.58的3种组分。 9.权利要求7所述的Plipastatin衍生环五脂肽或其粗提物在制备抑制丝状真菌和/或 革兰氏阳性细菌的制剂中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于权利要求7所述的Plipastatin衍生环五脂 肽或其粗提物在制备抑制丝状真菌和/或革兰氏阳性细菌。
12、的生物农药、 食品防腐剂或生防 试剂中的应用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105754917 A 3 一种Plipastatin衍生环五脂肽及其产生菌和应用 技术领域 0001 本发明属于分子生物学和基因工程领域， 涉及一种Plipastatin衍生环五脂肽及 其产生菌和应用。 背景技术 0002 很多微生物产生的次级代谢产物中含有一类分子量较小、 成环的短肽骨架和 -羟 基脂肪酸链尾构成的脂肽抗菌物质， 除了具有良好的表面活性和抗菌活性， 还具有抗肿瘤、 抗病毒、 抗感染等生物功效以及其他药理活性； 另外脂肽及其衍生物结构多种多样， 因而极 大地拓宽和丰富了药物筛选来源的天然化合物库。
13、， 在创制新型有效药物方面具有潜在的价 值。 0003 Plipastatin是导入了有功能活性的sfp基因的Bacillussubtilis168菌株产生 的一种与Fengycin结构和性质非常类似的物质， 也归于Fengycin家族； 是由1418个碳原 子组成的 -羟基脂肪酸和成环十肽两部分组成， 微生物发酵产生的Plipastatin是多种同 系物组成的混合物； Plipastatin对丝状真菌显示了良好的抑菌活性， 而对酵母和细菌没有 作用。 0004 Plipastatin是由Plipastatin合成酶通过 “多载体巯基化模板机制” 合成的一类 非核糖体肽； 枯草芽孢杆菌Plip。
14、astatin合成酶基因簇包含5个ORF， 分别编码Plipastatin 合成酶的五个酶亚基， 在基因簇中呈线性排列， 分别是ppsA、 ppsB、 ppsC、 ppsD和ppsE； 随着 组合生物学的发展， 本发明将在基因层面将Plipastatin合成酶系进行重新组合， 构建杂合 的Plipastatin合成酶， 利用该杂合酶系产生天然活性物质， 在完善微生物药物创制等方面 提供了不同于化学合成的全新思路和策略。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种产Plipastatin衍生环五脂肽的枯草芽孢杆菌Best2。 0006 本发明的另一目的是提供制备Plipastatin衍生环五脂肽。
15、的方法及获得的 Plipastatin衍生环五脂肽。 0007 本发明的又一目的是提供Plipastatin衍生环五脂肽的应用。 0008 一种产Plipastatin衍生环五脂肽的枯草芽孢杆菌Best2， 通过同源重组的方法靶 向缺失保藏号为CGMCCNo.11723的枯草芽孢杆菌pB2-L基因组中的ppsC和ppsD基因， 获得 缺失ppsC和ppsD基因产Plipastatin衍生环五脂肽的枯草芽孢杆菌Best2。 0009 所述的枯草芽孢杆菌Best2， 优选通过以下方法构建： 0010 (1)构建缺失ppsC和ppsD基因的敲除质粒pKS-CD： 0011 a.根据NCBI数据库设计。
16、如下引物： 0012 P1： SEQIDNO.1， P2： SEQIDNO.2， P3： SEQIDNO.3， P4： SEQIDNO.4； 0013 b.以B.subtilispB2-L基因组为模板， 用引物P1、 P2和引物P3、 P4分别扩增上下游 片段， 再以上、 下游片段为模板， 在反应体系中加入P1、 P4进行融合PCR反应， 获得敲除基因 说明书 1/6 页 4 CN 105754917 A 4 片段CD； 0014 c.用限制性内切酶对敲除基因片段CD和质粒pKS2进行酶切， 并通过连接反应将敲 除基因片段插入质粒pKS2获得pKS-CD； 0015 (2)重组质粒pKS-CD。
17、转化保藏号为CGMCCNo.11723的枯草芽孢杆菌pB2-L感受态 细胞， 获得含有敲除质粒pKS-CD的枯草芽孢杆菌； 0016 (3)缺失了ppsC和ppsD基因的敲除菌株的筛选和鉴定： 用经转化的含敲除质粒 pKS-CD的枯草芽孢杆菌进行37温度诱导重组， 筛选出LB固体培养基平板上红霉素敏感的 单菌落， 提取该基因组， 运用PCR方法验证敲除基因片段， 并通过测序进一步确认为敲除菌 株， 该敲除菌株即为所述的产Plipastatin衍生环五脂肽的枯草芽孢杆菌Best2。 0017 本发明所述的枯草芽孢杆菌Best2在制备Plipastatin衍生环五脂肽中的应用。 0018 一种利用。
18、所述的枯草芽孢杆菌Best2制备Plipastatin衍生环五脂肽的方法， 包含 在改良的Landy培养基中对枯草芽孢杆菌Best2进行发酵， 获得含Plipastatin衍生环五脂 肽的发酵液， 对发酵液进行分离纯化， 获得含Plipastatin衍生环五脂肽粗提物。 0019 所述的利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Best2制备Plipastatin衍生环五脂肽 的方法， 优选包含以下步骤： 0020 a.将枯草芽孢杆菌Best2进行培养， 得到抗菌物质发酵液； 0021 b.抗菌物质发酵液离心， 收集上清液， 酸沉， 将沉淀进行甲醇抽提， 得抗菌提取物； 0022 c.抗菌提取物通过LC。
19、-ESI-MS/MS分离鉴定Plipastatin衍生环五脂肽。 0023 所述的利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Best2制备Plipastatin衍生环五脂肽 的方法， 进一步优选包括下列步骤： 0024 a.将枯草芽孢杆菌Best2进行培养， 得到抗菌物质发酵液 0025 将枯草芽孢杆菌Best2接种于试管斜面PDA琼脂培养基上， 37培养24h， 将菌种活 化； 再将试管斜面活化的枯草芽孢杆菌Best2菌种接种于LB液体培养基， 337， 180rmin-1 培养18h至对数生长期， 得到发酵种子液； 将枯草芽孢杆菌Best2种子液以5浓度接种至改 良的Landy培养基中， 33， 1。
20、80rmin-1培养72h， 得到发酵液； 其中， 改良的Landy培养基组 分40.0gL-1葡萄糖， 14.0gL-1L-谷氨酸钠， 2.3gL-1(NH4)2SO4， 1.0gL-1K2HPO4， 0.5g L-1MgSO4， 0.5gL-1KCl， 1.6mgL-1CuSO4， 1.2mgL-1Fe2(SO4)3， 0.4mgL-1MnSO4， 100mM3- N-玛啡啉丙磺酸(MOPS)构成的， pH7.07.2； 0026 b.抗菌物质发酵液离心， 收集上清液， 酸沉， 将沉淀进行甲醇抽提， 得抗菌提取物： 0027 取上述发酵液在5000r/min下离心15min除去菌体， 上清。
21、液调pH至2.0， 低温过夜， 5000r/min离心20min取沉淀， 用甲醇溶解， 调节pH至7.0， 于磁力搅拌器上低温搅拌5h， 10000r/min离心10min后得到的上清液即为Plipastatin衍生环五脂肽粗提物； 0028 c.抗菌提取物通过LC-ESI-MS/MS分离鉴定Plipastatin衍生环五脂肽： 0029 枯草芽孢杆菌Best2产抗菌物质采用液相色谱-傅里叶变换离子回旋共振高分辨 质谱仪测定其分子量和鉴定其结构， 其条件为： 质谱柱： C18-MS-2.6mm250mm， TSK； 柱 温： 25； 进样体积： 10 L； 流动相为A相： 乙腈+0.1甲酸和B。
22、相： 水+0.1甲酸， 流速为 0.2mL/min， 梯度洗脱条件为： 0-20min， A相5-95， B相95-5； 20-22min， A相95-100， B相 5-0， ESI离子源， 采用正离子检测模式， 喷雾电压3.5kV； 毛细管温度275； 鞘气(N2)流速 35arb； 辅助气(N2)流速10arb； 扫尾气(N2)流速3arb； 管状透镜： 110V； 碰撞能量35V； 扫描范 说明书 2/6 页 5 CN 105754917 A 5 围1002000u； 扫描方式： LTQ采用全扫描方式； m/z903.58和m/z875.55、 m/z889.56对应 的物质即为Pli。
23、pastatin衍生环五脂肽及同系物。 0030 按照本发明所述的方法获得的Plipastatin衍生环五脂肽或其粗提物。 所述的 Plipastatin衍生环五脂肽包括分子量为875.55、 889.56和903.58的3种组分。 0031 本发明所述的Plipastatin衍生环五脂肽或其粗提物在制备抑制丝状真菌和/或 革兰氏阳性细菌的制剂中的应用； 优选在制备抑制丝状真菌和/或革兰氏阳性细菌的生物 农药、 食品防腐剂或生防试剂中的应用。 0032 本发明的有益效果 0033 本发明利用同源重组的方法， 对Plipastatin合成酶系进行改造， 通过敲除pps操 纵子中ppsC和ppsD。
24、基因， 获得了敲除菌株Best2； 该敲除菌株的pps操纵子仅是由三个开放 阅读框ppsA、 ppsB和ppsE组成， 其编码的新合成酶系， 无法合成脂肽Plipastatin， 但是能够 合成由16-18个碳原子组成的 -羟基脂肪酸和成环五肽两部分组成的新脂肽； 该新型的 plipastatin衍生环五脂肽是首次改造成功产物， 不仅对丝状真菌(以尖孢镰刀菌为例)仍 然具有一定的抑菌活性， 并且对革兰氏阳性菌(以金黄色葡萄球菌为例)的抑菌活性有所提 高。 0034 本发明采用的基因无痕敲除方法， 获得的枯草芽孢杆菌Best2无抗性基因标记， 具 有传代遗传稳定性， 其菌落形态与原始菌株无明显差。
25、别， 该菌株可以作为基因工程的受体 菌株使用， 通过组合生物学的方法进一步研究Plipastatin合成酶的结构与功能。 附图说明： 0035 图1为敲除质粒pKS-CD示意图； 0036 图2为同源重组原理示意图； 0037 图3为融合PCR琼脂糖凝胶电泳图； 0038 图4为新型plipastatin衍生环五脂肽的ESI-MS图； 0039 图5环五脂肽m/z903.58作为前导子的CID图谱及其分子结构与离子碎片分析图； 0040 图6为敲除菌株Best2环五脂肽的抑菌活性测定 0041 生物材料保藏信息： 0042 pB2-L， 分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，。
26、 保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心， 保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院 微生物研究所， 保藏编号为CGMCCNo.11723， 保藏日期为2015年11月23日。 具体实施方式 0043 以下通过实施例来进一步阐述本发明， 下列实施例中未注明具体条件的实验方 法， 基本上都按照常见的分子克隆手册进行实验操作。 0044 实施例1： CD敲除基因片段的获得 0045 根据NCBI数据库提供的B.subtilis168全基因组序列， 选取的同源臂分别为上游 同源臂1422bp(1983998至1982577)和下游同源臂945bp(1964049至19631。
27、05)。 该成功案例 的具体实施步骤如下： 0046 首先， 根据Prime5.0软件设计引物 说明书 3/6 页 6 CN 105754917 A 6 0047 P1： GTCGACGTCGAAGGCGAGATTACTTGGACAC(SEQIDNO.1) 0048 P2： CATAGTGTCTGCACCTTTCTTCACCTATAGTTTGTTGACGGCTCCCATG(SEQIDNO.2) 0049 P3： CATGGGAGCCGTCAACAAACTATAGGTGAAGAAAGGTGCAGACACTATG(SEQIDNO.3) 0050 P4： GGTACCTTTAATTCGAATCGGT。
28、ATGGT(SEQIDNO.4) 0051 引物P15 端引入Sal酶切位点； 引物P45 端引入Kpn酶切位点。 以B.subtilispB2- L基因组为模板， 用引物P1、 P2和P3、 P4分别扩增上下游片段。 切胶纯化。 再以上、 下游片段为 模板， 反应体系中加入P1、 P4进行融合PCR反应， 获得CD基因敲除片段， 各PCR产物琼脂糖凝 胶电泳见图3， M为1kbladderMarker， 1号泳道为上游同源臂， 2号泳道为下游同源臂， 3号 泳道为融合PCR产物。 将基因克隆到pMD19-T载体上， 测序。 0052 实施例2： 敲除质粒的构建 0053 用限制性内切酶Sal。
29、和Kpn对CD基因敲除片段和质粒pKS2(该质粒全序列如SEQ IDNO.5所示， 杨慧林,王坤,廖瑜玲,王斌,林影,潘力.解淀粉芽孢杆菌ptsGHI基因的敲除及 缺陷株生长特性J.华南理工大学学报(自然科学版),2012,08:95-100)进行酶切， 试剂盒 回收后， 使用T4连接酶连接， 转化DH5 感受态， 挑取阳性转化子， 提取质粒， 测序验证， 结果 表明连接成功。 获得质粒pKS-CD。 0054 实施例3： 敲除质粒pKS-CD转化B.subtilispB2-L 0055 与国内外文献报道的枯草芽孢杆菌168的化学转化方法相似， 具体成功实施例如 下： 0056 (1)将出发菌。
30、株B.subtilispB2-L在LB培养基上37划线， 培养2d； 0057 (2)挑取单菌落接种于10mLGM 溶液中， 30、 100rmin-1过夜培养； 0058 (3)细胞培养物按1:10(体积比)转接于GM 溶液中， 37， 200rmin-1， 培养3.5h； 0059 (4)细胞培养物再次按1:10(体积比)转接于GM 溶液中， 30， 100rmin-1， 培养 90min； 0060 (5)取出细胞培养物， 5000rmin-1， 离心10min收集细胞， 保留上清液， 按1:10(体 积比)用上清液重悬细胞， 每管200 L分装菌体， 现做现用。 0061 (6)将约1。
31、 g质粒pKS-CD加入200 L现制备好的感受态细胞中， 30， 80rmin-1培 养2040min； 均匀涂布于含有10 g/mL红霉素的LB固体培养基平板， 30静置培养36 48h获得含有敲除质粒pKS-CD的枯草芽孢杆菌。 0062 其中， GM ： 10Tbaase100mL， 100gL1葡萄糖50mL， 50gL-1酵母膏20mL， 10gL-1酸水解酪蛋白20mL， 2.5gL-1色氨酸20mL， 加水至1000mL； 0063 GM ： 10Tbaase100mL， 100gL-1葡萄糖50mL， 50gL-1酵母膏0.4mL， 10gL-1 酸水解酪蛋白5mL， 0.5。
32、molL-1MgCl25mL， 0.05molL-1CaCl210mL， 加水至1000mL； 0064 10Tbaase： (NH4)2SO420.0g， K2HPO4140.0g， KH2PO460.0g， Na3C6H5O72H2O 10.0g， MgSO47H2O2.0g， 加水至1000mL； 0065 GM 、 GM 中的各组分分开灭菌， 用时按比例混匀， 其中氨基酸通过滤除菌， 葡萄糖 115灭菌30min， 其余皆121灭菌20min。 0066 实施例4： 缺失了基因ppsC和ppsD的敲除菌株的筛选和鉴定 0067 (1)将含有敲除质粒pKS-CD的枯草芽孢杆菌菌株接种至2。
33、0mLLB液体培养基中37 ， 180rmin-1培养24h， 稀释涂布于含有10 g/mL红霉素的LB固体培养基平板， 37静置培 说明书 4/6 页 7 CN 105754917 A 7 养过夜； 0068 (2)挑取单菌落接种于20mLLB液体培养基中30， 180rmin-1培养48h， 稀释涂布 于LB固体培养基平板， 37静置培养过夜； 0069 (3)筛选出LB固体培养基平板上红霉素敏感的单菌落， 并提取基因组作为模板， 使 用引物P1和P4PCR获得敲除基因片段CD， 纯化后， 测序， 鉴定为缺失了基因ppsC和ppsD的枯 草芽孢杆菌， 以下简称敲除菌株Best2。 0070。
34、 实施例5： 新型Plipastatin衍生环五脂肽的生产和分子结构鉴定 0071 (1)将敲除菌株Best2单菌落接种于LB培养基中， 37， 180rmin-1培养18h， 得到 发酵种子液； 0072 (2)将发酵种子液转接至改良的Landy培养基中， 33， 180rmin-1培养72h， 得到 发酵液； 改良的Landy培养基组分40.0gL-1葡萄糖， 14.0gL-1L-谷氨酸钠， 2.3gL-1 (NH4)2SO4， 1.0gL-1K2HPO4， 0.5gL-1MgSO4， 0.5gL-1KCl， 1.6mgL-1CuSO4， 1.2mgL-1Fe2 (SO4)3， 0.4mg。
35、L-1MnSO4， 100mM3-N-玛啡啉丙磺酸(MOPS)构成的， pH7.07.2。 0073 (3)将发酵离心5000g， 15min， 收集上清液， 并用6NHCl酸沉(pH2.0)处理过夜， 离心收集沉淀， 沉淀用甲醇复溶， 调节pH7.0， 获得抗菌粗提液； 0074 将抗菌粗提液经过0.45 m滤膜处理后， 采用液相色谱-傅里叶变换离子回旋共振 高分辨质谱仪(LC-FTICR-MS)测定抗菌粗提液中理论预测的新型Plipastatin衍生脂肽的 分子量并鉴定其分子结构。 0075 (4)LC-ESI-MS/MS条件： 0076 a)质谱柱： C18-MS-2.6mm250mm，。
36、 TSK； 0077 b)柱温： 25； 0078 c)进样体积： 10 L； 0079 流动相为乙腈+0.1甲酸(A)和水+0.1甲酸(B)， 流速为0.2mL/min， 梯度洗脱条 件为： 0-20min， A5-95， B95-5； 20-22min， A95-100， B5-0。 0080 ESI离子源， 采用正离子检测模式； 喷雾电压3.5kV； 毛细管温度275； 鞘气(N2)流 速35arb； 辅助气(N2)流速10arb； 扫尾气(N2)流速3arb； 管状透镜： 110V； 碰撞能量35V； 扫描 范围1002000u； 扫描方式： LTQ采用全扫描方式。 0081 (5)图。
37、4为敲除菌株Best2产环五脂肽的ESI-MS图， 从图4中可以看出， m/z875.55、 m/z889.56和m/z903.58与理论预测的环五脂肽同系物的质荷比一致， 且同系物之间的分 子量均相差14Da； 为了进一步确定该脂肽的结构， 选择了m/z903.58为前导子进行CID分 析， 从图5中获得的离子碎片与其预测的环五脂肽分子结构相吻合， 由此可以推断m/z 903.58的物质正是预测的环五脂肽。 同理可知， m/z875.55和m/z889.56分别为其同系物。 0082 实施例6敲除菌株Best2产新型Plipastatin衍生环五脂肽的抑菌试验 0083 1)抑菌试验采用的细。
38、菌指示菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus AS1.2465)， LB培养基， 37培养； 真菌指示菌： 尖镰孢菌黄瓜专化型(Fusariumoxysporum f.sp.cucumerinum37438)， PDA培养基， 28培养； 均购自中国科学院微生物研究所菌种保 藏中心。 0084 2)细菌抑菌试验方法： 将培养到对数期的细菌用无菌生理盐水稀释到106cfu/L， 取1.0mL菌液混入LB琼脂培养基中， 倾倒入培养皿中待其冷却后， 采用琼脂孔扩散法， 取100 说明书 5/6 页 8 CN 105754917 A 8 L样品加入琼脂孔中， 37培养过夜， 观察。
39、抑菌效果。 0085 3)真菌抑菌试验方法： 方法同细菌。 采用琼脂孔扩散法， 在PDA培养基中混入1.0mL 菌量为106cfu/L浓度的指示菌， 取100 L样品加入琼脂孔中， 28培养72h以上， 观察抑菌效 果。 0086 从图6中可以看出， 脂肽样品对尖孢镰刀菌存在明显的抑菌圈， 说明菌株Best2产 新型Plipastatin衍生环五脂肽对真菌仍然具有抑菌活性； 而对金黄色葡萄球菌的抑菌圈 直径要比原始菌株pB2-L的大， 表明菌株Best2产新型Plipastatin衍生环五脂肽后， 对金黄 色葡萄球菌抑菌活性有所提高。 0087 由于BacillussubtilisBest2产。
40、新型Plipastatin衍生环五脂肽对多种农作物 病害菌具有明显抑制作用， 表现出高效广谱的特性， 可开发成为新型的天然食品防腐剂及 生防试剂， 对于减少农作物病虫害等具有十分重要的价值。 说明书 6/6 页 9 CN 105754917 A 9 0001 序列表 1/4 页 10 CN 105754917 A 10 0002 序列表 2/4 页 11 CN 105754917 A 11 0003 序列表 3/4 页 12 CN 105754917 A 12 0004 序列表 4/4 页 13 CN 105754917 A 13 图1 图2 说明书附图 1/3 页 14 CN 105754917 A 14 图3 图4 说明书附图 2/3 页 15 CN 105754917 A 15 图5 图6 说明书附图 3/3 页 16 CN 105754917 A 16 。