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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610426937.4 (22)申请日 2016.06.15 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 106117294 A (43)申请公布日 2016.11.16 (73)专利权人 安顺市人民医院 地址 561000 贵州省安顺市西秀区虹山湖 路22号 专利权人 贵州省中国科学院天然产物化学 重点实验室 (72)发明人 晏晨骆衡张云东王星慧 黄丽荣王天元孙茂 (74)专利代理机构 贵阳东圣专利商标事务有限 公司 52002 代理人 兰艳文 (51)Int.Cl.。
2、 C07J 9/00(2006.01) A61K 31/575(2006.01) A61P 35/00(2006.01) 审查员 冯媛 (54)发明名称 一种川黄柏果实中提取的甘遂烷型三萜 Phellochin F化合物及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种川黄柏果实中提取的甘 遂烷型三萜PhellochinF化合物及其应用， 该化 合物从贵州安顺产川黄柏干燥果实中分离提取 得到， 其结构式为 （1） 式， 其制备方法包括乙醇萃 取， 浸膏浓缩， 硅胶柱层析， 梯度洗脱， 凝胶柱层 析， 半制备高效液相色谱纯化等步骤。 本发明所 公开的甘遂烷型三萜PhellochinF化合物是首 次从贵州安。
3、顺产川黄柏干燥果实中提取分离出 来， 并确定其结构式， 该化合物对人体乳腺癌细 胞株 （MDA） 的细胞具有治疗作用， 并能诱导人体 乳腺癌细胞株 （MDA） 细胞的凋亡， 可在制备治疗 乳腺癌的药物中得到应用， 该化合物可作为治疗 乳腺癌药物的先导性化合物。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 106117294 B 2017.11.14 CN 106117294 B 1.一种治疗乳腺癌的药物， 其特征在于： 该药物是从川黄柏果实中提取的甘遂烷型三 萜Phellochin F化合物， 其结构式为 （1） 式： ； 其制备方法包括乙醇萃取， 浸膏浓缩， 硅胶柱层析， 梯度洗脱， 凝胶柱。
4、层析， 半制备高效 液相色谱纯化， 具体为： （1） 取贵州安顺产川黄柏果实， 采用95%工业乙醇在温度为80 -90下对其回流提取 3-5次后回收乙醇浓缩得浸膏， 浸膏用水混溶成浑浊物， 经过乙酸乙酯等体积萃取、 浓缩得 乙酸乙酯层浸膏； （2） 乙酸乙酯层浸膏经过300-400目硅胶柱层析， 采用石油醚与丙酮体积比为60:10: 1比例的洗脱剂梯度洗脱， 点薄层板合并为4个部分： Fr 1 、 Fr 2、 Fr 3、 Fr 4； （3） 对步骤2中Fr 2再次进行硅胶柱层析， 采用石油醚与丙酮体积比为40:11/1比例 的洗脱剂梯度洗脱， 再次被分成4个亚部分： Fr 2a 、 Fr 2b。
5、 、 Fr 2c、 Fr 2d； （4） 对步骤3中Fr 2d 再次经过流动相为氯仿:甲醇体积比为1:1的混合液的凝胶柱层 析； （5） 对步骤 （4） 中凝胶柱层析的液体经过半制备高效液相色谱纯化得到甘遂烷型三萜 Phellochin F， 其中半制备高效液相色谱的流动相为甲醇:水体积比为95:5； 所述的化合物用作药物时， 可以直接使用或者以药物组合物的形式使用， 该药物组合 物含有 0.199的所述化合物， 其余为药用载体或赋形剂。 2.根据权利要求1所述的一种治疗乳腺癌的药物， 其特征在于： 所述的药用载体或赋形 剂是一种或多种固体、 半固体和液体稀释剂、 填料以及药物制品辅剂。 3.。
6、根据权利要求1所述的一种治疗乳腺癌的药物， 其特征在于： 所述的药物组合物以单 位体重服用量的形式使用。 4.根据权利要求1所述的一种治疗乳腺癌的药物， 其特征在于： 所述的药物组合物的剂 型有： 注射剂、 混悬剂、 乳剂、 溶液剂、 糖浆剂、 片剂、 胶囊剂、 颗粒剂， 冲剂、 喷剂、 气雾剂。 5.根据权利要求1所述的一种治疗乳腺癌的药物， 其特征在于： 所述的药物组合物进行 抗乳腺癌的治疗给药途径有： 静脉注射、 静脉滴注、 肌肉注射、 腹腔注射、 皮下注射口服、 舌 下给药、 粘膜透析。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106117294 B 2 一种川黄柏果实中提取的甘遂烷型三萜P。
7、hellochin F化合物 及其应用 技术领域 0001 本发明属于药物领域， 具体涉及一种川黄柏果实中提取的甘遂烷型三萜 Phellochin F化合物及其制备方法和应用。 背景技术 0002 甘遂烷型三萜Phellochin F是一类具有四环体系三萜类型的化合物,在植物分布 中比较罕见,是一类数量较少的三萜类化合物， 中国药科大学天然药物化学教研室张耀在 中草药 期刊上发表 “甘遂烷型三萜的研究进展” 提出甘遂烷型三萜是一类柠檬苦素的前 体物质, 药理研究显示该类化合物对 KB细胞显示出一定的活性, 但对其他类型的肿瘤细 胞只有微弱的活性或无活性， 文中综述了甘遂烷型三萜类化合物的植物分。
8、布和化学结构分 类, 主要植物分布为： 芸香科、 苦木科、 大戟科、 漆树科、 三柱草科、 红树科。 0003 黄柏为芸香科黄檗属 （Phellodendron） 植物。 该属植物共4种， 我国有2种及1变种， 分别为黄檗 （Phellodendron amurense Rupr. ） ， 川黄檗 （Phellodendron chinense Schneid. ） 和秃叶黄檗 （Phellodendron chinense Schneid .var. glabriusculum Schneid. ） . 关黄柏主产于辽宁、 吉林、 黑龙江、 河北、 内蒙古等地； 川黄柏主产于四川、 湖 北、。
9、 贵州、 云南、 陕西、 广西等地。 其药材基源为芸香科植物黄檗或黄皮树的树皮， 主治： 湿热 痢疾、 泄泻、 黄疸； 梦遗、 淋浊、 带下； 骨蒸劳热， 盗汗； 以及口舌生疮； 目赤肿痛； 痈疽疮毒； 皮 肤湿疹， 迄今为止， 现有技术中未见有从黄柏果实中提取甘遂烷型三萜Phellochin F及其 活性的研究报道。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种川黄柏果实中提取甘遂烷型三萜Phellochin F化合物 及其制备方法， 以及该化合物用于制备治疗乳腺癌药物中的应用。 0005 本发明的目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的： 一种川黄柏 果实中提取的甘遂烷型三萜Phe。
10、llochin F化合物， 其特征在于： 所述的甘遂烷型三萜 Phellochin F化合物从川黄柏干燥果实中分离提取得到， 其结构式为 （1） 式： 0006， 0007 其制备方法包括乙醇萃取， 浸膏浓缩， 硅胶柱层析， 梯度洗脱， 凝胶柱层析， 半制备 高效液相色谱纯化， 具体为： 0008 （1） 取川黄柏果实， 采用95%工业乙醇在温度为80 -90下对其回流提取3-5次 后回收乙醇浓缩得浸膏， 浸膏用水混溶成浑浊物， 经过乙酸乙酯等体积萃取、 浓缩得乙酸乙 说明书 1/5 页 3 CN 106117294 B 3 酯层浸膏； 0009 （2） 乙酸乙酯层浸膏经过300-400目硅胶。
11、柱层析， 采用石油醚与丙酮体积比为60:1 0:1比例的洗脱剂梯度洗脱， 点薄层板合并为4个部分： Fr 1 、 Fr 2、 Fr 3、 Fr 4； 0010 （3） 对步骤2中Fr 2再次进行硅胶柱层析， 采用石油醚与丙酮体积比为40:11/1 比例的洗脱剂梯度洗脱， 再次被分成4个亚部分： Fr 2a 、 Fr 2b 、 Fr 2c、 Fr 2d； 0011 （4） 对步骤3中Fr 2d 再次经过流动相为氯仿:甲醇体积比为1:1的混合液的凝胶 柱层析； 0012 （5） 对步骤 （4） 中凝胶柱层析的液体经过半制备高效液相色谱纯化得到甘遂烷型 三萜Phellochin F， 其中半制备高效。
12、液相色谱的流动相为甲醇:水体积比为95:5。 0013 所述的川黄柏为贵州安顺产川黄柏。 0014 所述步骤所制备的甘遂烷型三萜Phellochin F化合物在制备治疗乳腺癌药物中 的应用。 0015 所述的化合物用作药物时， 可以直接使用或者以药物组合物的形式使用， 该药物 组合物含有 0.199的所述化合物， 其余为药用载体或赋形剂。 0016 所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、 半固体和液体稀释剂、 填料以及药 物制品辅剂。 0017 所述的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。 0018 所述的药物组合物的剂型有： 注射剂、 混悬剂、 乳剂、 溶液剂、 糖浆剂、 片剂、 胶囊 剂。
13、、 颗粒剂， 冲剂、 喷剂、 气雾剂。 0019 所述的药物组合物进行抗乳腺癌的治疗给药途径有： 静脉注射、 静脉滴注、 肌肉注 射、 腹腔注射、 皮下注射口服、 舌下给药、 粘膜透析。 0020 本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果。 由以上技术方案可知， 本发 明来自于贵州安顺产川黄柏果实中的甘遂烷型三萜Phellochin F 化合物， 对乳腺癌细胞 （MDA） 具有治疗作用， 将甘遂烷型三萜Phellochin F用于制备治疗乳腺癌的药物， 具有重要 的开发应用前景。 附图说明 0021 图1是甘遂烷型三萜Phellochin F的结构图。 0022 图2是在10 M 的Phe。
14、llochin F药物对HEL、 K562、 MDA、 PC3的抑制率。 0023 图3是不同浓度下Phellochin F对MDA的抑制率。 0024 图4. 1H-NMR spectrum of Phellochin F in CD3Cl。 0025 图5. 13C-NMR spectrum of Phellochin F in CD3Cl。 具体实施方式 0026 以下结合附图和较佳实施例， 对依据本发明提出的一种川黄柏果实中提取的甘遂 烷型三萜Phellochin F化合物及其应用具体实施方式、 特征及其功效， 详细说明如后。 0027 一种川黄柏果实中提取的甘遂烷型三萜Phelloc。
15、hin F化合物， 其特征在于： 所述 的甘遂烷型三萜Phellochin F化合物从川黄柏干燥果实中分离提取得到， 其结构式为 （1） 式： 说明书 2/5 页 4 CN 106117294 B 4 0028， 0029 其制备方法包括乙醇萃取， 浸膏浓缩， 硅胶柱层析， 梯度洗脱， 凝胶柱层析， 半制备 高效液相色谱纯化， 具体为： 0030 （1） 取川黄柏果实， 采用95%工业乙醇在温度为80 -90下对其回流提取3-5次 后回收乙醇浓缩得浸膏， 浸膏用水混溶成浑浊物， 经过乙酸乙酯等体积萃取、 浓缩得乙酸乙 酯层浸膏； 0031 （2） 乙酸乙酯层浸膏经过300-400目硅胶柱层析，。
16、 采用石油醚与丙酮体积比为60:1 0:1比例的洗脱剂梯度洗脱， 点薄层板合并为4个部分： Fr 1 、 Fr 2、 Fr 3、 Fr 4； 0032 （3） 对步骤2中Fr 2再次进行硅胶柱层析， 采用石油醚与丙酮体积比为40:11/1 比例的洗脱剂梯度洗脱， 再次被分成4个亚部分： Fr 2a 、 Fr 2b 、 Fr 2c、 Fr 2d； 0033 （4） 对步骤3中Fr 2d 再次经过流动相为氯仿:甲醇体积比为1:1的混合液的凝胶 柱层析； 0034 （5） 对步骤 （4） 中凝胶柱层析的液体经过半制备高效液相色谱纯化得到甘遂烷型 三萜Phellochin F， 其中半制备高效液相色谱。
17、的流动相为甲醇:水体积比为95:5。 0035 所述的川黄柏为贵州安顺产川黄柏。 0036 所述步骤所制备的甘遂烷型三萜Phellochin F化合物在制备治疗乳腺癌药物中 的应用。 0037 所述的化合物用作药物时， 可以直接使用或者以药物组合物的形式使用， 该药物 组合物含有 0.199的所述化合物， 其余为药用载体或赋形剂。 0038 所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、 半固体和液体稀释剂、 填料以及药 物制品辅剂。 0039 所述的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。 0040 所述的药物组合物的剂型有： 注射剂、 混悬剂、 乳剂、 溶液剂、 糖浆剂、 片剂、 胶囊 剂、 颗粒。
18、剂， 冲剂、 喷剂、 气雾剂。 0041 所述的药物组合物进行抗乳腺癌的治疗给药途径有： 静脉注射、 静脉滴注、 肌肉注 射、 腹腔注射、 皮下注射口服、 舌下给药、 粘膜透析。 0042 实施例1 0043 取贵州安顺产川黄柏果实15 Kg， 经95%工业乙醇在温度80的条件下对其回流 提取3次后回收乙醇浓缩得浸膏2.0 Kg， 浸膏用水混溶成浑浊物， 经过乙酸乙酯等体积萃 取、 浓缩得乙酸乙酯层浸膏为0.9 Kg， 乙酸乙酯层经过300目硅胶硅胶柱层析， 采用石油醚 与丙酮体积比为60:1的洗脱剂梯度洗脱， 点薄层板合并为4个部分： Fr 1、 Fr 2、 Fr 3 、 Fr 4， 对得到。
19、的55.0g Fr 2再次进行硅胶柱层析， 洗脱剂为石油醚与乙酸乙酯体积比为40:1梯 度洗脱， 再次被分成4个亚部分： Fr 2a 、 Fr 2b、 Fr 2c、 Fr 2d ； 对四个亚部分中Fr 2d 再 次经过流动相为氯仿： 甲醇体积比为1:1的混合液的凝胶柱层析； 最后半制备高效液相色谱 纯化得到甘遂烷型三萜Phellochin F， 其中半制备高效液相色谱的流动相为甲醇： 水体积 说明书 3/5 页 5 CN 106117294 B 5 比为95:5。 0044 采用核磁质谱分析化合物， 其数据分析如下： White amorphous powder; a24 D-35.52 (c。
20、 2.20, MeOH); UV (MeOH)max (log ) 204.6 (3.63) nm; IR (KBr) vmax 3440, 2969, 2937, 1708, 1630, 1469, 1386, 1161, 996 cm-1; positive ESIMS m/z 517 M + Na+; HRESIMSm/z 517.3058 M + Na+ (calcd for C29H47Cl O4Na , 517.3055). 1H-NMR(400MHz, CDCl3) : 1.43 (1H, m, H-1 ), 1.98 (1H, m, H-1 ), 2.24 (1H, m, H-。
21、2 ), 2.78 (1H, m, H-2 ), 1.71 (1H, m, H-5), 2.09 (1H, m, H-6), 5.33 (1H, d, J = 2.8 Hz, H-7), 2.34 (1H, m, H-9), 1.59 (2H, m, H-11), 1.67 (1H, m, H-12 ), 1.84 (1H, m, H-12 ), 1.51 (1H, m, H-15 ), 1.59 (1H, m, H-15 ), 1.60 (1H, m, H-16 ), 2.19 (1H, m, H-16 ), 2.13 (1H, m, H-17), 0.85 (3H, s, H-18) , 。
22、1.00 (3H, s, H-19) , 4.19 (1H, td, J = 1.2, 11.2 Hz, H-21) , 1.53 (1H, m, H-22 ), 2.36 (1H, m, H-22 ), 4.38 (1H, d, J = 9.6 Hz, H-23) , 3.08 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-24), 1.32 (3H, s, H-26), 1.31 (3H, s, H-27), 1.11 (3H, s, H-28), 1.04 (3H, s, H-29), 1.05 (3H, s, H-30). 13C-NMR(100MHz, CD3OD): 38.4 (C-。
23、1) , 34.8 (C-2) , 216.9 (C-3) , 47.8 (C-4) , 52.2 (C-5) , 24.3 (C-6) , 118.5 (C-7), 144.9 (C-8), 48.2 (C-9), 35.0 (C-10), 18.0 (C-11), 33.2 (C-12), 44.0 (C-13), 51.8 (C-14), 33.6 (C-15), 29.2 (C-16), 55.6 (C-17), 22.0 (C-18), 12.7 (C-19), 66.5 (C-20), 42.2 (C-22), 68.2 (C-23), 77.4 (C-24), 74.4 (C-2。
24、5), 26.2 (C-26), 27.3 (C-27), 21.6 (C-28), 24.4 (C-29), 27.4 (C-30)。 0045 其相应的1H-NMR、 13C-NMR图见附图4， 图5； 0046 片剂： 取所得的甘遂烷型三萜Phellochin F 10mg， 乳糖180mg， 淀粉55mg， 硬脂酸 镁5 mg； 0047 制备方法： 将化合物、 乳糖和淀粉混合， 用水均匀湿润， 把湿润的混合物过筛并干 燥， 再过筛， 加入硬脂酸镁， 然后将混合物压片， 每片重250 mg， 化合物含量为10 mg。 0048 实施例2 0049 安瓿剂 ： 实施例 1 所得化合物Ph。
25、ellochin F 2 mg， 氯化钠 10 mg； 0050 制备方法： 将化合物和氯化钠溶解于适量的注射用水中， 过滤所得溶液， 在无菌条 件下装入安瓿瓶中。 0051 实施例3 0052 胶囊剂： 实施例1所得Phellochin F 10 mg， 乳糖187 mg， 硬脂酸镁3 mg； 0053 制备方法： 将Phellochin F与助剂混合， 过筛， 均匀混合， 把得到的混合物装入硬 明胶胶囊中， 每个胶囊重200 mg， 活性成分为10 mg。 0054 为了进一步分析甘遂烷型三萜Phellochin F对人体乳腺癌细胞株 （MDA） 的细胞具 有治疗作用， 并能诱导人体乳腺癌。
26、细胞株 （MDA） 细胞的凋亡， 并更好的用于制备治疗乳腺癌 的药物中， 将得到的甘遂烷型三萜Phellochin F对肿瘤细胞的抑制影响做以下实验： 0055 1 实验材料： 0056 进口96孔培养板， DEME培养液 （美国HyClone公司生产） ， 胎牛血清 （杭州四季青公 司生产） ， 0.25% 胰酶 （Trypsin） 为美国HyClone 产品， 四甲基偶氮唑蓝( 3-( 4， 5- Dimethyl-thiazol-2-yl-tetrazolium bromide； MTT) 购自Sigma 公司， 二甲基亚砜 说明书 4/5 页 6 CN 106117294 B 6 （d。
27、imethyl sulfoxide； DMSO） 为北京索莱宝科技有限公司产品， Allegra X-15R台式离心机 （美国贝克曼公司） ， Axio Vert.A1倒置生物显微镜 （德国卡尔蔡司公司） ， TS100双目倒置相 差生物显微镜(日本尼康公司） ， 酶标仪 （美国BIOTEK公司。 选用的肿瘤细胞株为： 人红白细 胞白血病细胞HEL、 白血病细胞株K562、 人体乳腺癌细胞株MDA、 前列腺癌细胞株PC3。 药物用 DMSO （二甲基亚砜） 溶解后配成储存液， -20保存备用。 0057 试验过程 0058 将冻存管内的肿瘤细胞于37 水浴箱中迅速解冻， 离心收集细胞后， 用含。
28、10% 胎 牛血清及1%青霉素、 1% 链霉素的DMEM培养液， 至37、 5% CO2恒温饱和湿度的培养箱中进 行培养， 隔天换液。 当细胞80% 汇合时进行传代， 选取对数生长期细胞进行实验。 取约80% 面积覆有细胞的培养皿， 将细胞转移到离心管后， 800 r/min离心5min， 弃上清后加入新的 培养液调整细胞浓度至1104个/ml密度接种于96孔培养板中， 每孔加入190 l细胞液， 各 药物分别设置3个复孔， 并设置空白组与对照组， 于37， 5% CO2恒温饱和湿度条件下培养4 h后加药10 l， 对照组加10 l与对应药物同比例稀释的DMSO， 空白组加10 l无血清培养 。
29、液， 继续培养72 h后， 1500 r/min离心8min， 倒板， 加入100 l DMEM培养基与MTT混合液 （DMEM与MTT混合比例为9:1， 现配现用） ， 继续培养4 h后， 1500 r/min离心8 min， 倒板， 每孔 加150 l DMSO溶解结晶物， 摇床低速震荡5-10 min， 采用酶标仪于490 nm处检测OD值。 得 到各组OD值后， 按下列公式计算细胞增殖抑制率 （此部分实验重复3次） ： 0059 生长抑制率 （%） = （空白组吸光度平均值-加药组吸光度平均值） / 空白组吸光度平 均值 100% 0060 3.试验结果 0061 从图2、 图3结果表。
30、明， Phellochin F可以剂量依赖性的抑制MDA细胞的增殖， 对 HEL、 K562、 PC3抑制较差， 表现出很好的选择性。 进一步的实验、 计算， 其IC50为10.66 2.15 mol/L。 得出结论： Phellochin F对人体乳腺癌细胞株MDA具有较强的抑制作用， 并且 对肿瘤细胞株表现出很好的选择性。 0062 以上所述， 仅是本发明的较佳实施例而已， 并非对本发明作任何形式上的限制， 任 何未脱离本发明技术方案内容， 依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修 改、 等同变化与修饰， 均仍属于本发明技术方案的范围内。 说明书 5/5 页 7 CN 106117294 B 7 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 8 CN 106117294 B 8 图4 图5 说明书附图 2/2 页 9 CN 106117294 B 9 。