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1、(10)申请公布号 CN 104304015 A (43)申请公布日 2015.01.28 CN 104304015 A (21)申请号 201410540625.7 (22)申请日 2014.10.14 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 南京帝道农业科技有限公司 地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇工 业集中区 (72)发明人 刘东锋 杨成东 (54) 发明名称 一种瘤毛獐牙菜悬浮细胞培养的快速繁殖方 法 (57) 摘要 本发明研究了一种瘤毛獐牙菜悬浮细胞培养 的快速繁殖方法， 包括无菌苗的获得、 愈伤组织的 诱导、 愈伤组织的增殖、 悬浮细胞的培养等步骤， 本发。
2、明方法所制备的瘤毛獐牙菜出愈率高， 生长 周期短， 产量大， 为其工厂化生产提供研究基础。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书2页 (10)申请公布号 CN 104304015 A CN 104304015 A 1/1 页 2 1. 一种瘤毛獐牙菜悬浮细胞培养的快速繁殖方法， 包括无菌苗的获得、 愈伤组织的诱 导、 愈伤组织的增殖、 悬浮细胞的培养， 其主要步骤如下 ： （1） 取瘤毛獐牙菜的种子， 进行消毒处理 ； （2）取 步 骤 （1）消 毒 处 理 过 的 种 子 放 置 与 光。
3、 照 培 养 箱 中 接 入 H+NAA0.01mg/ L+6-BA0.3mg/L+ZT0.8mg/L 培养基中进行愈伤组织诱导， 附加 7g/L 琼脂， 30g/L 蔗糖， 温度 25 ； （3） 取步骤 （2） 诱导出来的愈伤组织接入培养基 H+ZT0.5mg/L+KT0.5mg/L 中进行愈伤 组织增殖培养， 附加 7g/L 琼脂， 30g/L 蔗糖， 光照 3500lx， 光照时间 12h/d， 温度 25 ； （4）取步骤 （3）诱导出来的颜色翠绿， 结构均一的愈伤组织， 接入 H+ZT0.3-0.5mg/ L+KT0.3-0.5mg/L培养基中进行悬浮震荡培养， 附加30g/L蔗糖。
4、， 温度25， 光照3500lx， 光 照时间 12h/d， 振幅 3cm， 震动频率 100r/min。 2. 按照权利要求 1 所述的一种瘤毛獐牙菜悬浮细胞培养的快速繁殖方法， 其特征 在于 ： 步骤 （1） 中所述瘤毛獐牙菜无菌种子的获得为， 取瘤毛獐牙菜种子， 清洗干净， 在洗 衣粉中浸泡 25min， 流水冲洗 2.5h， 超净工作台上 75% 酒精处理 10min， 0.2% 氯化汞处理 23min， 无菌水冲洗 5 遍。 权 利 要 求 书 CN 104304015 A 2 1/2 页 3 一种瘤毛獐牙菜悬浮细胞培养的快速繁殖方法 技术领域 0001 本发明涉及瘤毛獐牙菜悬浮细胞。
5、培养的快繁方法， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 瘤毛獐牙菜， 龙胆科，Swertia pseudochinensis Hara， 又名 ： 当药、 紫花。当药为 一年生草本植物， 主产于中国、 朝鲜、 俄罗斯， 国内广泛见于北方各省， 全草均可入药。生于 山坡草甸、 沟谷溪边草甸， 分布于我国河北、 甘肃、 四川、 辽宁、 吉林、 山东、 山西、 河南、 北京、 燕山北部、 鄂尔多斯。全草含生物碱、 龙胆碱、 黄酮类化合物、 当药黄酮、 异牡荆素、 咕吨酮 类、 维菊叶龙胆酮、 当药咕吨酮、 甲基当药咕吨酮、 甲基雏菊叶龙胆酮、 对叶当药咕吨酮及微 量去甲基当药咕吨酮。另外， 尚含黄。
6、色龙胆根素、 黄色龙胆根素葡萄糖甙及龙胆苦甙、 龙胆 蒽醌和齐墩果酸。 主治黄疸型肝炎， 痢疾， 胃痛， 消化不良， 牙痛， 目赤， 头痛， 口疮 ； 外用治疮 肿， 目前关于其栽培方法尚无研究。 发明内容 0003 本发明所要解决的技术问题是瘤毛獐牙菜悬浮细胞培养的繁殖方法， 本发明方法 所制备的瘤毛獐牙菜出愈率高， 生长周期短， 产量大， 为其工厂化生产提供研究基础。 0004 为解决上述技术问题， 本发明采用下列技术方案 ： 取瘤毛獐牙菜种子， 清洗干净， 在洗衣粉中浸泡 25min， 流水冲洗 2.5h， 超净工作台 上 75% 酒精处理 10min， 0.2% 氯化汞处理 23min。
7、， 无菌水冲洗 5 遍， 消毒处理过的种子放置 与光照培养箱中接入 H+NAA0.01mg/L+6-BA0.3mg/L+ZT0.8mg/L 培养基中进行愈伤组织诱 导， 附加 7g/L 琼脂， 30g/L 蔗糖， 温度 25， 诱导出来的愈伤组织接入培养基 H+ZT0.5mg/ L+KT0.5mg/L 中进行愈伤组织增殖培养， 附加 7g/L 琼脂， 30g/L 蔗糖， 光照 3500lx， 光照 时间 12h/d， 温度 25， 增殖后的颜色翠绿， 结构均一的愈伤组织， 接入 H+ZT0.3-0.5mg/ L+KT0.3-0.5mg/L培养基中进行悬浮震荡培养， 附加30g/L蔗糖， 温度2。
8、5， 光照3500lx， 光 照时间 12h/d， 振幅 3cm， 震动频率 100r/min。 0005 本发明具有细胞增殖率高等特点， 生产出来的瘤毛獐牙菜周期短， 产量大， 污染 小， 利于大规模种植。 0006 下面将结合具体实施方式对本发明作进一步阐述， 但本发明要求保护的范围并不 局限于下列实施方式。 具体实施方式 0007 实施例 1 取瘤毛獐牙菜种子， 清洗干净， 在洗衣粉中浸泡 25min， 流水冲洗 2.5h， 超净工作台 上 75% 酒精处理 10min， 0.2% 氯化汞处理 23min， 无菌水冲洗 5 遍， 消毒处理过的种子放置 与光照培养箱中接入 H+NAA0.0。
9、1mg/L+6-BA0.3mg/L+ZT0.8mg/L 培养基中进行愈伤组织诱 导， 附加 7g/L 琼脂， 30g/L 蔗糖， 温度 25， 诱导出来的愈伤组织接入培养基 H+ZT0.5mg/ 说 明 书 CN 104304015 A 3 2/2 页 4 L+KT0.5mg/L中进行愈伤组织增殖培养， 附加7g/L琼脂， 30g/L蔗糖， 光照3500lx， 光照时间 12h/d， 温度 25， 增殖后的颜色翠绿， 结构均一的愈伤组织， 接入 H+ZT0.3mg/L+KT0.3mg/L 培养基中进行悬浮震荡培养， 附加 30g/L 蔗糖， 温度 25， 光照 3500lx， 光照时间 12h。
10、/d， 振 幅 3cm， 震动频率 100r/min， 悬浮细胞增长率 65%。 0008 实施例 2 取瘤毛獐牙菜种子， 清洗干净， 在洗衣粉中浸泡 25min， 流水冲洗 2.5h， 超净工作台 上 75% 酒精处理 10min， 0.2% 氯化汞处理 23min， 无菌水冲洗 5 遍， 消毒处理过的种子放置 与光照培养箱中接入 H+NAA0.01mg/L+6-BA0.3mg/L+ZT0.8mg/L 培养基中进行愈伤组织诱 导， 附加 7g/L 琼脂， 30g/L 蔗糖， 温度 25， 诱导出来的愈伤组织接入培养基 H+ZT0.5mg/ L+KT0.5mg/L中进行愈伤组织增殖培养， 附加。
11、7g/L琼脂， 30g/L蔗糖， 光照3500lx， 光照时间 12h/d， 温度 25， 增殖后的颜色翠绿， 结构均一的愈伤组织， 接入 H+ZT0.5mg/L+KT0.5mg/L 培养基中进行悬浮震荡培养， 附加 30g/L 蔗糖， 温度 25， 光照 3500lx， 光照时间 12h/d， 振 幅 3cm， 震动频率 100r/min， 悬浮细胞增长率 60%。 0009 实施例 3 取瘤毛獐牙菜种子， 清洗干净， 在洗衣粉中浸泡 25min， 流水冲洗 2.5h， 超净工作台 上 75% 酒精处理 10min， 0.2% 氯化汞处理 23min， 无菌水冲洗 5 遍， 消毒处理过的种子。
12、放置 与光照培养箱中接入 H+NAA0.01mg/L+6-BA0.3mg/L+ZT0.8mg/L 培养基中进行愈伤组织诱 导， 附加 7g/L 琼脂， 30g/L 蔗糖， 温度 25， 诱导出来的愈伤组织接入培养基 H+ZT0.5mg/ L+KT0.5mg/L中进行愈伤组织增殖培养， 附加7g/L琼脂， 30g/L蔗糖， 光照3500lx， 光照时间 12h/d， 温度 25， 增殖后的颜色翠绿， 结构均一的愈伤组织， 接入 H+ZT0.3mg/L+KT0.5mg/L 培养基中进行悬浮震荡培养， 附加 30g/L 蔗糖， 温度 25， 光照 3500lx， 光照时间 12h/d， 振 幅 3cm， 震动频率 100r/min， 悬浮细胞增长率 65%。 说 明 书 CN 104304015 A 4 。