吲哚咔唑生物碱及其制备方法和用途 技术领域：
本发明涉及新颖的吲哚咔唑生物碱类化合物，由海洋来源的马杜拉放线菌Actinomadurasp.007发酵制备该吲哚咔唑生物碱类化合物的方法，以及该类化合物在制备细胞周期抑制剂、肿瘤细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。
背景技术：
吲哚咔唑类生物碱星形孢菌素(staurosporine)自从链霉菌AM-2282产物中分离报道(S.Omura，Y.Iwai，A.Nalagawa，et al.，J.Antibiot.，1977，30，275；A.Furusaki，N.Hashiba，T.Matsumoto，et al.，J.Chem.Soc.Chem.Comm.，1978，800-801)以来陆续发现具有多种重要的生物活性，如抗菌、扩张血管、细胞毒活性以及抑制血小板凝集和抑制蛋白激酶C等。由于星形孢菌素苷元对其相关生物活性具有重要意义(D.Meksurriyen，G.A.Cordell，J.Nat.Prod.1988，51，884-892)，因而以星形孢菌素苷元为母体的吲哚咔唑生物碱类化合物作为重要的生物活性分子受到极大关注。
含有星形孢菌素苷元骨架的吲哚咔唑生物碱类化合物除了非苷类衍生物以外主要还有以Staurosporine、K-252a(H.Kase，K.Iwahashi，Y.Matsuda，J.Antibiot.，1986，39，1059-1065)和K-252d(T.Yasuzawa，T.Iida，M.Yoshida，et al.，J.Antibiot.，1986，39，1072-1078)为代表的三个类型的苷类化合物。这四大吲哚咔唑生物碱类化合物均已从自然界分离得到，而且数百个苷类衍生物也已被人工合成(金井文彦，網城 宣善，北村 雄志，等，WO01/004125，国际公开日2001年1月18日；マイケル·イ一·ルイス，コラ·ネフ，ヅル·ロバ一ッ-ルイス，等，特開2003-113184)。但迄今尚未见有关糖环上并有杂环的天然星形孢菌素类似物的报道。另外，经X-线单晶衍射分析(A.Furusaki，N.Hashiba，T.Matsumoto，et al.，J.Chem.Soc.Chem.Commun.，1978，800-801；N.Funato，H.Takayanagi，Y.Konda，et al.，Tetreahedron Lett.，1994，35，1251-1254)和核磁共振研究(P.D.Davis，C.H.Hill，W.A.Thomas，et al.，J.Chem.Soc.Chem.Commun.，1991，182-184)，已确定了星形孢菌素及其类似物的吡喃环在固态和溶液状态中的构型，即游离碱取椅式构型，而4′-N被质子化的盐则取船式构型(其中O-1′和C-4′为船头和船尾)。但迄今尚未见吡喃环取C-2′和C-5′为船头和船尾的船式构型的化合物。
发明内容：
本发明旨在提供一类新化学结构的具有细胞周期抑制、肿瘤细胞增殖抑制等抗肿瘤活性的化合物，具体而言，是要提供一种在糖环3′和4′位并氧氮杂环、糖吡喃环取C-2′和C-5′为船头和船尾的船式构型的星形孢菌素类化合物。
本发明的目的还在于提供该类新化合物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供该类新化合物在制备细胞周期抑制剂、细胞凋亡诱导剂、肿瘤细胞杀伤剂、肿瘤细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。
本发明首次从自然界微生物发酵物中发现了一种新的吲哚咔唑生物碱类式I化合物：
式I
式I中，R1、R2、R4、R5、R6、R7均可为氢、羟基、烃氧基、酰氧基、氨基、酰氨基；R3和R8可为氢、烃基、羟基、酰基。
优选地本发明化合物是R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7均为氢，R8为甲基的式I化合物。
本发明所提供化合物其最显著的结构特点在于：在糖环3′和4′位并氧氮杂环、且吡喃环取C-2′和C-5′为船头和船尾的船式构型。
本发明式I化合物的制备方法是，通过发酵培养可生产吲哚咔唑生物碱类化合物的微生物，如放线菌007株，首先获取含式I化合物的发酵产物，再利用相关专业技术人员熟知的分离纯化技术，如液液萃取、柱层析、高效液相等，纯化制备并获得式I化合物。
本发明的实施例中列举了利用放线菌007株制备优选的本发明式I化合物的实例。
该放线菌007株由从青岛近海海泥样品中分离，并经分类学研究鉴定为马杜拉放线菌属的一株微生物Actinomadura sp.007。该菌株已于2004年12月13日保藏在中国典型培养物保减中心(保减编号：CCTCC M204076)。该马杜拉放线菌Actinomadura sp.007 CCTCCM204076株具有如下微生物菌学特征(见表1)：
表1 007菌株的微生物菌学特征 检测项目 结果 检测项目 结果 菌落直径(um) 表面颜色 基质色素 气生菌丝 孢子丝 形成孢子链 孢囊形成 孢子表面 吐温80 阿东糖醇 D-甘露醇 D-甘露糖 D-阿拉伯糖 D-阿拉伯醇 D-纤维二糖 半乳糖 D-半乳糖醛酸 m-肌醇 N-乙酰-D-葡萄糖胺 龙胆二糖 2.0～3.1 白色 浅褐色 丰茂 稍直曲 + + 光滑 + + + + + + + + - + - + 淀粉 D-木糖 麦芽糖 α-D-葡萄糖 L-鼠李糖 麦牙三糖 蜜二糖 D-果糖 D-乳糖 D-棉子糖 D-阿酪醇糖 D-松三糖 海藻糖 溴化琥珀酸 癸二酸 琥珀酸 琥珀酸甲酯 甘油 L-天冬酰胺 D-L-α-磷酸甘油 + + + + + + + + + + + + + - - + + - - -
需要特别说明的是，经发酵微生物制取本发明式I化合物的方法可采用其它任何能生产吲哚咔唑生物碱类化合物的微生物，只要能生产该类化合物的微生物均可用作产素菌用于制备式I化合物。
本发明采用丽丝胺罗丹明B(sulforhodamine B，SRB)法、四氮唑盐(MTT)还原法和流式细胞术结合显微镜下检测细胞形态特征的方法，测试评价了本发明式I化合物对小鼠乳腺癌tsFT210细胞、人肺癌A549细胞、人肝癌BEL-7402细胞、小鼠白血病P388细胞、人白血病HL60细胞的细胞增殖抑制、细胞周期抑制和细胞凋亡诱导以及对肿瘤细胞的直接杀伤等作用。实验证实，式I化合物对肿瘤细胞可通过抑制细胞周期周转、诱发癌细胞凋亡或直接的杀伤等方式，显示抑制肿瘤细胞增殖的生物学活性，从而发挥其抗肿瘤作用，尤其对人肺癌A549细胞具有非常强的抗肿瘤活性。
本发明的式I化合物与药物可接受的各种载体、赋形剂或辅料配伍，可制成作细胞周期抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂等抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗。
本发明的式I化合物还可作为抑制细胞周期的低分子生物探针用于生命科学研究。当把式I化合物作为细胞周期抑制剂用于生命科学研究时，可溶于甲醇或含水甲醇中，也可溶于二甲基亚砜的含水溶液中加以应用。
具体实施方式：
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
在如下的实施例中所指的化合物I的化学结构是：式I化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7为氢，R8为甲基，吡喃环取C-2′和C-5′为船头和船尾的船式构型：
式I
实施例1 化合物I的发酵生产及分离精制
1发酵生产
产素菌的发酵培养 按培养微生物的常规方法，取马杜拉放线菌Actinomadura sp.007 CCTCC M204076适量，接种于高氏合成1号琼脂固体斜面培养基上，在28摄氏度培养箱中培养7天。
取斜面培养7天的马杜拉放线菌Actinomadura sp.007 CCTCC M204076适量，接种到一个含100毫升种子培养液(培养基组成：葡萄糖20.0克，K2HPO4 0.5克，MgSO4 0.5克，牛肉膏3.0克，玉米浆3.0克，酵母膏10.0克，淀粉10.0克，CaCO3 2.0克，人工海水1升，调pH7.0)的三角烧瓶中，在28℃、120转/分钟条件下摇床培养48小时，获种子培养液。取该种子培养液，按5％接种量分别接种于100个内装100毫升生产培养液(培养基组成同上)的三角烧瓶中，装载于28℃、120转/分钟摇床上进行为期7天的生产发酵，获得含有吲哚咔唑生物碱类目标化合物的发酵物。相同条件下发酵两次，共获发酵物约20升。
2含化合物I的菌体粗提物的制备
将上述马杜拉放线菌Actinomadura sp.007 CCTCC M204076的发酵物(约20升)抽滤，滤取菌体部分，用1.5升80％丙酮水溶液浸泡并在室温下搅拌过夜提取，4000转/分钟离心15分钟，取上清液，减压浓缩至不含丙酮，所得水层用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得含化合物I的菌体粗浸膏(4.8克)。
3化合物I的分离精制
取含化合物I的Actinomadura sp.007 CCTCC M204076的菌体粗浸膏(4.8克)，用氯仿-甲醇混合溶剂溶解后加20克200-300目硅胶H(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，添加到装填有50克青岛海洋化工集团公司产薄层层析用硅胶H的玻璃减压柱上，以氯仿→氯仿-甲醇混合液为洗脱剂，进行减压柱层析。洗脱溶剂的极性通过提高氯仿中甲醇的用量来梯度递增，每个洗脱流份儿分别接收150毫升，根据薄层层析和活性检测结果，进行合并，得到含化合物I的活性组份Fr-3(520毫克，氯仿-甲醇98∶2→85∶15洗脱物)。将Fr-3同法上硅胶H减压柱，以石油醚-丙酮混合液为洗脱剂，进行减压柱层析，经薄层层析和活性检测，合并相关流份，得到用石油醚-丙酮(5∶5)洗脱的目标化合物部分，再经SephadexLH-20柱层析分离(氯仿-甲醇5∶5洗脱)，得到含化合物I的目标组分Fr-3-6。将该组分Fr-3-6干法上反相硅胶RP-18减压柱，用甲醇-水混合溶剂洗脱，经HPLC检测合并，得到化合物I粗品，再经半制备HPLC(Capcell Pak C18柱，5μm，20×250mm；流动相40％乙腈-水，流速4毫升/分钟，检测波长288纳米)纯化制备，得化合物I纯品(15毫克，保留时间15分钟)。
化合物I淡黄色结晶(氯仿-甲醇)，mp 283.4-285.5℃，[α]D20+83.2(c 0.10，MeOH)，分子式C28H22N4O4。正离子TOF-MS m/z：479[M+H]+；正离子HR-TOF-MS：实测值479.1704，C28H23N4O4[M+H]+ 计算值479.1719。UVλmaxMeOHnm(ε)：232(19613)，243(19020)，275(19720)，290(33212)，318(9936)，332(9636)。IR(KBr)νmaxcm-1：3377(NH)，2924，2935(CH2)，1739(恶唑酮C＝O)，1677(内酰胺C＝O)，1589，1458，1399，1354，1321，1275，1228，1150，1133，1105，1030，774，751。1H及13CNMR数据见表2。
表2 化合物I在氘代DMSO中的600MHz 1H和150MHz 13C NMR数据 No. δH(J in Hz)COSY NOE’s δc HMBC 1 2 7.79brd(8.4) 7.53ddd(8.4，7.6，1.1)H-2H-1，H-3 108.74d 125.51d C-2，C-3，C-4a C-1，C-3，C-4， C-13a 3 4 4a 4b 4c 5 NH 7 7a 7b 7c 8 9 10 11 11a 12a 12b 13a 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 2′-CH3 N-CH3 1″ 7.32brt(7.6) 9.25brd(7.6) - - - - 8.71brs Ha 5.03d(17.2) Hb 4.99d(17.2) - - - 8.05brd(7.4) 7.39brt(7.4) 7.52ddd(8.5，7.4，1.1) 8.07brd(8.5) - - - - - 5.30d(8.8) 4.34ddd(12.0，8.8，5.3) Ha 2.01ddd(13.6，12.0，10.0) He 2.93ddd(13.6，6.0，5.3) 6.97dd(10.0，6.0) 2.03s 2.59s - H-2，H-4 H-3 Hb-7 Ha-7 H-9 H-8，H-10 H-9，H-11 H-11 H-4 H-3′，Ha-5′，He-5′ H-4′，He-5′ H-4′，Ha-5′ Ha-5′，He-5′ H-4′ H-3′，H-6′H-4′，Ha-5′，H-6′，N-CH3 H-1，H-4′，He-5′ 119.62d 125.79d 122.39s 115.81s 120.31s 171.62s - 45.51t 132.98s 115.44s 124.61s 121.24d 120.98d 124.98d 116.65d 140.36s 128.60s 124.61s 136.43s 92.52s 75.41d 52.07d 28.75t 79.18d 29.56q 28.25q 155.66s C-1，C-2，C-4， C-4a，C-13a C-1，C-2，C-3， C-4b，C-13a C-4b，C-4c，C-5， C-7，C-7a，C-7b C-4，C-5，C-7a，C-7b C-4，C-5，C-7a，C-7b C-7b，C-10，C-11a C-7c，C-8，C-11，C-11a C-8，C-9，C-11，C-11a C-7c，C-9，C-10 C-2′，2′-CH3，C-4′， C-5′，C-1″ C-2′，C-3′，C-1″ C-3′，C-4′，C-6′ C-3′，C-4′，C-6′ C-2′，C-5′，C-12b， C-13a C-2′，C-3′ C-4′，C-1″
实施例2 化合物I的体外抗肿瘤活性测试
1实验样品及实验方法
被测样品溶液的配制 测试样品为上述实施例1中分离精制的化合物I纯品。精密称取适量样品，用甲醇配制成所需浓度的溶液，供测活性。
细胞系及细胞的继代培养 采用人肺癌A549细胞、人肝癌BEL-7402细胞、人白血病HL60细胞、小鼠乳腺癌tsFT210细胞及小鼠白血病P388细胞等癌细胞系。各种细胞均用含10％FBS的RPMI-1640培养基，在32℃(tsFT210和P388细胞)或在37℃(A549、HL60及BEL-7402细胞)于通入5％二氧化碳的培养箱中继代培养。
细胞增殖抑制活性测试方法
丽丝胺罗丹明B(SRB)法 取对数生长期的人肺癌A549细胞、人肝癌BEL-7402细胞或小鼠乳腺癌tsFT210细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2×105个细胞的细胞悬液，按每孔200微升接种于96孔板中，每孔加入2微升不同浓度的样品或空白溶液，32℃下培养17小时(tsFT210细胞)或37℃下培养24小时(A549或BEL-7402细胞)。取药物作用下培养后的细胞，首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化，判断有无细胞周期抑制，细胞凋亡或细胞坏死的形态学特征，继而在4℃、3000转/分钟离心3分钟，吸去上清。每孔细胞中加入20％三氯醋酸50微升，置于4℃固定1小时，用水冲洗5次并空气干燥。每孔加入0.4％SRB的醋酸溶液50微升并在室温静置30分钟。用1％醋酸水清洗4次，除去未结合的游离SRB染料。每孔加入150微升Tris缓冲液(10mmol/L，pH10.5)溶解蛋白结合染料并利用MD公司产SPECTRA MAX Plus型酶标仪测定每孔在520nm处的光密度(OD)值。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，另设三孔空白对照和无细胞调零孔(如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零)。各孔OD值先做相应无细胞调零，再取三孔平均OD值按IR％＝(OD空白对照-OD样品)/OD空白对照×100％式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR％)。
四氮唑盐(MTT)法 取对数生长期的人白血病HL60细胞和小鼠白血病P388细胞，将细胞密度调至每毫升2×105个细胞，按每孔200微升接种于96孔细胞培养板中，于37℃通入5％CO2的培养箱中培养4小时。每孔加样品液或空白液各2微升，培养24小时后，每孔加MTT液(MTT的每毫升5毫克生理盐水溶液)10微升，继续培养4小时，37℃、2000转/分钟离心8分钟，吸去上清。每孔加入DMSO各100微升，在微量振荡器上振荡15分钟，至结晶完全溶解后，利用MD公司产SPECTRA MAX Plus型酶标仪测定每孔在570nm处的吸光值(OD值)。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，另设三孔空白对照和无细胞调零孔(如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零)。各孔OD值先做相应无细胞调零，再取三孔平均OD值按IR％＝(OD空白对照-OD样品)/OD空白对照×100％式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR％)。
流式细胞术
取对数生长期的tsFT210细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2×105个细胞的细胞悬液，按每孔0.5毫升接种于24孔板中，每孔加入5微升不同浓度的样品溶液，32℃下培养17小时。取药物作用下培养后的细胞，首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化，判断有无细胞周期抑制，细胞凋亡或细胞坏死的形态学特征，必要时进行拍照。继而将细胞分别从24孔板转移至1.5毫升Eppendorf离心管中，4℃下3000转/分离心3分钟，吸去上清液，加0.5毫升磷酸缓冲溶液(PBS)震荡洗涤一次，相同条件下离心收集细胞，加150微升碘化丙啶(PI)水溶液(在100毫升水中含5毫克PI、100毫克柠檬酸纳和200毫克NP-40)，4℃下染色30分钟后，加入150微升PBS稀释，用流式细胞仪分析测定细胞中DNA的含量分布。细胞在细胞周期各时相中的分布利用库尔特公司产计算机软件WinCycle进行分析计算。
2实验结果
化合物I对癌细胞增殖的抑制活性
在SRB法测试中，化合物I在21和2.1微摩尔的浓度下对小鼠乳腺癌tsFT210细胞增殖的抑制率分别为28.3％和21％。
在SRB法或MTT法测试中，不同浓度的化合物I对人肺癌A549细胞、人肝癌BEL-7402细胞、人白血病HL60细胞和小鼠白血病P388细胞的增殖抑制结果见表3。
表3 不同浓度的化合物I对癌细胞增殖的抑制率(％) 细胞株 化合物I 1×10-4M 1×10-5M 1×10-6M1×10-7M1×10-8M A549 BEL-7402 HL60 P388 92.2％ 85.4％ 100.0％ 87.9％ 86.8％ 70.0％ 100.0％ 72.5％ 82.6％ 57.3％ 76.1％ 62.2％64.2％13.5％18.2％14.3％46.4％4.5％0％12.5％
流式细胞术检测分析结果
tsFT210细胞经化合物I处理17小时后测得的流式细胞术结果见表4。如表4所示，化合物I当在每毫升10微克以上浓度时可将tsFT210细胞的细胞周期显著阻滞在G2/M期，在每毫升100微克时还显示了较弱的细胞凋亡诱导活性。
表4 tsFT210细胞经化合物I处理17小时后在细胞周期各时相中的相对分布浓度(μg/ml) sub-G0/G1％ G0/G1％ S％ G2/M％ 空白对照 1.0 10.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.51 33.8 44.2 13.3 1.2 59.0 55.7 34.3 43.5 7.2 2.0 52.4 55.4
注：本表数据系将tsFT210细胞经碘化丙啶染色后用流式细胞术分析测得结果。
形态学检测结果
在光学倒置显微镜下观测到，经高浓度的化合物I处理后，各种癌细胞呈不同程度的典型的坏死性细胞的形态学特征，表明化合物I在高浓度时对哺乳动物癌细胞具有一定的直接杀伤性细胞毒活性。
3结论
化合物I对多种人癌细胞及哺乳动物癌细胞具有直接杀伤作用和对细胞增殖的抑制、对细胞周期的G2/M期抑制以及细胞凋亡诱导等抗肿瘤活性，尤其是对人肺癌A549细胞具有非常强的增殖抑制作用。这些结果表明化合物I可制成细胞周期抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂等抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗，也可作为抑制细胞周期的低分子生物探针用于生命科学研究。