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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510919981.4 (22)申请日 2015.12.11 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105384704 A (43)申请公布日 2016.03.09 (73)专利权人 常州南京大学高新技术研究院 地址 213100 江苏省常州市武进区科教城 天润大道南京大学常州高新技术研究 院 (72)发明人 王凯陈强肖尖陆国元 张秀芹 (74)专利代理机构 常州佰业腾飞专利代理事务 所(普通合伙) 32231 代理人 翁斌 (51)Int.Cl. C07D 27。
2、7/68(2006.01) 审查员 徐建国 (54)发明名称 一种2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑的脱甲基 工艺及其制备D-荧光素的方法 (57)摘要 本发明属于化学合成领域， 一种2-氰基-6- 甲氧基-苯并噻唑的脱甲基工艺， 包括如下步骤： (1)依次将2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑、 金属碘 化物、 硫醇、 乙腈投入反应瓶中， 搅拌溶解； (2)将 三甲基氯硅烷的乙腈溶液缓慢滴加到上述体系 中； (3)滴加结束后， 保温反应； (4)反应结束后， 滴加碱的水溶液， 调节pH值在712之间， 加入有 机溶剂， 搅拌、 分层， 用水反洗有机相， 干燥、 脱溶 后得2-氰基-6-羟基-苯并噻唑。。
3、 本发明选用的溶 剂对反应底物及产物有较好的溶解性， 反应彻 底、 催化效率高， 缩短反应时间； 反应条件温和， 无高压高温等苛刻反应条件， 收率高， 无剧毒物 质产生。 中间产物无需提纯精制， 一锅法制备得 最终产物。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 105384704 B 2017.12.19 CN 105384704 B 1.一种2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑的脱甲基工艺， 其特征在于： 包括如下步骤： (1)依次将2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑、 金属碘化物、 硫醇、 乙腈投入反应瓶中， 搅拌溶 解； (2)将三甲基氯硅烷的乙腈溶液缓慢滴加到上述体系中； (3)滴加结束后，。
4、 保温反应； (4)反应结束后， 滴加碱的水溶液， 调节pH值在712之间， 加入有机溶剂， 搅拌、 分层， 用水反洗有机相， 干燥、 脱溶后得2-氰基-6-羟基-苯并噻唑。 2.根据权利要求1所述的2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑的脱甲基工艺， 其特征在于： 所述 的金属碘化物为碘化钠、 碘化钾、 碘化锂或碘化镁中的一种； 所述的硫醇为甲硫醇、 乙硫醇、 1-丙硫醇或半胱氨酸中的一种。 3.根据权利要求1所述的2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑的脱甲基工艺， 其特征在于： 所述 的2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑与三甲基氯硅烷的物质的量的比为1:11:3， 三甲基氯硅烷 与金属碘化物的物质的量的比为。
5、1:11:2， 硫醇的物质的量为2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑 的物质的量的520。 4.根据权利要求1所述的2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑的脱甲基工艺， 其特征在于： 步骤 (2)中滴加三甲基氯硅烷的乙腈溶液时体系温度为-530。 5.根据权利要求1所述的2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑的脱甲基工艺， 其特征在于： 步骤 (3)所述的保温反应为控制体系温度在3090温度下， 反应26h。 6.根据权利要求1所述的2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑的脱甲基工艺， 其特征在于： 步骤 (4)所述的碱为碳酸钠、 碳酸氢钠、 碳酸钾、 碳酸氢钾、 氢氧化钠、 氢氧化钾或氨水中的一种， 所述有机溶剂为乙酸乙。
6、酯、 二氯甲烷、 甲苯或氯仿中的一种。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105384704 B 2 一种2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑的脱甲基工艺及其制备D-荧 光素的方法 技术领域 0001 本发明属于化学合成领域， 尤其涉及一种2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑的脱甲基工 艺及其制备D-荧光素的方法。 背景技术 0002 活体成像技术 (optical in vivo imaging)目前主要采用生物发光 (bioluminescence)与荧光(fluorescence)两种技术， 生物发光法是基于荧光素酶能催化 底物(D-Luciferin或Coelenterazine)化学发光的原理，。
7、 将体外能稳定表达荧光素酶的细 胞株植入动物体内， 与后期注射入体内的底物发生反应， 利用光学系统检测光强度， 间接反 映出细胞数量的变化或细胞的定位。 常见的荧光素酶为是萤火虫荧光素酶(firefly luciferase， 编码基因是luc)， 底物是D-Luciferin。 作用原理是在ATP和荧光素酶的催化作 用下， 底物被氧化发光(不同底物光的颜色和波长不同)， 当底物过量时， 产生的光量子数与 荧光素酶的浓度呈正相关性。 0003 这项技术已被广泛应用于多个领域， 最常用的有肿瘤或疾病动物模型的建立， 并 可用于病毒学研究、 siRNA研究、 干细胞研究、 蛋白质相互作用研究等。 。
8、0004 随着生物发光方法应用的增加， 其需求量越来越大， 但是由于其天然的D-荧光素 产量极小， 而国内外价格高， 货期长， 发光系数低， 通过化学方法合成该物质显得尤为重要。 0005 本课题组总结前人的研究发现， 目前对于D-荧光素化学合成方法的研究较多， 最 初由White等人从对甲氧基苯胺为原料， 8步法合成D-荧光素， 但是中间原料氨甲酰硫代羰 基硫代乙酸必须随用随制备， 效率较低， 且收率很低(6.5)。 White以及日本的Yoshiaki等 人改进了路线， 通过以2-氨基-6-甲氧基-苯并噻唑为原料合成最终产物， 取得理想的收率 (36)， 但是合成中用到了KCN或CuCN，。
9、 毒性太大， 对产业工人及生态环境存在较大安全隐 患。 从原料易得， 安全生产角度出发， 我们发现2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑的合成对最终产 物的合成起到至关重要的作用。 本课题组已经改进了2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑的合成步 骤， 使用催化剂价格低廉， 简单易得， 反应步骤缩短(5步)， 反应条件温和， 收率较高(45)， 部分中间产物无需提纯精制， 直接投料， 一锅法制备得最终产物， 无剧毒物质产生， 对环境 友好。 并申请了相关专利(申请号为： 201510072398.4)。 0006 在此基础上， 本课题组将D-荧光素的合成步骤缩减为7步， 并对2-氨基-6-甲氧基- 苯并噻唑的。
10、脱甲基工艺及缩合成环工艺进行优化， 从目前文献报道可知， 主要的脱甲基工 艺有下面三种， 祝曙英等人报道利用吡啶盐酸盐在高温熔融状态下进行脱甲基反应， 收率 高达80， 但是反应温度太高， 有危险性， 且有副产物生成， 难于分离， 产物纯度低。 最近陈 书艳等人采用三溴化硼为脱甲基试剂， 低温下反应， 后处理方便， 但是反应温度太低， 需要- 78下反应， 给工业化生产带来不便， 且收率很低， 只有60。 史兰香等人报道在N-吡咯烷 酮为溶剂， 半胱氨酸钠盐为脱甲基试剂， 175反应脱去甲基， 收率高达86， 但是该方法成 本较高， 实验温度也高， 难以适应工业化生产需求。 说明书 1/5 页。
11、 3 CN 105384704 B 3 发明内容 0007 本发明的目的是克服现有技术存在2-氨基-6-甲氧基-苯并噻唑的脱甲基工艺条 件苛刻的缺陷， 提供一种2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑的脱甲基工艺及其制备D-荧光素的方 法。 0008 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 一种2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑的 脱甲基工艺， 包括如下步骤： 0009 (1)依次将2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑、 金属碘化物、 硫醇、 乙腈投入反应瓶中， 搅 拌溶解； 0010 (2)将三甲基氯硅烷的乙腈溶液缓慢滴加到上述体系中； 0011 (3)滴加结束后， 保温反应； 0012 (4)反应结束后， 。
12、滴加碱的水溶液， 调节pH值在712之间， 加入有机溶剂， 搅拌、 分 层， 用水反洗有机相， 干燥、 脱溶后得2-氰基-6-羟基-苯并噻唑。 0013 作为优选， 所述的金属碘化物为碘化钠、 碘化钾、 碘化锂或碘化镁中的一种； 所述 的硫醇为甲硫醇、 乙硫醇、 1-丙硫醇或半胱氨酸中的一种。 0014 进一步地， 所述的2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑与三甲基氯硅烷的物质的量的比为 1:11:3， 三甲基氯硅烷与金属碘化物的物质的量的比为1:11： 2， 硫醇的物质的量为2- 氰基-6-甲氧基-苯并噻唑的物质的量的520。 0015 作为优选， 步骤(2)中滴加三甲基氯硅烷的乙腈溶液时体系温度。
13、为-530。 0016 作为优选， 步骤(3)所述的保温反应为控制体系温度在090温度下， 反应2 6h。 0017 进一步地， 步骤(4)所述的碱为碳酸钠、 碳酸氢钠、 碳酸钾、 碳酸氢钾、 氢氧化钠、 氢 氧化钾或氨水中的一种， 所述有机溶剂为乙酸乙酯、 二氯甲烷、 甲苯或氯仿中的一种。 0018 利用上述的2-氰基-6-甲氧基-苯并噻唑的脱甲基工艺制备的2-氰基-6-羟基-苯 并噻唑制备D-荧光素的方法， 其特征在于： 步骤如下： 0019 (1)将制得的2-氰基-6-羟基-苯并噻唑溶于有机溶剂， 加入适量D-半胱氨酸盐酸 盐水合物， 并加入水助溶， 搅拌下加入无机碱， 惰性气体氛围下，。
14、 避光搅拌28小时； 0020 (2)点板监控， 反应结束后， 减压脱去有机溶剂， 用无机酸的水溶液调整至pH值在2 7之间， 有固体析出； 0021 (3)抽滤得白色固体， 滤饼用水反洗3次， 干燥得最终产物。 0022 本发明方法可以通过以下反应方程式说明： 0023 0024 进一步地， 为简化工艺流程， 所述的2-氰基-6-羟基-苯并噻唑为经2-氰基-6-甲氧 基-苯并噻唑脱甲基后干燥、 脱溶后的产物， 无需纯化。 说明书 2/5 页 4 CN 105384704 B 4 0025 作为优选， 所述的产物与所述D-半胱氨酸盐酸盐水合物的物质的量的比为1:1.1 1:3， 所述的产物与无。
15、机碱物质的量的比为1:21:5。 0026 进一步地， 步骤(1)所述的有机溶剂为甲醇， 乙醇， 叔丁醇， 乙腈， 氯仿中的一种， 步 骤(2)所述的无机酸为盐酸、 硫酸、 磷酸、 氢溴酸、 氢碘酸或硝酸中的一种； 在步骤(3)中， 所 述的干燥方式为常压蒸馏、 减压蒸馏、 机械脱水或冷冻干燥中的一种。 0027 有益效果： 与现有方法相比， (1)本发明选用的溶剂对反应底物及产物有较好的溶 解性， 反应彻底， 缩短反应时间， 同时溶剂可回收利用， 经济性较好。 (2)本发明选用的催化 剂价格低廉， 催化效率高， 缩减反应时间。 (3)本发明所有反应条件温和， 无高压高温等苛刻 反应条件， 收。
16、率高， 无剧毒物质产生， 排放少， 对环境友好， 适合工业化生产。 (4)本发明中间 产物无需提纯精制， 直接投料， 一锅法制备得最终产物， 且产品容易分离提纯， 能耗低， 经济 性好。 (5)本发明最后产物干燥方式温和， 最大限度保证产物的性质稳定。 附图说明 0028 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。 0029 图1是中间产物2-氰基-6-羟基苯并噻唑的核磁氢谱图； 0030 图2是最终产物D-荧光素的核磁氢谱图。 具体实施方式 0031 实施例1： 0032 在500mL装有温度计、 滴液漏斗、 搅拌器、 干燥管的四口烧瓶中， 加入150mL乙腈， 2- 氰基-6-。
17、甲氧基苯并噻唑20g(105.14mmol)， 碘化钠47.28g(315.42mmol)搅拌溶解， 加入 0.65g(10.51mmol)乙硫醇。 25下滴加三甲基氯硅烷34.26g(315.42mmol)的乙腈溶液， 滴 加完毕后， 升温到80反应3小时， 反应结束后， 滴加饱和碳酸钾水溶液淬灭反应， 调节pH至 7， 加入二氯甲烷100mL萃取3次， 合并有机相， 再用100mL水反洗有机相3次， 合并有机相， 干 燥、 脱溶得产物1(14.82g， 80(收率， 下同)， 核磁氢普见图1。 0033 惰性气体氛围下， 将100mL乙醇加入到上述产物1中， 搅拌溶解， 称取D-半胱氨酸盐。
18、 酸盐水合物23g(130.93mmol)加入到上述体系中， 避光条件下加入无水碳酸钾36.2g (261.86mmol)， 搅拌8小时。 反应结束后， 减压脱去甲醇， 浓度为10盐酸水溶液调节体系pH 为2， 有固体析出， 抽滤， 滤饼用水200mL水反洗3次， 抽滤得白色固体， 冷冻干燥得最终产物 22.76g(93， m.p.187188， 核磁氢谱图见附图2)。 0034 实施例2： 0035 在250mL装有温度计、 滴液漏斗、 搅拌器、 干燥管的四口烧瓶中， 加入120mL乙腈， 2- 氰基-6-甲氧基苯并噻唑20g(105.14mmol)， 碘化锂21.1g(157.71mmol。
19、)搅拌溶解， 加入 0.65g(10.51mmol)乙硫醇。 30下滴加三甲基氯硅烷11.42g(105.14mmol)的乙腈溶液， 滴 加完毕后， 升温到90反应2小时， 反应结束后， 滴加饱和碳酸钾水溶液淬灭反应， 调节pH至 12， 加入乙酸乙酯100mL萃取3次， 合并有机相， 再用100mL水反洗有机相3次， 合并有机相， 干 燥、 脱溶得产物1(12.97g， 70)。 0036 惰性气体氛围下， 将100mL甲醇加入到上述产物1中， 搅拌溶解， 称取D-半胱氨酸盐 酸盐水合物23g(130.93mmol)加入到上述体系中， 避光条件下加入无水碳酸钠27.76g 说明书 3/5 页。
20、 5 CN 105384704 B 5 (261.86mmol)， 搅拌6小时。 反应结束后， 减压脱去甲醇， 浓度为10盐酸水溶液调节体系pH 为6， 有固体析出， 抽滤， 滤饼用水200mL水反洗3次， 抽滤得白色固体， 减压蒸馏干燥脱水得 最终产物19.58g(80， m.p.187188， 核磁氢谱图见附图2)。 0037 实施例3： 0038 在500mL装有温度计、 滴液漏斗、 搅拌器、 干燥管的四口烧瓶中， 加入150mL乙腈， 2- 氰基-6-甲氧基苯并噻唑20g(105.14mmol)， 碘化镁43.86g(157.71mmol)搅拌溶解， 加入 0.8g(10.51mmol。
21、)1-丙硫醇。 25下滴加三甲基氯硅烷17.13g(157.71mmol)的乙腈溶液， 滴 加完毕后， 升温到80反应3小时， 反应结束后， 滴加饱和氢氧化钠水溶液淬灭反应， 调节pH 至12， 加入甲苯100mL萃取3次， 合并有机相， 再用100mL水反洗有机相3次， 合并有机相， 干 燥、 脱溶得产物1(13.9g， 75)。 0039 惰性气体氛围下， 将100mL叔丁醇加入到上述产物1中， 搅拌溶解， 称取D-半胱氨酸 盐酸盐水合物27.6g(157.12mmol)加入到上述体系中， 避光条件下加入无水碳酸钾36.2g (261.86mmol)， 搅拌5小时。 反应结束后， 减压脱去。
22、甲醇， 浓度为10硫酸水溶液调节体系pH 为2， 有固体析出， 抽滤， 滤饼用水200mL水反洗3次， 抽滤得白色固体， 常压蒸馏脱水得最终 产物18.63g(88， m.p.187188， 核磁氢谱图见附图2)。 0040 实施例4： 0041 在500mL装有温度计、 滴液漏斗、 搅拌器、 干燥管的四口烧瓶中， 加入150mL乙腈， 2- 氰基-6-甲氧基苯并噻唑20g(105.14mmol)， 碘化钾104.72g(630.84mmol)搅拌溶解， 加入 1.27g(10.51mmol)半胱氨酸。 0下滴加三甲基氯硅烷34.26g(315.42mmol)的乙腈溶液， 滴 加完毕后， 升温。
23、到30反应6小时， 反应结束后， 滴加饱和氢氧化钾溶液淬灭反应， 调节pH至 10， 加入氯仿100mL萃取3次， 合并有机相， 再用100mL水反洗有机相3次， 合并有机相， 干燥、 脱溶得产物1(14.82g， 80)。 0042 惰性气体氛围下， 将100mL甲醇加入到上述产物1中， 搅拌溶解， 称取D-半胱氨酸盐 酸盐水合物23g(130 .93mmol)加入到上述体系中， 避光条件下加入氢氧化钠10 .47g (261.86mmol)， 搅拌7小时。 反应结束后， 减压脱去甲醇， 浓度为10磷酸水溶液调节体系pH 为3， 有固体析出， 抽滤， 滤饼用水200mL水反洗3次， 抽滤得白。
24、色固体， 冷冻干燥得最终产物 22g(90， m.p.187188， 核磁氢谱图见附图2)。 0043 实施例5： 0044 在500mL装有温度计、 滴液漏斗、 搅拌器、 干燥管的四口烧瓶中， 加入150mL乙腈， 2- 氰基-6-甲氧基苯并噻唑20g(105.14mmol)， 碘化钾78.54g(315.42mmol)搅拌溶解， 加入 0.65g(10.51mmol)乙硫醇。 -5下滴加三甲基氯硅烷34.26g(315.42mmol)的乙腈溶液， 滴 加完毕后， 升温到60反应5小时， 反应结束后， 滴加饱和碳酸钾水溶液淬灭反应， 调节pH至 8， 加入甲苯100mL萃取3次， 合并有机相。
25、， 再用100mL水反洗有机相3次， 合并有机相， 干燥、 脱 溶得产物1(13.46g， 70)。 0045 惰性气体氛围下， 将100mL乙醇加入到上述产物1中， 搅拌溶解， 称取D-半胱氨酸盐 酸盐水合物23g(130.93mmol)加入到上述体系中， 避光条件下加入无水碳酸钾52.79g (371.86mmol)， 搅拌8小时。 反应结束后， 减压脱去甲醇， 浓度为10氢碘酸水溶液调节体系 pH为7， 有固体析出， 抽滤， 滤饼用水200mL水反洗3次， 抽滤得白色固体， 冷冻干燥得最终产 物18.35g(75， m.p.187188， 核磁氢谱图见附图2)。 说明书 4/5 页 6 。
26、CN 105384704 B 6 0046 实施例6： 0047 在500mL装有温度计、 滴液漏斗、 搅拌器、 干燥管的四口烧瓶中， 加入150mL乙腈， 2- 氰基-6-甲氧基苯并噻唑20g(105.14mmol)， 碘化钾26.18g(157.71mmol)搅拌溶解， 加入 0.65g(10.51mmol)乙硫醇。 -5下滴加三甲基氯硅烷17.13g(157.71mmol)的乙腈溶液， 滴 加完毕后， 升温到30反应6小时， 反应结束后， 滴加饱和碳酸钠水溶液淬灭反应， 调节pH至 9， 加入乙酸乙酯100mL萃取3次， 合并有机相， 再用100mL水反洗有机相3次， 合并有机相， 干 。
27、燥、 脱溶得产物1(15.38g， 83)。 0048 惰性气体氛围下， 将100mL甲醇加入到上述产物1中， 搅拌溶解， 称取D-半胱氨酸盐 酸盐水合物23g(130.93mmol)加入到上述体系中， 避光条件下加入无水碳酸钾36.2g (261.86mmol)， 搅拌8小时。 反应结束后， 减压脱去甲醇， 浓度为10盐酸水溶液调节体系pH 为2， 有固体析出， 抽滤， 滤饼用水200mL水反洗3次， 抽滤得白色固体， 冷冻干燥得最终产物 22.76g(93， m.p.187188， 核磁氢谱图见附图2)。 0049 实施例7： 0050 在500mL装有温度计、 滴液漏斗、 搅拌器、 干燥。
28、管的四口烧瓶中， 加入150mL乙腈， 2- 氰基-6-甲氧基苯并噻唑20g(105.14mmol)， 碘化钾34.9gg(210.28mmol)搅拌溶解， 加入 1.3g(21mmol)乙硫醇。 30下滴加三甲基氯硅烷17.13g(157.71mmol)的乙腈溶液， 滴加完 毕后， 升温到90反应4小时， 反应结束后， 滴加氨水淬灭反应， 调节pH至10， 加入二氯甲烷 100mL萃取3次， 合并有机相， 再用100mL水反洗有机相3次， 合并有机相， 干燥、 脱溶得产物1 (15.2g， 82)。 0051 惰性气体氛围下， 将100mL乙醇加入到上述产物1中， 搅拌溶解， 称取D-半胱氨。
29、酸盐 酸盐水合物45.45g(258.8mmol)加入到上述体系中， 避光条件下加入无水碳酸钾59.61g (431.33mmol)， 搅拌7小时。 反应结束后， 减压脱去甲醇， 浓度为10硝酸溶液调节体系pH为 4， 有固体析出， 抽滤， 滤饼用水200mL水反洗3次， 抽滤得白色固体， 机械脱水得最终产物 20.8g(75， m.p.187188， 核磁氢谱图见附图2)。 0052 实施例8： 0053 在500mL装有温度计、 滴液漏斗、 搅拌器、 干燥管的四口烧瓶中， 加入150mL乙腈， 2- 氰基-6-甲氧基苯并噻唑20g(105.14mmol)， 碘化钾26.18g(157.71。
30、mmol)搅拌溶解， 加入 0.4g(5.3mmol)乙硫醇。 10下滴加三甲基氯硅烷17.13g(157.71mmol)的乙腈溶液， 滴加完 毕后， 升温到30反应6小时， 反应结束后， 滴加饱和氢氧化钾水溶液淬灭反应， 调节pH至 12， 加入乙酸乙酯100mL萃取3次， 合并有机相， 再用100mL水反洗有机相3次， 合并有机相， 干 燥、 脱溶得产物1(14.64g， 79)。 0054 惰性气体氛围下， 将100mL甲醇加入到上述产物1中， 搅拌溶解， 称取D-半胱氨酸盐 酸盐水合物23g(130.93mmol)加入到上述体系中， 避光条件下加入无水碳酸钾36.2g (261.86m。
31、mol)， 搅拌2小时。 反应结束后， 减压脱去甲醇， 浓度为10盐酸水溶液调节体系pH 为2， 有固体析出， 抽滤， 滤饼用水200mL水反洗3次， 抽滤得白色固体， 冷冻干燥得最终产物 21g(90， m.p.187188， 核磁氢谱图见附图2)。 0055 应当理解， 以上所描述的具体实施例仅用于解释本发明， 并不用于限定本发明。 由 本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。 说明书 5/5 页 7 CN 105384704 B 7 图1 说明书附图 1/2 页 8 CN 105384704 B 8 图2 说明书附图 2/2 页 9 CN 105384704 B 9 。