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1、(10)授权公告号 CN 103468805 B (45)授权公告日 2014.10.22 CN 103468805 B (21)申请号 201310409805.7 (22)申请日 2013.09.11 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (73)专利权人 山西省农业科学院棉花研究所 地址 044000 山西省运城市黄河大道 118 号 (72)发明人 李朋波 曹美莲 吴翠翠 杨六六 曹彩荣 刘惠民 王长彪 (74)专利代理机构 太原科卫专利事务所 ( 普通 合伙 ) 14100 代理人 朱源 (54) 发明名称 用于鉴定哈克尼西棉胞质不育纯合恢复系。
2、的 标记及方法 (57) 摘要 本发明涉及棉花分子育种技术领域， 具体是 一种用于鉴定哈克尼西棉胞质不育纯合恢复系的 标记及方法。本发明与现有技术相比具有如下有 益效果 ： 1） 速度快 ： 用本发明所述引物进行分子 标记鉴定， 就可以很快鉴定出恢复系 （株） 的纯合 性， 比传统鉴定方法减少工作量 70% 以上 ； 2） 准确 率高 ： 本发明所述引物具有简单、 稳定可靠、 重复 性好等优点， 可快速鉴定恢复基因是否纯合， 真正 从 DNA 水平上鉴定恢复基因的遗传情况， 提高了 选择的精确性， 准确率至少在 97% 以上 ； 3） 实用简 单 ： 本发明所述的用于鉴定哈克尼西棉胞质不育 纯。
3、合恢复系方法的整个程序易于操作， 具有很好 的科学研究和商业应用前景。 (51)Int.Cl. 审查员 赵重甲 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 (10)授权公告号 CN 103468805 B CN 103468805 B 1/1 页 2 1.核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示的引物在鉴定哈克尼西棉胞质不育纯合恢复系 中的应用。 2. 用于鉴定哈克尼西棉胞质不育纯合恢复系的方法， 其特征在于， 步骤为 ： 用 SEQ ID NO.1 和 2 所示的。
4、引物扩增待测哈克尼西棉样本的基因组 DNA ； 同时具有 170bp 处和 190bp 处的两条扩增带的样本为具有恢复基因的杂合株， 具有170bp处扩增带且不具有190 bp处 扩增带的样本为哈克尼西棉胞质不育纯合恢复株， 该恢复株扩繁获得纯合恢复系。 3. 用于鉴定哈克尼西棉胞质不育纯合恢复系的方法， 其特征在于， 步骤为 ： a用 SEQ ID NO.3 和 4 所示的引物扩增待测哈克尼西棉样本的基因组 DNA ； 同时具有 1200 bp处和1045bp处两条扩增带的哈克尼西棉样本即为可育株， 具有1045bp处扩增带且 不具有 1200 bp 处扩增带的哈克尼西棉样本即为不育株 ； 。
5、b用 SEQ ID NO.1 和 2 所示的引物扩增步骤 a 所述可育株的基因组 DNA ； 同时具有 170bp处和190bp处的两条扩增带的可育株为具有恢复基因的杂合株， 具有170bp处扩增带 且不具有190 bp处扩增带的可育株为哈克尼西棉胞质不育纯合恢复株， 该恢复株扩繁获得 纯合恢复系。 4. 根据权利要求 2 或 3 所述的用于鉴定哈克尼西棉胞质不育纯合恢复系的方法， 其特 征在于， 所述的待测哈克尼西棉样本为经过花粉育性调查获得的可育株。 权 利 要 求 书 CN 103468805 B 2 1/4 页 3 用于鉴定哈克尼西棉胞质不育纯合恢复系的标记及方法 技术领域 0001 。
6、本发明涉及棉花分子育种技术领域， 具体是一种用于鉴定哈克尼西棉胞质不育纯 合恢复系的标记及方法。 背景技术 0002 杂交棉是我国棉花获得高产的重要途径。 人工杂交棉已经在长江流域棉区和黄河 流域棉区广泛应用。 近年来随着用工成本的增加， 人工去雄杂交制种成本居高不下， 杂交棉 推广受到影响。 利用棉花胞质雄性不育三系配套制种方式具有省工、 种子纯度高、 成本较低 等优点。在我国棉花种植面积下滑的情况下， 利用棉花胞质雄性不育三系配套制种方式是 棉花杂交种生产发展的必然趋势， 是保证总产基本稳定的重要战略手段。 0003 目前， 以哈克尼西棉细胞质雄性不育材料为基础的三系配套材料已经在我国得到。
7、 成功应用。但是， 与人工制种相比， 可用的亲本资源仍然很少， 特别是具有强恢复力的优良 恢复系材料仍然是三系杂交棉选育的主要限制因素。 因此， 在三系杂交棉选育过程中， 具有 强恢复力的优良恢复系选育和改良一直是研究的重点和难点。 而采用常规育种技术选育和 改良新恢复系材料需要年限长， 且每年转育后都需要进行大量的田间测交和鉴定工作， 以 确保恢复基因在转育和改良过程中没有丢失， 从而需要耗费大量的人力和财力。 因此， 如何 通过分子标记辅助选择技术， 既稳定可靠又快速简便地进行恢复系选育和改良成为三系杂 交棉发展的关键环节。 发明内容 0004 本发明为了解决哈克尼西棉胞质不育恢复系田间测。
8、交和鉴定工作所需时间长、 消 耗大、 准确性差等问题， 提供了一种用于鉴定哈克尼西棉胞质不育纯合恢复系的引物及方 法， 从而可以加快恢复系选育和改良进程， 同时保证恢复系的纯合性。 0005 本发明是通过以下技术方案实现的 ： 用于鉴定哈克尼西棉胞质不育纯合恢复系的 标记 （SSR 标记 NAU5121） ， 其为核苷酸序列如 SEQ ID NO.1 和 2 所示的引物。 0006 SSR 标记 NAU5121 引物 ： 0007 正向引物 5，- AGGGCAAATTTCATCTCTCT -3，（SEQ ID NO.1） 0008 反向引物 5，- AAAGCTTGACCGAAATCAAC 。
9、-3，（SEQ ID NO.2） 0009 本发明所述 SSR 标记 NAU5121 引物来自 CMD 网站 www.cottonmarkers.org。 0010 本发明还提供了SSR标记NAU5121在鉴定哈克尼西棉胞质不育纯合恢复系中的应 用。 0011 本发明采用 SSR 标记 NAU5121（SEQ ID NO.1 和 2 所示的引物） 的鉴定方法为 ： 用 SEQ ID NO.1和2所示的引物扩增待测哈克尼西棉样本的基因组DNA ； 同时具有170bp处和 190bp处的两条扩增带的样本为具有恢复基因的杂合株， 具有170bp处扩增带且不具有190 bp 处扩增带的样本为哈克尼西棉。
10、胞质不育纯合恢复株， 该恢复株扩繁获得纯合恢复系。以 传统方法 （田间测交和鉴定） 为验证， 证明采用本发明所述 SSR 标记 NAU5121 对待测样本是 说 明 书 CN 103468805 B 3 2/4 页 4 否为哈克尼西棉胞质不育纯合恢复系的鉴定， 其准确率为 97% 以上， SSR 标记 NAU5121 与 哈克尼西棉胞质不育恢复基因Rf1遗传距离为 0.4cM， 为共显性标记， 能够快速鉴定可育株 是否为纯合恢复系， 其次与传统方法相比， 哈克尼西棉胞质不育恢复系的鉴定工作量减少 70%。 0012 进一步， 对于育种群体较大的后代， 本发明还提供了一种快速鉴定哈克尼西棉胞 质。
11、不育纯合恢复系的方法， 该方法中提供了一种用于鉴定是否携带有恢复基因的标记引物 PF1， 其为核苷酸序列如 SEQ ID NO.3 和 4 所示的引物。 0013 标记引物 PF1 ： 0014 正向序列 ： 5，-CAAGATATGGGTAAGCTTCC -3，（SEQ ID NO.3） 0015 反向序列 ： 5，-TAACAACATTAGGCTCGATTT -3，（SEQ ID NO.4） 0016 上述针对育种群体较大后代的快速鉴定哈克尼西棉胞质不育纯合恢复系的方法， 其具体步骤为 ： a 用SEQ ID NO.3和4所示的引物扩增待测哈克尼西棉样本的基因组DNA ； 同时具有 120。
12、0 bp 处和 1045bp 处两条扩增带的样本即为可育株， 具有 1045bp 处扩增带且 不具有 1200 bp 处扩增带的样本即为不育株 ； b用 SEQ ID NO.1 和 2 所示的引物扩增步骤 a所述可育株的基因组DNA ； 同时具有170bp处和190bp处的两条扩增带的可育株为具有恢 复基因的杂合株， 具有170bp处扩增带且不具有190 bp处扩增带的可育株为哈克尼西棉胞 质不育纯合恢复株， 该恢复株扩繁获得纯合恢复系。 0017 上述标记引物 PF1 与恢复基因Rf1共分离， 其为显性标记， 可准确鉴定出恢复基 因， 同时在可育株与不育株中均在 1045bp 处一条共同扩增。
13、带， 也可以确定是否扩增成功 ； SSR 标记 NAU5121 引物与恢复基因Rf1遗传距离为 0.4cM， 为共显性标记， 可快速鉴定携带 恢复基因的可育株是否为纯合 ； 以传统方法 （田间测交和鉴定） 为验证， 证明采用本发明所 述两个标记引物共同使用， 即可快速鉴定出纯合恢复系， 准确率为 99% 以上。 0018 具体实施时， 各鉴定方法中所述的待测哈克尼西棉样本为经过花粉育性调查获得 的可育株。经过花粉育性调查后的样本， 缩短了鉴定工作量以及鉴定时间。 0019 本发明与现有技术相比具有如下有益效果 ： 1） 速度快 ： 棉花三系恢复系选育过 程中， 正常的田间测交和鉴定试验需要检测。
14、大量的表型性状， 伴随着投入大量的时间、 人力 和物力， 若不及时快速地对恢复基因进行鉴定， 势必延缓棉花三系杂交种的培育进程。 而本 发明只需要提取恢复系分离后代材料的 DNA， 用本发明所述引物进行分子标记鉴定， 就可以 很快鉴定出恢复系 （株） 的纯合性， 比传统鉴定方法减少工作量 70% 以上 ； 2） 准确率高 ： 哈 克尼西胞质不育恢复基因的表达易受环境因素影响， 花粉育性不能准确、 真实地反应恢复 基因的遗传情况 ； 本发明所述引物具有简单、 稳定可靠、 重复性好等优点， 很容易通过 PCR 快速扩增和琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测， 而且分子鉴定不受环境因素的影响， 并且 与目。
15、标基因紧密连锁或共分离， 可快速鉴定恢复基因是否纯合， 真正从 DNA 水平上鉴定恢 复基因的遗传情况， 提高了选择的精确性， 准确率至少在 97% 以上 ； 3） 实用简单 ： 本发明所 述的用于鉴定哈克尼西棉胞质不育纯合恢复系方法的整个程序易于操作， 具有很好的科学 研究和商业应用前景。 附图说明 0020 图 1 为特异标记 PF1 引物选择可育和不育单株的分析结果示意图， 图中 S 表示不 说 明 书 CN 103468805 B 4 3/4 页 5 育型， F 表示可育型， X 表示扩增失败样本。 0021 图2为 SSR标记NAU5121引物鉴定纯合恢复系的分析结果示意图， 图中P。
16、1表示不 育系亲本， P2 表示恢复系亲本， B 表示纯合恢复系， H 表示杂合恢复系。 具体实施方式 0022 材料的制备与方法 ： 0023 （1） （19R 晋棉 50） BC3F2： 以哈克尼西棉胞质不育的恢复系为母本， 晋棉 50 为 父本 （轮回亲本） ， 与恢复系杂交 1 代、 回交 3 代后， BC3F1分离群体中的可育株自交加代获得 BC3F2分离群体。 0024 （19RGK44） F2： 以哈克尼西棉胞质不育的恢复系为母本， GK44 为父本， 与恢复系 杂交 2 代后， 获得 （19RGK44） F2。 0025 （2）花粉育性调查 ： 育性调查方法参照 Justus（。
17、Justus N, Leinweber CL. A heritable partially male sterile character in cotton. J Hered (1960) 51 (4): 191-192） 的方法， 以手捻破花药是否出现花粉粒为区分可育和不育的标准。 0026 （3）分子标记检测方法 ： DNA 提取参照 CTAB 法 （Paterson AH, Brubaker CL, Wendel JF. A rapid method for extraction of cotton （Gossypium spp.） genomic DNA suitable for RF。
18、LP or PCR analysis . Plant Mol Biol Rep, 1993, 11, 2: 122-127） ， 改进为无液氮电钻研磨法， 每株取1片未展开嫩叶放入1.5ml的离心管中， 并加入预冷的新 鲜配制的提取缓冲液 600 l 进行提取。PCR 反应体系 15L， 包括 20ng 总 DNA、 0.2mmol/L dNTP、 0.5U Taq DNA聚合酶、 1 Taq DNA聚合酶buffer、 正向和反向引物各0.33mol/L、 MgCl2 2mmol/L。PCR 反应条件为 94预变性 3min ； 94 变性 30s、 55 退火 30s、 72延 伸 70s。
19、， 30 次循环 ； 72补平延伸 10min。特异标记 PF1 的 PCR 产物用 1琼脂糖胶电泳， 电压降 3V/cm， 电泳 1h， 溴化乙锭染色 ； SSR 标记 NAU5121 的 PCR 产物用 6变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳， 70W 恒功率电泳 40min， 银染显影。 0027 实施例 1 0028 2010年夏季在山西省农科院棉花研究所农场种植 （19R晋棉50） BC3F2分离群体， 种植 8 行， 每行 23-25 株。由于母本来源于胞质不育的恢复系， 在后代出现育性分离， 该分 离群体共有196株， 首先捻破花药， 鉴定单株育性， 其中可育株125株， 在可育株中， 选取。
20、SSR 标记NAU5121引物扩增出的具有170bp处扩增带且不具有190 bp处扩增带的单株共48株。 0029 2010 年冬季在海南进行田间测交和鉴定上述具有 170bp 处扩增带且不具有 190 bp 处扩增带的单株， 结果显示其中有 47 株证实为纯合恢复株， 准确率为 97.9%。 0030 实施例 2 0031 2010 年夏季在山西省农科院棉花研究所农场种植 （19RGK44） F2分离群体， 种植 20 行， 每行 23-25 株。该分离群体共有 483 株， 在开花前对该分离群体单株提取 DNA。在该 分离群体中， 选取标记 PF1 引物扩增出的具有 1200 bp 处和 。
21、1045bp 处两条扩增带的单株共 349 株， 仅有 1045bp 带型的有 126 株， 无扩增带型的有 8 株， PCR 扩增结果见图 1 ； 用 SSR 标 记 NAU5121 引物对 349 株做第二轮鉴定， 具有 170bp 处扩增带且不具有 190 bp 处扩增带的 单株共 117 株， PCR 扩增结果见图 2， 将 117 个单株与不育系测交组合。 0032 2010 年冬季海南对上述 117 个仅具有 170bp 处扩增带的单株田间测交 F1进行育 说 明 书 CN 103468805 B 5 4/4 页 6 性恢复鉴定， 结果显示其中 116 株证实为纯合恢复系 （株） 。
22、， 准确率为 99.1%。 说 明 书 CN 103468805 B 6 1/1 页 7 110 山西省农业科学院棉花研究所 120 用于鉴定哈克尼西棉胞质不育纯合恢复系的标记及方法 160 4 210 1 211 20 212 DNA 213 人工序列 400 AGGGCAAATTTCATCTCTCT 20 210 2 211 20 212 DNA 213 人工序列 400 AAAGCTTGACCGAAATCAAC 20 210 3 211 20 212 DNA 213 人工序列 400 CAAGATATGGGTAAGCTTCC 20 210 4 211 20 212 DNA 213 人工序列 400 TAACAACATTAGGCTCGATTT 20 序 列 表 CN 103468805 B 7 1/1 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103468805 B 8 。