技术领域
本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine Induced killer,CIK）的培养，即利用各种细胞因子的组合来刺激外周血单核细胞 （Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC）获得大量高杀伤活性的杀伤细胞。
背景技术
恶性肿瘤，目前在全世界仍然是尚未攻克的疾病之一，并已经成为中国人 口的首要死因，我国每年新增肿瘤患者已经超过280万人。手术、化疗和放疗 是肿瘤治疗的常规手段，然而，许多肿瘤患者由于发现不及时，失去了进行手 术的机会；化疗和放疗对患者的免疫系统的打击比较大，严重影响到患者的生 存质量，另外，许多癌种对放化疗不敏感。因此，越来越需要一种低副作用， 广谱性的新型肿瘤治疗手段。
1986年，Rosenberg教授首创过继细胞免疫治疗,体外应用白细胞介素2 （Interleukin2,IL-2）活化、扩增并获得具有抗瘤活性的效应细胞，即LAK （Lymphokine Activated Killer,LAK）细胞。使用LAK细胞输注给肿瘤患者能产生 一定的肿瘤杀伤活性。
过继细胞免疫治疗技术一经建立，其中细胞培养的方法也在不断改进。 CD3AK疗法是在LAK细胞的基础上增加了抗CD3单克隆抗体来刺激肿瘤患者的外 周血淋巴细胞，体外在与IL-2的共同作用下产生以CD3+CD8+T细胞为主的杀伤细 胞群。
1991年，斯坦福大学的Schmidt等首先报道细胞因子诱导的杀伤细胞 （Cytokine Induced-Killer，CIK）。CIK是人外周血单个核细胞在体外经IFN-γ刺 激一天，然后用IL-2和抗CD3单克隆抗体等诱导而成的具有杀伤多种肿瘤活性 的细胞毒性T细胞。CIK细胞的增殖速度较LAK和CD3AK细胞有很大的提高，具 备更强的杀瘤活性。
CIK细胞是目前抗肿瘤过继细胞免疫治疗中最有效的方案之一，也是现在 应用最广泛的一种。2013年全球有超过30家的医疗机构在开展CIK相关的正式 的临床试验，而我国也已经有大量的医院进行CIK的临床应用。因此，进一步提 高CIK培养过程中的细胞增殖能力，以及对肿瘤细胞的杀伤活性，已经成为国内 外科研人员的主要目标。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效CIK的培养方法，即在经传统CIK的基础之上， 通过添加层粘连蛋白、纤维连接蛋白和抗CD28单克隆抗体的刺激作用，提高 CIK细胞的增殖倍数和杀伤活性。
申请人在长期的研究中发现，层粘连蛋白和纤维连接蛋白包被后的培养瓶在 培养CIK细胞时，可以吸附细胞成半贴壁状态，并且极大的提高CIK细胞的增殖 速度；而抗CD28单克隆抗体的添加可以有效的激活CIK细胞中T细胞亚群的共 刺激信号，促进CIK细胞的活化，提高其对肿瘤细胞的杀伤活性。申请人将层粘 连蛋白、纤维连接蛋白和抗CD28单克隆抗体三种因子共用引入到传统CIK细胞 的培养中，从而促成了本发明。
本发明的CIK细胞的培养方法，包括如下步骤：
1）将层粘连蛋白和纤维连接蛋白溶解稀释后，加入到细胞培养瓶中包被；
2）将外周血单核细胞PBMC接种到包被后的培养瓶中，在培养液中添加 IFN-gamma、IL-2、抗CD3单克隆抗体和抗CD28单克隆抗体因子刺激培养细胞；
3）培养到第5天，将细胞转移到透气的细胞培养袋中继续扩大培养；持续 扩大培养至第15天时，完成高效CIK细胞的制备。
本发明步骤2）所述的培养液，其配方组成如下:氯化钙40mg/L、氯化钾 300mg/L、硫酸镁120mg/L、氯化钠5000mg/L、磷酸二氢钾300mg/L、碳酸氢 钙1200mg/L、氨基酸1365mg/L、维生素21.4mg/L、微量元素0.93126mg/L、 白蛋白450mg/L、胰岛素8mg/L、亚油酸0.4mg/L、油酸5mg/L、谷胱甘肽2.5 mg/L、双甘氨肽mg/L、次黄嘌呤0.8mg/L、硫辛酸0.1mg/L、丙酮酸150mg/L、 葡萄糖1500mg/L、胸腺嘧啶0.12mg/L。
其中氨基酸的配比如下：8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份 谷氨酸、12份甘氨酸、4份组氨酸、80份异亮氨酸、4份亮氨酸、4份赖氨酸、 20份蛋氨酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份丝氨酸、8份苏氨酸、3份色 氨酸、10酪氨酸、17份缬氨酸。
维生素的配比如下：2份D-生物素、120份氯化胆碱、10份叶酸、35份硫 胺素、2份维生素B2、25份维生素B1、20份D-泛酸酯。
微量元素的配比如下：85000份硫酸铁、120份硫酸铜、1500份亚硒酸钠、 6份偏钒酸铵、5000份硫酸锌。
为了获得更好的培养效果，在培养液中还添加有25mg/L的小球藻生长因子 （Chlorella Growth Factor，CGF）。
本发明所制备出的CIK细胞具有增殖速度快、细胞数量大、细胞活性高、对 肿瘤细胞的杀伤能力高等特点。本发明的主要特点是：利用层粘连蛋白和纤维 连接蛋白包被的培养瓶对PBMC进行培养，这两种蛋白的吸附作用可以使细胞 成半贴壁状态，从而利于细胞接受各种因子的刺激，并且这两种蛋白本身就有 对CIK细胞增殖的促进作用；而抗CD28单克隆抗体的使用可以刺激CIK细胞中 T细胞亚群的共刺激信号，促进CIK细胞的活化。到目前为止，仍未见有将层粘 连蛋白、纤维连接蛋白和抗CD28单克隆抗体联合应用于CIK细胞制备的研究报 道，本发明首次提供出一种在CIK细胞制备中通过添加以上三种因子提高细胞数 量和杀伤活性的方法。
具体实施方法
本发明所用到的材料的描述如下，并给出了具体实施例中材料的出处。本领 域的技术人员在本说明书的基础上，可选择不同来源的材料，而不限于本发明 的具体记载。
抗CD3单克隆抗体：鼠抗人CD3单克隆抗体，IgG1，购于安迪生物科技（上 海）有限公司；
抗CD28单克隆抗体：鼠抗人CD28单克隆抗体，IgG1，购于安迪生物科技（上 海）有限公司；
K562细胞：人慢性髓细胞性白血病细胞系，购于中科院细胞库；
Raji细胞：人B细胞淋巴瘤细胞系，购于中科院细胞库；
769-P细胞：人肾腺癌细胞系，购于中科院细胞库；
HepG2细胞：人肝细胞癌细胞系，购于中科院细胞库；
小球藻生长因子（Chlorella Growth Factor，CGF）
本发明高效CIK的制备方法的步骤如下：
1）培养瓶的包被：分别取层粘连蛋白和纤维连接蛋白各100微克，于20毫 升的磷酸盐缓冲液中充分溶解，将液体用0.22微米的无菌滤膜过滤后，加入到底 面积为175平方厘米的培养瓶中，室温放置3-5小时。
2）细胞接种：采集50毫升的静脉外周血，使用淋巴细胞分离液离心分离得 到PBMC，生理盐水洗涤2次，用60毫升的培养基重悬，取样计数后，接种到去 包被液的培养瓶中。添加60000单位的IFN-gamma，60000单位的IL-2，1200纳 克的抗CD3单克隆抗体和1200纳克的抗CD28单克隆抗体。
3）转移培养：接种后的细胞在培养到第5天时，转入透气的细胞培养袋中 继续培养，添加无血清培养基至400毫升，添加80000单位的IL-2。
4）扩大培养：隔天添加无血清培养基，并按200单位/毫升的浓度添加IL-2， 持续扩大培养。
5）收获细胞：在培养的第15天，取1毫升的细胞悬液进行细胞计数，计算 CIK细胞的增殖倍数。离心收集全部培养所得细胞，取适量细胞进行杀伤实验。
下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述.
实施例1
1）培养瓶的包被：分别取层粘连蛋白和纤维连接蛋白100微克，于20毫升 的磷酸盐缓冲液中充分溶解，将液体用0.22微米的无菌滤膜过滤后，加入到底 面积为175平方厘米的培养瓶中，室温放置4小时。
2）细胞接种：采集50毫升的静脉外周血，缓慢加入到已加有15毫升淋巴 细胞分离液的离心管中，每管25毫升。2000转/分钟，离心15分钟，取中间的 白色PBMC层，生理盐水洗涤2次，用60毫升的无血清培养基重悬，取样计数， 细胞数为4.8×107个。加细胞悬液接种到去包被液的培养瓶中，添加60000单位 的IFN-gamma，60000单位的IL-2，1200ng的抗CD3单克隆抗体和1200ng的抗CD28 单克隆抗体。其中无血清培养基的组份如下：氯化钙40mg/L、氯化钾300mg/L、 硫酸镁120mg/L、氯化钠5000mg/L、磷酸二氢钾300mg/L、碳酸氢钙1200mg/L、 氨基酸1365mg/L、维生素21.4mg/L、微量元素0.93126mg/L、白蛋白450mg/L、 胰岛素8mg/L、亚油酸0.4mg/L、油酸5mg/L、谷胱甘肽2.5mg/L、双甘氨肽 mg/L、次黄嘌呤0.8mg/L、硫辛酸0.1mg/L、丙酮酸150mg/L、葡萄糖1500mg/L、 胸腺嘧啶0.12mg/L、25mg/L的小球藻生长因子。
其中氨基酸的配比如下：8份丙氨酸、40份天冬氨酸、10份胱氨酸、4份 谷氨酸、12份甘氨酸、4份组氨酸、80份异亮氨酸、4份亮氨酸、4份赖氨酸、 20份蛋氨酸、20份苯丙氨酸、25份脯氨酸、4份丝氨酸、8份苏氨酸、3份色 氨酸、10酪氨酸、17份缬氨酸。
维生素的配比如下：2份D-生物素、120份氯化胆碱、10份叶酸、35份硫 胺素、2份维生素B2、25份维生素B1、20份D-泛酸酯。
微量元素的配比如下：85000份硫酸铁、120份硫酸铜、1500份亚硒酸钠、 6份偏钒酸铵、5000份硫酸锌。
上述的培养基是申请人长期优化获得的，在同样的培养时间内，本发明的 培养液对细胞的增殖效果要明显好于现有的细胞培养液，细胞增殖速度可以提 高约12%，伽马干扰素的分泌量提高7.8%。
3）转移培养：接种后的细胞在培养到第5天时，转入透气的细胞培养袋中 继续培养，添加无血清培养基至400毫升，添加80000单位的IL-2。
4）扩大培养：第7天，添加无血清培养基至800毫升，添加160000单位 的IL-2;第9天，添加无血清培养基至1600毫升，添加320000单位的IL-2;第 11天，添加无血清培养基至3200毫升，添加640000单位的IL-2;第13天，添 加无血清培养基至6400毫升，添加1280000单位的IL-2。
5）收获细胞：在培养的第15天，取1毫升的细胞悬液进行细胞计数，计 算得细胞总数为1.97×1010,增殖410倍。离心收集全部培养所得细胞，取适量 细胞进行杀伤实验。高效CIK细胞在效靶比为10:1的条件下，对K562、Raji、769-P 和HepG2细胞系的杀伤分别达到14.1%、18.6%、25.7%、10.6%。
按照上述步骤，重复试验7次，高效CIK细胞增殖倍数的平均值为438倍， 在效靶比为10:1的条件下，对K562、Raji、769-P和HepG2细胞系的杀伤平均值 分别为15.2%、17.9%、26.2%和11.6%。
其中细胞计数方法具体如下：
1、将培养第15天取出的1毫升细胞悬液充分混匀。取出其中的50微升加 入到1.5毫升离心管中，添加50微升0.4%的台盼蓝，充分混匀。
2、吸取混合液，滴加到细胞计数板。
3、倒置显微镜下，用手动细胞计数仪，记录细胞计数板上四个大方格中的 细胞数。
4、计算细胞数：记录得到的细胞数乘以5000再乘以培养液的总体积，即 是培养所得的细胞总数。
5、计算增殖倍数：用培养所得的细胞总数除以细胞接种当天所得的细胞数， 即是CIK细胞的增殖倍数。
杀伤试验方法（Promega CytoTox96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay）具体 操作如下：
1、取2个96孔细胞培养板，在试验孔和效应细胞自发释放对照孔中加入效 应细胞，50μl/孔，细胞浓度为1×105/50μl；
2、分别在试验孔、靶细胞自发释放对照孔和靶细胞最大释放对照孔中加入 靶细胞(K562/Raji/769-P/Hep G2/)，50μl/孔，细胞浓度为1×104/50μl；
3、分别在培养基对照孔和体积校正孔中加入培养基，100μl/孔；
4、分别在效应细胞自发释放对照孔、靶细胞自发释放对照孔及靶细胞最大 释放对照孔分别再加入培养基，100μl/孔;
以上各孔均设置3个平行样；
5、将96孔细胞培养板在室温，250g，离心4分钟，然后置于37℃5％CO2 培养箱中孵育4小时；
6、取出96孔细胞培养板，在靶细胞最大释放对照孔及体积校正孔中分别添 加裂解液，10μl/孔；然后置于37℃5％CO2培养箱中孵育45分钟；
7、将96孔细胞培养板在室温，250g，离心4分钟，每孔吸出50μl上清转 移至96孔酶标板相应位置；
8、用分析缓冲液溶解底物，在每个待测孔中加入50μl，室温避光放置30 分钟；加入反应终止液，50μl/孔，测吸收值OD490；计算效应细胞杀伤百分率 数值校正：
a)试验孔、靶细胞自发释放孔和效应细胞自发释放孔的吸光度值分别减去 培养基对照孔的吸光度值，并计算平均值；
b)靶细胞最大释放孔的吸光度值减去体积校正对照的吸光度值，并计均值。 杀伤率计算（使用平均吸光度数值）：
实验例2
1）培养瓶的包被：分别取层粘连蛋白和纤维连接蛋白80微克，于20毫升 的磷酸盐缓冲液中充分溶解，将液体用0.22微米的无菌滤膜过滤后，加入到底 面积为175平方厘米的培养瓶中，室温放置4小时。
2）细胞接种：采集50毫升的静脉外周血，缓慢加入到已加有15毫升淋巴 细胞分离液的离心管中，每管25毫升。2000转/分钟，离心15分钟，取中间的 白色PBMC层，生理盐水洗涤2次，用60毫升的无血清培养基重悬，取样计数， 细胞数为4.2×107个。加细胞悬液接种到去包被液的培养瓶中，添加无血清培养 基至70毫升，然后添加70000单位的IFN-gamma，70000单位的IL-2，1400纳克 的抗CD3单克隆抗体和1400纳克的抗CD28单克隆抗体。无血清培养基的成分与 实施例1的一致。
3）转移培养：接种后的细胞在培养到第5天时，转入透气的细胞培养袋中 继续培养，添加无血清培养基至450毫升，添加90000单位的IL-2。
4）扩大培养：第7天，添加无血清培养基至900毫升，添加180000单位 的IL-2;第9天，添加无血清培养基至1800毫升，添加360000单位的IL-2;第 11天，添加无血清培养基至3600毫升，添加720000单位的IL-2;第13天，添 加无血清培养基至7200毫升，添加1440000单位的IL-2。
5）收获细胞：在培养的第15天，取1毫升的细胞悬液进行细胞计数，计 算得细胞总数为1.86×1010,增殖443倍。离心收集全部培养所得细胞，取适量 细胞进行杀伤实验。高效CIK细胞在效靶比为10:1的条件下，对K562、Raji、769-P 和HepG2细胞系的杀伤分别达到17.2%、18.8%、23.5%、11.6%。
实验例3
1）培养瓶的包被：分别取层粘连蛋白和纤维连接蛋白80微克，于20毫升 的磷酸盐缓冲液中充分溶解，将液体用0.22微米的无菌滤膜过滤后，加入到底 面积为175平方厘米的培养瓶中，室温放置4小时。
2）细胞接种：采集50毫升的静脉外周血，缓慢加入到已加有15毫升淋巴 细胞分离液的离心管中，每管25毫升。2000转/分钟，离心15分钟，取中间的 白色PBMC层，生理盐水洗涤2次，用60毫升的无血清培养基重悬，取样计数， 细胞数为5.3×107个。加细胞悬液接种到去包被液的培养瓶中，添加无血清培养 基至80毫升，然后添加80000单位的IFN-gamma，80000单位的IL-2，1600纳克 的抗CD3单克隆抗体和1600纳克的抗CD28单克隆抗体。
3）转移培养：接种后的细胞在培养到第5天时，转入透气的细胞培养袋中 继续培养，添加无血清培养基至450毫升，添加67500单位的IL-2。
4）扩大培养：第7天，添加无血清培养基至900毫升，添加135000单位 的IL-2;第9天，添加无血清培养基至1800毫升，添加270000单位的IL-2;第 11天，添加无血清培养基至3600毫升，添加540000单位的IL-2;第13天，添 加无血清培养基至7200毫升，添加1080000单位的IL-2。
5）收获细胞：在培养的第15天，取1毫升的细胞悬液进行细胞计数，计 算得细胞总数为2.47×1010,增殖466倍。离心收集全部培养所得细胞，取适量 细胞进行杀伤实验。高效CIK细胞在效靶比为10:1的条件下，对K562、Raji、769-P 和HepG2细胞系的杀伤分别达到11.2%、13.8%、21.1%、9.5%。
本发明所制备的高效CIK细胞在培养第15天时，增殖倍数超过400倍，比 常规CIK培养方法提高超过400%，并且高效CIK细胞在较低的效靶比条件下， 即可对常见的白血病、淋巴瘤、肾癌和肝癌细胞系产生较高的杀伤。