技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一套适于不结球白菜品种核酸指纹数据库构建的核 心SNP标记及其应用。
背景技术
不结球白菜俗称青菜、小白菜、又称油菜，起源于中国，现今已逐渐成为了一种世界性 的蔬菜作物。小白菜性喜冷凉，又较耐低温和高温，一年四季均可种植、上市，在蔬菜的周 年供应中占据极为重要的地位。近几年，随着不结球白菜种植面积的逐年扩大，品种数目也 急剧增多。频繁使用少数骨干自交系使得新品种的遗传基础日益狭窄，品种间相似程度高， 并存在很多假冒伪劣品种或衍生、派生品种。如何高效进行品种管理，保护生产者和育种家 的权益已成为当前不结球白菜产业发展面临的主要难题之一。基于新一代SNP分子标记，建 立不结球白菜品种核酸指纹数据库，是开展不结球白菜品种真实性和纯度鉴定的基础。
2011年白菜基因组测序，继而完成了多份白菜作物核心种质的重测序工作，建立了白菜 遗传变异的大数据，为开发覆盖全基因组的SNP和InDel等特异分子标记奠定了重要基础。 与此同时，高通量基因分型技术也得到了快速发展，我国多家企事业单位引进了高通量基因 分型的技术和平台，为开展多位点、多样品的分子检测工作提供了重要支撑。总之，目前我 国在高通量测序和基因分型方面的研究成果，为开展白菜及其它蔬菜作物DNA指纹鉴定技 术提供了前所未有的机遇。
新一代SNP分子标记是基因组上单个核苷酸变异形成的遗传标记，其数量数以万计，分 布广泛。常见的SNP遗传标记是一种二等位基因的标记，不用分析片段的长度，它与被广泛 应用的SSR标记技术相比具有明显优势：①遗传变异稳定；②适于高通量规模化筛选和易于 准确基因分型，无论是英国LGC(LaboratoryoftheGovernmentChemist政府化学家实验室) 有限公司的基于竞争性等位基因特异性PCR(KASPar)技术还是Taqman技术均可以实现SNP 的低成本、高通量分型检测，而且检测结果可视化、数据化、更加稳定可靠；③对于分析两 个等位变异材料，不需要参照品种或标准品种；④在样品DNA的使用量上，LGC公司的 KASPar技术仅需要ng级的DNA，而且适用于多个方法提取的DNA(包括NaOH法等快速 提取方法)，可以实现全程高通量检测分型。
在国际上，SNP指纹鉴定技术已被孟山都、先锋、国际种业联盟ISF等机构广泛应用于 玉米、小麦和蔬菜等多个重要作物的身份鉴定。但我国还没有利用SNP标记技术进行不结球 白菜DNA指纹数据库构建和品种鉴定的有关报道。本研究采用KASPar技术，利用62对SNP 核心引物对124个不结球白菜品种进行基因分型，获得了不同品种的SNP分型数据；利用 GGT2.0对上述数据进行分析，形成了各个品种的SNP指纹代码；进而使用PowerMarkerV3.25 和MEGA6.06软件对不同品种进行聚类分析，结果可以将这些品种完全分开。本研究构建的 白菜品种SNP指纹图谱数据库，为建立白菜品种特异性、一致性及纯度的鉴定技术体系提供 了基础依据。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种不结球白菜基因组中的62个SNP位点或检测不结球白菜 基因组中的62个SNP位点的物质的新用途。
本发明提供了不结球白菜基因组中的62个SNP位点或检测不结球白菜基因组中的62个 SNP位点的物质在如下任一中的应用：
(1)不结球白菜品种进行基因分型；
(2)构建不结球白菜DNA指纹数据库；
(3)不结球白菜种质资源遗传多样性分析和/或进化分析和/或聚类分析；
(4)鉴别或辅助鉴别不结球白菜品种；
(5)检测任意两个不结球白菜的相似性；
所述62个SNP位点如下：
所述SNP位点1为A01染色体上的第4878177位核苷酸；
所述SNP位点2为A01染色体上的第9716212位核苷酸；
所述SNP位点3为A01染色体上的第11039761位核苷酸；
所述SNP位点4为A01染色体上的第17311260位核苷酸；
所述SNP位点5为A01染色体上的第22449302位核苷酸；
所述SNP位点6为A01染色体上的第26752589位核苷酸；
所述SNP位点7为A02染色体上的第751652位核苷酸；
所述SNP位点8为A02染色体上的第6431221位核苷酸；
所述SNP位点9为A02染色体上的第11181828位核苷酸；
所述SNP位点10为A02染色体上的第14369430位核苷酸；
所述SNP位点11为A02染色体上的第16465013位核苷酸；
所述SNP位点12为A02染色体上的第23174443位核苷酸；
所述SNP位点13为A02染色体上的第26812976位核苷酸；
所述SNP位点14为A03染色体上的第128271位核苷酸；
所述SNP位点15为A03染色体上的第4471683位核苷酸；
所述SNP位点16为A03染色体上的第5450320位核苷酸；
所述SNP位点17为A03染色体上的第12523505位核苷酸；
所述SNP位点18为A03染色体上的第15431305位核苷酸；
所述SNP位点19为A03染色体上的第19649018位核苷酸；
所述SNP位点20为A03染色体上的第24127049位核苷酸；
所述SNP位点21为A03染色体上的第28629888位核苷酸；
所述SNP位点22为A04染色体上的第1833604位核苷酸；
所述SNP位点23为A04染色体上的第9741929位核苷酸；
所述SNP位点24为A04染色体上的第11311194位核苷酸；
所述SNP位点25为A04染色体上的第13764622位核苷酸；
所述SNP位点26为A05染色体上的第1283352位核苷酸；
所述SNP位点27为A05染色体上的第6796365位核苷酸；
所述SNP位点28为A05染色体上的第8088873位核苷酸；
所述SNP位点29为A05染色体上的第14441564位核苷酸；
所述SNP位点30为A05染色体上的第17810370位核苷酸；
所述SNP位点31为A05染色体上的第19009544位核苷酸；
所述SNP位点32为A05染色体上的第22895070位核苷酸；
所述SNP位点33为A06染色体上的第18887位核苷酸；
所述SNP位点34为A06染色体上的第6403261位核苷酸；
所述SNP位点35为A06染色体上的第16193195位核苷酸；
所述SNP位点36为A06染色体上的第18685199位核苷酸；
所述SNP位点37为A06染色体上的第20833714位核苷酸；
所述SNP位点38为A06染色体上的第24717886位核苷酸；
所述SNP位点39为A07染色体上的第246275位核苷酸；
所述SNP位点40为A07染色体上的第6101124位核苷酸；
所述SNP位点41为A07染色体上的第11498098位核苷酸；
所述SNP位点42为A07染色体上的第14747998位核苷酸；
所述SNP位点43为A07染色体上的第18060124位核苷酸；
所述SNP位点44为A07染色体上的第20112319位核苷酸；
所述SNP位点45为A08染色体上的第240722位核苷酸；
所述SNP位点46为A08染色体上的第8933259位核苷酸；
所述SNP位点47为A08染色体上的第16162051位核苷酸；
所述SNP位点48为A08染色体上的第18668405位核苷酸；
所述SNP位点49为A08染色体上的第20716882位核苷酸；
所述SNP位点50为A09染色体上的第165179位核苷酸；
所述SNP位点51为A09染色体上的第583658位核苷酸；
所述SNP位点52为A09染色体上的第4354836位核苷酸；
所述SNP位点53为A09染色体上的第5122605位核苷酸；
所述SNP位点54为A09染色体上的第11056315位核苷酸；
所述SNP位点55为A09染色体上的第26520788位核苷酸；
所述SNP位点56为A09染色体上的第30448774位核苷酸；
所述SNP位点57为A09染色体上的第34559009位核苷酸；
所述SNP位点58为A09染色体上的第37047265位核苷酸；
所述SNP位点59为A10染色体上的第8425118位核苷酸；
所述SNP位点60为A10染色体上的第12134922位核苷酸；
所述SNP位点61为A10染色体上的第13859895位核苷酸；
所述SNP位点62为A10染色体上的第15835648位核苷酸。
上述应用中，所述检测不结球白菜基因组中的62个SNP位点的物质为如下62组引物：
(1)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点1的引物组1，
所述引物组1由序列1所示的正向引物、序列2所示的正向引物和序列3所示的反向引 物组成；
(2)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点2的引物组2，
所述引物组2由序列4所示的正向引物、序列5所示的正向引物和序列6所示的正向引 物组成；
(3)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点3的引物组3，
所述引物组3由序列7所示的正向引物、序列8所示的正向引物和序列9所示的正向引 物组成；
(4)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点4的引物组4，
所述引物组4由序列10所示的正向引物、序列11所示的正向引物和序列12所示的正 向引物组成；
(5)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点5的引物组5，
所述引物组5由序列13所示的正向引物、序列14所示的正向引物和序列15所示的正 向引物组成5；
(6)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点6的引物组6，
所述引物组6由序列16所示的正向引物、序列17所示的正向引物和序列18所示的正 向引物组成；
(7)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点7的引物组7，
所述引物组7由序列19所示的正向引物、序列20所示的正向引物和序列21所示的正 向引物组成；
(8)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点8的引物组8，
所述引物组8由序列22所示的正向引物、序列23所示的正向引物和序列24所示的正 向引物组成；
(9)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点9的引物组9，
所述引物组9由序列25所示的正向引物、序列26所示的正向引物和序列27所示的正 向引物组成；
(10)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点10的引物组10，
所述引物组10由序列28所示的正向引物、序列29所示的正向引物和序列30所示的正 向引物组成；
(11)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点11的引物组11，
所述引物组2由序列31所示的正向引物、序列32所示的正向引物和序列33所示的反 向引物组成；
(12)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点12的引物组12，
所述引物组12由序列34所示的正向引物、序列35所示的正向引物和序列36所示的反 向引物组成；
(13)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点13的引物组13，
所述引物组13由序列37所示的正向引物、序列38所示的正向引物和序列39所示的反 向引物组成；
(14)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点14的引物组14，
所述引物组14由序列40所示的正向引物、序列41所示的正向引物和序列42所示的反 向引物组成；
(15)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点15的引物组15，
所述引物组15由序列43所示的正向引物、序列44所示的正向引物和序列45所示的反 向引物组成；
(16)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点16的引物组16，
所述引物组16由序列46所示的正向引物、序列47所示的正向引物和序列48所示的反 向引物组成；
(17)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点17的引物组17，
所述引物组17由序列49所示的正向引物、序列50所示的正向引物和序列51所示的反 向引物组成；
(18)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点18的引物组18，
所述引物组18由序列52所示的正向引物、序列53所示的正向引物和序列54所示的反 向引物组成；
(19)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点19的引物组19，
所述引物组19由序列55所示的正向引物、序列56所示的正向引物和序列57所示的反 向引物组成；
(20)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点20的引物组20，
所述引物组20由序列58所示的正向引物、序列59所示的正向引物和序列60所示的反 向引物组成；
(21)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点21的引物组21，
所述引物组21由序列61所示的正向引物、序列62所示的正向引物和序列63所示的正 向引物组成；
(22)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点22的引物组22，
所述引物组22由序列64所示的正向引物、序列65所示的正向引物和序列66所示的反 向引物组成；
(23)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点23的引物组23，
所述引物组23由序列67所示的正向引物、序列68所示的正向引物和序列69所示的反 向引物组成；
(24)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点24的引物组24，
所述引物组24由序列70所示的正向引物、序列71所示的正向引物和序列72所示的反 向引物组成；
(25)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点25的引物组25，
所述引物组25由序列73所示的正向引物、序列74所示的正向引物和序列75所示的反 向引物组成；
(26)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点26的引物组26，
所述引物组26由序列76所示的正向引物、序列77所示的正向引物和序列78所示的反 向引物组成；
(27)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点27的引物组27，
所述引物组27由序列79所示的正向引物、序列80所示的正向引物和序列81所示的反 向引物组成；
(28)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点28的引物组28，
所述引物组28由序列82所示的正向引物、序列83所示的正向引物和序列84所示的反 向引物组成；
(29)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点29的引物组29，
所述引物组29由序列85所示的正向引物、序列86所示的正向引物和序列87所示的反 向引物组成；
(30)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点30的引物组30，
所述引物组30由序列88所示的正向引物、序列89所示的正向引物和序列90所示的反 向引物组成；
(31)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点31的引物组31，
所述引物组31由序列91所示的正向引物、序列92所示的正向引物和序列93所示的反 向引物组成；
(32)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点32的引物组32，
所述引物组32由序列94所示的正向引物、序列95所示的正向引物和序列96所示的正 向引物组成；
(33)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点33的引物组33，
所述引物组33由序列97所示的正向引物、序列98所示的正向引物和序列99所示的反 向引物组成；
(34)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点34的引物组34，
所述引物组34由序列100所示的正向引物、序列101所示的正向引物和序列102所示 的反向引物组成；
(35)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点35的引物组35，
所述引物组35由序列103所示的正向引物、序列104所示的正向引物和序列105所示 的反向引物组成；
(36)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点36的引物组36，
所述引物组36由序列106所示的正向引物、序列107所示的正向引物和序列108所示 的反向引物组成；
(37)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点37的引物组37，
所述引物组37由序列109所示的正向引物、序列110所示的正向引物和序列111所示 的反向引物组成；
(38)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点38的引物组38，
所述引物组2由序列112所示的正向引物、序列113所示的正向引物和序列114所示的 反向引物组成；
(39)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点39的引物组39，
所述引物组39由序列115所示的正向引物、序列116所示的正向引物和序列117所示 的反向引物组成；
(40)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点40的引物组40，
所述引物组40由序列118所示的正向引物、序列119所示的正向引物和序列120所示 的反向引物组成；
(41)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点41的引物组41，
所述引物组41由序列121所示的正向引物、序列122所示的正向引物和序列123所示 的反向引物组成；
(42)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点42的引物组42，
所述引物组42由序列124所示的正向引物、序列125所示的正向引物和序列126所示 的反向引物组成；
(43)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点43的引物组43，
所述引物组43由序列127所示的正向引物、序列128所示的正向引物和序列129所示 的正向引物组成；
(44)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点44的引物组44，
所述引物组44由序列130所示的正向引物、序列131所示的正向引物和序列132所示 的反向引物组成；
(45)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点45的引物组45，
所述引物组45由序列133所示的正向引物、序列134所示的正向引物和序列135所示 的反向引物组成；
(46)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点46的引物组46，
所述引物组46由序列136所示的正向引物、序列137所示的正向引物和序列138所示 的反向引物组成；
(47)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点47的引物组47，
所述引物组47由序列139所示的正向引物、序列140所示的正向引物和序列141所示 的反向引物组成；
(48)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点48的引物组48，
所述引物组48由序列142所示的正向引物、序列143所示的正向引物和序列144所示 的反向引物组成；
(49)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点49的引物组49，
所述引物组49由序列145所示的正向引物、序列146所示的正向引物和序列147所示 的反向引物组成；
(50)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点50的引物组50，
所述引物组50由序列148所示的正向引物、序列149所示的正向引物和序列150所示 的反向引物组成；
(51)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点51的引物组51，
所述引物组51由序列151所示的正向引物、序列152所示的正向引物和序列153所示 的反向引物组成；
(52)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点52的引物组52，
所述引物组52由序列154所示的正向引物、序列155所示的正向引物和序列156所示 的反向引物组成；
(53)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点53的引物组53，
所述引物组53由序列157所示的正向引物、序列158所示的正向引物和序列159所示 的反向引物组成；
(54)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点54的引物组54，
所述引物组54由序列160所示的正向引物、序列161所示的正向引物和序列162所示 的反向引物组成；
(55)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点55的引物组55，
所述引物组55由序列163所示的正向引物、序列164所示的正向引物和序列165所示 的反向引物组成；
(56)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点56的引物组56，
所述引物组56由序列166所示的正向引物、序列167所示的正向引物和序列168所示 的反向引物组成；
(57)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点57的引物组57，
所述引物组57由序列169所示的正向引物、序列170所示的正向引物和序列171所示 的反向引物组成；
(58)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点58的引物组58，
所述引物组58由序列172所示的正向引物、序列173所示的正向引物和序列174所示 的反向引物组成；
(59)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点59的引物组59，
所述引物组59由序列175所示的正向引物、序列176所示的正向引物和序列177所示 的反向引物组成；
(60)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点60的引物组60，
所述引物组60由序列178所示的正向引物、序列179所示的正向引物和序列180所示 的反向引物组成；
(61)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点61的引物组61，
所述引物组61由序列181所示的正向引物、序列182所示的正向引物和序列183所示 的反向引物组成；
(62)用于检测不结球白菜基因组DNA的SNP位点62的引物组62，
所述引物组62由序列184所示的正向引物、序列185所示的正向引物和序列186所示 的反向引物组成。
本发明的第二个目的是提供一种检测不结球白菜62个SNP位点的物质、或一种对不结 球白菜品种进行基因分型的物质、或构建不结球白菜DNA指纹数据库的物质、或不结球白 菜种质资源聚类分析的物质、或鉴别或辅助鉴别不结球白菜品种的物质。
本发明提供的检测不结球白菜62个SNP位点的物质、或一种对不结球白菜品种进行基 因分型的物质、或构建不结球白菜DNA指纹数据库的物质、或不结球白菜种质资源聚类分 析的物质、或鉴别或辅助鉴别不结球白菜品种的物质为上述应用中的62组引物。
本发明的第三个目的是提供一种对不结球白菜品种进行基因分型和/或构建不结球白菜 DNA指纹数据库和/或不结球白菜种质资源聚类分析和/或鉴别或辅助鉴别不结球白菜品种的 成套PCR试剂。
本发明提供的对不结球白菜品种进行基因分型和/或构建不结球白菜DNA指纹数据库和 /或不结球白菜种质资源聚类分析和/或鉴别或辅助鉴别不结球白菜品种的成套PCR试剂由 PCR试剂1、PCR试剂2、PCR试剂3、PCR试剂4、PCR试剂5、PCR试剂6、PCR试剂7、 PCR试剂8、PCR试剂9、PCR试剂10、PCR试剂11、PCR试剂12、PCR试剂13、PCR试 剂14、PCR试剂15、PCR试剂16、PCR试剂17、PCR试剂18、PCR试剂19、PCR试剂20、 PCR试剂21、PCR试剂22、PCR试剂23、PCR试剂24、PCR试剂25、PCR试剂26、PCR 试剂27、PCR试剂28、PCR试剂29、PCR试剂30、PCR试剂31、PCR试剂32、PCR试剂 33、PCR试剂34、PCR试剂35、PCR试剂36、PCR试剂37、PCR试剂38、PCR试剂39、 PCR试剂40、PCR试剂41、PCR试剂42、PCR试剂43、PCR试剂44、PCR试剂45、PCR 试剂46、PCR试剂47、PCR试剂48、PCR试剂49、PCR试剂50、PCR试剂51、PCR试剂 52、PCR试剂53、PCR试剂54、PCR试剂55、PCR试剂56、PCR试剂57、PCR试剂58、 PCR试剂59、PCR试剂60、PCR试剂61和PCR试剂62组成；
所述PCR试剂1包括上述引物组1；
所述PCR试剂2包括上述引物组2；
所述PCR试剂3包括上述引物组3；
所述PCR试剂4包括上述引物组4；
所述PCR试剂5包括上述引物组5；
所述PCR试剂6包括上述引物组6；
所述PCR试剂7包括上述引物组7；
所述PCR试剂8包括上述引物组8；
所述PCR试剂9包括上述引物组9；
所述PCR试剂10包括上述引物组10；
所述PCR试剂11包括上述引物组11；
所述PCR试剂12包括上述引物组12；
所述PCR试剂13包括上述引物组13；
所述PCR试剂14包括上述引物组14；
所述PCR试剂15包括上述引物组15；
所述PCR试剂16包括上述引物组16；
所述PCR试剂17包括上述引物组17；
所述PCR试剂18包括上述引物组18；
所述PCR试剂19包括上述引物组19；
所述PCR试剂20包括上述引物组20；
所述PCR试剂21包括上述引物组21；
所述PCR试剂22包括上述引物组22；
所述PCR试剂23包括上述引物组23；
所述PCR试剂24包括上述引物组24；
所述PCR试剂25包括上述引物组25；
所述PCR试剂26包括上述引物组26；
所述PCR试剂27包括上述引物组27；
所述PCR试剂28包括上述引物组28；
所述PCR试剂29包括上述引物组29；
所述PCR试剂30包括上述引物组30；
所述PCR试剂31包括上述引物组31；
所述PCR试剂32包括上述引物组32；
所述PCR试剂33包括上述引物组33；
所述PCR试剂34包括上述引物组34；
所述PCR试剂35包括上述引物组35；
所述PCR试剂36包括上述引物组36；
所述PCR试剂37包括上述引物组37；
所述PCR试剂38包括上述引物组38；
所述PCR试剂39包括上述引物组39；
所述PCR试剂40包括上述引物组40；
所述PCR试剂41包括上述引物组41；
所述PCR试剂42包括上述引物组42；
所述PCR试剂43包括上述引物组43；
所述PCR试剂44包括上述引物组44；
所述PCR试剂45包括上述引物组45；
所述PCR试剂46包括上述引物组46；
所述PCR试剂47包括上述引物组47；
所述PCR试剂48包括上述引物组48；
所述PCR试剂49包括上述引物组49；
所述PCR试剂50包括上述引物组50；
所述PCR试剂51包括上述引物组51；
所述PCR试剂52包括上述引物组52；
所述PCR试剂53包括上述引物组53；
所述PCR试剂54包括上述引物组54；
所述PCR试剂55包括上述引物组55；
所述PCR试剂56包括上述引物组56；
所述PCR试剂57包括上述引物组57；
所述PCR试剂58包括上述引物组58；
所述PCR试剂59包括上述引物组59；
所述PCR试剂60包括上述引物组60；
所述PCR试剂61包括上述引物组61；
所述PCR试剂62包括上述引物组62。
上述PCR试剂中，所述各PCR试剂中的每条所述正向引物和所述反向引物的物质的量 比均为6：15。
本发明的第四个目的是提供含有上述物质或上述PCR试剂的试剂盒。
上述物质或上述PCR试剂或上述试剂盒在对不结球白菜品种进行基因分型和/或构建不 结球白菜DNA指纹数据库和/或不结球白菜种质资源聚类分析和/或鉴别或辅助鉴别不结球白 菜品种中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的第五个目的是提供一种对不结球白菜品种进行基因分型的方法。
本发明提供的对不结球白菜品种进行基因分型的方法包括如下步骤：用上述62组引物 对待测不结球白菜基因组DNA进行PCR扩增，得到待测不结球白菜的PCR扩增产物；对所 述PCR扩增产物进行分析，确定所述待测不结球白菜的62个SNP位点的基因型；
所述62个SNP位点如下：
所述SNP位点1为A01染色体上的第4878177位核苷酸；
所述SNP位点2为A01染色体上的第9716212位核苷酸；
所述SNP位点3为A01染色体上的第11039761位核苷酸；
所述SNP位点4为A01染色体上的第17311260位核苷酸；
所述SNP位点5为A01染色体上的第22449302位核苷酸；
所述SNP位点6为A01染色体上的第26752589位核苷酸；
所述SNP位点7为A02染色体上的第751652位核苷酸；
所述SNP位点8为A02染色体上的第6431221位核苷酸；
所述SNP位点9为A02染色体上的第11181828位核苷酸；
所述SNP位点10为A02染色体上的第14369430位核苷酸；
所述SNP位点11为A02染色体上的第16465013位核苷酸；
所述SNP位点12为A02染色体上的第23174443位核苷酸；
所述SNP位点13为A02染色体上的第26812976位核苷酸；
所述SNP位点14为A03染色体上的第128271位核苷酸；
所述SNP位点15为A03染色体上的第4471683位核苷酸；
所述SNP位点16为A03染色体上的第5450320位核苷酸；
所述SNP位点17为A03染色体上的第12523505位核苷酸；
所述SNP位点18为A03染色体上的第15431305位核苷酸；
所述SNP位点19为A03染色体上的第19649018位核苷酸；
所述SNP位点20为A03染色体上的第24127049位核苷酸；
所述SNP位点21为A03染色体上的第28629888位核苷酸；
所述SNP位点22为A04染色体上的第1833604位核苷酸；
所述SNP位点23为A04染色体上的第9741929位核苷酸；
所述SNP位点24为A04染色体上的第11311194位核苷酸；
所述SNP位点25为A04染色体上的第13764622位核苷酸；
所述SNP位点26为A05染色体上的第1283352位核苷酸；
所述SNP位点27为A05染色体上的第6796365位核苷酸；
所述SNP位点28为A05染色体上的第8088873位核苷酸；
所述SNP位点29为A05染色体上的第14441564位核苷酸；
所述SNP位点30为A05染色体上的第17810370位核苷酸；
所述SNP位点31为A05染色体上的第19009544位核苷酸；
所述SNP位点32为A05染色体上的第22895070位核苷酸；
所述SNP位点33为A06染色体上的第18887位核苷酸；
所述SNP位点34为A06染色体上的第6403261位核苷酸；
所述SNP位点35为A06染色体上的第16193195位核苷酸；
所述SNP位点36为A06染色体上的第18685199位核苷酸；
所述SNP位点37为A06染色体上的第20833714位核苷酸；
所述SNP位点38为A06染色体上的第24717886位核苷酸；
所述SNP位点39为A07染色体上的第246275位核苷酸；
所述SNP位点40为A07染色体上的第6101124位核苷酸；
所述SNP位点41为A07染色体上的第11498098位核苷酸；
所述SNP位点42为A07染色体上的第14747998位核苷酸；
所述SNP位点43为A07染色体上的第18060124位核苷酸；
所述SNP位点44为A07染色体上的第20112319位核苷酸；
所述SNP位点45为A08染色体上的第240722位核苷酸；
所述SNP位点46为A08染色体上的第8933259位核苷酸；
所述SNP位点47为A08染色体上的第16162051位核苷酸；
所述SNP位点48为A08染色体上的第18668405位核苷酸；
所述SNP位点49为A08染色体上的第20716882位核苷酸；
所述SNP位点50为A09染色体上的第165179位核苷酸；
所述SNP位点51为A09染色体上的第583658位核苷酸；
所述SNP位点52为A09染色体上的第4354836位核苷酸；
所述SNP位点53为A09染色体上的第5122605位核苷酸；
所述SNP位点54为A09染色体上的第11056315位核苷酸；
所述SNP位点55为A09染色体上的第26520788位核苷酸；
所述SNP位点56为A09染色体上的第30448774位核苷酸；
所述SNP位点57为A09染色体上的第34559009位核苷酸；
所述SNP位点58为A09染色体上的第37047265位核苷酸；
所述SNP位点59为A10染色体上的第8425118位核苷酸；
所述SNP位点60为A10染色体上的第12134922位核苷酸；
所述SNP位点61为A10染色体上的第13859895位核苷酸；
所述SNP位点62为A10染色体上的第15835648位核苷酸。
上述方法在鉴别或辅助鉴别多个待测不结球白菜品种或构建不结球白菜DNA指纹数据 库或对不结球白菜种质资源进行聚类分析中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的第六个目的是提供一种鉴别或辅助鉴别多个待测不结球白菜品种的方法。
本发明提供的鉴别或辅助鉴别多个待测不结球白菜品种的方法包括如下步骤：根据上述 方法确定所有待测不结球白菜品种在所述62个SNP位点的基因型，根据所得基因型数据， 鉴别多个待测不结球白菜品种。
本发明的第七个目的是提供一种构建不结球白菜DNA指纹数据库的方法。
本发明提供的构建不结球白菜DNA指纹数据库的方法包括如下步骤：根据上述方法确 定所有待测不结球白菜品种在所述62个SNP位点的基因型，所得基因型数据即构成不结球 白菜DNA指纹数据库。
本发明的第八个目的是提供一种对不结球白菜种质资源进行聚类分析的方法。
本发明提供的对不结球白菜种质资源进行聚类分析的方法包括如下步骤：根据上述方法 确定待测不结球白菜种质资源在所述62个SNP位点的基因型，根据所得基因型数据，建立 聚类树状图，从而实现对不结球白菜种质资源进行聚类分析。
上述不结球白菜品种如表4所示：
表4、不结球白菜品种
上述62个SNP位点的物理位置是基于不结球白菜品种 Brassicacampestrisssp.chinensisMakino的全基因组序列比对确定的，所述不结球白菜品种 Brassicacampestrisssp.chinensisMakino的全基因组序列的版本号为V1.5(下载地址 http://brassicadb.org/brad)。上述62个SNP位点的物理位置及碱基信息具体如表5所示：
表5、62个SNP位点的物理位置及碱基
本发明基于10个白菜核心资源的重测序，发掘了白菜全基因组的序列变异，筛选了一套 适于不结球白菜品种核酸指纹数据库构建的62组SNP核心引物。通过实验证明：本发明的 62组SNP核心引物分布于白菜整个基因组，具有较高的多态性信息量(PIC值)、最小等位 基因频率(MAF值)以及较低的期望杂合度，而且绝大部分位点位于基因的编码区，能够准 确进行育种材料的遗传多样性分析和品种鉴别，并且基因分型结果稳定，有利于进行不结球 白菜核酸指纹数据库构建和品种鉴定等方面的研究，且本发明提供的SNP位点和检测方法可 实现高通量、低成本、标准化和稳定可靠品种真实性检测，实际操作过程还可获得实验数据 的全程记录和清晰的可视化效果，为建立标准化、高通量、低成本的分子检测技术平台奠定 了良好基础，可用于构建不结球白菜主栽品种和核心育种材料的核酸指纹数据库，从而高效、 准确的进行不结球白菜品种的真实性和特异性鉴定。
附图说明
图1为BrSNPA09038引物对124个不结球白菜品种的分型效果图。
图2为124个不结球白菜品种在62个SNP位点的基因分型图，图中标记的顺序从上到 下依次为引物编号1～62。
图3为利用62个SNP引物组合分析124份不结球白菜品种的聚类图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、一套适于不结球白菜品种核酸指纹数据库构建的SNP引物组
一、62组SNP核心引物
本发明基于62个SNP位点设计了62组适于不结球白菜品种核酸指纹数据库构建的SNP 核心引物，每组引物由3条引物序列组成。62个SNP位点的物理位置、差异碱基及62组SNP 核心引物的核苷酸序列如表1所示。表1中的1-62分别代表62个SNP位点，连锁群代表染 色体号，物理位置代表该SNP位点对应染色体上的位数，差异碱基代表该SNP位点的的碱 基，如SNP位点1位于A01号染色体上第4878711位，其碱基为T或C。
上述62个SNP位点的物理位置是基于不结球白菜品种 Brassicacampestrisssp.chinensisMakino的全基因组序列比对确定的，所述不结球白菜品种 Brassicacampestrisssp.chinensisMakino的全基因组序列的版本号为V1.5(下载地址 http://brassicadb.org/brad)。
表1、62组SNP核心引物
实施例2、适于不结球白菜品种核酸指纹数据库构建的SNP引物组的应用
1、基因组DNA的提取
分别提取表2中53个省市单位的124份的不结球白菜待测品种的基因组DNA，提取方 法可采用常规CTAB法或快速高通量提取植物基因组DNA的方法。本发明采用常规CTAB 法提取基因组DNA。具体步骤如下：
先每份材料各取4～5粒种子催芽2～3天，把长出两片绿色子叶的小芽单个装入2mL离心 管中，加入1粒0.4mm的钢珠后写清编号，放入液氮中冷冻5-10min，再使用组织研磨机打 碎。每管加入800μL65℃预热的CTAB缓冲液，迅速振荡混匀，放入65℃水浴锅水浴30min， 期间至少颠倒混匀一次。再向离心管中加入800μL氯仿/异戊醇(氯仿：异戊醇为24：1)， 振荡混匀，静止5min后，12000r/min离心10min。吸600μL上清液转入另一只2mL离心管 中，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻柔颠倒混匀，放于-20℃冰箱冷却20min，然后10000r/min 离心5min，弃上清。用800μL75％乙醇漂洗2次，每次10000r/min离心5min，弃上清液收 集沉淀，最后室温下吹干沉淀，加入50μLddH2O溶解DNA。
表2、124份不结球白菜品种信息
通过1％琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别对提取得到的基因组DNA的质量进行检测， 合格的DNA要求：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2100检测 A260/280介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)；A260/230介于1.8-2.0之间(DNA 样品盐离子浓度低)；270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)。根据英国LGC公 司的KASPar检测技术和白菜基因组大小换算出DNA用量为4～10ng/每样品，稀释DNA浓 度成为4～10ng/μl，备用。
2、引物的合成和引物预混液的配制
委托北京生工生物工程有限公司合成实施例1中的62组SNP引物，且在每组引物中的 引物名1的序列的5’端需加上如下所示的接头序列：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，引物 名2的序列的5’端需加上如下所示的接头序列：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，引物名3 的序列不用改变。
分别将各组SNP引物中的引物链均稀释成10μmol，并按照体积比为6:6:15(引物名1： 引物名2：引物名3)的比例混匀，分别得到62组引物预混液(各组540μl)。
3、SNP基因分型
基于实施例1中的62个SNP位点利用KASPar技术对124份不结球白菜品种进行SNP 基因分型，SNP基因分型过程按照LGC公司提供的KASPar技术的实验流程进行，以下使用 的试剂、耗材和仪器没有特殊说明的均由LGC公司提供，包括试剂用量、用法、以及整个实 验步骤按照LGC公司的操作指南KASPuserguideandmanual(www.lgcgenomics.com)进行， KASPar反应在384孔板(PartNo.KBS-0750-001)或1536微孔板(PartNo.KBS-0751-001) 中进行，反应体系为3ul或1ul。具体步骤如下：
首先利用K-pette分液工作站将步骤1稀释好的待测DNA模板(4～10ng/μl)1.5ul和空 白对照(Notemplatecontrol,NTC)分别加入384孔或者1536孔反应板中，60℃烘干30min (干燥箱，LGC公司)，DNA变成干粉备用。然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样 工作站分别向每个反应孔中加入1ˉMastermix(384孔板货号PartNo.KBS-1016-002或1536 微孔板货号PartNo.KBS-1016-011)与62组引物混合液，Mix分装完毕立即将微孔板依次放 在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜，利用Hydrocyler进行高通量水浴PCR扩增。每 一轮最多进行14块PCR反应板(384和1536)，384孔板或1536孔板的反应体系如表3所示。
表3、384孔板或1536孔板的反应体系
注：Meridian在分液过程中为排气泡每加1对引物时需损失230μl的反应液，即2xMastermix和ddH2O各115μl。
PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为94℃预变性，15分钟；94℃， 20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸：以touchdown程序扩增10个循环，每循 环降低0.6℃)；94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。扩增结束后，利用 BMGPHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况。若分型不充分，则继续扩增，每3个循 环查看分型情况，直至分型完全，从Kraken软件中导出实验结果。
基因分型结果显示：每一组引物对待测不结球白菜的分型效果均很好。其中， BrSNPA10032引物对124份不结球白菜品种的分型效果图如图1所示，图中每个圆点代表一 份待测材料，其中红色圆点表示该位点是纯合基因型“TT”；蓝色圆点表示该位点是纯合基 因型“GG”；绿色圆点表示该位点是杂合基因型“GT”或“TG”；黑色圆点表示NTC，即为 水对照。
4、SNP指纹图谱
利用GGT2.0软件构建124份不结球白菜品种的SNP指纹图谱。
结果如图2所示，图2中每种颜色对应于一个字母或符号，用于区分不同的基因型，其 中，“A”代表基因型“AA”；“C”代表基因型“CC”；“G”代表基因型“GG”；“K”代表基 因型“GT或TG”；“M”代表基因型“AC或CA”；“R”代表基因型“AG或GA”；“S”代 表基因型“GC或CG”；“T”代表基因型“TT”；“W”代表基因型“AT或TA”；“Y”代表 基因型“CT或TC”和“？”代表缺失或不确定的基因型。从图中可以看出，本发明的62组 SNP引物可以应用于不结球白菜品种DNA指纹数据库构建和品种的真实性检测。
5、聚类分析
使用PowerMarkerV3.25和MEGA6.06软件对124份不结球白菜品种进行聚类分析。
聚类结果如图3所示，从图中可以看出，62个SNP引物组能够把来源于53个省市单位 的124份不结球白菜品种完全区分开，表明本发明的SNP核心引物组的鉴别能力较好。