酮还原酶、核酸、重组表达载体、重组表达菌株及应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711481250.1 (22)申请日 2017.12.29 (71)申请人 安徽联创生物医药股份有限公司 地址 230601 安徽省合肥市经开区繁华大 道工投立恒工业广场B-9幢 (72)发明人 葛德培吴其华洪炯刘涛 王海涛 (74)专利代理机构 合肥市科融知识产权代理事 务所(普通合伙) 34126 代理人 陈思聪 (51)Int.Cl. C12N 9/02(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/。

2、21(2006.01) C12P 17/12(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 酮还原酶、 核酸、 重组表达载体、 重组表达菌 株及应用 (57)摘要 本发明提供了提供了一种酮还原酶， 编码所 述酮还原酶的核酸， 包含所述核酸的重组表达载 体， 包含所述重组表达载体的重组表达菌株及其 制备方法， 以及所述酮还原酶在不对称还原制备 (S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶中的应用。 相对 于现有的其它制备方法， 使用本发明的述酮还原 酶所制备的(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶不仅 浓度和光学纯度高， 且反应条件温和， 对环境友 好， 操作简便， 易于工业放。

3、大， 具有很好的工业应 用前景。 权利要求书2页 说明书4页 序列表2页 附图1页 CN 108220261 A 2018.06.29 CN 108220261 A 1.一种酮还原酶， 其特征在于： 是如下(a)、 (b)或(c)的蛋白质： (a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的多肽； (b)在(a)所述多肽的基础上经过突变、 缺失或添加一个或几个氨基酸的具有酮还原酶 性质的多肽； 所述突变是在所述多肽的基础上进行1-10个氨基酸的突变， 几个是指在1-30 个的氨基酸； (c)与(a)所述多肽具有至少90同一性且具有酮还原酶活性的多肽。 2.一种编码权利要求1所述酮还原酶的核酸。

4、， 其特征在于： 所述核酸由SEQ ID NO:1所 示的DNA序列组成。 3.一种包含权利要求2所述核酸的重组表达载体pET21a-MT-KRED。 4.一种包含权利要求3所述重组表达载体的重组表达菌株。 5.权利要求4所述重组表达菌株的制备方法， 其特征在于： 包括以下步骤： (a)将权利要求3所述重组表达载体转化到宿主细胞， 涂布在含有50 g/mL氨苄的LB平 板上， 37过夜培养后， 从中挑选阳性菌落接种到50mL液体LB培养基中进行培养； 培养4h 后， 吸取10ml种子液转入1L新鲜的LB液体培养基； (b)当培养的浓度达到OD6000.6-1.0时， 加入终浓度为0.051.0。

5、mmol/L的异丙基- -D- 硫代吡喃半乳糖苷进行诱导， 诱导温度为16-35， 诱导培养为8-16h， 诱导培养后通过离心 或浓缩得到更高浓度的湿菌体， 经过超声波破碎或者高压均质机破碎后离心收集上清液， 即为重组表达菌株的粗酶裂解液。 6.根据权利要求5所述重组表达菌株的制备方法， 其特征在于： 步骤(a)中所述液体LB 培养基成分为： 蛋白胨10g/L， 酵母膏5g/L， NaCl10g/L， pH7.2； 所述宿主细胞为大肠杆菌 E.coliBL21； 步骤(b)中加入终浓度为0.15mmol/L的异丙基- -D-硫代吡喃半乳糖苷进行诱 导， 诱导温度为28， 诱导培养为12h。 7。

6、.权利要求1所述酮还原酶在不对称还原制备(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶中的应 用， 其特征在于： 在pH6.08.0的缓冲液中， 在葡萄糖、 葡萄糖脱氢酶和辅酶存在下， 所述酮 还原酶对前体羰基化合物进行不对称还原反应， 形成(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。 8.根据权利要求7所述酮还原酶在不对称还原制备(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶中 的应用， 其特征在于： 包括以下步骤： (1)在烧瓶中加入500ml50mM的磷酸盐缓冲液， 所述磷酸盐缓冲液pH为6.0-8.0， 搅拌； (2)再加入所述酮还原酶的裂解液， 葡萄糖脱氢酶和葡萄糖， 再加入NAD辅酶以及前体 羰基化合物， 。

7、再用磷酸盐缓冲液定容， 在25-35温度下反应， 用2mol/L的氢氧化钠控制pH， 反应16h后用TLC点板检测反应完全； (3)将反应体系升温至70加热2h， 加入硅藻土过滤除蛋白， 用等体积乙酸乙酯萃取水 相和洗涤滤饼； (4)萃取两次后合并有机相， 用无水硫酸钠干燥后减压旋烝得油状物粗品， 即得(S)-1- 叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。 9.根据权利要求9所述酮还原酶在不对称还原制备(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶中 的应用， 其中， 步骤(2)中所述NAD辅酶为NAD+或NADP+， 所述NAD辅酶的用量为0.010.1g/L； 所述前体羰基化合物为N-Boc-3-哌啶酮， 所述N。

8、-Boc-3-哌啶酮在反应液中的浓度为10- 200g/L； 所述酮还原酶的用量为1001000U/L； 所述葡萄糖的用量为20200g/L， 所述葡萄 权利要求书 1/2 页 2 CN 108220261 A 2 糖脱氢酶的用量为1002000U/L， 所述葡萄糖的浓度为所述前体羰基化合物的1.2-1.5当 量。 10.根据权利要求7-9任意一项所述酮还原酶在不对称还原制备(S)-1-叔丁氧羰基-3- 羟基哌啶中的应用， 其特征在于： 步骤(1)中所述磷酸盐缓冲液pH为7.0， 步骤(2)中在30 温度下反应。 权利要求书 2/2 页 3 CN 108220261 A 3 酮还原酶、 核酸、。

9、 重组表达载体、 重组表达菌株及应用 技术领域 0001 本发明属于生物化工技术领域， 特别是涉及一种酮还原酶、 核酸、 重组表达载体、 重组表达菌株及酮还原酶在不对称合成(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶中的应用。 背景技术 0002 (S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶是一种重要的医药中间体， 在镇痛， 抗精神病、 抗 肿瘤等药物中广泛应用， 如依鲁替尼。 0003 (S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶可通过化学或者拆分获得， 但是化学法或者拆分 法的局限在于收率比较低， 拆分法理论上最高收率50。 0004 在生物学上， 手性羟基化合物可通过酶催化合成， 其反应条件温和， 能够使产物对。

10、 应选择性达到99。 目前， 越来越多的药物或者中间体是通过生物催化的方式来合成的。 生 物催化法是通过对前体N-Boc-3-哌啶酮不对称还原成(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。 0005 专利CN201310173088.2公开了一种利用重组酮还原酶(KRED)酶粉来不对称还原 N-Boc-3-哌啶酮， 但是并没有公开酮还原酶(KRED)的基因序列或者氨基酸序列。 专利 CN201310054684.9公开了一种利用醇脱氢酶PAR来不对称合成(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基 哌啶， 但是利用了有机试剂异丙醇来进行辅酶循环， 有机试剂对酶活力有较大程度的损害， 且有明显的抑制作用。 专利C。

11、N201610132936.9公开了一种利用羰基还原酶ReCR酶液体来不 对称还原酮还原酶(KRED)， 但是该酶液需要经过Ni-NTA纯化， 且是用仲辛醇-水两相反应， 不利于放大生产或生产成本比较高。 发明内容 0006 针对已报道的不对称还原反应制备(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶反应中收率 低、 反应条件不友善、 以及成本比较高的问题， 本发明的目的在于提供一种催化活性高、 对 映选择性强、 收率比较高的酮还原酶， 还提供了编码该酮还原酶的核酸， 含有该核酸的重组 表达载体、 包含所述重组表达载体的重组表达菌株及其制备方法， 以及该酮还原酶在不对 称合成(S)-1-叔丁氧羰基-3-。

12、羟基哌啶中的应用。 0007 本发明采用的技术方案是： 0008 一种酮还原酶， 是如下(a)、 (b)或(c)的蛋白质： 0009 (a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的多肽； 0010 (b)在(a)所述多肽的基础上经过突变、 缺失或添加一个或几个氨基酸的具有酮还 原酶性质的多肽； 所述突变是在所述多肽的基础上进行1-10个氨基酸的突变， 即经过突变 后的多肽仍然具有酮还原酶的性质， 几个是指在1-30个的氨基酸， 比如增加His Tag标签或 添加一段分泌表达的信号肽； 0011 (c)与(a)所述多肽具有至少90同一性且具有酮还原酶活性的多肽。 0012 一种编码本发明所。

13、述酮还原酶的核酸， 所述核酸由SEQ ID NO:1所示的DNA序列组 成。 说明书 1/4 页 4 CN 108220261 A 4 0013 一种包含本发明所述核酸的重组表达载体pET21a-MT-KRED。 0014 一种包含本发明所述重组表达载体的重组表达菌株。 0015 本发明所述重组表达菌株的制备方法， 包括以下步骤： 0016 (a)将所述重组表达载体转化到宿主细胞， 涂布在含有50 g/mL氨苄的LB平板上， 37过夜培养后， 从中挑选阳性菌落接种到50mL液体LB培养基中进行培养； 培养4h后， 吸取 10ml种子液转入1L新鲜的LB液体培养基； 0017 (b)当培养的浓度。

14、达到OD6000.6-1.0时， 加入终浓度为0.051.0mmol/L的异丙基- -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导， 诱导温度为16-35， 诱导培养为8-16h， 诱导培养 后通过离心或浓缩得到更高浓度的湿菌体， 经过超声波破碎或者高压均质机破碎后离心收 集上清液， 即为重组表达菌株的粗酶裂解液。 0018 本发明所述重组表达菌株的制备方法， 其中， 步骤(a)中所述液体LB培养基成分 为： 蛋白胨10g/L， 酵母膏5g/L， NaCl 10g/L， pH 7.2； 所述宿主细胞为大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)； 步骤(b)中加入终浓度为0.15mmol/L的异丙基。

15、- -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行 诱导， 诱导温度为28， 诱导培养为12h。 0019 本发明所述酮还原酶在不对称还原制备(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶中的应 用， 在pH 6.08.0的缓冲液中， 在葡萄糖、 葡萄糖脱氢酶(GDH)和辅酶存在下， 所述酮还原 酶对前体羰基化合物进行不对称还原反应， 形成(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。 0020 本发明所述酮还原酶在不对称还原制备(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶中的应 用， 其中， 包括以下步骤： 0021 (1)在烧瓶中加入500ml 50mM的磷酸盐缓冲液， 所述磷酸盐缓冲液pH为6.0-8.0， 搅拌； 00。

16、22 (2)再加入所述酮还原酶的裂解液， 葡萄糖脱氢酶和葡萄糖， 再加入NAD辅酶以及 前体羰基化合物， 再用磷酸盐缓冲液定容， 在25-35温度下反应， 用2mol/L的氢氧化钠控 制pH， 反应16h后用TLC点板检测反应完全； 0023 (3)将反应体系升温至50-70加热1-2h， 加入硅藻土过滤除蛋白， 用等体积乙酸 乙酯萃取水相和洗涤滤饼； 0024 (4)萃取两次后合并有机相， 用无水硫酸钠干燥后减压旋烝得油状物粗品， 即得 (S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。 0025 本发明所述酮还原酶在不对称还原制备(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶中的应 用， 其中， 步骤(2)中所。

17、述NAD辅酶为NAD+或NADP+， 所述NAD辅酶的用量为0.010.1g/L； 所述 前体羰基化合物为N-Boc-3-哌啶酮， 所述N-Boc-3-哌啶酮在反应液中的浓度为10-200g/L； 所述酮还原酶的用量为1001000U/L； 所述葡萄糖的用量为20200g/L， 所述葡萄糖脱氢 酶的用量为1002000U/L， 所述葡萄糖的浓度为所述前体羰基化合物的1.2-1.5当量。 0026 本发明所述酮还原酶在不对称还原制备(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶中的应 用， 其中， 步骤(1)中所述磷酸盐缓冲液pH为7.0， 步骤(2)中在30温度下反应。 0027 本发明有益效果： 00。

18、28 本发明所述酮还原酶， 可将底物N-Boc-3-哌啶酮转化为(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟 基哌啶， 其氨基酸序列与其它已知酮还原酶具有明显差异性。 0029 本发明所述酮还原酶在不对称还原制备(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶中的应 说明书 2/4 页 5 CN 108220261 A 5 用， 前体羰基化合物可高达200g/L， 反应时间小于24h； NAD+作为辅酶， 在液体酶反应时添 加， 且在全细胞时不需要添加昂贵的辅酶NAD+； 产物(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶得率为 95.8， 其e.e.值99， 应用葡萄糖脱氢酶实现了NAD+/NADH之间的循环， 避免了使用异丙。

19、 醇等有机试剂对环境及酮还原酶的伤害。 相对于现有的其它制备方法， 使用本发明的述酮 还原酶所制备的(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶不仅浓度和光学纯度高， 且反应条件温和， 对环境友好， 操作简便， 易于工业放大， 具有很好的工业应用前景。 附图说明 0030 图1为实施例2中PCR扩增电泳图谱； 0031 图2为实施例3中SDS-PAGE电泳图谱。 0032 下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。 具体实施方式 0033 实施例1 0034 酮还原酶MT-KRED基因的获得 0035 (1)从安徽省合肥市中国科学技术大学采集土壤样本并提取DNA(基因提取方法参 考Chroma 。

20、Spin TE-1000， Clontech Laboratories， Inc.， USA)， 将提取的DNA样品用Sau3AI 酶切后， 电泳后切胶回收0.54kb的DNA片段， 通过BamHI位点连接到pUC19质粒上， 从而得 到基因组的质粒文库； 0036 (2)将步骤(1)中所述质粒文库转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(购自北京全式 金生物技术有限公司)， 并涂布到有相应氨苄抗生素的LB平板上， 挑选阳性克隆接种到加有 500 L LB的96深孔孔板， 37培养4h后加入终浓度为0.2mmol/L异丙基- -D-硫代吡喃半乳 糖苷(IPTG)诱导， 28继续培养诱导过。

21、夜； 离心收集深孔培养物并加入50ul的10mmol/ LpH7.5的磷酸钠缓冲液， -80反复冻融三次后使细菌裂解； 0037 (3)加入1mmol/L前体羰基化合物N-Boc-3-哌啶酮为底物、 20mmol/L葡萄糖、 1U葡 萄糖脱氢酶(GDH)、 0.001的酚红， 30培养4h， 挑取颜色变红最明显的孔所对应的深孔培 养物， 抽提质粒并送测序； 用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的ORF Finder分析序列的 开放读码框(ORF)， 得到ORF核苷酸序列后筛选出SEQ ID NO:1， 获得SEQ.ID.N01所示的酮还 原酶基因， 并进一步得到其编码的氨基酸序列SEQ ID。

22、 NO:2。 0038 实施例2 0039 酮还原酶MT-KRED基因的克隆 0040 根据SEQ ID NO:1合成引物对F1(核苷酸序列为SEQ ID NO:3)和F2(核苷酸序列为 SEQ ID NO:4)； 0041 PCR 20ul体系如下： 2mmol/L dNTP 2 L， 10PCRbuffer 2 L， PCR高保真酶0.5 L， 实施例1获得的DNA模板1 L， ddH2O 12 L， F1和F2各1 L(5mmol/L)。 PCR扩增步骤为： 95， 预变性5min； 98， 变性15s； 56退火30s； 72延伸50s； 步骤重复32次； 72 继续延伸10min， 。

23、冷却至16。 PCR产物经琼脂糖电泳纯化， PCR扩增电泳图谱如图1所示， 在1000bp左右出现目标条带， 用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收所述目标条带， 获得一条完整 的序列， 经DNA测序， 全长1026bp， 即获得SEQ.ID.N01所示的酮还原酶基因的PCR产物。 说明书 3/4 页 6 CN 108220261 A 6 0042 实施例3 0043 酮还原酶MT-KRED基因的表达 0044 将实施例2中所述PCR产物和pET21a载体同时用NdeI/XhoI双酶切后， 经琼脂糖凝 胶电泳纯化， 利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目标片段； 在T4DNA连接酶的作用下， 将所述 目标片段与双。

24、酶切后的pET21a载体连接得到重组表达载体pET21a-MT-KRED。 0045 将上述重组表达载体pET21a-MT-KRED转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞， 涂布 在含有50 g/mL氨苄的LB平板上， 37过夜培养后， 从中挑选阳性菌落接种到50mL液体LB培 养基中进行培养， 液体LB培养基成分为： 蛋白胨10g/L， 酵母膏5g/L， NaCl 10g/L， pH 7.2； 培 养4h后， 吸取10ml种子液转入1L新鲜的LB液体培养基， 培养到OD600达0.61.0后， 降温至28 ， 并加入终浓度为0.15mmol/L的IPTG进行诱导培养12h， 500。

25、0rpm离心收集菌体(即获得重 组表达菌株的湿菌体)， 用50mmol/LpH7.0的磷酸钠缓冲液洗一次， 每克菌体重悬于10mL上 述磷酸盐缓冲液中， 在冰浴中超声破碎， 离心收集上清液， 即为重组表达菌株的粗酶裂解 液。 取部分上清液进行SDS-PAGE蛋白电泳检验表达水平， SDS-PAGE电泳图谱如图2所示， 由 图2可知， 目标蛋白大小与预期一致。 0046 实施例4 0047 一种酮还原酶在不对称还原制备(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶中的应用， 包括 以下步骤： 0048 (1)在2L三口烧瓶中加入500ml 50mmol/L的磷酸盐缓冲液， 所述磷酸盐缓冲液pH 为7.0，。

26、 搅拌； 0049 (2)再加入实施例3中所述粗酶裂解液200ml， 葡萄糖脱氢酶(GDH)2000U(购自 sigama)和葡萄糖100g， 再加入NAD辅酶0.05g以及前体羰基化合物N-Boc-3-哌啶酮100g， 再 用磷酸盐缓冲液定容至1L， 在30温度下反应， 用2mol/L的氢氧化钠控制pH， 反应16h后用 TLC点板检测反应完全； 酮还原酶的用量为500U/L； 0050 (3)将反应体系升温至70加热2h， 加入10g硅藻土过滤除蛋白， 用等体积乙酸乙 酯(EA)萃取水相和洗涤滤饼； 0051 (4)萃取两次后合并有机相， 用无水硫酸钠干燥后减压旋烝得油状物粗品， 即得 (。

27、S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。 0052 测定本实施例粗品的纯度98.0， 摩尔收率95， e.e.值99。 0053 产物e.e.值的具体分析条件为： 色谱柱为CP-Chirasil-DEX CB手性毛细管柱， FID 检测器。 色谱柱温度120， 气化和检测温度均为280， 载气为N2。 0054 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述， 并非对本发明的范 围进行限定， 在不脱离本发明设计精神的前提下， 本领域普通技术人员对本发明的技术方 案作出的各种变形和改进， 均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。 说明书 4/4 页 7 CN 108220261 A 7 序列。

28、表 安徽联创生物医药股份有限公司 酮还原酶、 核酸、 重组表达载体、 重组表达菌株及应用 2017-12-29 4 SIPOSequenceListing 1.0 1 1026 DNA incognita 1 2 341 PRT incognita 2 Met Ala Asp Leu Pro Lys Thr Gln Tyr Gly Trp Lys Tyr Asp Lys Ser 1 5 10 15 Ile Asn Asn Leu Lys Leu Val Glu Asp Leu Lys Val Pro Thr Pro Ser 20 25 30 Ala Thr Gln Val Val Val Ly。

29、s Ile Glu Ala Ala Gly Leu Cys His Ser 35 40 45 Asp Leu His Val Leu Glu Gly Leu Asp Val Gly Asp Asp Tyr Val Met 50 55 60 Gln His Glu Ile Phe Gln His Ile Val Leu Glu Ile Gly Asp Ser Val 65 70 75 80 Asn Pro Glu Val Phe Lys Val Gly Gly Arg Tyr Ala Val His Gly Leu 85 90 95 Asn Ser Cys Gly Ser Cys Glu Met。

30、 Cys Arg Thr Gly His Asp Asn Asp 100 105 110 Cys Thr Gly Asn Glu Ser Lys Trp Tyr Gly Leu Gly Ile Ser Gly Gly 115 120 125 Tyr Gln Gln Tyr Leu Leu Val Pro Asn Ser His His Leu Leu Pro Ile 130 135 140 Pro Asp Asn Val Ser Tyr Glu Val Ala Ala Ala Thr Ser Asp Ala Val 145 150 155 160 Ser Ala Pro His His Ala。

31、 Ile Lys Asn Ser Gly Val Thr Pro Ser Ser 165 170 175 序列表 1/2 页 8 CN 108220261 A 8 Lys Val Leu Met Phe Gly Leu Gly Gly Leu Gly Ser Asn Ala Leu Gln 180 185 190 Ile Leu Lys Ala Phe Gly Ala Tyr Val Val Ala Val Asp Val Lys Pro 195 200 205 Ala Ser Lys Ala Ile Ala Asp Glu Phe Lys Ala Asp Glu Phe Tyr Thr 21。

32、0 215 220 Asp Ile Ser Gln Ser Ser Trp Lys Pro Ala Ser Phe Asp Tyr Cys Phe 225 230 235 240 Asp Phe Val Ser Leu Gln Val Thr Phe Asp Ile Cys Gln Lys Tyr Ile 245 250 255 Lys Ser His Gly Val Cys His Pro Val Gly Leu Gly Ser Ser Lys Leu 260 265 270 Thr Phe Asp Leu Gly Asn Leu Ala Leu Arg Glu Val Lys Ile Va。

33、l Gly 275 280 285 Asn Phe Trp Gly Thr Ser Gln Glu Gln Ile Glu Ala Met Glu Leu Val 290 295 300 Ser Ser Gly Arg Val Lys Pro Gln Val His Thr Thr Val Lys Leu Phe 305 310 315 320 Asp Gly Ala Lys Lys Glu Thr His Ser Gly Lys Phe Phe Asn Val Asp 325 330 335 Gly Thr Phe Leu Pro 340 3 24 DNA Ordo artificialis 3 4 29 DNA Ordo artificialis 4 序列表 2/2 页 9 CN 108220261 A 9 图1 图2 说明书附图 1/1 页 10 CN 108220261 A 10 。