一种苹果酸脱氢酶基因RKMDH2及其重组表达载体.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510782491.4 (22)申请日 2015.11.16 C12N 15/53(2006.01) C12N 15/70(2006.01) (71)申请人 昆明理工大学 地址 650093 云南省昆明市五华区学府路 253 号 (72)发明人 张琦 肖虎 季秀玲 魏云林 林连兵 (54) 发明名称 一种苹果酸脱氢酶基因 RKMDH2 及其重组表 达载体 (57) 摘要 本发明公开了一种从红冬孢酵母 YM25235 中 分离的编码苹果酸脱氢酶的核苷酸序列， 其核苷 酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示， 该基因编码的氨基 酸序。

2、列如 SEQ ID NO ： 2 所示， 通过构建重组载体 并在大肠杆菌中表达， 表达产物具有苹果酸脱氢 酶功能， 能催化苹果酸转化成草酰乙酸。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表3页 附图1页 CN 105296509 A 2016.02.03 CN 105296509 A 1/1 页 2 1.一种苹果酸脱氢酶基因RKMDH2， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示， 该基因编码的 氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。 2.一种含有权利要求 1 所述苹果酸脱氢酶基因RKMDH2的重组表。

3、达载体。 权 利 要 求 书 CN 105296509 A 2 1/5 页 3 一种苹果酸脱氢酶基因RKMDH2及其重组表达载体 技术领域 0001 以红冬孢酵母 （Rhodosporidium kratochvilovae） YM25235 的总 RNA 反转录产物 cDNA 为模板， 扩增得到编码苹果酸脱氢酶 (MDH) 的基因， 将其克隆到大肠杆菌表达载体后 诱导表达， 亲和层析法纯化后得到纯酶， 并对该酶进行了酶活测定及酶学性质的相关研究， 属于基因工程和酶工程领域。 背景技术 0002 苹果酸脱氢酶 ( MDH) 广泛分布于生物体内， 是一种活性非常强的酶， 它催化草酰 乙酸盐和苹果。

4、酸盐的相互转化反应， 与二核苷酸辅酶的氧化还原相关。草酰乙酸盐在许多 代谢途径中都有重要作用， 包括三羧酸循环、 乙醛酸旁路、 氨基酸合成、 糖原异生等， 并维持 氧化还原平衡， 还能促进胞质和亚细胞器代谢物的交换。依生物体的功能不同、 组织差异、 细胞内定位的不同其表达种类不同， MDH 具有多种同工酶形式。胞质苹果酸脱氢酶 (cMDH) 存在于细胞胞质内， 担负着将 NADH 转入线粒体的重任， 并且还对调控三羧酸循环有作用， 同时 cMDH 还是核酸通路 (NACh) 复合体的一个组成部分 苹果酸脱氢酶 (MDH) 广泛分布在动物组织、 微生物和植物中。它是一种活性最强的酶， 根据亚细胞。

5、定位， 苹果酸脱氢酶可分为 5 种类型， 存在于乙醛酸体、 线粒体、 过氧化物体、 叶 绿体、 细胞浆以及锥虫甘油体内。MDH 为多聚体酶， 是由相同或相似亚基组成的二聚体或四 聚体， 亚基的分子量为 30-35kDa， MDH 在医学方面也引起越来越多的关注如利用基因工程 疫苗预防人体带绦虫病已是备受关注的研究方向， 通过牛带绦虫亚洲亚种 MDH 基因的生物 信息学分析， 预测到胞浆型 MDH 是一个潜在的诊断抗原， 这为带绦虫在诊断、 药物及疫苗研 究中的应用前景提供了重要的线索， 在临床诊断中用于多酶分析及疾病的早期诊断， 例如 用于诊断 DIC（弥散性血管内凝血） ， 心肌梗塞， 急慢。

6、性肝炎等。在食品领域， 苹果酸脱氢酶 用于有机酸含量的测定， 如L-苹杲酸、 醋酸、 柠檬酸等物质的测定， 应用前景广泛。 利用MDH 底物专一性， 还可将其用于拆分 D， L- 苹果酸酶。 0003 总之， MDHs 作为生物体中枢代谢途径的关键酶， 国内外对其己进行了较为广泛的 研究， MDHs同工酶正应用于生物分类、 物种分化、 遗传变异、 物种杂交和个体发育等研究。 因 此深入了解 MDHs 的生理生化特性、 结构及功能、 催化机制， 对于酶重组蛋白的表达、 纯化及 免疫特性分析， 探讨生物体中 MDHs 的代谢作用以及一些疾病的分子致病机制有着重要的 意义。同时 MDH 的应用研究也。

7、将会推动 MDHs 转基因植物及手性药物的进一步发展。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种从红冬孢酵母 （Rhodosporidium kratochvilovae） YM25235 中分离的苹果酸脱氢酶基因RKMDH2， 该基因核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示或该 核苷酸序列的片段， 或与 SEQ ID NO ： 1 互补的核苷酸序列， 该基因序列长为 1008bp （碱基） ， 该基因编码的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示的多肽或其片段。 0005 本发明的另一目的是提供一种含有苹果酸脱氢酶基因RKMDH2的重组表达载体 说 明 书 CN 1052965。

8、09 A 3 2/5 页 4 pET32aRKMDH2， 该重组表达载体是将 SEQ ID NO:1 所示基因直接与载体 pET32a（+） 所构建 的重组表达载体。 0006 本发明另一目的是提供一种含有上述的苹果酸脱氢酶基因RKMDH2或上述的重组 表达载体的宿主表达细胞。 0007 用本发明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重组载体优化宿主细胞可用本 领域的技术人员熟知的方法进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时， 能吸收 DNA 的感受态 细胞可在指数生长期收集菌体， 用 CaCl2、 电穿孔等方法进行 ； 当宿主是真核生物， 可选用 DNA 转染法、 显微注射、 电穿孔、 脂质体包装等方。

9、法。 0008 本发明提供的核苷酸序列是一种高效、 特异性的苹果酸脱氢酶基因， 可以将其与 载体连接后转化至微生物细胞体内生产苹果酸脱氢酶， 具有产物特异性高、 生产周期短、 生 产不受场地、 气候、 季节的影响及利用不同的菌种和培养基适合开发商业化苹果酸脱氢酶 等优点。 本发明应用基因工程技术构建特异性生产苹果酸脱氢酶的转基因大肠杆菌生产苹 果酸脱氢酶， 具有操作简单、 成本低、 可行性高等优点， 为苹果酸脱氢酶基因工程化生产奠 定基础。 附图说明 0009 图1为利用本发明的红冬孢酵母YM25235苹果酸脱氢酶基因构建的大肠杆菌重组 表达质粒 pET32aRKMDH2 质粒图谱 ； 图 2。

10、 为本发明的苹果酸脱氢酶基因RKMDH2诱导表达并纯化后的 SDS-PAGE 分析图， 其 中 ： 1 为蛋白电泳 Marker ； 2 为转化了 pET32a(+) 并经 IPTG 诱导的大肠杆菌 BL21 总蛋白 ； 3 为转化了 pET32aRKMDH2 并经 IPTG 诱导的大肠杆菌 BL21 总蛋白 ； 4 为纯化的目的蛋白条 带。 具体实施方式 0010 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明， 但本发明保护范围不局限于 所述内容， 实施例中使用的试剂和方法， 如无特殊说明， 均采用常规试剂和使用常规方法。 0011 实施例 1 ： 红冬孢酵母苹果酸脱氢酶基因RKMDH2的克。

11、隆 采 用 OMEGA 试 剂 盒 E.Z.N.A Fungal RNA Kit 从 红 冬 孢 酵 母 (Rhodosporidium kratochvilovae) YM25235 中提取总 RNA， 用反转录试剂盒 Thermo Scientific Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA， 取1l为模板进行聚合酶链式反应， 设计引物 （引物 1 和引物 2） 进行 PCR 扩增， 反应所用引物、 组分和扩增条件如下 ： 引物 P1 ： RKMDH2F1: 5 -ATGGGCCTCAAGACTGCTGTTCT-3 （SEQ。

12、 ID NO:3） 引物 P2 ： RKMDH2R1: 5 -TCAGAGCTTGGAGCCCTGGATGA-3 （SEQ ID NO:4） PCR 扩增体系 （50L） 组成如下 ： 5Trans PFU Buffer 10L dNTP（2.5mol/L） 5L cDNA 1L RKMDH2F1（10mol/L） 2L RKMDH2R1（10mol/L） 2L 说 明 书 CN 105296509 A 4 3/5 页 5 Fast Pfu DNA polymerase（5U/L） 2L 无菌 ddH2O 补足至 50L 扩增条件 ： 94变性 4min， 再用 94 45s、 59 45s、。

13、 72 1.5 min 进行 30 个循环， 最 后72 10min， 反应完后取产物1L， 然后在浓度为1%的琼脂糖凝胶中， 进行电泳分析。 经 凝胶成像系统成像确认片段大小正确后， 用百泰克生物技术有限公司多动能 DNA 纯化回收 试剂盒回收目的片段， 然后将PCR扩增得到的目的基因连接到pMD18-T上， 连接产物转化大 肠杆菌 DH5， 用含有氨苄青霉素 (Amp+) 的 LB 固体平板进行筛选， 挑取平板上的转化子进 行菌落 PCR 筛选阳性克隆， 然后送去上海生工测序。测序结果显示， 获得一段 1008bp 长的 序列， 命名为RKMDH2， 序列组成如SEQ ID NO:1所示的。

14、核苷酸序列。 通过核苷酸序列所编码 的氨基酸相似性搜索表明， 该基因编码的蛋白与真菌来源的苹果酸脱氢酶序列相似， 但不 完全相同。 0012 实施例 2 ： 重组表达质粒 pET32aRKMDH2 的构建 采用实施例 1 中的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增， 反应所用引物组合、 反应组分和扩增条 件如下 ： 引物 P1 ： RKMDH2F2: 5 -CGCGGATCCATGGGCCTCAAGACTGCTGT-3 （SEQ ID NO:5） 引物 P2 ： RKMDH2R2: 5 -CCGCTCGAGGAGCTTGGAGCCCTGGATGA-3 （SEQ ID NO:6） PCR 扩增体系。

15、 （50L） 组成如下 ： 5Fast Pfu Buffer 10L dNTP（2.5 mol/L） 5L cDNA 1L RKMDH2F2（10 mol/L） 1L RKMDH2R2（10mol/L） 1L Fast Pfu DNA polymerase（5U/L） 1L 无菌 ddH2O 补足至 50L ； 扩增条件 ： 94变性 4min， 再用 94 45s、 59 45s、 72 1.5min 进行 30 个循环， 最 后 72 10min ； 取纯化的 PCR 产物和质粒 pET32a 分别用BamH 和XhoI 酶切过夜， 50L PCR 产物双酶切体系 ： PCR 产物 25l。

16、， 10Tango Buffer 10ul， BamH I 2ul 和 Xho I 1.5 L， 用灭菌的双蒸水补齐， 37酶切过夜 ； 50 L 质粒 pET-32a 双酶切体系 ： 质粒 pET-32a 15l， 10Tango Buffer 10l， BamH I 2L和Xho I1.5L， 用灭菌的双蒸水补齐， 37 酶切过夜。 用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收 ； 再将回收片段进行连接， 连接体 系 （10L） ： 纯化的 PCR 产物和表达载体 pET-32a 按 7:1 的比例用 0.5L 的 T4 DNA 连接 酶， T4 Buffer 1L， 16连接过夜。连接产物转。

17、入大肠杆菌 DH5 感受态细胞中。37振 荡培养1h后， 涂布在含氨苄的LB培养基平板， 37培养箱中培养12h， 挑取平板上的转化子 进行菌落 PCR， 筛选阳性克隆， 构建获得重组表达质粒命名为 pET32aRKMDH2， 该质粒图谱如 图 1 所示， 进一步酶切分析和测序分析也证明重组质粒的正确性。 0013 实施例 3 ： 苹果酸脱氢酶基因RKMDH2在大肠杆菌 BL21 中的诱导表达 1、 苹果酸脱氢酶蛋白 RKMDH2 的诱导表达及纯化 为了验证该基因编码蛋白的活性， 将 1g 重组质粒 pET32aRKMDH2 加入 50l 大肠杆 菌 BL21 感受态细胞中， ， 将整个体系冰。

18、浴 30min 之后于 42热击 90s， 再次冰浴 2min， 然后 说 明 书 CN 105296509 A 5 4/5 页 6 加入950L LB液体培养基于37、 100rpm振荡孵育1h。 孵育结束后， 5000rpm离心10min， 留下约 80L 悬浮沉淀菌体并涂布于含有氨苄青霉素 (Amp+) 的 LB 固体平板， 37倒置培 养 10h。挑取阳性转化子阳性克隆验证后， 再接入 100 mL LB( 含 100g/mL 氨苄霉素 ) 的 液体培养基中， 37 振荡培养过夜， 将富集的菌液按 1% 比例接种到 1L LB 液体培养基中， 于 37， 160rpm 培养至 OD60。

19、0 值约为 0.8。取 5ml 菌液作为空白对照， 其余加入 IPTG 至终 浓度为 1mmol/L， 于 15恒温摇床 80 rpm 诱导培养 8 小时， 12000 rpm 离心 15min 收集菌 体。SDS-PAGE 分析显示， pET32aRKMDH2 转化的大肠杆菌中表达出一条分子量约为 53kD 的 蛋白 （见图 3 泳道 3） ， 但在空载体 pET32a（+） 转化的大肠杆菌中没有 （见图 3 泳道 2） 。 0014 进一步将该菌体悬浮于适量 （使菌悬液的 OD600 20） 30 mM 的咪唑缓冲液中， 冰上 超声破碎细胞， 4、 14000 rpm离心15 min， 上。

20、清和沉淀分别用SDS-PAGE电泳检测， 电泳检 测发现目的蛋白pET32aRKMDH2是以包涵体的形式存在。 首先对包涵体进行纯化 ： 将破菌后 的沉淀用 PE 缓冲液 （20mmol/L 磷酸钠， 1mM EDTA pH7.2） 重悬， 用移液枪吹打混匀， 于 4、 12000rpm 离心 15min 收集沉淀， 再用 2mol/L 的脲重悬沉淀振荡混匀静置 20min 后， 于 4， 12000rpm 离心 30min 收集沉淀， 用 30mL Triton X-100(0.5%) EDTA(10mmol/L) 的溶液重 悬沉淀， 充分混匀后离心收集沉淀。最后再用 PE 缓冲液洗涤沉淀 。

21、2-3 次以出去残留的去污 剂。对纯化后的包涵体进行变性 ： 将纯化后的包涵体用变性缓冲液 （100mmol/L Tris-HCl pH7.6， 8mol/L 脲， 10mmol/L DTT） 溶解后， 置于 37恒温培养箱中变 3-4h。将变性的包涵 体溶液直接加入到1L的透析缓冲液中 （100mmoL/L Tris-HCl 缓冲液pH7.6， 5mmol/L-巯 基乙醇） 。在 4透析 24h， 中间换两次缓冲液以彻底透析复性。 0015 将复性的蛋白质 4、 12000rpm 离心 15min， 取上清液用 0.2 m 的微型滤膜过 滤， 滤液上样于已用10mM咪唑缓冲液平衡好的His 。

22、Trap HP柱 （1 ml， GE Healthcare） ， 用 200mM 咪唑缓冲液进行洗脱， 洗脱液用离心管按顺序收集， 洗脱样品用 SDS-PAGE 电泳检测， 获得一纯蛋白条带 （见图 3 泳道 4） 。 0016 2、 苹果酸脱氢酶 RKMDH2 的酶活测定 苹果酸脱氢酶是调控苹果酸代谢的关键酶， 可以催化苹果酸进行脱氢氧化， 伴随着产 生草酰乙酸和NADH。 由于MDH的酶活在一定的反应时间内与反应产物NADH的浓度变化呈 线性关系， 所以 MDH 的活性可通过检测 NADH 的浓度变化来测定。以苹果酸和 NAD（+） 为底 物加入苹果酸脱氢酶进行反应， 用紫外分光光度计在 。

23、340nm 处测定酶活， MDH 酶活的计算 ： 单位定义 ： 一个酶活力单位是指 25时每分钟生成 1nmol NADH 所需的酶量。 0017 苹果酸脱氢酶酶活计算公式 ： E=(e/t) Vtdf/(DVsC) =(0.207-0.194)1.995/(6.2210.020.3445) =54.748U/mg Vt- 反应溶液总体积 (ml) -340nm 处测定的 NADH 的吸光度为 6.22 D- 光路长 （1cm） （比色皿直径） Vs- 酶液体积 （ml） C- 蛋白质浓度 （mg/ml） e/t-1min 内 340nm 处吸光度的变化 说 明 书 CN 105296509 。

24、A 6 5/5 页 7 df- 稀释因子 结果显示， 所纯化的苹果酸脱氢酶 RKMDH2 的酶活为 54.748U/mg， 表明基因重组载体在 大肠杆菌 BL21 中诱导表达出来的蛋白 RKMDH2 具有苹果酸脱氢酶的活性。 说 明 书 CN 105296509 A 7 1/3 页 8 序列表 昆明理工大学 一种苹果酸脱氢酶基因RKMDH2及其重组表达载体 6 PatentIn version 3.5 1 1008 DNA 红冬孢酵母 1 atgggcctca agactgctgt tctcggcgct gctggcggca tcggccagcc cctctccctc 60 ctcctcaag。

25、c agaacccggc catcaccgag ctcgccctct tcgatgtcgt ccccgtcgta 120 aagggcgtcg ccgccgacat cagccacgtc gacacccccg ccgtcaccaa gggcttcgtc 180 aaggacgagg acggcctcaa gggcgccctt accggcgccg acctcgtcgt catccccgcc 240 ggcgtccccc gcaagcccgg catgacccgc gacgacctgt tcaacatcaa cgccggcatc 300 gtccgcgacc tcgcgcaggg catcgcc。

26、gac tactgcccca aggcgttcgt cctcatcatc 360 tcgaacccgg tcaactcgac ggtccccgtc gccgccgagg tcctcaaggc cgcgggcgtc 420 tttgacccga agcgcctctt cggcgtcaca acgctcgacg tcgtccgcgc gtcgaccatg 480 tcggcgcagg cgatcggcaa gcccaactcg gcgcccgagt acaccatccc ggtcgtcggc 540 ggccactcgg gcctcacgat cctgcccctc ctctcgcagt cgcag。

27、ccggc gctcccgcag 600 tcgctcttcg acgaccagga ggcgctcaag gcgctcgtgc accgcatcca gtttggcggc 660 gacgaggtcg tcgaggccaa ggcgggcgcc ggcagcgcga cgctcagcat ggcgtacgcc 720 ggctacaagt ttgccgcgca gctcatcagc gccgcgttcg agggcaagaa gggcgtcgtc 780 gcgccgagct ttgtctacgt caaggacgac caggagatcc agtcggtcgt tggccaggac 840。

28、 ctcgcgttct tctccgtccc cgtcgagctc ggccccaacg gcgccgagaa gctccacccg 900 ctcggcaagc tcagcgcgta cgagcaggag ctcctccagg gctgcctcgg cgagctcccc 960 ggctccatca ccaagggcgt cgccttcatc cagggctcca agctctga 1008 2 335 PRT 红冬孢酵母 2 Met Gly Leu Lys Thr Ala Val Leu Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Gln Pro Leu Ser Leu 10 。

29、20 Leu Leu Lys Gln Asn Pro Ala Ile Thr Glu Leu Ala Leu Phe Asp Val Val Pro Val Val 30 40 Lys Gly Val Ala Ala Asp Ile Ser His Val Asp Thr Pro Ala Val Thr Lys Gly Phe Val 50 60 序 列 表 CN 105296509 A 8 2/3 页 9 Lys Asp Glu Asp Gly Leu Lys Gly Ala Leu Thr Gly Ala Asp Leu Val Val Ile Pro Ala 70 80 Gly Val 。

30、Pro Arg Lys Pro Gly MET Thr Arg Asp Asp Leu Phe Asn Ile Asn Ala Gly Ile 90 100 Val Arg Asp Leu Ala Gln Gly Ile Ala Asp Tyr Cys Pro Lys Ala Phe Val Leu Ile Ile 110 120 Ser Asn Pro Val Asn Ser Thr Val Pro Val Ala Ala Glu Val Leu Lys Ala Ala Gly Val 130 140 Phe Asp Pro Lys Arg Leu Phe Gly Val Thr Thr L。

31、eu Asp Val Val Arg Ala Ser Thr MET 150 160 Ser Ala Gln Ala Ile Gly Lys Pro Asn Ser Ala Pro Glu Tyr Thr Ile Pro Val Val Gly 170 180 Gly His Ser Gly Leu Thr Ile Leu Pro Leu Leu Ser Gln Ser Gln Pro Ala Leu Pro Gln 190 200 Ser Leu Phe Asp Asp Gln Glu Ala Leu Lys Ala Leu Val His Arg Ile Gln Phe Gly Gly 2。

32、10 220 Asp Glu Val Val Glu Ala Lys Ala Gly Ala Gly Ser Ala Thr Leu Ser MET Ala Tyr Ala 230 240 Gly Tyr Lys Phe Ala Ala Gln Leu Ile Ser Ala Ala Phe Glu Gly Lys Lys Gly Val Val 250 260 Ala Pro Ser Phe Val Tyr Val Lys Asp Asp Gln Glu Ile Gln Ser Val Val Gly Gln Asp 270 280 Leu Ala Phe Phe Ser Val Pro V。

33、al Glu Leu Gly Pro Asn Gly Ala Glu Lys Leu His Pro 290 300 Leu Gly Lys Leu Ser Ala Tyr Glu Gln Glu Leu Leu Gln Gly Cys Leu Gly Glu Leu Pro 310 320 Gly Ser Ile Thr Lys Gly Val Ala Phe Ile Gln Gly Ser Lys Leu * 330 335 3 23 DNA 人工序列 3 atgtttgccg ctacccgtgt tct 23 4 23 DNA 人工序列 4 序 列 表 CN 105296509 A 9 3/3 页 10 tcagagcttg gagccctgga tga 23 5 29 DNA 人工序列 5 cgcggatcca tgggcctcaa gactgctgt 29 6 29 DNA 人工序列 6 ccgctcgagg agcttggagc cctggatga 29 序 列 表 CN 105296509 A 10 1/1 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 105296509 A 11 。