技术领域
本发明涉及生物技术领域中提取RNA的方法，主要是一种快速从抗辐射菌中提取总RNA的方法，适用 于此类细胞壁结构复杂的细菌的总RNA的提取。
背景技术
抗辐射菌Deinococcus radiodurans是一种革兰氏阴性的非孢子菌，对电离辐射、干燥、紫外线、强 氧化剂和一些化学诱变剂有着极强的抗性。自从抗辐射菌被发现以来，就受到生物、医学和环境工程等领 域的极大关注，纷纷从基因组学、蛋白组学水平对其进行研究。当前对小分子RNA的研究是生物学界的一 项热点，要从这方面研究抗辐射菌Deinococcus radiodurans，如何提取高质量的总RNA是关键。
当前提取组织样本中的总RNA(核糖核酸)的基本方法主要有Trizol(RNA提取试剂)试剂盒、SDS(十 二烷基硫酸钠)法、异硫氰酸胍法、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法、苯酚法等。要提取组织样品中的 总RNA，如何充分裂解组织样品的细胞壁是关键。对于动植物组织样本，一般采取液氮研磨的方式来帮助 裂解组织；而对于一般的细胞和细菌样本，则采用直接加入Trizol等RNA提取剂提取。
抗辐射菌Deinococcus radiodurans的细胞壁可以划分为14-20nm的肽聚糖层和一个未知的分层结 构，在电镜观察下，其结构至少可以分成六层。最初，人们认为抗辐射菌Deinococcus radiodurans是革 兰氏阳性菌，这是由于其细胞壁的肽聚糖层太厚且在革兰氏染色后难以脱色，显革兰氏阳性反应，实际上 它的细胞壁成分和一般革兰氏阴性菌相似。抗辐射菌Deinococcus radiodurans的脂肪酸组成也与众不同， 它既不含羟基脂肪酸、类脂以及庚糖、也不含有多不饱和脂肪酸、环丙基和分支脂肪酸，而是含有一个由 15-、16-、17-以及18-碳饱和或单不饱和脂肪酸组成的混合物。这些就决定了按照一般的细菌的总RNA的 提取方法是无法提取抗辐射菌Deinococcus radiodurans中的总RNA。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术的缺陷，而提供一种快速从抗辐射菌中提取总RNA的方法，一种能快 速从抗辐射菌Deinococcus radiodurans中提取能满足下游分子生物学实验的高质量的总RNA的方法，整 个实验过程快速便捷，提取的总RNA质量高，实验结果重复性好。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。这种快速从抗辐射菌中提取总RNA的方法，包括以下步 骤：
1)、材料：指数生长期的抗辐射菌Deinococcus radiodurans；
2)、提取总RNA：
裂解：加入500μL细胞裂解液(pH7-8)，涡旋混匀；加入120-200υL 50mg/mL溶菌酶，50℃保温15 分钟。
抽提：加入1mL Ezol(上海吉玛制药技术有限公司出品的一种RNA提取液)，室温裂解15分钟；加入 200μL氯仿，离心，取上清，然后加入1.5-2.5倍的异丙醇沉淀。
样品的清洗和保存：清洗RNA样品后加入DEPC水溶解，在-80℃下保存。
3)、RNA质量的检测
通过NanoDrop ND-1000分光光度计(美国NanoDrop科技有限公司)和甲醛琼脂糖变性胶检测提取的总 RNA的纯度、得率和完整性。
在步聚2)中，加入的裂解液的pH为7.5，用量是500-1000μL/mL菌液。在步聚2)中，加入的溶 菌酶的最终浓度是0.95mg/mL。在步聚2)中，加入的异丙醇的体积是上清液体积的2倍。
本发明的有益效果：本技术通过加入细胞裂解液和溶菌酶，使抗辐射菌Deinococcus radiodurans的 细胞壁得到了充分裂解，使在提取抗辐射菌Deinococcus radiodurans总RNA的过程中免除了使用研钵研 磨的过程，简化了实验过程，缩短操作时间，同时也避免了在研磨过程中发生的污染、氧化和总RNA的损 失。该方法同时还适合细胞壁厚、成分复杂的细菌总RNA的提取。
附图说明
图1是本发明提取的抗辐射菌中总RNA的电泳图；
图2是本发明提取总RNA后取RT PCR(反转录聚合酶链式反应)后的产物的电泳图；
其中，图1上的2个样品是重复；图2中1：16S rRNA(16S核糖体核糖核酸)；2：SAM riboswitch(S- 甲腺甲硫氨酸核开关)；3：Pyrococcus C/D box sma11 nucleolar RNA(Pyrococcus C/D方块小核仁RNA)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步地详细 描述：
这种快速从抗辐射菌Deinococcus radiodurans中提取总RNA的方法，包括以下步骤：
1、取1mL指数生长期的抗辐射菌液入2mL离心管，室温下4,000rpm离心4分钟，去上清。加500μL细 胞裂解液，充分混匀，使菌悬浮在裂解液中，然后加入120-200μL 50mg/mL溶菌酶，振荡混匀，50℃保 温15分钟；
注意：上清要尽量去干净，细胞裂解液(pH7-8)的配方是：10mM Tris-HCl(pH7.5)(三羟甲基 氨基甲烷-盐酸缓冲液)，10mM EDTA(pH8.0)(乙二胺四乙酸)，0.5％(g/v)SDS。溶菌酶的最终浓度 是0.95-1.5mg/mL。
2、加入1mL Ezol，室温放置15分钟。在1.5mL离心管中加入200μL氯仿，充分混匀，4℃，12,000× g，离心15分钟；
3、取上清，加到一个新的EP管中，加入1mL异丙醇，充分混匀，-20℃沉淀过夜；
注意：异丙醇的最佳用量是取上清液的1.5-2.5倍。如果实验最终需要的是mRNA，沉淀时间是2个小 时左右，如果实验的目的是小RNA，则需要沉淀过夜。
4、4℃，12,000×rpm，离心10分钟，去上清，加1mL75％乙醇；4℃，7,500×g，离心5分钟，去上清， 真空干燥.溶于30μL DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水，待用。
5、加1μL样品溶液到NanoDrop ND-1000分光光度计中，测定其纯度；然后加入1μg左右的总RNA， 1％甲醛琼脂糖MOPS(3-吗啉丙磺酸)胶，60V，40分钟，检测其完整性。
注意：本实验中所用耗材均在0.01％的DEPC水中浸泡过夜，然后120℃灭菌20分钟；DEPC处理水(RNase Free)是将0.01％的DEPC水在37℃下放置16小时，然后120℃灭菌20分钟。
经NanoDrop测定(表1)，本发明提取的总RNA的A260nm/A280nm的值为2.00左右，得率每微升菌能 提取35μg左右的总RNA，这说明本发明提取的总RNA的纯度很高。电泳结果(图1)表明，本发明提取的总 RNA的23S rRNA(23S核糖体核糖核酸)、16S rRNA和5S rRNA(5S核糖体核糖核酸)三条电泳条带清晰明 亮，5S带浅，且23S/16S的亮度比大约为2：1，这表明本发明提取的总RNA是完整的、高质量的。
将本发明提取的总RNA进行反转录聚合酶链式(RT PCR)反应，在200μLPCR管中加入2μL经DNase 1(脱氧核糖核酸酶1)(Rnase Free(无核糖核酸酶))处理总RNA，1μL反向引物，7μL DEPC水，70℃ 保温5分钟，然后冰上放置3分钟。再依次加入：dNTP(脱氧核苷三磷酸)2μL、5×RT buffer(5×反转 录缓冲液)4μL、RNase inhibitor(核糖核酸酶抑制剂)1μL、Rtase(核糖核酸反转录酶)1μL、DEPC 水2μL，42℃保温60分钟，然后70℃放置10分钟，冰上放置3分钟。取0.4μL cDNA(互补脱氧核糖核酸) 为模板进行PCR，反应条件是：95℃ 5分钟；95℃ 15秒，60℃ 31秒，40个循环。然后将PCR产物进行2％琼 脂糖凝胶电泳，结果见图2。从电泳图上看出，条带大小和设计的目的片段相吻合，这说明本发明提取的 总RNA符合下游分子生物学实验的要求。
表1
实验号 RNA含量(μg mL-1) A260/A280 1 35.2±3.0 2.00±0.01
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围 内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。