技术领域
本发明属于巯基生物小分子检测技术领域，具体涉及一种基于苝的小分子荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
巯基生物小分子包括半胱氨酸、高半胱氨酸和还原型谷胱甘肽等，主要是通过巯基-SH而发挥生理作用的，巯基(-SH)是细胞中化学活性最高的基团。由于巯基的强配位能力和还原性，它们可以与重金属离子结合，或清除掉人体内的活性氧，在细胞的抗氧化系统中具有重要的作用，可用于维持生物细胞正常的生理活性并保护细胞免受外来物质伤害的小分子化合物。巯基生物小分子作为细胞必不可少的一类氨基酸，它们在细胞的生理和病理过程中都扮演着重要的角色。例如，缺乏半胱氨酸可导致嗜睡、生长缓慢、肝脏损伤，高半胱氨酸水平过高可能会诱发阿尔兹海默病，心血管疾病和冠心病等。作为细胞中许多化学物质的前体，谷胱甘肽也是必不可少的。因此，通过检测生物细胞内的巯基生物小分子的含量，可获取生物细胞的一些生理和病理的信息，在生物科学、医学方面具有重大的意义。
目前，巯基生物小分子的检测方法主要为电化学测定、免疫测定、高效液相色谱法等。然而这些方法均存在检测成本高、选择性差、灵敏度低、抗光漂白性差、生物毒性高等缺陷。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于苝的小分子荧光探针及其制备方法。该荧光探针分子量小，结构新颖，应用于检测生物细胞内的巯基生物小分子，具有灵敏度高、选择性好、制备简单和成本低廉的优点。
为实现上述发明目的，本发明的具体技术方案如下：
一种基于苝的小分子荧光探针，其化学结构式为：
本发明还提供了一种上述小分子荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
a)将苝溶解于第一反应溶剂中，然后缓慢加入浓硝酸，反应，得到第一中间产物；
b)将所述第一中间产物、三氯化铁和活性炭溶解于第二反应溶剂中，然后缓慢加入水合肼，反应，得到第二中间产物；
c)将所述第二中间产物和马来酸酐在第三反应溶剂中反应，得到所述小分子荧光探针。
优选的，步骤a)中所述浓硝酸的浓度为65％～68％；
所述浓硝酸中的硝酸和所述苝的摩尔添加比为2:(14.4～15.2)。
更优选的，步骤a)中所述反应的温度为60℃，反应时间为0.5～1h。
更优选的，步骤a)中所述第一中间产物为1-硝基苝或3-硝基苝；
所述第一反应溶剂为1,4-二氧六环。
优选的，步骤b)中所述第一中间产物、三氯化铁和水合肼的摩尔添加比为(80～90):(3～7):100；
所述活性炭和所述第一中间产物的摩尔添加比为12:1～20:1。
更优选的，步骤b)中所述反应的温度为90～100℃，时间为3～4h；
所述第二中间产物为1-苝胺或3-苝胺；
更优选的，步骤b)中所述第二反应溶剂为非极性溶剂和醇的混合溶液；
所述非极性溶剂和醇溶液的混合体积比为1:1～1:3。
优选的，步骤c)中所述第二中间产物和所述马来酸酐的摩尔添加比为1:2～1:6；
所述回流反应的温度为70～90℃，反应时间为5～6h；
所述第三反应溶剂为乙酸。
本发明还提供了前述小分子荧光探针或上述制备方法得到的小分子荧光探针在检测细胞内巯基生物小分子中的应用。
综上所述，本发明通过先在苝的1位碳或3位碳上发生硝化反应连接一个硝基，然后将硝基还原成氨基，再采用马来酸酐取代氨基，从而得到本发明所提供的两个结构新颖的小分子荧光探针，其化学结构如式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示。该小分子荧光探针与生物细胞内的巯基生物小分子结合时发出绿光，明显区别于生物细胞的背景蓝光，具有灵敏度高、选择性好和生物低毒性的优点，而且其制备工艺简单优化，大大地降低了巯基生物小分子的检测成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例2中荧光探针1-NH-MA在DMSO溶液中加入半胱氨酸(Cys)前后的紫外-可见吸收光谱图；
图2为实施例2中荧光探针3-NH-MA在DMSO溶液中加入Cys前后的紫外-可见吸收光谱图；
图3为实施例3中荧光探针1-NH-MA在DMSO溶液中加入Cys前后的荧光发射谱图；
图4为实施例3中荧光探针3-NH-MA在DMSO溶液中加入Cys前后的荧光发射谱图；
图5为实施例4中荧光探针1-NH-MA在不同底物下的荧光强度柱状图；
图6为实施例4中荧光探针3-NH-MA在不同底物下的荧光强度柱状图；
图7a为实施例5中含巯基生物小分子的细胞加入荧光探针1-NH-MA培养后的细胞成像图；
图7b为实施例5中不含巯基生物小分子的细胞加入荧光探针1-NH-MA培养后的细胞成像图；
图7c为实施例5中含巯基生物小分子的细胞加入荧光探针3-NH-MA培养后的细胞成像图；
图7d为实施例5中不含巯基生物小分子的细胞加入荧光探针3-NH-MA培养后的细胞成像图。
具体实施方式
本发明提供了化学结构如式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示的一种基于苝的小分子荧光探针：
该小分子荧光探针属于亲核加成型结构，是一种共轭程度较高的小分子化合物。分子结构中马来酰亚胺具有较强的吸电子能力，形成光诱导电子转移(PET)效应，导致该探针荧光淬灭，但当探针遇到含巯基的化合物时，巯基与马来酰亚胺发生加成反应，PET效应被打破，探针的荧光也随之恢复。该小分子荧光探针与生物细胞内的巯基生物小分子结合时发出绿光，明显区别于生物细胞的背景蓝光，具有灵敏度高、选择性好和生物低毒性的优点。
经过对上述小分子荧光探针的合成工艺的优化，上述小分子荧光探针的合成包括以下步骤：
a)将苝溶解于1,4-二氧六环中，然后缓慢加入浓硝酸，在60℃下反应0.5～1h，得到第一中间产物；
b)将所述第一中间产物、三氯化铁和活性炭溶解于反应溶液中，然后缓慢加入水合肼，在90～100℃下反应3～4h，得到1-苝胺或3-苝胺；
c)将所述第二中间产物和马来酸酐在乙酸中70～90℃回流反应5～6h，得到所述小分子荧光探针。
进一步的，步骤a)中所述浓硝酸的浓度为65％～68％；所述浓硝酸中的硝酸和所述苝的添加摩尔比为2:(14.4～15.2)；
所述第一中间产物为1-硝基苝和/或3-硝基苝。
进一步的，步骤b)中所述第一中间产物、三氯化铁和水合肼的摩尔添加比为84:5:100；
所述活性炭和所述第一中间产物的摩尔添加比为12:1～20:1。
所述反应溶液为甲苯和乙醇按体积比1:1～1:3混合得到的混合溶液。
进一步的，步骤c)中所述第二中间产物和所述马来酸酐的摩尔添加比为1:4。
本发明小分子荧光探针的合成过程可采用以下反应式表示：
本发明还提供了前述小分子荧光探针或上述制备方法得到的小分子荧光探针在巯基生物小分子检测技术中的应用。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的小分子荧光探针的制备过程主要包括以下步骤：
1、依次将0.5g(2mmol)苝、40mL的1,4-二氧六环置于双颈烧瓶中，在80℃下搅拌至苝完全溶解为澄清的黄色溶液；然后用注射器缓慢注入1mL浓硝酸，浓硝酸选择浓度为65％～68％的浓硝酸(14.4～15.2mol/L)，在60℃下搅拌30min后，得到包含化合物1和化合物2的反应液；接着，趁热将反应液倒入大量冰水中，经减压过滤和真空干燥12h后得到鲜红色的粗产物；最后，采用色谱法以体积比为1.5:1的石油醚(PE)-二氯甲烷(DCM)作为洗脱液得到暗红色针状固体化合物1(产率20％)和砖红色固体化合物2(产率63％)。
其化学反应式如下：
化合物1和化合物2的核磁共振氢谱数据如下：
化合物1-1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ8.28(m,2H),7.84(m,3H),7.74(m,2H),7.62(t,1H,J＝8Hz),7.57(m,2H),7.44(t,1H,J＝8Hz)；
化合物2-1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ8.48(d,1H,J＝8Hz),8.26(m,4H),8.10(d,1H,J＝8Hz),7.82(d,1H,J＝8Hz),7.76(d,1H,J＝8Hz),7.68(t,1H,J＝8Hz),7.55(m,2H)。
2、将0.1248g(0.42mmol)的化合物1、0.004g(0.025mmol)的FeCL3和0.0083g的活性炭加入双颈烧瓶，然后加入5mL甲苯和5mL乙醇溶解；接着，加热搅拌至98℃沸腾后，往混合液中缓慢滴加0.25mL(5mmol)的水合肼进行反应，中间补加0.0054g FeCl3、0.0049g活性炭、125μL水合肼、2mL乙醇和2mL甲苯，反应4h后减压过滤，将滤液旋干；最后，采用色谱法以PE：DCM＝1:1.25的洗脱液经柱层析法得到橘黄色的化合物3。
其化学反应式如下：
化合物3的核磁共振氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ8.42(d,1H,J＝7.6Hz),8.16(t,2H,J＝6.8Hz),7.69(d,1H,J＝8.0Hz),7.59(q,3H,J＝9.2Hz),7.5-7.4(m,2H),7.27(t,1H,J＝7.27Hz),7.24(d,1H,J＝8.8Hz),6.05(s,2H)。
3、本步骤和步骤2的区别点在于：化合物1替换为化合物2，其余地方和步骤2相同，此处不再一一赘述。
本步骤的化学反应式如下：
化合物4的核磁共振氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ8.28(d,1H,J＝4Hz),8.22(d,1H,J＝8Hz),8.10(d,1H,J＝12Hz),8.01～7.95(m,2H),7.66(d,1H,J＝8Hz),7.53(d,1H,J＝8Hz),7.44～7.37(m,3H),6.77(d,1H,J＝12Hz),6.12(s,2H)。
4、在15mL含有0.196g(2mmol)马来酸酐的乙酸溶液中加入化合物3，在100～120℃下回流6h；经过TLC检测反应完全后，用旋转蒸发仪将溶剂除去，再用饱和NaHCO3溶液和DCM萃取两次，并经无水硫酸钠干燥；最后，采用色谱法以正己烷(HeX)：DCM＝1:2为洗脱液用柱层析法得到橘黄色固态的化合物5。
本步骤的化学反应式如下：
化合物5的核磁共振氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ8.24(t,2H,J＝8Hz),7.78～7.68(m,5H),7.60～7.51(m,2H),7.33(t,1H,J＝8Hz),7.22(d,1H,J＝8Hz),6.97(s,2H)。
5、本步骤和步骤4的区别点在于：化合物3替换为化合物4，最后采用色谱法以正己烷(HeX)：DCM＝1:4.5为洗脱液用柱层析法得到金黄色固态的化合物6，产率约83％。其余地方和步骤4相同，此处不再一一赘述。
本步骤的化学反应式如下：
化合物6的核磁共振氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ8.48(q,4H,J＝8Hz),7.88～7.85(m,2H),7.62～7.52(m,5H),7.31(s,2H)。
实施例2
取化合物5和化合物6分别命名为荧光探针1-NH-MA和3-NH-MA，然后均采用DMSO制取浓度为10-5mol/L的探针溶液；接着，往两种探针溶液中分别加入与探针浓度相同的半胱氨酸溶液(Cys)；最后，采用紫外可见分光光度计检测其吸光度。结果如图1和图2所示，探针1-NH-MA和3-NH-MA的吸收均位于350nm～480nm之间，探针在加入半胱氨酸前后吸收波长与吸收强度几乎没有变化。
实施例3
取化合物5和化合物6分别命名为荧光探针1-NH-MA和3-NH-MA，然后均采用DMSO制取浓度为10-5mol/L的探针溶液；接着，往两种探针溶液中分别加入与不同浓度的半胱氨酸溶液(Cys)，测试Cys对探针的荧光强度的影响，经测试发现当Cys浓度为1×10-5mol/L时，探针发光强度最强。如图3和图4所示，探针1-NH-MA和3-NH-MA本身不发光或发光比较弱，加入Cys(10-5mol/L)之后立即出现明显的荧光增强，1-NH-MA和3-NH-MA加入Cys后荧光强度分别增强了71倍与196倍，说明本实施例提供的两种荧光探针具有较高的灵敏度。
实施例4
取化合物5和化合物6分别命名为荧光探针1-NH-MA和3-NH-MA，然后均采用DMSO制取15组探针溶液(10-5mol/L)，其中10组分别加入1倍当量荧光探针的氨基酸，所述氨基酸分别为半胱氨酸(L-cysteine)、谷氨酰胺(glutamine)、同型半胱氨酸(DL-Homocysteine)、谷氨酸(glutamic)、氨基乙酸(aminoacetic)、组氨酸(histidine)、赖氨酸(lysine)、甲硫氨酸(L-Methionine)、苯丙氨酸(L-Phenylalanine)、丝氨酸(L-Serine)、苏氨酸(L-Threonine)和色氨酸(L-Tryptophan)；另外2组分别加入抗坏血酸(Ascorbic acid)和通入过氧化氢(Hydrogen Peroxide)；最后一组作为空白对照组。接着，在437nm下采用荧光光谱检测15组荧光探针1-NH-MA溶液的发光强度，结果如图5所示；在439nm下采用荧光光谱检测15组荧光探针3-NH-MA溶液的发光强度，结果如图6所示。
如图5和图6所示，探针1-NH-MA和3-NH-MA的荧光强度比较弱接近零，在加入非巯基氨基酸、抗坏血酸和过氧化氢后荧光增强不明显，与空白对照组相比无明显区别。然而，在加入半胱氨酸、谷氨酰胺和同型半胱氨酸等巯基氨基酸后荧光增强最为明显。说明本实施例提供的荧光探针1-NH-MA和3-NH-MA对巯基生物小分子具有很高的选择性。
实施例5
将探针1-NH-MA和3-NH-MA分别加入培养好的贴壁细胞培养液中，置于37℃细胞培养箱中培养一段时间，然后将细胞用PBS清洗后进行细胞成像。结果如图7a和7c所示，显示细胞在加入探针1-NH-MA和3-NH-MA发出较强的绿色荧光。
在对照试验中，将细胞首先采用N-甲基马来酸酐预处理后(消除细胞内含巯基的化合物)，再分别加入荧光探针1-NH-MA和3-NH-MA，之后继续在37℃细胞培养箱中培养一段时间，进行细胞成像。如图7b和7d所示，细胞没有发射出荧光或荧光非常弱。
本实施例结果说明探针1-NH-MA和3-NH-MA在细胞中具有较好的选择性，进一步说明了探针1-NH-MA和3-NH-MA在生物细胞内能够进行巯基化合物可视化检测。