技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高通量检测牛常见遗传缺陷的引物组及试剂盒。
背景技术
在奶牛育种中，由于后裔测定、基因组选择等现代育种技术的应用，在极大地提高了选择准确性的同时，也潜在地提高了选择强度。由于人工授精(AI)等繁殖生物技术的应用，使个别优秀种公牛得到广泛使用，增加了群体的近交系数，降低了有效群体含量，隐性基因纯合的概率加大，使不良基因在奶牛群体中不断出现。
近年来，为了提高奶牛的生产性能，我国大量从国外引进遗传物质，促进了国内奶牛群体的遗传改良。然而，在引进遗传物质的过程中也导致了一些遗传缺陷在我国奶牛群体的传播，这导致近年来奶牛育种工作者在重视优秀种公牛生产性能表现的同时，更加重视优秀种公牛是否携带一些不良隐性基因的影响。
牛脊柱畸形综合征(Complex Vertebral Malformation，CVM)是由常染色体上SLC35A3基因第4外显子(exon4)的第559位的单碱基突变(G/T)引起的，该碱基突变是错义突变，导致第180位氨基酸的改变(Val→Phe)，CVM呈隐性遗传,纯合时可以造成妊娠早期流产、死胎或犊牛出生后很快死亡，患畜最显著的特征为脊椎弯曲畸形、两前腿筋腱缩短、颈短、心脏畸形等综合症状。
牛白细胞黏附缺陷症(Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency，BLAD)是一种常染色体上单基因控制的隐性遗传缺陷疾病,是由CD18基因第2外显子(exon2)的第55位的单碱基突变(A/G)引起的,该突变是错义突变,使128位天门冬氨酸变成甘氨酸,导致白细胞表面的β2整合素表达明显减少或缺乏而引起临床发病。临床表现为严重的重复性感染、脓液形成减弱、伤口愈合延迟和白细胞增多为主要特征，也表现在犊牛初生重低和发育不良等症状。
牛尿苷酸合成酶缺失症(bovine deficiency of uridine monophosphate synthase，DUMPS)，是在荷斯坦和红荷斯坦牛群中存在一个隐性遗传缺陷基因，纯合时可以造成40天左右胚胎早期流产。DUMPS是由常染色体上UMPS(Uridine Monophosphate Synthase)基因第5外显子(exon5)的第55位的单碱基突变(C/T)引起的，该碱基突变是无义突变，导致氨基酸编码序列的终止(Arg405stop)。
牛并趾症(Syndactyly)，也称为骡蹄症(Mule-foot，MF)，是一种常染色体的隐性遗传病，但在不同品种中表现不同的外显率，感染者一般一只或多只蹄子均可表现骡蹄。Duchesne(2006)对36个患有骡蹄症的荷斯坦母牛进行了研究，发现所有患病个体的低密度脂蛋白受体结合蛋白(Low Density Lipoprotein Receptor—related Protein 4，LPR4)基因第33外显子第26-27位碱基发生了两个连续突变(CG/AT)，导致LRP4蛋白的两个遗传密码发生发改变，改变了保守性的类表皮样生长因子蛋白的结构。由于两个突变为紧密连锁的连续突变，实际应用中可直接检测LPR4基因第33外显子的第26位的单碱基突变C/A。
牛瓜氨酸血症(Citrullinemia，CN)是荷斯坦牛中的一种常染色体上基因突变引起的隐形遗传缺陷疾病。患病犊牛主要表现为血液和尿液中瓜氨酸含量升高，尿素循环受阻引起高氨血症，从而导致犊牛在出生一周内死亡。该病的致病机理为ASS基因的表达缺陷所致，其分子遗传学基础是位于奶牛第11号染色体(BTA11)上ASS基因的第4外显子(exon4)的第82位的单碱基突变(C/T)引起，导致ASS基因表达缺陷而引起疾病的发生。
牛蜘蛛腿综合征(Arachnomelia syndrome,AS)是一种先天性致死性遗传疾病，患病犊牛体重较轻，头部、背部和四肢骨骼均表现畸形，出生时或出生不久后死亡。该遗传缺陷疾病主要存在于德系西门塔尔牛和瑞士褐牛群体中。在瑞士褐牛群体中，AS是由位于牛第5号染色体BTA5上的SUOX基因外显子4上的一个G碱基的插入c.363-364insG突变所致。插入突变会导致亚硫酸盐氧化酶的氨基酸序列从124位发生移码突变,提前产生终止密码子，导致发病。在西门塔尔牛群体中，AS是由位于牛23号染色体上的MOCS1基因外显子11上的一个2bp缺失突变c.1224_1225delCA引起的，该突变将造成移码突变，产生不成熟的短链蛋白，导致MoaC结构域丢失，进而引起编码的蛋白MOCS1A功能丧失。无论在哪个群体该遗传疾病的爆发都源于大量使用携带者公牛冻精造成致病基因的广泛传播，从而导致患病犊牛的出现。
HH1单倍型是在荷斯坦牛群体中发现一种新的遗传缺陷单倍型，隐性基因纯合时导致奶牛胚胎早期流产，严重影响奶牛的繁殖。分子遗传基础是牛5号染色体上APAF1基因第11外显子(exon11)的第127位的单碱基突变(C/T)引起的，该无义突变使编码谷氨酰胺的密码子突变为终止密码子，导致APAF1基因编码的蛋白质缺失约1/3而丧失其功能所导致。
HH3单倍型是在荷斯坦牛群体中发现一种新的遗传缺陷单倍型，隐性基因纯合时导致奶牛胚胎早期流产，严重影响奶牛的繁殖。牛8号染色体SMC2基因第24外显子(exon24)的第135位的单碱基突变(T/C)引起的，导致编码的氨基酸由苯丙氨酸突变为丝氨酸，SMC2基因在染色体结构的维持和DNA的修复中起关键作用，突变导致SMC2基因功能异常，最终导致胚胎死亡。
HH4单倍型是在荷斯坦牛群体中发现一种新的遗传缺陷单倍型，隐性基因纯合时导致奶牛胚胎早期流产，严重影响奶牛的繁殖。HH4遗传缺陷单倍型的致病机理是牛1号染色体的GART基因第11外显子(exon11)的第58位的单碱基突变(A/C)引起的，导致编码氨基酸从天冬酰胺突变为苏氨酸。由于GART基因编码甘氨酰胺核苷酸转甲酰基转移酶，而该物质在嘌呤的生物合成中起关键作用，发生突变后GART功能丧失，使得嘌呤无法合成，最终导致胚胎在妊娠早期死亡。
我国对奶牛遗传缺陷基因已开展了相关的研究和检测工作，但基本都是基于单遗传缺陷的诊断，严重制约了检测效率及成果的转化应用。现有技术中，牛遗传缺陷主要诊断方法为：PCR(Polymerase Chain Reaction)、限制性片段长度多态性(restrition fragment length polymophism，RFLP)、SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism，单链构象多态性)分析、KASP(Kompetitive Allele Specific PCR)。均针对单遗传缺陷的点突变，无法实现对众多的遗传缺陷基因实现高通量的分型鉴定。因此，建立一种高通量、快速的检测牛遗传缺陷基因的分型方法，并制定合理选种选配方案，是降低遗传缺陷带来危害的最好方法。所以，建立一种高通量的牛遗传缺陷基因筛查方法是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种高通量检测牛常见遗传缺陷的引物组及试剂盒。
本发明提供了引物组甲，由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10组成；
引物对1由引物1-HC-F和引物1-HC-R组成；引物1-HC-F如序列表的序列1所示；引物1-HC-R如序列表的序列2所示；
引物对2由引物2-HB-F和引物2-HB-R组成；引物2-HB-F如序列表的序列3所示；引物2-HB-R如序列表的序列4所示；
引物对3由引物3-HD-F和引物3-HD-R组成；引物3-HD-F如序列表的序列5所示；引物3-HD-R如序列表的序列6所示；
引物对4由引物4-HM-F和引物4-HM-R组成；引物4-HM-F如序列表的序列7所示；引物4-HM-R如序列表的序列8所示；
引物对5由引物5-HN-F和引物5-HN-R组成；引物5-HN-F如序列表的序列9所示；引物5-HN-R如序列表的序列10所示；
引物对6由引物6-HAS-F和引物6-HAS-R组成；引物6-HAS-F如序列表的序列11所示；引物6-HAS-R如序列表的序列12所示；
引物对7由引物7-HAM-F和引物7-HAM-R组成；引物7-HAM-F如序列表的序列13所示；引物7-HAM-R如序列表的序列14所示；
引物对8由引物8-H1-F和引物8-H1-R组成；引物8-H1-F如序列表的序列15所示；引物8-H1-R如序列表的序列16所示；
引物对9由引物9-H3-F和引物9-H3-R组成；引物9-H3-F如序列表的序列17所示；引物9-H3-R如序列表的序列18所示；
引物对10由引物10-H4-F和引物10-H4-R组成；引物10-H4-F如序列表的序列19所示；引物10-H4-R如序列表的序列20所示。
所述引物组甲中，将所有引物混合包装。
本发明还提供了引物组乙，由扩增引物组和延伸引物组组成；
所述扩增引物组为所述引物组甲；
所述延伸引物组由引物1-HC-YS-F、引物2-HB-YS-R、引物3-HD-YS-R、引物4-HM-YS-R、引物5-HN-YS-R、引物6-HAS-YS-F、引物7-HAM-YS-R、引物8-H1-YS-R、引物9-H3-YS-F和引物10-H4-YS-R组成；
引物1-HC-YS-F如序列表的序列21所示；引物2-HB-YS-R如序列表的序列22所示；引物3-HD-YS-R如序列表的序列23所示；引物4-HM-YS-R如序列表的序列24所示；引物5-HN-YS-R如序列表的序列25所示；引物6-HAS-YS-F如序列表的序列26所示；引物7-HAM-YS-R如序列表的序列27所示；引物8-H1-YS-R如序列表的序列28所示；引物9-H3-YS-F如序列表的序列29所示；引物10-H4-YS-R如序列表的序列30所示。
所述引物组乙中，扩增引物组和延伸引物组分别包装。扩增引物组中的所有引物混合包装。延伸引物组中的所有引物混合包装。
本发明还保护所述引物组甲或所述引物组乙在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为鉴定多种牛遗传缺陷；所述多种牛遗传缺陷为牛脊柱畸形综合征、牛白细胞黏附缺陷症、牛尿苷酸合成酶缺失症、牛并趾症、牛瓜氨酸血症、牛蜘蛛腿综合征、牛HH1单倍型、牛HH3单倍型和牛HH4单倍型。
本发明还保护所述引物组甲或所述引物组乙在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为鉴定多种牛遗传缺陷；所述多种牛遗传缺陷为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)、(Ⅵ)、(Ⅶ)、(Ⅷ)、(Ⅸ)和(Ⅹ)：
(Ⅰ)SLC35A3基因第4外显子的第559位的单核苷酸突变G/T；
(Ⅱ)CD18基因第2外显子的第55位的单核苷酸突变A/G；
(Ⅲ)UMPS基因第5外显子的第55位的单核苷酸突变C/T；
(Ⅳ)LPR4基因第33外显子的第26位的单核苷酸突变C/A；
(Ⅴ)ASS基因第4外显子的第82位的单核苷酸突变C/T；
(Ⅵ)SUOX基因的c.363-364insG突变；
(Ⅶ)MOCS1基因的c.1224_1225delCA突变；
(Ⅷ)APAF1基因第11外显子的第127位的单核苷酸突变C/T；
(Ⅸ)SMC2基因第24外显子的第135位的单核苷酸突变T/C；
(Ⅹ)GART基因第11外显子的第58位的单核苷酸突变A/C。
本发明还保护所述引物组甲或所述引物组乙在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为鉴定待测牛是否为多种牛遗传缺陷的携带者；所述多种牛遗传缺陷为牛脊柱畸形综合征、牛白细胞黏附缺陷症、牛尿苷酸合成酶缺失症、牛并趾症、牛瓜氨酸血症、牛蜘蛛腿综合征、牛HH1单倍型、牛HH3单倍型和牛HH4单倍型。
本发明还保护所述引物组甲或所述引物组乙的应用；所述应用为鉴定多种牛遗传缺陷；所述多种牛遗传缺陷为牛脊柱畸形综合征、牛白细胞黏附缺陷症、牛尿苷酸合成酶缺失症、牛并趾症、牛瓜氨酸血症、牛蜘蛛腿综合征、牛HH1单倍型、牛HH3单倍型和牛HH4单倍型。
本发明还保护所述引物组甲或所述引物组乙的应用；所述应用为鉴定多种牛遗传缺陷；所述多种牛遗传缺陷为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)、(Ⅵ)、(Ⅶ)、(Ⅷ)、(Ⅸ)和(Ⅹ)：
(Ⅰ)SLC35A3基因第4外显子的第559位的单核苷酸突变G/T；
(Ⅱ)CD18基因第2外显子的第55位的单核苷酸突变A/G；
(Ⅲ)UMPS基因第5外显子的第55位的单核苷酸突变C/T；
(Ⅳ)LPR4基因第33外显子的第26位的单核苷酸突变C/A；
(Ⅴ)ASS基因第4外显子的第82位的单核苷酸突变C/T；
(Ⅵ)SUOX基因的c.363-364insG突变；
(Ⅶ)MOCS1基因的c.1224_1225delCA突变；
(Ⅷ)APAF1基因第11外显子的第127位的单核苷酸突变C/T；
(Ⅸ)SMC2基因第24外显子的第135位的单核苷酸突变T/C；
(Ⅹ)GART基因第11外显子的第58位的单核苷酸突变A/C。
本发明还保护所述引物组甲或所述引物组乙的应用；所述应用为鉴定待测牛是否为多种牛遗传缺陷的携带者；所述多种牛遗传缺陷为牛脊柱畸形综合征、牛白细胞黏附缺陷症、牛尿苷酸合成酶缺失症、牛并趾症、牛瓜氨酸血症、牛蜘蛛腿综合征、牛HH1单倍型、牛HH3单倍型和牛HH4单倍型。
如果SLC35A3基因第4外显子的第559位的基因型为GT杂合型，待测牛为牛脊柱畸形综合征的携带者。如果CD18基因第2外显子的第55位的基因型为AG杂合型，待测牛为牛白细胞黏附缺陷症的携带者。如果UMPS基因第5外显子的第55位的基因型为CT杂合型，待测牛为牛尿苷酸合成酶缺失症的携带者。如果LPR4基因第33外显子的第26位的基因型为CA杂合型，待测牛为牛并趾症的携带者。如果ASS基因第4外显子的第82位的基因型为CT杂合型，待测牛为牛瓜氨酸血症的携带者。如果SUOX基因的c.363-364insG突变为杂合型，待测牛为牛蜘蛛腿综合征携带者。如果MOCS1基因的c.1224_1225delCA突变为杂合型，待测牛为牛蜘蛛腿综合征携带者。如果APAF1基因第11外显子的第127位的基因型为CT杂合型，待测牛为牛HH1单倍型携带者。如果SMC2基因第24外显子的第135位的基因型为TC杂合型，待测牛为牛HH3单倍型携带者。如果GART基因第11外显子的第58位的基因型为AC杂合型，待测牛为牛HH1单倍型携带者。
如果SLC35A3基因第4外显子的第559位的基因型为TT纯合型，待测牛为牛脊柱畸形综合征的患者。如果CD18基因第2外显子的第55位的基因型为GG纯合型，待测牛为牛白细胞黏附缺陷症的患者。如果UMPS基因第5外显子的第55位的基因型为TT纯合型，待测牛为牛尿苷酸合成酶缺失症的患者。如果LPR4基因第33外显子的第26位的基因型为AA纯合型，待测牛为牛并趾症的患者。如果ASS基因第4外显子的第82位的基因型为TT纯合型，待测牛为牛瓜氨酸血症的患者。如果SUOX基因的c.363-364insG突变为突变纯合型，待测牛为牛蜘蛛腿综合征患者。如果MOCS1基因的c.1224_1225delCA突变为突变纯合型，待测牛为牛蜘蛛腿综合征患者。如果APAF1基因第11外显子的第127位的基因型为TT纯合型，待测牛为牛HH1单倍型患者。如果SMC2基因第24外显子的第135位的基因型为CC纯合型，待测牛为牛HH3单倍型患者。如果GART基因第11外显子的第58位的基因型为CC纯合型，待测牛为牛HH1单倍型患者。
本发明还保护一种鉴定多种牛遗传缺陷的方法，其特征在于：
采用SNaPshot技术鉴定多种牛遗传缺陷；所述多种牛遗传缺陷为牛脊柱畸形综合征、牛白细胞黏附缺陷症、牛尿苷酸合成酶缺失症、牛并趾症、牛瓜氨酸血症、牛蜘蛛腿综合征、牛HH1单倍型、牛HH3单倍型和牛HH4单倍型；
所述SNaPshot技术中采用扩增引物组进行多重PCR；所述扩增引物组为所述的扩增引物组；所述SNaPshot技术中采用延伸引物组进行单碱基延伸；所述延伸引物组为所述的延伸引物组。
本发明还保护一种鉴定多种牛遗传缺陷的方法，其特征在于：
采用SNaPshot技术鉴定多种牛遗传缺陷；
所述SNaPshot技术中采用扩增引物组进行多重PCR；所述扩增引物组为所述的扩增引物组；所述SNaPshot技术中采用延伸引物组进行单碱基延伸；所述延伸引物组为所述的延伸引物组；
所述多种牛遗传缺陷为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)、(Ⅵ)、(Ⅶ)、(Ⅷ)、(Ⅸ)和(Ⅹ)：
(Ⅰ)SLC35A3基因第4外显子的第559位的单核苷酸突变G/T；
(Ⅱ)CD18基因第2外显子的第55位的单核苷酸突变A/G；
(Ⅲ)UMPS基因第5外显子的第55位的单核苷酸突变C/T；
(Ⅳ)LPR4基因第33外显子的第26位的单核苷酸突变C/A；
(Ⅴ)ASS基因第4外显子的第82位的单核苷酸突变C/T；
(Ⅵ)SUOX基因的c.363-364insG突变；
(Ⅶ)MOCS1基因的c.1224_1225delCA突变；
(Ⅷ)APAF1基因第11外显子的第127位的单核苷酸突变C/T；
(Ⅸ)SMC2基因第24外显子的第135位的单核苷酸突变T/C；
(Ⅹ)GART基因第11外显子的第58位的单核苷酸突变A/C。
SNaPshot技术，是由美国应用生物公司(ABI)开发，基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序。适用中等通量的SNP分型检测。核心反应(即延伸反应)体系中包含：测序酶；四种荧光标记ddNTP；紧挨多态位点5’-端的不同长度延伸引物；包含SNP位点的PCR产物模板。通过反应，引物延伸一个碱基即终止，再经测序仪检测，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。
本发明建立了一种高通量、快速的检测牛主要遗传缺陷的分型方法，为牛遗传缺陷的分子筛查提供一种新方法，提高了检测效率，有助于成果的转化应用，为在今后的育种工作中有计划地降低遗传缺陷基因频率提供了技术支撑，为奶牛场进行科学的选种选配提供了依据。
附图说明
图1为实施例2中扩增引物组中各个引物对的特异性。
图2为牛脊椎畸形综合征携带者的分型图谱。
图3为牛白细胞黏附缺陷症携带者的分型图谱。
图4为牛尿苷酸合成酶缺失症正常个体的分型图谱。
图5为牛并趾症携带者的分型图谱。
图6为牛瓜氨酸血症正常个体的分型图谱。
图7为瑞士褐牛蜘蛛腿综合征正常个体的分型图谱。
图8为西门塔尔牛蜘蛛腿综合征正常个体的分型图谱。
图9为牛HH1单倍型携带者的分型图谱。
图10为牛HH3单倍型携带者的分型图谱。
图11为牛HH4单倍型携带者的分型图谱。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
10×Buffer I：ABI,4323163。ABI Mix：ABI,4323163。SAP为碱性磷酸酶：Thermo scientific-fermentas,EF0511。ExoI为核酸外切酶I：NEB,M0293S。CIP为碱性磷酸酶：NEB,M0290S。荷斯坦公牛：北京市种公牛站。
Ensembl数据库的牛基因组序列(UMD 3.1)，SLC35A3(BTA3:
43412524-43412324),CD18(BTA1：145114663-145115263),UMPS(BTA1：
69756580-69757180),LPR4(BTA15：77675216-77675816),ASS(BTA11：
100802481-100803081),SUOX(BTA5：57641033-57641633),MOCS1(BTA23：
13833571-13834171),APAF1(BTA5：63150100-63150700),SMC2(BTA8：
95410207-95410807),GART(BTA1：1276927-1277527)。
实施例1、引物组的设计
进行大量引物设计、引物筛选、多引物组合效果验证。
获得可以进行多重PCR的一个扩增引物组。扩增引物组由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10组成。
引物对1，又称为引物对HC，用于扩增SLC35A3基因片段(331bp)，由上游引物1-HC-F和下游引物1-HC-R组成。
1-HC-F(序列表的序列1)：5’-AGTGGCCCTCAGATTCTCAAG-3’；
1-HC-R(序列表的序列2)：5’-AAAGGAACCAAAAGGGATGTG-3’。
引物对2，又称为引物对HB，用于扩增CD18基因片段(213bp)，由上游引物2-HB-F和下游引物2-HB-R组成。
2-HB-F(序列表的序列3)：5’-CCCTGACTCTCTCCCAAATCC-3’；
2-HB-R(序列表的序列4)：5’-GAGTAGCTGCCTCACCAATGC-3’。
引物对3，又称为引物对HD，用于扩增UMPS基因片段(195bp)，由上游引物3-HD-F和下游引物3-HD-R组成。
3-HD-F(序列表的序列5)：5’-TTGATTACATTCCATTCAGGTGC-3’；
3-HD-R(序列表的序列6)：5’-TATTTTGCTGACTTGGAAAAAGC-3’。
引物对4，又称为引物对HM，用于扩增LPR4基因片段(167bp)，由上游引物4-HM-F和下游引物4-HM-R组成。
4-HM-F(序列表的序列7)：5’-ATCTCCTCCATTTGGAGAAGC-3’；
4-HM-R(序列表的序列8)：5’-CTCATCAGGACAGGCACACAC-3’。
引物对5，又称为引物对HN，用于扩增ASS基因片段(260bp)，由上游引物5-HN-F和下游引物5-HN-R组成。
5-HN-F(序列表的序列9)：5’-TTAGACACAGGCCATCGGAG-3’；
5-HN-R(序列表的序列10)：5’-CCGTGAGACACATACTTGGCT-3’。
引物对6，又称为引物对HAS，用于扩增SUOX基因片段(259bp)，由上游引物6-HAS-F和下游引物6-HAS-R组成。
6-HAS-F(序列表的序列11)：5’-GGAAGTGAAATCCCACAGCAG-3’；
6-HAS-R(序列表的序列12)：5’-TCAGAGGTCTTCAAGATGGAGG-3’。
引物对7，又称为引物对HAM，用于扩增MOCS1基因片段(233bp)，由上游引物7-HAM-F和下游引物7-HAM-R组成。
7-HAM-F(序列表的序列13)：5’-TTTGGACTGAGTCTCCTCTTCTG-3’；
7-HAM-R(序列表的序列14)：5’-GAACTGAAGTGTCTCTGAGGGAG-3’。
引物对8，又称为引物对H1，用于扩增APAF1基因片段(260bp)，由上游引物8-H1-F和下游引物8-H1-R组成。
8-H1-F(序列表的序列15)：5’-ATGGACATCTTCTTGGACGACAG-3’；
8-H1-R(序列表的序列16)：5’-AGTTCCAGCCCTTTCTAGGAAGT-3’。
引物对9，又称为引物对H3，用于扩增SMC2基因片段(255bp)，由上游引物9-H3-F和下游引物9-H3-R组成。
9-H3-F(序列表的序列17)：5’-AGTGGCTCTGTCATTAATCCTGTC-3’；
9-H3-R(序列表的序列18)：5’-CAACACCTTGGTATTCTTCAATCC-3’。
引物对10，又称为引物对H4，用于扩增GART基因片段(192bp)，由上游引物10-H4-F和下游引物10-H4-R组成。
10-H4-F(序列表的序列19)：5’-GAAGGTGTCCTCTATGCTGGTAT-3’；
10-H4-R(序列表的序列20)：5’-TCACTGAAATATCAGAATTTGCAT-3’。
获得与扩增引物组中的各个引物对相对应的单碱基延伸引物，按照与引物对对应的顺序，依次命名为单碱基延伸引物1(1-HC-YS-F)、单碱基延伸引物2(2-HB-YS-R)、单碱基延伸引物3(3-HD-YS-R)、单碱基延伸引物4(4-HM-YS-R)、单碱基延伸引物5(5-HN-YS-R)、单碱基延伸引物6(6-HAS-YS-F)、单碱基延伸引物7(7-HAM-YS-R)、单碱基延伸引物8(8-H1-YS-R)、单碱基延伸引物9(9-H3-YS-F)和单碱基延伸引物10(10-H4-YS-R)。单碱基延伸引物1至单碱基延伸引物10组成延伸引物组。单碱基延伸引物中F代表正向引物，R代表反向引物。目标突变位点即单碱基延伸引物的目标延伸位点。当单碱基延伸引物为正向引物时，目标突变位点为靶序列中与该引物相同的区段的下游相邻核苷酸。当单碱基延伸引物为反向引物时，目标突变位点为靶序列中与该引物反向互补的区段的上游相邻核苷酸。1-HC-YS-F对应的目标突变位点为SLC35A3基因第4外显子的第559位的单核苷酸突变G/T。2-HB-YS-R对应的目标突变位点为CD18基因第2外显子的第55位的单核苷酸突变A/G。3-HD-YS-R对应的目标突变位点为UMPS基因第5外显子的第55位的单核苷酸突变C/T。4-HM-YS-R对应的目标突变位点为LPR4基因第33外显子的第26位的单核苷酸突变C/A。5-HN-YS-R对应的目标突变位点为ASS基因第4外显子的第82位的单核苷酸突变C/T。6-HAS-YS-F对应的目标突变位点为SUOX基因的c.363-364insG突变。7-HAM-YS-R对应的目标突变位点为MOCS1基因的c.1224_1225delCA突变。8-H1-YS-R对应的目标突变位点为APAF1基因第11外显子的第127位的单核苷酸突变C/T。9-H3-YS-F对应的目标突变位点为SMC2基因第24外显子的第135位的单核苷酸突变T/C。10-H4-YS-R对应的目标突变位点为GART基因第11外显子的第58位的单核苷酸突变A/C。
1-HC-YS-F(序列表的序列21)：5’-CACAATTTGTAGGTCTCATGGCA-3’；
2-HB-YS-R(序列表的序列22)：5’-GGAGAGGTCCATCAGGTAGTACAGG-3’；
3-HD-YS-R(序列表的序列23)：5’-AAGAAATTCTGGTTTCATGCTTACTC-3’；
4-HM-YS-R(序列表的序列24)：5’-AGCAGAGGTGAGTGCATCCGC-3’；
5-HN-YS-R(序列表的序列25)：5’-AGAGAGGTGCCCAGGAGGTATC-3’；
6-HAS-YS-F(序列表的序列26)：5’-TGGACATACACCCAGGGGGGG-3’；
7-HAM-YS-R(序列表的序列27)：5’-CTGGCTGGAGAAACTCACTCTGT-3’；
8-H1-YS-R(序列表的序列28)：5’-GCTTGGCCTGCAGCTTAGCTT-3’；
9-H3-YS-F(序列表的序列29)：5’-ATTGGACATATGCTACGTACTCATT-3’；
10-H4-YS-R(序列表的序列30)：5’-TCTGGATCACCGAAACGGCAA-3’。
实施例2、扩增引物组中各个引物对的特异性
分别检测引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10的特异性。
1、提取荷斯坦公牛血液的基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用引物对进行PCR扩增。
PCR扩增的反应体系均为(10μL)：1μl 10×Buffer I、0.8μl 2.5μM dNTP溶液、1μl上游引物溶液、1μl下游引物溶液、0.1μL 5U/μL Hs Taq DNA聚合酶溶液、2μl 10-20ng/μL模板DNA溶液，余量为ddH2O。上游引物溶液中，上游引物的浓度为1μM。下游引物溶液中，下游引物的浓度为1μM。
PCR扩增的反应程序均为：95℃5min；95℃30s、退火30s(第1个循环退火温度为60℃、第2个循环退火温度为59℃、第3个循环退火温度为58℃、第4个循环退火温度为57℃、第5个循环退火温度为56℃)、72℃30s，5个循环；95℃30s、55℃30s、72℃30s，30个循环；72℃10min。
3、步骤2的PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。
结果见图1。结果表明：各个引物对的扩增产物均显示单一条带，无非特异性扩增的杂带，均特异性良好。
实施例3、扩增引物组和延伸引物组配套使用的效果验证
待测样本为：荷斯坦公牛的血液。
1、提取待测样本的基因组DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用扩增引物组进行多重PCR扩增。
反应体系(10μL)：1μl 10×Buffer I、0.8μl 2.5μM dNTP溶液、2μl引物混合物溶液(引物混合物溶液中，具有扩增引物组的所有引物，每种引物的浓度均为5μM)、0.1μL 5U/μL Hs Taq DNA聚合酶溶液、2μl 10-20ng/μL模板DNA溶液，余量为ddH2O。
反应程序：95℃5min；95℃30s、退火30s(第1个循环退火温度为60℃、第2个循环退火温度为59℃、第3个循环退火温度为58℃、第4个循环退火温度为57℃、第5个循环退火温度为56℃)、72℃30s，5个循环；95℃30s、55℃30s、72℃30s，30个循环；72℃10min。
3、完成步骤2后，取4μl扩增产物，进行消化。
反应体系：4μl扩增产物，1.33μl 1U/μL SAP溶液、0.27μl 20U/μL ExoI溶液。
反应条件：37℃1h，75℃20min。
4、完成步骤3后，取1.2μL消化产物，进行单碱基延伸反应。
反应体系(6μl)：1.2μL消化后扩增产物、2.0μL延伸引物组溶液(延伸引物组溶液中，具有延伸引物组的所有引物，1-HC-YS-F的浓度为0.5μM、2-HB-YS-R的浓度为0.8μM、3-HD-YS-R的浓度为1.0μM、4-HM-YS-R的浓度为0.3μM、5-HN-YS-R的浓度为0.5μM、6-HAS-YS-F的浓度为0.3μM、7-HAM-YS-R的浓度为0.5μM、8-H1-YS-R的浓度为0.3μM、9-H3-YS-F的浓度为0.8μM、10-H4-YS-R的浓度为μ0.3M)、0.5μL ABI Mix、0.4μL 10×Buffer I，余量为H2O。
反应条件：96℃10s、50℃5s、60℃30s，30个循环。
5、取5.6μL步骤4得到的延伸反应产物，加入1μl CIP溶液，充分混匀，然后37℃静置1小时，然后75℃静置15min。
6、取96孔板，每孔加入9μL混合物(0.5μL分子量内标和8.5μL甲酰胺的混合物)和1μL步骤5的反应产物，95℃变性3min，在3730xl上进行分型检测。
每个样本的各个目标突变均能获得有效检测结果。在获自476头荷斯坦公牛的476例样本中：21例样本的SLC35A3基因第4外显子的第559位的单核苷酸突变G/T的基因型为GT杂合型，为牛脊柱畸形综合征携带者，携带率为4.4％；3例样本的CD18基因第2外显子的第55位的单核苷酸突变A/G的基因型为AG杂合型，为牛白细胞黏附缺陷症携带者，携带率为0.6％；9例样本的LPR4基因第33外显子的第26位的单核苷酸突变C/A的基因型为CA杂合型，为牛并趾症携带者，携带率为1.9％；22例样本的APAF1基因第11外显子的第127位的单核苷酸突变C/T的基因型为CT杂合型，为HH1单倍型携带者，携带率为4.6％；14例样本的SMC2基因第24外显子的第135位的单核苷酸突变T/C的基因型为TC杂合型，为HH3单倍型携带者，携带率为2.9％；2例样本的GART基因第11外显子的第58位的单核苷酸突变A/C的基因型为AC杂合型，为HH4单倍型携带者，携带率为0.4％；1例样本的SLC35A3基因第4外显子的第559位的单核苷酸突变G/T的基因型为GT杂合型且APAF1基因第11外显子的第127位的单核苷酸突变C/T的基因型为CT杂合型，为牛脊柱畸形综合征和HH1单倍型的同时携带者。其他未描述的目标突变也都得到了有效检测结果，均为野生纯合基因型的正常个体。
牛脊椎畸形综合征携带者的分型图谱见图2。牛白细胞黏附缺陷症携带者的分型图谱见图3。非牛尿苷酸合成酶缺失症正常个体的分型图谱见图4。牛并趾症携带者的分型图谱见图5。非牛瓜氨酸血症正常个体的分型图谱见图6。非瑞士褐牛蜘蛛腿综合征正常个体的分型图谱见图7。非西门塔尔牛蜘蛛腿综合征正常个体的分型图谱见图8。牛HH1单倍型携带者的分型图谱见图9。牛HH3单倍型携带者的分型图谱见图10。牛HH4单倍型携带者的分型图谱见图11。
7、对步骤1得到的基因组DNA中的各个目标突变进行测序，测序结果表明，步骤6的检测结果的正确率为100％。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京奶牛中心
<120> 一种高通量检测牛常见遗传缺陷的引物组及试剂盒
<130> GNCYX181442
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
agtggccctc agattctcaa g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
aaaggaacca aaagggatgt g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
ccctgactct ctcccaaatc c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
gagtagctgc ctcaccaatg c 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
ttgattacat tccattcagg tgc 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
tattttgctg acttggaaaa agc 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
atctcctcca tttggagaag c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
ctcatcagga caggcacaca c 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
ttagacacag gccatcggag 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
ccgtgagaca catacttggc t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
ggaagtgaaa tcccacagca g 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
tcagaggtct tcaagatgga gg 22
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
tttggactga gtctcctctt ctg 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
gaactgaagt gtctctgagg gag 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
atggacatct tcttggacga cag 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 16
agttccagcc ctttctagga agt 23
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 17
agtggctctg tcattaatcc tgtc 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 18
caacaccttg gtattcttca atcc 24
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 19
gaaggtgtcc tctatgctgg tat 23
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 20
tcactgaaat atcagaattt gcat 24
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 21
cacaatttgt aggtctcatg gca 23
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 22
ggagaggtcc atcaggtagt acagg 25
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 23
aagaaattct ggtttcatgc ttactc 26
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 24
agcagaggtg agtgcatccg c 21
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 25
agagaggtgc ccaggaggta tc 22
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 26
tggacataca cccagggggg g 21
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 27
ctggctggag aaactcactc tgt 23
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 28
gcttggcctg cagcttagct t 21
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 29
attggacata tgctacgtac tcatt 25
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 30
tctggatcac cgaaacggca a 21