技术领域
本发明属于生命科学领域，具体涉及一种马脐血间充质干细胞的培养基及其分离培养 方法。
背景技术
间充质干细胞定义：间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是干细胞家族的重 要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化 潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。 如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、 韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分 化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。目前的研究表 明，MSC细胞表面抗原为CD73、CD90、CD105阳性，CD34、CD45阴性。
鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫 以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。随着间充质干细胞及其相关技术 的日益成熟，临床研究已经在许多国家开展。作为种子细胞,临床上主要用于治疗机体无法 自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和 自身免疫性疾病。
目前,我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、 脐带血中分离和制备间充质干细胞，用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。但骨髓来源 的间充质干细胞存在以下问题：随着年龄的老化，干细胞数目显著降低、增殖分化能力大 幅度衰退；制备过程不容易质控；移植给异体可能引起免疫反应；取材时对患者有损伤， 患者有骨髓疾病时不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。这都限制了骨髓 间充质干细胞临床应用，使得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要 的问题。
目前在胎盘、脐带、脐血等组织中已成功分离出间充质干细胞，这种组织来源的间充 质干细胞不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且还具备如下优点：①胎盘和脐带中 的干/祖细胞更原始，有更强的增殖分化能力。②免疫细胞较为幼稚，功能活性低，不会触 发免疫反应及引起移植物抗宿主病。③干细胞易于分离，纯度高，无肿瘤细胞污染。④扩 增时培养体系能统一，便于质控。⑤可制成种子细胞冷冻，多次使用，冷冻后细胞损失小。 ⑥潜伏性病毒和病原微生物的感染及传播几率比较低。⑦采集时对产妇及新生儿无任何危 害及损伤。⑧采集方便，易于保存和运输，伦理学争议少。这种胎盘和脐带来源的间充质 干细胞有可能成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，并具有更大的应用潜能。
迄今的研究表明，脐带来源的间充质干细胞不但能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物， 而且具有更大的应用潜能。脐带间充质干细胞表达多种胚胎干细胞的特有分子标志，具有 分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化 制备等特征，因此有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。目前赛马项目十分盛行， 而一匹赛马的价格惊人，而马又时常在赛马活动中受伤，厂家受伤部位为骨关节、肌肉等。 这种情况下，用马脐带间充质干细胞移植就可能治愈赛马的疾患，挽救赛马的运动生涯。
目前人脐血MSC的分离、培养方法主要为用淋巴细胞分离液Ficoll从脐血中分离出单个 核细胞，之后再用干细胞专用培养基培养，所获得贴壁细胞即为MSC。但该方法所得MSC 增殖缓慢，数量较少。目前尚无从马脐血分离培养MSC的相关专利报道。此外由于脐血中 MSC数量稀少，根据文献报道，脐血中的MSC含量为每106单个核细胞含有0.5～1个MSC， 仅为骨髓的1/10。现有的方法所得MSC增殖缓慢，数量较少，且培养成功率低，并不是所 有的脐血均能用该方法分离培养获得MSC。
发明内容
本发明的目的是从马脐血中分离出MSC，并改良脐血MSC的培养条件，进行体外大 规模扩增培养，为应用马脐血MSC治疗马疾患创造条件。
本发明目的通过以下技术方案来实现：
一种马脐血间充质干细胞的培养基，在IMDM培养基中添加马血清、粒细胞-巨噬细胞 集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)和人干 细胞生长因子(stem cell factor，SCF)，其中马血清的体积百分数为1～50％；GM-CSF 的质量浓度为1～100ng/ml；SCF的质量浓度为1～100ng/ml，余量为IMDM培养基。
优选，所述马血清的体积百分数为10％；GM-CSF的质量浓度为10ng/ml；SCF的质量 浓度为10ng/ml，余量为IMDM培养基。
所述IMDM培养基为Gibco，货号：31980030。
本发明还提供了所述的马脐血间充质干细胞的培养基在细胞培养中的应用。
具体可以应用在马脐血间充质干细胞的分离培养方法中，包括以下步骤：
(1)单个核细胞的分离：将添加抗凝剂的脐血用生理盐水或细胞培养基稀释后，采用密 度梯度离心法得到单个核细胞；
(2)MSC的培养：将单个核细胞用所述的马脐血间充质干细胞的培养基进行培养。
优选，所述抗凝剂为枸橼酸钠。
优选，所述细胞培养基为RPMI1640培养基；所述稀释比例为1:1～1:5。
优选，所述密度梯度离心法是采用Ficoll淋巴细胞分离液，100g～1000g离心10～50min， 吸取单个核细胞层，再用RPMI1640培养基重悬细胞，100g～1000g离心1～20min。
优选，将单个核细胞用马脐血间充质干细胞的培养基进行培养是将单个核细胞用所述的 马脐血间充质干细胞的培养基重悬后，以1～10×105/ml的细胞密度接种于马脐血间充质干 细胞的培养基中，在37℃、5％CO2条件下培养。
优选，所述培养到达第6天时，去除旧培养基，添加所述的马脐血间充质干细胞的培养 基，此后，每三天更换培养基一次。
本发明相对于现有技术所具有的优点和有益效果：
1.从马脐血中分离、培养MSC，目前尚无相关专利报道。
2.培养脐血MSC时，添加GM-CSF、SCF，可有效提高脐血MSC的扩增效率。现有 的扩增培养脐血MSC方法未添加GM-CSF、SCF。
3.本发明采用培养基来重悬分离后的脐血单个核细胞，而非用生理盐水或者磷酸盐缓 冲液。前者更有优势：其一，可以比生理盐水提供更好的缓存体系，其二，可以比 生理盐水和磷酸盐缓冲液提供更好的细胞所需营养成分。
附图说明：
图1为脐血MSC P1代细胞放大100倍的细胞形态图。
图2为脐血MSC P1代流式检测结果显示。
具体实施方式：
为更好地说明本发明，以下结合具体实施方式和附图作进一步说明。
实施例1
1....脐血单个核细胞的分离
1.1用10mL一次性移液管将添加枸橼酸钠抗凝剂的25ml脐血转移到50mL离心管中。
1.2往上述脐血中加入等体积的RPMI1640培养基，用10mL一次性移液管混合均匀。
1.3另取一支新的50mL离心管，用10mL一次性移液管每管加入12mL淋巴细胞分离 液(血液稀释液：淋巴分离液＝2:1)，用10mL一次性移液管将稀释后的血液缓慢转移至淋 巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面。
1.4700g离心30min，离心升降速率改为0。
1.5离心后从管底到液面分为4层，依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、脐 血单个核细胞层、血浆层。用巴氏吸管将单个核细胞层吸出，转移至另一支50mL离心管 中。
1.6用10mL一次性移液管加RPMI1640培养基至40mL，重悬单个核细胞，400g离 心5min。
1.7离心结束后弃上清，用一次性移液管加入40mL RPMI1640培养基充分重悬细胞后， 取20μL细胞悬液于1.5mL EP管中，用细胞计数仪进行计数，其余悬液250g离心5min。
1.9去上清，得到单个核细胞。
2....脐血MSC的培养
2.1将1.9中的单个核细胞用含10％马血清、10ng/ml GM-CSF、10ng/ml SCF的IMDM 培养基(Gibco)重悬后，细胞密度为2×105/ml，接种至细胞培养瓶中。
2.2将上述细胞培养瓶转移至37度、5％CO2的细胞培养箱中培养。
2.3培养至第6天，去除旧培养基，添加等量的新鲜IMDM培养基，含10％马血清、 10ng/ml GM-CSF、10ng/ml SCF。
2.4此后，每三天换液一次，细胞培养基与2.3一样。
2.5当贴壁细胞汇合度达到85～90％时，进行常规细胞传代培养。
3....脐血MSC的鉴定
3.1取P1代的脐血MSC(见图1)，用流式细胞仪检测其表面抗原表达，结果显示， CD73、CD90、CD105呈阳性，CD45为阴性，符合MSC表面抗原标志。
图2为脐血MSC P1代流式检测结果，由图2显示CD73、CD90、CD105呈阳性，CD45 为阴性，符合MSC表面抗原标志。
4....脐血MSC的培养方法比较
4.1取步骤1.9所获得的脐血单个核细胞
4.2平均分成A、B、C、D四组，各组培养基组成如下表，均用T25细胞培养瓶进行 常规培养。
组别 培养基组成 A 10％马血清，10ng/ml GM-CSF，10ng/ml SCF，IMDM培养基 B 10％马血清，10ng/ml GM-CSF，IMDM培养基 C 10％马血清，10ng/ml SCF，IMDM培养基 D 10％马血清，IMDM培养基
4.3培养至增殖最快的一组细胞汇合度达85％时，用0.25％胰酶消化细胞，进行细胞计 数，结果见下表。结果表明，A组的细胞数量最多，这说明，添加GM-CSF、SCF可明显促 进脐血MSC的增殖，提高细胞产量。
组别 细胞数量 A 1.1±0.2×106 B 0.6±0.1×106 C 0.5±0.1×106 D 0.2±0.05×106
实施例2
1....脐血单个核细胞的分离
1.1用10mL一次性移液管将添加枸橼酸钠抗凝剂的25ml脐血转移到50mL离心管中。
1.2往上述脐血中加入的RPMI1640培养基，稀释比例为1:5，用10mL一次性移液管 混合均匀。
1.3另取一支新的50mL离心管，用10mL一次性移液管每管加入12mL淋巴细胞分离 液(血液稀释液：淋巴分离液＝2:1)，用10mL一次性移液管将稀释后的血液缓慢转移至淋 巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面。
1.4100g离心50min，离心升降速率改为0。
1.5离心后从管底到液面分为4层，依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、脐 血单个核细胞层、血浆层。用巴氏吸管将单个核细胞层吸出，转移至另一支50mL离心管 中。
1.6用10mL一次性移液管加RPMI1640培养基至40mL，重悬单个核细胞，400g离 心5min。
1.7离心结束后弃上清，用一次性移液管加入40mL RPMI1640培养基充分重悬细胞后， 取20μL细胞悬液于1.5mL EP管中，用细胞计数仪进行计数，其余悬液250g离心5min。
1.9去上清，得到单个核细胞。
2....脐血MSC的培养
2.1将1.9中的单个核细胞用含50％(v/v)马血清、100ng/ml GM-CSF、1ng/ml SCF的 IMDM培养基(Gibco)重悬后，细胞密度为1×105/ml，接种至细胞培养瓶中。
2.2将上述细胞培养瓶转移至37度、5％CO2的细胞培养箱中培养。
2.3培养至第6天，去除旧培养基，添加等量的新鲜IMDM培养基，含50％(v/v)马血 清、100ng/ml GM-CSF、1ng/ml SCF。
2.4此后，每三天换液一次，细胞培养基与2.3一样。
2.5当贴壁细胞汇合度达到85～90％时，进行常规细胞传代培养。
实施例3
1...脐血单个核细胞的分离
1.1用10mL一次性移液管将添加枸橼酸钠抗凝剂的25ml脐血转移到50mL离心管中。
1.2往上述脐血中加入等体积的RPMI1640培养基，用10mL一次性移液管混合均匀。
1.3另取一支新的50mL离心管，用10mL一次性移液管每管加入12mL淋巴细胞分离 液(血液稀释液：淋巴分离液＝2:1)，用10mL一次性移液管将稀释后的血液缓慢转移至淋 巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面。
1.41000g离心10min，离心升降速率改为0。
1.5离心后从管底到液面分为4层，依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、脐 血单个核细胞层、血浆层。用巴氏吸管将单个核细胞层吸出，转移至另一支50mL离心管 中。
1.6用10mL一次性移液管加RPMI1640培养基至40mL，重悬单个核细胞，400g离 心5min。
1.7离心结束后弃上清，用一次性移液管加入40mL RPMI1640培养基充分重悬细胞后， 取20μL细胞悬液于1.5mL EP管中，用细胞计数仪进行计数，其余悬液250g离心5min。
1.9去上清，得到单个核细胞。
2....脐血MSC的培养
2.1将1.9中的单个核细胞用含1％马血清、1ng/ml GM-CSF、100ng/ml SCF的IMDM 培养基(Gibco)重悬后，细胞密度为10×105/ml，接种至细胞培养瓶中。
2.2将上述细胞培养瓶转移至37度、5％CO2的细胞培养箱中培养。
2.3培养至第6天，去除旧培养基，添加等量的新鲜IMDM培养基，含1％马血清、1ng/ml GM-CSF、100ng/ml SCF。
2.4此后，每三天换液一次，细胞培养基与2.3一样。
2.5当贴壁细胞汇合度达到85～90％时，进行常规细胞传代培养。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变 更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修 改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些 特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。