技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种应用于基因治疗的重组单纯疱疹病毒遗传操作系统，该系统可广泛应用于复制缺陷型重组单纯疱疹病毒和选择复制型溶瘤单纯疱疹病毒的建立。
背景技术
基因治疗是近廿年来医学研究的热点领域。基因治疗就是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。与常规治疗方法不同：一般意义上的疾病治疗针对的是因基因异常而导致的各种症状，而基因治疗针对的是疾病的根源一异常的基因本身。目前已发现人类与疾病相关的基因约有5000多个，迄今已有1/3被分离和确认。因而，基因治疗将是医学和药学领域的一次革命，必将成为21世纪重要的医药产业。基因治疗的发展极其迅速，据统计，自1990年美国FDA正式批准第一个基因治疗临床试验开始，截止2009年3月，世界范围内已有1537个各期基因治疗临床研究方案(http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical/)，涵盖了遗传病(如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等)、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病(如艾滋病、类风湿等)等众多威胁严重人类健康的疾病。其中III期临床研究有52个，另外中国SFDA还在世界上首次批准了2个基因治疗新药上市。但是，总体上讲，基因治疗技术和产品还处在其发展的初期阶段，仍面临着诸多问题与挑战，其中最主要的挑战之一就是基因导入系统效率低下。发展新的基因导入系统是当前基因治疗的最重要研究方向之一。
目前，基因导入系统主要包括病毒载体系统和非病毒载体系统，其中病毒载体系统由于其天然的嗜细胞活性使之处于基因治疗导入系统的主导地位，占目前全体基因治疗临床方案的68.6％。由于技术原因，逆转录病毒(占21.2％)和腺病毒(占24.1％)一度分别成为最主要的基因导入系统。近年来，单纯疱疹病毒由于其卓越的性能正越来越受到基因治疗研究专家的重视。
单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)HSV分为I型和II型，其中被用作基因治疗载体通常是I型(HSV-1)。HSV-1是包膜双链DNA病毒，其基因组长为152kb，由2个相互连接的长节段(UL和短节段(US)组成，各节段末端为倒转重复序列。基因组编码84个基因，这些基因可根据他们在病毒复制过程中是否表达分为必需基因和非必需基因，不过非必需基因对于病毒-宿主的相互作用非常重要，如涉及到免疫逃逸、在非分裂细胞中复制或关闭宿主蛋白合成等功能。HSV-1生活周期包括裂解感染(Lytic infection)和潜伏期(Latency)。在裂解感染过程中，病毒基因的表达是有严格的时空顺序的，分为极早期基因(immediate-early gene，IE或α)、早期基因(Early gene，E或β)和晚期基因(Late gene，L或γ)，极早期基因包括ICPO、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47等5个感染细胞蛋白(infected cell protein，ICP)基因，其中ICP4和ICP27是必需基因。
HSV-1是基因治疗常用的、也是极其优秀的病毒载体，主要表现在：
(1)HSV-l的宿主细胞范围广，HSV-l的细胞进入受体HveA和HveC广泛表达于各种未知功能的细胞表面蛋白；
(2)感染效率高，即使在感染复数(MOI)很低的情况下，复制缺陷的HSV在体外仍然可以感染70％左右的细胞群体；
(3)可高效感染静息期和非静息期细胞，表达外源基因；
(4)容量大，可插入外源大片段，因为HSV-1基因组编码的基因中有一半是非必需基因，可被外源治疗基因所替换；
(5)可方便地制备和纯化高滴度的复制缺陷重组体，没有野生型病毒体的污染；
(6)可在神经元细胞内建立潜伏感染，持续稳定表达治疗基因；
(7)复制缺陷重组体进入细胞后可产生流产的基因表达级联链(abortive gene expression cascade)，建立类似于潜伏感染的状态，只不过不能被再激活，这有助于增强外源基因在神经元细胞和非神经元细胞中的慢性长期表达(chronic transgene expression)。
一般来说，可通过三种方式把HSV基因组改造为非致病性的基因治疗的载体：一是扩增子(Amplicons)载体，即仅把HSV的复制起点和包装信号序列插入到质粒中，当将其转染至包装细胞并以HSV辅助病毒超感染后，便可获得含有扩增子的假病毒；二是重组复制缺陷型载体(Replication-defective Vectors)，即剔除了与复制相关的必需基因及非必需基因，以减少细胞毒性，多用于在宿主神经元细胞内长期表达外源性治疗基因；三是条件复制型载体(Conditionally Replicating Vectors)，即剔除了非必需基因、保留了复制相关基因，因其具有裂解细胞的特性，主要作为溶瘤病毒来选择性杀伤肿瘤细胞。
溶瘤单纯疱疹病毒是目前研究得最多的溶瘤病毒之一，其原因在于溶瘤单纯疱疹病毒具有很多优势，除了上述单纯疱疹病毒的宿主细胞范围广、感染效率高的优势外，还在于：
(1)在感染的宿主细胞中，HSV-1的全部复制循环过程可在20小时内结束，释放出数千计的子代病毒颗粒；
(2)HSV-1病毒颗粒既能通过细胞膜融合进行直接的细胞-细胞传播，也能通过细胞外空间(extracellular space)进行传播，这对于溶瘤病毒尤其有用，因为低剂量的病毒就可以在实体瘤内实现高效的病毒侵入(Viral Penetration)；
(3)临床上有多种抗HSV-1的药物(如无环鸟苷、泛昔洛韦等)用于治疗HSV-1的感染，而HSV-1表达抗肿瘤自杀基因——胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-TK)。这就为HSV-TK的抗肿瘤作用提供了一个安全机制，因为可用药物关闭HSV-1的复制循环；
(4)HSV-1能有效感染多种实验动物，有利于建立动物模型，也便于把临床前研究结果平移到(translation)临床试验中。
然而，尽管HSV具有如此多的优势，但相对于腺病毒等而言，HSV基因治疗技术还是发展得较慢，截止2009年3月，以HSV为载体的基因治疗临床方案只有51个，占全部基因治疗方案的3.3％(http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical/)。这其中的主要原因是：HSV-1是基因组长达152kb的双链DNA病毒，而且有多个基因如ICP0、ICP4、ICP34.5等为双拷贝，因此要对HSV-1进行遗传操作就相对困难得多。不过，经过近30年的努力，HSV-1遗传操作的获得了很大的发展，总体而言涉及HSV-1的遗传操作的主要技术有：
(1)化学诱变：这是最早的对HSV-1进行遗传操作的方法，采用化学诱变剂进行随机突变并筛选预期表型，这种方法主要筛选到的是温度敏感型突变体(Temperature-sensitive Mutant)、细胞溶解抗性突变体(Cytolysis-resistant Mutant)、药物抗性突变体(Drug-resistant Mutants)。
(2)同源重组：这也是一种早期的HSV-1遗传操作技术，经细胞内同源重组直接将目的基因插人HSV骨架中，为便于筛选突变体，需要同时导入标记基因。本法若涉及必需基因(Essential Gene)突变，还需要同时构建包装细胞系。
(3)扩增子：所谓扩增子就是仅把HSV-1的DNA复制原点oriS和包装信号序列pac插入到细菌质粒中，当其与HSV-1辅助病毒共转染包装细胞时，可以串联体形式包装形成获得含有扩增子的假病毒。但辅助病毒会带来重组等安全性问题。扩增子载体最大的优点在于基本上消除了HSV-1的毒性或免疫原性，外源基因容量较大(通常可达数十kb，最高可达150kb)。
(4)COS系统：先把HSV-1基因组分别转载在一系列交互重叠的COS质粒(通常是5个或以上)中，然后根据需要用分子生物学技术对其中某一个特定的COS质粒做基因工程操作，交互重叠的COS质粒经线性化后共转染许可细胞(Permissive Cell)，从而经同源重组得到突变体。本法最大的优点在于只有突变体产生，没有野生型HSV-1的污染，但缺点在于通常在COS质粒中没有用于制造突变的合适的限制性内切酶位点可用，且某些COS质粒遗传不稳定并由此导致不必要的突变出现。
(5)BAC技术：细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosomes，BAC)技术是近年来发展起来的HSV-1遗传操作新技术，主要应用的是等位交换(Allelic Exchange)原理，其基本过程是：首先构建一个携带目的基因及同源臂的BAC质粒，与病毒基因组一起共转染细胞(如Vero)，经细胞内同源重组把BAC质粒插入病毒基因组中，然后提取可复制的重组病毒基因组环状中间体并转化E.coli，从而获得大量的HSV-BAC，在对HSV-BAC进行必要的遗传操作后转染Vero细胞，收获重组病毒。BAC技术最大的优点在于其包装容量大(可包装整个病毒基因组)、无需辅助病毒、遗传操作简单。BAC技术是目前HSV-1遗传操作的主流技术。
(6)嵌合病毒(Chimeric Virus)，亦称杂合病毒(Hybrid Virus)。HSV不能整合入宿主细胞染色体，因此只能短暂表达外源基因，最终在分裂细胞会导致丢失。嵌合病毒就能弥补这种缺憾，与HSV形成嵌合病毒通常是EBV、AAV和逆转录病毒等。
基于此，本发明就针对HSV-1的基因组大、遗传操作难度高的问题，设计并提供一种新的重组单纯疱疹病毒遗传操作系统，该系统是基于BAC质粒骨架建立的，并融合入了Cre-loxP、FLP-FRT等位点特异性重组酶系统，有效降低了单纯疱疹病毒遗传操作的难度，显著提高了其遗传操作的便利性和可操控性，可广泛应用于复制缺陷型重组单纯疱疹病毒和选择复制型溶瘤单纯疱疹病毒的建立。
发明内容
本发明主要目的是设计并建立一种新的重组单纯疱疹病毒遗传操作系统。应用该操作系统可以便捷、高效地对单纯疱疹病毒进行各种遗传操作，广泛地应用于建立各种复制缺陷型重组单纯疱疹病毒和选择复制型溶瘤单纯疱疹病毒。
本发明提供了一种重组单纯疱疹病毒遗传操作系统，包括HSV骨架载体和穿梭质粒；所述的HSV骨架载体包含HSV基因组DNA、BAC质粒骨架、多克隆位点、真核抗性基因以及原核抗性基因，在多克隆位点和真核抗性基因的外侧融入位点特异性重组酶系统识别序列；所述的穿梭质粒是包含多克隆位点的细菌克隆载体，并且在多克隆位点外侧融入位点特异性重组酶系统识别序列。
所述的位点特异性重组酶系统识别序列是LoxP序列、FRT序列、attP或attB序列中的一种或者几种。
多克隆位点通常用于插入外源DNA序列。HSV骨架载体和穿梭质粒的多克隆位点都是由一系列外切酶的编码序列串联而成，两者的多克隆位点可以相同，也可以不相同。多克隆位点含有以下一种或者几种酶切位点：HindIII、EcoRI、SacI、KpnI、EcoRV、NotI、SphI、NcoI、XhoI、SmaI、PacI、NheI、BamHI、PmeI或者SalI。
该重组单纯疱疹病毒遗传操作系统还包括表达重组酶的质粒。所述的重组酶是Cre酶、FRT酶、φC31或者φBT1整合酶。表达这些重组酶的质粒可以选自市售的相应重组酶的表达质粒。
BAC质粒骨架来源但不限于：BAC克隆载体pBeloBACll(New England Biolabs)、BAC(Lucigen)和pBACe3.6(Frengen et al.1999)等。[Ref：Frengen，E.et al.(1999)A Modular，Positive Selection Bacterial Artificial Chromosome Vector with Multiple Cloning Sites.Genomics 58：250-253.]。
真核抗性基因包括但不限于：卡那霉素抗性基因(Kanamycin resistance gene，Kanr)、潮霉素抗性基因(Hygromycin resistance gene，Hygr)、新霉素抗性基因(Neomycin resistance gene，Neor)、吉欧霉素抗性基因(Zeocin resistance gene，Zeor)等。
原核抗性基因包括但不限于：氯霉素抗性基因(Chloramphenicol resistance gene，Cmr)、四环素抗性基因(Tetracycline resistance gene，Tetr)等。
位点特异性重组酶系统识别序列包括但不限于：Cre酶识别的LoxP序列、FLP酶识别的FRT序列、φC31与φBT1整合酶识别的attP和/或attB序列等。
上述的重组单纯疱疹病毒遗传操作系统还可以包含荧光蛋白基因等目标基因。荧光蛋白基因包括但不限于：红色荧光蛋白基因DsRed1、绿色荧光蛋白基因GFP、黄色荧光蛋白基因YFP及他们的增强型等。
本发明还提供了上述的重组单纯疱疹病毒遗传操作系统的制备方法：首先，构建同源重组前体质粒，该质粒包含多克隆位点MCS、荧光蛋白基因、真核抗性基因以及原核抗性基因，在MCS和真核抗性基因的外侧融入位点特异性重组酶系统识别序列；其次，同源重组前体质粒pRKBAC-MCS中插入了HSV基因组的两条同源臂DNA；再次，构建穿梭质粒，在细菌克隆载体的多克隆位点MCS2外侧融入位点特异性重组酶系统识别序列。
具体步骤包括：
1.构建同源重组前体质粒
通常用于基因治疗的单纯疱疹病毒HSV-1的基因组达152kb，对其整体进行遗传操作难度很大。随着基因工程技术的进步，细菌人工染色体BAC技术成为目前HSV-1遗传操作的主流技术。本发明所设计的重组单纯疱疹病毒遗传操作系统就是建立在BAC技术的基础上，同时融合入Cre-loxP、FLP-FRT等位点特异性重组酶系统。这些核心特征就完整地集中设计在同源重组前体质粒中。本发明就应用常规分子克隆技术，构建同源重组前体质粒pRKBAC-MCS(图1)，其特征包括但不限于：基于BAC质粒骨架建立，包含多克隆位点MCS、(荧光蛋白基因、)真核抗性基因以及原核抗性基因，在MCS和真核抗性基因的外侧融入位点特异性重组酶系统识别序列。
其中，BAC质粒骨架来源但不限于：BAC克隆载体pBeloBACl1(New England Biolabs)、BAC(Lucigen)和pBACe3.6(Frengen et al.1999)等。[Ref：Frengen，E.et al.(1999)A Modular，Positive Selection Bacterial Artificial Chromosome Vector with Multiple Cloning Sites.Genomics 58：250-253.]
多克隆位点MCS包括但不限于：5’-BamHI-XhoI-PmeI-NotI-HindIII-SacI-PacI-3’：
荧光蛋白基因包括但不限于：红色荧光蛋白基因DsRed1、绿色荧光蛋白基因GFP、黄色荧光蛋白基因YFP及他们的增强型等。
真核抗性基因包括但不限于：卡那霉素抗性基因(Kanamycin resistance gene，Kanr)、潮霉素抗性基因(Hygromycin resistance gene，Hygr)、新霉素抗性基因(Neomycin resistance gene，Neor)、吉欧霉素抗性基因(Zeocin resistance gene，Zeor)等。
原核抗性基因包括但不限于：氯霉素抗性基因(Chloramphenicol resistance gene，Cmr)、四环素抗性基因(Tetracycline resistance gene，Tetr)等。
位点特异性重组酶系统识别序列包括但不限于：Cre酶识别的LoxP序列、FLP酶识别的FRT序列、φC31与φBT1整合酶识别的attP和/或attB序列等。
2.构建单纯疱疹病毒骨架载体
单纯疱疹病毒骨架载体是其遗传操作系统的核心组分之一，它是把单纯疱疹病毒基因组DNA插入BAC质粒内，以便于在大肠杆菌内对单纯疱疹病毒基因组进行遗传操作。本发明中，单纯疱疹病毒骨架载体是基于同源重组前体质粒pRKBAC-MCS建立起来的。首先从HSV基因组中经PCR或酶切得到两条同源臂(Homologous Arm，HA)并插入同源重组前体质粒pRKBAC-MCS中，构建成同源重组质粒pRKBAC-HA，然后把同源重组质粒pRKBAC-HA与HSV基因组DNA共同转染包装细胞系Vero及其衍生细胞系，在包装细胞系中进行同源重组，并因此建立HSV骨架载体pHsvEasy-X。
HSV骨架载体pHsvEasy-X的特征包括但不限于：在同源重组前体质粒pRKBAC-MCS中插入了HSV基因组DNA。其中，所插入的HSV基因组DNA可以是全长的HSV基因组DNA，也可以是缺失部分序列的HSV基因组DNA，HSV基因组既可是野生型，也可是突变型。
上述提供基因组的HSV包括但不限于1型HSV(HSV type 1，HSV-1)和2型HSV(HSV-2)。
3.构建穿梭质粒
穿梭质粒也是其遗传操作系统的核心组分之一，它主要功能是向HSV骨架载体pHsvEasy-X中导入外源基因或基因片段。本发明应用常规的分子克隆技术建立穿梭质粒pHsvShuttle-MCS(+)(图2)，其特征包括但不限于：基于常规细菌克隆载体建立，包含多克隆位点MCS，在MCS外侧融入位点特异性重组酶系统识别序列。
其中，常规细菌克隆载体包括但不限于：pORF-MCS、pTransfer、pUC18等
多克隆位点MCS但不限于：5’-SalI-HindIII-EcoRI-SacI-KpnI-EcoRV-NotI-SphI-NcoI-XhoI-SmaI-PacI-NheI-BamHI-3’。该MCS方向亦可倒置，则载体命名为pHsvShuttle-MCS(-)。
位点特异性重组酶系统识别序列包括但不限于：Cre酶识别的LoxP序列、FLP酶识别的FRT序列、φC31与φBT1整合酶识别的attP和/或attB序列等。并且，该位点特异性重组酶系统识别序列与同源重组前体质粒pRKBAC-MCS中的位点特异性重组酶系统识别序列相一致。
根据需要，穿梭质粒pHsvShuttle-MCS可携带或不携带外源肿瘤治疗基因。
本发明还提供了上述的重组单纯疱疹病毒遗传操作系统的应用，即将该重组单纯疱疹病毒遗传操作系统用于构建复制缺陷型的重组单纯疱疹病毒。
也可以，将该重组单纯疱疹病毒遗传操作系统用于构建选择复制型的溶瘤单纯疱疹病毒。
上述同源重组前体质粒pRKBAC-MCS、HSV骨架载体pHsvEasy-X及穿梭质粒pHsvShuttle-MCS共同构成了多功能、通用型重组单纯疱疹病毒遗传操作系统。该系统基于BAC技术，并融入了Cre-loxP、FLP-FRT等位点特异性重组酶系统，有效提高了单纯疱疹病毒遗传操作的便利性和可操控性。应用基本的分子生物学技术，就可把该重组单纯疱疹病毒遗传操作系统广泛地应用于建立各种复制缺陷型重组单纯疱疹病毒和选择复制型溶瘤单纯疱疹病毒，并进一步用于肿瘤基因治疗研究。
本发明的实施例中，首先用常规方法制备包含HSV骨架载体pHsvEasy-X的电转化用E.coli感受态细胞，按照常规的E.coli电转化方法，把穿梭质粒pHsvShuttle-MCS(+)与整合酶(integrates)FTP的表达质粒pET-FTP共同导入上述含HSV骨架载体pHsvEasy-X的E.coli感受态细胞，电击后的E.coli细胞抗性筛选，培养过夜。鉴定并获得FTP-FRT位点特异性重组所得到的HSV-BAC质粒。
继而用常规试剂盒大规模制备上述得到的HSV-BAC质粒DNA。把HSV-BAC质粒与整合酶Cre的表达质粒共转染Vero细胞。常规筛选培养后，分别收获细胞及上清液，反复冻融细胞释放病毒颗粒。
取一份冻存病毒液样品稀释，感染Vero细胞，培养3-5天，在荧光显微镜下挑选6-10个无红色荧光的噬斑，分别反复冻融释放病毒。去上述病毒液感染培养于Vero细胞，并大量扩增培养，收获病毒液。用Southern Blot、PCR等常规分子生物学技术对上述病毒进行鉴定，最终所得到的重组病毒符合预期。
按照上述方法构件的含有荧光蛋白基因的重组单纯疱疹病毒遗传操作系统也同样与预期相同，说明本发明的重组单纯疱疹病毒遗传操作系统不仅是建立复制缺陷型重组单纯疱疹病毒和选择复制型溶瘤单纯疱疹病毒的高效工具，而且能够有效的携带表达外源目的基因。
本发明提供一种重组单纯疱疹病毒遗传操作系统。该系统是基于细菌人工染色体BAC质粒骨架建立的，融合入Cre-loxP、FLP-FRT等位点特异性重组酶系统，包括同源重组前体质粒pRKBAC-MCS、HSV骨架载体pHsvEasy-X及穿梭质粒pHsvShuttle-MCS等部分，有效提高了单纯疱疹病毒遗传操作的便利性和可操作性，可广泛应用于复制缺陷型重组单纯疱疹病毒和选择复制型溶瘤单纯疱疹病毒的建立。
与其它重组单纯疱疹病毒遗传操作系统相比较，本发明提供重组单纯疱疹病毒遗传操作系统具有更多的优势和创新性，具体主要表现在：(1)单纯疱疹病毒的整个重组遗传操作过程主要集中在大肠杆菌中完成，方便、快捷且费用低廉；(2)全部重组单纯疱疹病毒遗传操作系统只包含三个质粒，组分简单、高效。其中同源前体质粒与HSV骨架载体相关联可方便克隆不同来源的HSV，穿梭质粒与HSV骨架载体相关联便于外源基因插入；(3)同源重组前体质粒、穿梭质粒中特别设计的多克隆位点尤其适合于各种HSV基因组及外源基因的克隆；(4)该遗传操作系统把细菌人工染色体技术和位点特异性重组酶系统有机地结合在一起，解决了HSV基因组容量大、难操作的问题；(5)该遗传操作系统可同时适用于复制缺陷型重组单纯疱疹病毒和选择复制型溶瘤单纯疱疹病毒的建立，不需要分列的独立系统。
附图说明
图1同源重组前体质粒pRKBAC-MCS物理图谱。
图2穿梭质粒pHsvShuttle-MCS物理图谱。
具体实施方式
实施例1
同源重组前体质粒的建立
同源重组前体质粒是建立单纯疱疹病毒骨架载体的基础。本发明实施例的同源重组前体质粒pRKBAC-MCS是基于BAC质粒克隆载体pBeloBACl1(New England Biolabs)建立的。pBeloBACl1中包含大肠杆菌(E.coli)F因子的DNA复制原点Ori2、原核生物选择标记基因Cmr，它在E.coli中以单拷贝形式存在，可克隆300kb的DNA片段并保持其稳定性。采用常规的分子克隆技术，先行在复制原点Ori2与选择标记Cmr之间插入来质粒pDsRed1-N1(Clontech)中的红色荧光标记基因RFP(Red Fluorescent Protein，RFP)，然后用人工合成的多克隆位点区(Mutiple Cloning Site，MCS)取代pBeloBACl1中克隆位点、克隆选择标记基因lacZ、COS位点和LoxP位点，该MCS的5’端携带LoxP位点，3’端携带FRT位点，从而构成中间质粒pRBAC-MCS。中间质粒pRBAC-MCS经PacI酶切后插入真核抗性基因Kanr，从而建立同源重组前体质粒pRKBAC-MCS(附图1和SEQ No.1)。
实施例2
单纯疱疹病毒骨架载体的建立
单纯疱疹病毒骨架载体是基于同源重组前体质粒pRKBAC-MCS，应用基因克隆和同源重组等技术把HSV基因组DNA导入到BAC质粒中，因此便于HSV基因组在E.coli中保存、传代和进行遗传操作。本发明实施例中，以HSV-1突变系G47Δ(溶瘤HSV)为对象，应用常规PCR技术扩增长约1.0-2.0kb的同源臂haL和haR，并经酶切插入同源重组前体质粒pRKBAC-MCS的多克隆位点区，构建成同源重组质粒pRKBAC-HA。把同源重组质粒pRKBAC-HA与G47Δ基因组DNA混合共同转染非洲绿猴肾细胞系Vero，进行同源重组，3天后收获子代病毒。继而用子代病毒感染Vero细胞，并覆盖以0.75％的琼脂糖上层，同时以G418抗性选择，继续进行常规细胞培养5-7天后，在荧光显微镜下挑选红色的G418抗性噬斑。这些红色的抗性噬斑继续在Vero细胞中感染倍增一次后继而感染HEK293，2小时后收获全细胞DNA，并电转E.coli DHlOB(Invitrogen)，并涂布于含Cm(15μg/ml)的琼脂平皿。挑选若干Cm抗性菌落，抽提BAC质粒DNA，用HindIII酶切和PCR扩增鉴定重组子。所得到的包含HSV基因组的重组BAC质粒即是HSV骨架载体pHsvEasy-X。
实施例3
穿梭质粒的建立
穿梭质粒是向HSV骨架载体pHsvEasy-X中导入外源基因或基因片段的载体。本发明实施例中，穿梭质粒骨架来源于质粒pORF-MCS(Invivogen)。通过平端连接的方法用人工合成的多克隆位点区MCS取代pORF-MCS中的全部开放阅读框(经NdeI与PacI双酶切后补平末端)，在MCS的两端包含LoxP和FRT序列。重组质粒根据MCS的插入方向分别命名为pHsvShuttle-MCS(+)(附图2和SEQNo.2)或pHsvShuttle-MCS(-)。
穿梭质粒pHsvShuttle-MCS(+)可进一步用于插入外源肿瘤治疗基因、报告基因或其它需要克隆入HSV基因组中的DNA片段(如肿瘤特异性基因启动子等)。本发明实施例进一步向pHsvShuttle-MCS(+)中插入绿色荧光蛋白报告基因EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)，完整的EGFP表达框来源于质粒pFUGW(Addgene)。重组质粒命名为pHsvShuttle-EGFP。
实施例4
复制缺陷型的重组单纯疱疹病毒的建立
上述建立的HSV骨架载体pHsvEasy-X与穿梭质粒pHsvShuttle-MCS(+)或其衍生质粒可直接用于构建复制缺陷型的重组单纯疱疹病毒。本发明实施例中，首先用常规方法制备包含HSV骨架载体pHsvEasy-X的电转化用E.coli感受态细胞，按照常规的E.coli电转化方法，把穿梭质粒pHsvShuttle-MCS(+)及其报告基因pHsvShuttle-EGFP与整合酶(integrates)FTP的表达质粒pET-FTP共同导入上述含HSV骨架载体pHsvEasy-X的E.coli感受态细胞，电击后的E.coli细胞首先转入加入含四环素(10μg/ml)的500 lSOC的试管中30℃振荡培养1小时，然后取其中100μl转入含四环素(10μg/ml)、氨苄(50μg/ml)和氯霉素(15μg/ml)的900μl SOC中在30℃下继续振荡培养3小时。取50-250μl上述培养物涂布于含氨苄(50μg/ml)和氯霉素(15μg/ml)的LB平皿，于43℃下培养过夜。从平皿中挑选6-10个单菌落于37℃下小规模体积(5ml)培养过夜。用常规碱法提取上述BAC的DNA，并用HindIII酶切和PCR扩增等常规方式鉴定其重组结果。经上述FTP-FRT位点特异性重组所得到的HSV-BAC质粒分别命名为pHsvEasy-nul1及pHsvEasy-EGFP。
继而用常规试剂盒大规模制备(～250ml)pHsvEasy-nul1及pHsvEasy-EGFP质粒DNA。把HSV-BAC质粒pHsvEasy-nul1及pHsvEasy-EGFP与整合酶Cre的表达质粒pcDNA3-nCre按常规方法共转染Vero细胞，并在含6％FBS和G418(300mg/ml)的DMEM中继续常规培养60小时。分别收获细胞及上清液，反复冻融细胞释放病毒颗粒，4℃下3500rpm离心15分钟除去细胞碎片，将上清液合并转入上述病毒液中，分成若干等分，于-80℃下冻存。取一份冻存病毒液样品分别用含G418(300mg/ml)和2％FBS的DMEM稀释103、104、105和106倍，每一稀释度取其中的100μl用于感染培养于96孔板中的Vero细胞，37℃下常规细胞培养3-5天，在荧光显微镜下挑选6-10个无红色荧光的噬斑，分别反复冻融释放病毒，离心后将病毒上清液转入EP管中于-80℃下冻存。取上述冻存病毒液50μl梯级感染培养于Vero细胞，并大量扩增培养，收获病毒液。用Southern Blot、PCR等常规分子生物学技术对上述病毒进行鉴定，最终所得到的重组病毒分别命名为oHSV-nul1和oHSV-EGFP。
SEQUENCE LISTING
<110>复旦大学
<120>一种重组单纯疱疹病毒遗传操作系统及其应用
<130>76
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>9725
<212>DNA
<213>Artificial
<400>1
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aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc 960
ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt 1020
cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc 1080
gccaggctca aggcgagcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc 1140
tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg 1200
ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag 1260
cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg 1320
cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagaattcag ctcgctgatc 1380
agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc 1440
cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc 1500
gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg 1560
ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga 1620
ggcggaaaga accagctggg gctcgattaa ttaacgggtt tcgatgaatt gatccgaagt 1680
tcctattctc tagaaagtat aggaacttcg aattgtcgac caattctcat gtttgacagc 1740
ttatcatcga atttctgcca ttcatccgct tattatcact tattcaggcg tagcaaccag 1800
gcgtttaagg gcaccaataa ctgccttaaa aaaattacgc cccgccctgc cactcatcgc 1860
agtactgttg taattcatta agcattctgc cgacatggaa gccatcacaa acggcatgat 1920
gaacctgaat cgccagcggc atcagcacct tgtcgccttg cgtataatat ttgcccatgg 1980
tgaaaacggg ggcgaagaag ttgtccatat tggccacgtt taaatcaaaa ctggtgaaac 2040
tcacccaggg attggctgag acgaaaaaca tattctcaat aaacccttta gggaaatagg 2100
ccaggttttc accgtaacac gccacatctt gcgaatatat gtgtagaaac tgccggaaat 2160
cgtcgtggta ttcactccag agcgatgaaa acgtttcagt ttgctcatgg aaaacggtgt 2220
aacaagggtg aacactatcc catatcacca gctcaccgtc tttcattgcc atacggaatt 2280
ccggatgagc attcatcagg cgggcaagaa tgtgaataaa ggccggataa aacttgtgct 2340
tatttttctt tacggtcttt aaaaaggccg taatatccag ctgaacggtc tggttatagg 2400
tacattgagc aactgactga aatgcctcaa aatgttcttt acgatgccat tgggatatat 2460
caacggtggt atatccagtg atttttttct ccattttagc ttccttagct cctgaaaatc 2520
tcgataactc aaaaaatacg cccggtagtg atcttatttc attatggtga aagttggaac 2580
ctcttacgtg ccgatcaacg tctcattttc gccaaaagtt ggcccagggc ttcccggtat 2640
caacagggac accaggattt atttattctg cgaagtgatc ttccgtcaca ggtatttatt 2700
cgcgataagc tcatggagcg gcgtaaccgt cgcacaggaa ggacagagaa agcgcggatc 2760
tgggaagtga cggacagaac ggtcaggacc tggattgggg aggcggttgc cgccgctgct 2820
gctgacggtg tgacgttctc tgttccggtc acaccacata cgttccgcca ttcctatgcg 2880
atgcacatgc tgtatgccgg tataccgctg aaagttctgc aaagcctgat gggacataag 2940
tccatcagtt caacggaagt ctacacgaag gtttttgcgc tggatgtggc tgcccggcac 3000
cgggtgcagt ttgcgatgcc ggagtctgat gcggttgcga tgctgaaaca attatcctga 3060
gaataaatgc cttggccttt atatggaaat gtggaactga gtggatatgc tgtttttgtc 3120
tgttaaacag agaagctggc tgttatccac tgagaagcga acgaaacagt cgggaaaatc 3180
tcccattatc gtagagatcc gcattattaa tctcaggagc ctgtgtagcg tttataggaa 3240
gtagtgttct gtcatgatgc ctgcaagcgg taacgaaaac gatttgaata tgccttcagg 3300
aacaatagaa atcttcgtgc ggtgttacgt tgaagtggag cggattatgt cagcaatgga 3360
cagaacaacc taatgaacac agaaccatga tgtggtctgt ccttttacag ccagtagtgc 3420
tcgccgcagt cgagcgacag ggcgaagccc tcgattaaga tacattgatg agtttggaca 3480
aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc 3540
tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt gcattcattt 3600
tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa agcaagtaaa acctctacaa 3660
atgtggtatg gctgattatg atctagagtc gcggccggcc gctacaggaa caggtggtgg 3720
cggccctcgg tgcgctcgta ctgctccacg atggtgtagt cctcgttgtg ggaggtgatg 3780
tccagcttgg agtccacgta gtagtagccg ggcagctgca cgggcttctt ggccatgtag 3840
atggacttga actccaccag gtagtggccg ccgtccttca gcttcagggc cttgtggatc 3900
tcgcccttca gcacgccgtc gcgggggtac aggcgctcgg tggaggcctc ccagcccatg 3960
gtcttcttct gcattacggg gccgtcggag gggaagttca cgccgatgaa cttcaccttg 4020
tagatgaagc agccgtcctg cagggaggag tcttgggtca cggtcaccac gccgccgtcc 4080
tcgaagttca tcacgcgctc ccacttgaag ccctcgggga aggacagctt cttgtagtcg 4140
gggatgtcgg cggggtgctt cacgtacacc ttggagccgt actggaactg gggggacagg 4200
atgtcccagg cgaagggcag ggggccgccc ttggtcacct tcagcttcac ggtgttgtgg 4260
ccctcgtagg ggcggccctc gccctcgccc tcgatctcga actcgtggcc gttcacggtg 4320
ccctccatgc gcaccttgaa gcgcatgaac tccttgatga cgttcttgga ggagcgcacc 4380
atggtggcga ccggtggatc tgagtccggt agcgctagcg gatctgacgg ttcactaaac 4440
cagctctgct tatatagacc tcccaccgta cacgcctacc gcccatttgc gtcaatgggg 4500
cggagttgtt acgacatttt ggaaagtccc gttgattttg gtgccaaaac aaactcccat 4560
tgacgtcaat ggggtggaga cttggaaatc cccgtgagtc aaaccgctat ccacgcccat 4620
tgatgtactg ccaaaaccgc atcaccatgg taatagcgat gactaatacg tagatgtact 4680
gccaagtagg aaagtcccat aaggtcatgt actgggcata atgccaggcg ggccatttac 4740
cgtcattgac gtcaataggg ggcgtacttg gcatatgata cacttgatgt actgccaagt 4800
gggcagttta ccgtaaatac tccacccatt gacgtcaatg gaaagtccct attggcgtta 4860
ctatgggaac atacgtcatt attgacgtca atgggcgggg gtcgttgggc ggtcagccag 4920
gcgggccatt taccgtaagt tatgtaacgc ggaactccat atatgggcta tgaactaatg 4980
accccgtaat tgattactat taataactaa tgcatggcgg taatacggtt atccacagaa 5040
tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtcg agtgagcgag gaagcaccag ggaacagcac 5100
ttatatattc tgcttacaca cgatgcctga aaaaacttcc cttggggtta tccacttatc 5160
cacggggata tttttataat tatttttttt atagttttta gatcttcttt tttagagcgc 5220
cttgtaggcc tttatccatg ctggttctag agaaggtgtt gtgacaaatt gccctttcag 5280
tgtgacaaat caccctcaaa tgacagtcct gtctgtgaca aattgccctt aaccctgtga 5340
caaattgccc tcagaagaag ctgttttttc acaaagttat ccctgcttat tgactctttt 5400
ttatttagtg tgacaatcta aaaacttgtc acacttcaca tggatctgtc atggcggaaa 5460
cagcggttat caatcacaag aaacgtaaaa atagcccgcg aatcgtccag tcaaacgacc 5520
tcactgaggc ggcatatagt ctctcccggg atcaaaaacg tatgctgtat ctgttcgttg 5580
accagatcag aaaatctgat ggcaccctac aggaacatga cggtatctgc gagatccatg 5640
ttgctaaata tgctgaaata ttcggattga cctctgcgga agccagtaag gatatacggc 5700
aggcattgaa gagtttcgcg gggaaggaag tggtttttta tcgccctgaa gaggatgccg 5760
gcgatgaaaa aggctatgaa tcttttcctt ggtttatcaa acgtgcgcac agtccatcca 5820
gagggcttta cagtgtacat atcaacccat atctcattcc cttctttatc gggttacaga 5880
accggtttac gcagtttcgg cttagtgaaa caaaagaaat caccaatccg tatgccatgc 5940
gtttatacga atccctgtgt cagtatcgta agccggatgg ctcaggcatc gtctctctga 6000
aaatcgactg gatcatagag cgttaccagc tgcctcaaag ttaccagcgt atgcctgact 6060
tccgccgccg cttcctgcag gtctgtgtta atgagatcaa cagcagaact ccaatgcgcc 6120
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atatcacttc catgacgaca ggatagtctg agggttatct gtcacagatt tgagggtggt 6240
tcgtcacatt tgttctgacc tactgagggt aatttgtcac agttttgctg tttccttcag 6300
cctgcatgga ttttctcata ctttttgaac tgtaattttt aaggaagcca aatttgaggg 6360
cagtttgtca cagttgattt ccttctcttt cccttcgtca tgtgacctga tatcgggggt 6420
tagttcgtca tcattgatga gggttgatta tcacagttta ttactctgaa ttggctatcc 6480
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gttacacggc tgcggcgagc gctagtgata ataagtgact gaggtatgtg ctcttcttat 6660
ctccttttgt agtgttgctc ttattttaaa caactttgcg gttttttgat gactttgcga 6720
ttttgttgtt gctttgcagt aaattgcaag atttaataaa aaaacgcaaa gcaatgatta 6780
aaggatgttc agaatgaaac tcatggaaac acttaaccag tgcataaacg ctggtcatga 6840
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cagagatgcc gagaaagcag ggcgactacc gcacccggat atggaaattc gaggacgggt 7020
tgagcaacgt gttggttata caattgaaca aattaatcat atgcgtgatg tgtttggtac 7080
gcgattgcga cgtgctgaag acgtatttcc accggtgatc ggggttgctg cccataaagg 7140
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acgtgttttg ctcgtggaag gtaacgaccc ccagggaaca gcctcaatgt atcacggatg 7260
ggtaccagat cttcatattc atgcagaaga cactctcctg cctttctatc ttggggaaaa 7320
ggacgatgtc acttatgcaa taaagcccac ttgctggccg gggcttgaca ttattccttc 7380
ctgtctggct ctgcaccgta ttgaaactga gttaatgggc aaatttgatg aaggtaaact 7440
gcccaccgat ccacacctga tgctccgact ggccattgaa actgttgctc atgactatga 7500
tgtcatagtt attgacagcg cgcctaacct gggtatcggc acgattaatg tcgtatgtgc 7560
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gtttttcgat atgcttcgtg atctgctcaa gaacgttgat cttaaagggt tcgagcctga 7680
tgtacgtatt ttgcttacca aatacagcaa tagtaatggc tctcagtccc cgtggatgga 7740
ggagcaaatt cgggatgcct ggggaagcat ggttctaaaa aatgttgtac gtgaaacgga 7800
tgaagttggt aaaggtcaga tccggatgag aactgttttt gaacaggcca ttgatcaacg 7860
ctcttcaact ggtgcctgga gaaatgctct ttctatttgg gaacctgtct gcaatgaaat 7920
tttcgatcgt ctgattaaac cacgctggga gattagataa tgaagcgtgc gcctgttatt 7980
ccaaaacata cgctcaatac tcaaccggtt gaagatactt cgttatcgac accagctgcc 8040
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ttgcctgtat gtggtcggga tgtgaagttt actcttgaag tgctccgggg tgatagtgtt 8160
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gcactggatg atctcatccc ttcttttcta ctgactggtc aacagacacc ggcgttcggt 8280
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gctctttttt ctcaccccgg tgaactatct gcccggtcag gtgatgcact tcaaaaagcc 8640
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gttttagtct acgtttatct gtctttactt aatgtccttt gttacaggcc agaaagcata 9000
actggcctga atattctctc tgggcccact gttccacttg tatcgtcggt ctgataatca 9060
gactgggacc acggtcccac tcgtatcgtc ggtctgatta ttagtctggg accacggtcc 9120
cactcgtatc gtcggtctga ttattagtct gggaccacgg tcccactcgt atcgtcggtc 9180
tgataatcag actgggacca cggtcccact cgtatcgtcg gtctgattat tagtctggga 9240
ccatggtccc actcgtatcg tcggtctgat tattagtctg ggaccacggt cccactcgta 9300
tcgtcggtct gattattagt ctggaaccac ggtcccactc gtatcgtcgg tctgattatt 9360
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ccactcgtgt tgtcggtctg attatcggtc tgggaccacg gtcccacttg tattgtcgat 9480
cagactatca gcgtgagact acgattccat caatgcctgt caagggcaag tattgacatg 9540
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ctgctgtgtc ctgcttatcc acaacatttt gcgcacggtt atgtggacaa aatacctggt 9660
tacccaggcc gtgccggcac gttaaccggg ctgcatccga tgcaagtgtg tcgctgtcga 9720
ccggg 9725
<210>2
<211>230l
<212>DNA
<213>Artificial
<400>2
gatccgaagt tcctattctc tagaaagtat aggaacttcg aattgtcgac aagcttgatc 60
tggcttatcg aaattaatac gactcactat agggagaccg gaattcgagc tcggtaccga 120
tatcgcggcc gcgcatgctc catggctcga gcccgggtta attaagctag cggatccgga 180
acccttaata taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tattaggtcc aagaacatgt 240
gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 300
ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 360
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gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 1020
tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 1080
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cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 1260
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ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 1860
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tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 1980
ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 2040
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gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga 2280
ttgtactgag agtgcaccat a 2301