一种抑制IfnIsg15Gbp-1Oas2Irf7Isg20Ifn4细胞表达的方法.pdf

一种抑制Ifnβ，Isg15，Gbp-1，Oas2，Irf7，Isg20，Ifn4细胞表达的方法。本发明涉及生物医药领域，特别是涉及利用构建RXR过度表达所引起的水泡型口炎病毒易感细胞模型，通过测定Ifnβ，Isg15，Gbp-1，Oas2，Irf7，Isg20，Ifn4表达量来筛选一种抑制这些抗病毒基因细胞表达的方法。本发明发明人提供了RXR过度表达所引起的水泡型口炎病毒易感细胞模型的构建方法及RXR在筛选抑制Ifnβ，Isg15，Gbp-1，Oas2，Irf7，Isg20，Ifn4细胞表达中的用途，并发现COX感受通路以RXR依赖的方式对宿主免疫防御系统中的抗病毒基因存在抑制作用，进一步证实了RXR在筛选抑制Ifnβ，Isg15，Gbp-1，Oas2，Irf7，Isg20，Ifn4细胞表达中的实际应用价值。

1.一种抑制Ifnβ，Isg15，Gbp-1，Oas2，Irf7，Isg20，Ifn4细胞表达的方法。 2.如权利要求1所述一种抑制Ifnβ，Isg15，Gbp-1，Oas2，Irf7，Isg20，Ifn4细胞表达的方法，其特征在于，所述核受体为视黄醇类受体（RXR）。 3.如权利要求2所述一种抑制Ifnβ，Isg15，Gbp-1，Oas2，Irf7，Isg20，Ifn4细胞表达的方法，其特征在于，其特征在于，所述病毒为水泡型口炎病毒（VSV）。 4.如权利要求3所述一种抑制Ifnβ，Isg15，Gbp-1，Oas2，Irf7，Isg20，Ifn4细胞表达的方法，其特征在于，所述模型为RXR过度表达所引起的水泡型口炎病毒易感细胞模型。 5.如权利要求4所述一种抑制Ifnβ，Isg15，Gbp-1，Oas2，Irf7，Isg20，Ifn4细胞表达的方法，其特征在于，所述易感细胞模型为胚胎癌细胞模型。 6.如权利要求5所述一种抑制Ifnβ，Isg15，Gbp-1，Oas2，Irf7，Isg20，Ifn4细胞表达的方法，其特征在于，所述细胞模型为癌细胞模型。 7.RXR的过度表达所引起的水泡型口炎病毒胚胎癌细胞模型的构建方法，所述方法具体为：对野生型RXR和缺乏F9胚胎癌细胞预处理，给予注射水泡型口炎病毒（*PFU/μL），再通过噬菌斑实验计数上清液中不同特定时间点的病毒滴度。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种抑制Ifnβ，Isg15，Gbp-1，Oas2，Irf7，Isg20，Ifn4细胞表达的方法。

背景技术

在病毒感染期间免疫激活导致视黄醇X受体下调，后简称（RXR），RXR属于核受体，在细胞以及整个机体代谢中都是必不可少的。然而，RXR在抵御病毒感染的宿主防御中的作用仍然是未知的。核受体（NRs）代表一个大家族的转录因子参与的广谱生物学时间，例如发育、生殖以及代谢。（Robinson-Rechavi等2003）许多NR的超家族成员已经成为炎症和免疫反应的关键调节因子（Daynes和Jones，2002；Joseph等2003；Ogawa等2005），它们使巨噬细胞和树突状细胞感受其脂质环境并塑造其免疫反应。（Nagy等2012）RXR占据在核受体的中心位置，因为他们可以与其他家族成员一起形成异二聚体，因此参与多种生理过程包括细胞分化，免疫反应以及脂质代谢和糖代谢（kefebvre等2010；Roszer等2013）。RXR也能够形成同二聚体激活其靶基因（A等人2004；Zhang等1992）最近研究进展表明，RXR是巨噬细胞的关键调节因子，在免疫和代谢性紊乱中起到关键作用。RXR有三种同型异构体，RXR（NR2B1）RXR(NR2B2),RXR(NR2B3)。每个同型异构体存在于特定的几个亚型中，在发育过程中具有特异的组织分布和表达模式。（Roszer等2013）以往的研究表明，在骨髓细胞中最丰富的受体，或者说至少是功能最重要的受体是RXR（Mangelsdorf等1992）。维生素A衍生物9顺维甲酸（9cRA）是第一个发现的RXR的天然配体（Perez等2012）内源性脂肪酸如二十二碳六烯酸（DHA）、油酸和植烷酸也是RXR的配体（Dawson和Xia,2012），许多RXR特异性合成配体例如LG100268（LG268），AGN194204和贝沙罗汀也被称为视黄醇，被用于研究和临床应用（Perez等2012）。

巨噬细胞在固有免疫中起到关键作用，不仅仅在宿主防御病原体，细胞碎片清除，组织损伤后重塑，组织脂质代谢的整合器作用，但也可以产生一些列分泌产物，这些分泌产物可以影响其他免疫细胞的活性以及其迁移（Glass和Olefsky2012；Nagy等2012）。在组织中巨噬细胞的长期活化状态以及其病原体的保留可以创造一种炎症微环境，这反过来又有助于动脉粥样硬化、胰岛素抵抗和神经退行性疾病。（Glass和Olefsky2012；Roszer等2013）.因此，在巨噬细胞的免疫和代谢过程的精密调节是非常重要的。在巨噬细胞中，诸如Toll样受体的模式识别受体活化可以激发快速的炎症或通过产生前炎性因子Ι型干扰素来激发抗病毒反应。（Newton和Dixit2012;Takeuchi和Akira,2010）多个核受体家族成员已被证实可以抑制TLR诱导的体内和体外的炎症反应，其中包括维生素D受体VDRs，过氧化物酶增值激活受体PPARs，肝脏X受体LXRs和糖皮质激素受体（Castrillo和Tontonoz2004;Nagpal等2001；Nagy等2012;Ogawa等2005），同时，由病原体激活的TLRs也可以调节巨噬细胞核受体靶基因。例如TLR3/4配体可以强烈抑制包括ABCA1和ABCG1的LXR靶基因从而阻断来着巨噬细胞胆固醇外流。（Castrillo等2003）.越来越多的证据表明，核受体与过氧化物酶增值激活受体之间的相互作用可以调节炎症反应和细胞代谢（Castrillo等2003；Nagy等2012；Roszer等2013）。然而，核受体与宿主抗病毒反应之间的相互作用还需要进一步的研究。

细胞抗病毒反应的活化涉及许多信号转导途径可以产生Ι型干扰素。简单的说，病毒核酸激活TLR3、TLR7/8、TLR9或细胞内受体如维甲酸诱导基因Ι样受体家族、黑色素瘤分化相关抗原5，可以激活通路导致人TANK结合激酶1的激活，磷酸化，人干扰素调节因子3的迁移进入细胞核以及干扰素的转录等一系列变化。（Newton和Dixit2012；Takeuchi和Akira，2009,2010）.干扰素诱导多种抗病毒基因表达。许多基因比如说干扰素刺激基因15、干扰素诱导的鸟苷酸结合蛋白1寡腺苷酸合成酶2可以直接抑制病毒的生长周期过程（Sadler和Williams2008）。其他诸如人干扰素调节因子1、人干扰素调节因子7、以及病毒核酸感受器（RIG-Ι和MDA5）进一步健全了干扰素反应。（Takeuchi和Akira，2009）。我们以前研究发现，RXR在病毒干扰过程中通过干扰素调节因子3依赖性但干扰素非依赖性通路表达下调。（Chow等2006）进一步的证据表明：病毒感染的小鼠在诸如阿司匹林的药物刺激下对肝毒性更加敏感，会产生一种类似于人类雷氏综合症的症状，这可能是因为药物代谢导致RXR下游的酶表达抑制的原因。（Chow等2006）尽管有这些有趣的研究现象，为什么在固有免疫反应病毒感染中RXR的表达下降，还有RXR的下调是否会影响病毒感染过程中的宿主防御，这些都尚不清楚。

环氧合酶1和环氧合酶2（COX1和COX2）是前列腺素生物合成的关键酶。COX1在许多组织中持续表达，COX2是可诱导的酶，二者均可以促使前列腺素E2产生（Vane等1998）。PGE2的产生增加会导致大多数检测病毒的复制增加（巨细胞病毒、水泡型口炎病毒、牛白细胞增多病毒、单纯疱疹病毒-1、人类疱疹病毒-6、伪狂犬病毒、小鼠肝炎病毒-68）（Ray等2004；Steer和Corbett,2003;Symensma等2003）。最近的研究表明前列腺素E2通过激活前列腺素E2受体EP2和EP4受体来激活PI3K-Akt-GSK3通路从而抑制干扰素α和干扰素β。（Fabricius等2010；Xu等2008）。尽管前列腺素E2的产生增加主要是由于病毒感染过程中环氧合酶2的产生增加（Steer和Corbett2003）。药理学以及遗传相关证据也表明，由环氧合酶1调节产生的前列腺素E2在调节Ι型干扰素产生和宿主抗病毒反应中起到关键作用。（Carey等2005；Chen等2012；Ray等2004）。；比如环氧合酶1特异性抑制剂增加伪狂犬病毒PFV的复制（Ray等2004）给予环氧合酶1敲除但未给予环氧合酶2敲除的小鼠更能抵抗流感病毒的侵袭（Carey等2005）环氧合酶1启动子通过高度乙酰化在组蛋白去乙酰化缺陷的巨噬细胞中产生干扰素抑制（Chen等2012）尽管多个研究表明，环氧合酶1调节Ι型干扰素的抑制，但是通过宿主抗病毒反应调节环氧合酶1的研究仍然极少。

发明内容

视黄醇X受体（RetinoidXreceptor），后简称（RXR），RXR属于核受体（nuclearreceptors），在细胞以及整个机体代谢中都是必不可少的。研究发现，RXR的过度表达及配体刺激会导致宿主对水疱性口炎病毒（VSV）易感，在巨噬细胞内可显著抑制抗病毒基因的表达。其中包括I型干扰素及多种干扰素刺激因子。Ι型干扰素以及其下游的干扰素刺激基因ISGs在抗病毒感染中对宿主的免疫反应发挥着重要的作用。目前，针对RXR在病毒感染的自身免疫反应中通过下调其表达来抑制抗病毒基因的表达，进而导致宿主细胞易感病毒的机制仍然未知。

鉴于以上所述现有技术，本发明提供一种抑制Ifnβ，Isg15，Gbp-1，Oas2，Irf7，Isg20，Ifn4细胞表达的方法。

优选的，所述方法为RXR过度表达水泡型口炎病毒（vesicularstomatitisvirus）（登录号）易感细胞模型构建及RXR过度表达抑制Ifnβ，Isg15，Gbp-1，Oas2，Irf7，Isg20，Ifn4细胞表达中的方法，具体为RXR过度表达及配体刺激所引起的水泡型口炎病毒易感，寻找抑制Ifnβ，Isg15，Gbp-1，Oas2，Irf7，Isg20，Ifn4细胞表达的方法。

更优选的，所述易感细胞模型为胚胎癌细胞模型。

进一步优选的，所述细胞模型为癌细胞模型。

所述筛选RXR激动剂可理解为，将待筛选的RXR激动剂分别给予构建后的水泡型口炎病毒易感细胞模型与正常细胞模型，并对细胞模型进行比较，从而对所述待筛选的RXR激动剂所引起Ifnβ，Isg15，Gbp-1，Oas2，Irf7，Isg20，Ifn4表达情况进行分析与评估。

由于RXR过度表达对于水泡型口炎病毒易感，且RXR表达水平可能调控水泡型口炎病毒感染的宿主易感性，并阻碍细菌廓清，所以RXR过度表达可用于构建水泡型口炎病毒易感胚胎癌细胞模型，在寻找一种抑制Ifnβ，Isg15，Gbp-1，Oas2，Irf7，Isg20，Ifn4细胞表达方法中具有实际应用价值。

本发明进一步提供RXR过度表达所引起的水泡型口炎病毒易感胚胎癌细胞金模型的构建方法，所述方法具体为：对野生型RXR和缺乏F9胚胎癌细胞预处理，给予注射水泡型口炎病毒（*PFU/μL），再通过菌斑实验计数上清液中不同特定时间点的病毒滴度。

所述注射水泡型口炎病毒的具体方法为：给予骨髓源性巨噬细胞1ug/mlpolyΙ：C病毒转染，或给予骨髓源性巨噬细胞感染polydA:dT4小时QRT-PCR检测RXRmRNA表达。

本发明证实了RXR表达水平可调控水泡型口炎病毒感染的宿主易感性，抑制Ifnβ，Isg15，Gbp-1，Oas2，Irf7，Isg20，Ifn4等抗病毒基因在细胞模型的表达量，并进一步阐述了相关免疫机理。

本发明发明人发现RXR介导的固有免疫响应在水泡型口炎病毒感染过程中的宿主防御中不可或缺；并率先证明了在水泡型口炎病毒感染的宿主防御中，RXR依赖性COX感受通路有着关键性的作用。

综上所述，本发明发明人证实了COX感受通路以RXR依赖的方式对宿主免疫防御系统中的抗病毒基因存在抑制作用，进一步证实了RXR在寻找一种抑制Ifnβ，Isg15，Gbp-1，Oas2，Irf7，Isg20，Ifn4细胞表达方法中起到重要的作用。

附图说明：

图1显示为RXR表达调控宿主细胞对VSV感染的易感性：（A）巨噬细胞给予VSV(感染4小时)、HSV-1或MHV668（感染8小时），QRT-PCR检测RXRmRNA表达（感染复数=1）；（B）巨噬细胞给予polyΙ：C（1ug/ml）病毒转染，或给予polydA:dT感染，4小时后QRT-PCR检测RXRmRNA表达；（C）野生型RAW细胞（模拟）以及RAW264.7细胞使其转染pBABE空载体（空）和转染pBABE–人RXR载体（hRXRα），其产物的RXR蛋白表达；（D）RAW264.7细胞转染hRXRα，对照组细胞（空）感染VSV（*PFU/μL）（感染复数=0.01），第14小时收集上清液，用菌斑实验计数病毒滴度；（E）RXRαWT和RXR缺乏F9的胚胎癌细胞系（RXRαnull）中RXR蛋白的表达；（F）RXRαWT和RXRαnull中感染VSV（*PFU/μL）通过菌斑实验计数上清液中不同特定时间点的病毒滴度（感染复数=0.01）；（G）通过逆转录感染，RXRαnull与hRXRα或与pBABE空载体重组。三个独立的RXR过度表达群体的建立。hRXRα1（pop1）、hRXRα2（pop2）、hRXRα3（pop3）,在这些细胞系以及野生型细胞中RXR表达由免疫印迹实验证实，非特异性条带（NS）作为对照组;(H)RXRαnull与hRXRα或与pBABE空载体重组，二者均感染VSV（*PFU/μL）（感染复数=0.01）在第12小时收集上清液，其病毒滴度由菌斑实验测定。

（A）（B）（C）（D）（F）（H）的数据表现为均数±标准差（n=3），上图作为其代表性实验。在三个独立的实验中得到相似的结果：*P＜0.05且**P＜0.01（t检验），（C）（E）（G）的数据证实三个独立实验的代表。

图2显示为RXR特异性激动剂可以促进VSV感染，而其特异性拮抗剂可以减轻VSV感染：（A）RAW264.7细胞经过RXR特异性配体（LG268100nM）（AGN194204100nM）或DMSO预处理16小时。接着细胞感染VSV（*PFU/μL）（感染复数=0.01），在第14小时收集上清液。其病毒滴度由菌斑实验测定；（B）RAW264.7细胞给予天然RXR配体，9顺式维甲酸（9cRA）或给予HX531或给予DMSO，三组均预处理16小时后感染VSV（*PFU/μL）（感染复数=0.01）在第14小时收集上清液。其病毒滴度由菌斑实验测定；（C）RAW264.7细胞经过RXR特异性配体（LG268100nM）（AGN194204（100nM））或DMSO预处理，接着细胞感染VSV-GFP。这三个独立的实验中，VSV-GFP感染的细胞第9小时其代表图（B-F亮视野）；（D）WT细胞以及RXRαnull给予DMSO或AGN194204（100nM）16小时后，感染VSV（*PFU/μL）12小时（感染复数=0.01）其病毒滴度由菌斑实验测定；（E）RXRαnull与hRXRα或与pBABE空载体重组，给予DMSO或AGN194204（100nM）16小时后，感染VSV（*PFU/μL）（感染复数=0.01）12小时其病毒滴度由菌斑实验测定；（F）人RXR过度表达的RAW264.7细胞（RAW264.7RXR）给予DMSO、9cRA、HX531后，感染复制不充分的VSV假病毒编码VSV-G荧光素酶受体（VSV-G-luc），其产物在第24小时收集，荧光素酶活力被定量分析。RLU表达结果数据表现为：均数±标准差，**P＜0.01（t检验），数据显示三个独立实验的实验结果；（G）RAW264.7细胞表达pBABE抑制或人RXR给予DMSO或9cRA预处理后感染VSV（1mol），在实验第8小时收集其细胞上清液，VSG-G蛋白水平通过免疫印迹法测定。微管蛋白作为一种加载控制器被检测出来。数据代表了3个独立的实验结果；（H）RAW264.7细胞感染VSV（感染复数=0.01），基因组VSVRNA与第2小时和第4小时定量分析。

（A）（B）（D）（E）（H）数据表现为均数±标准差（n=3），上图作为其代表性实验。在三个独立的实验中得到相似的结果：*P＜0.05且**P＜0.01（t检验）。

图7显示为RXRα的表达和RXR配体激活增加了RAW264.7细胞对VSV病毒的宿主易感性。

图8显示为13cRA增加宿主对VSV病毒感染的易感性。RAW264.7细胞转染pBABE空载体(空)和转染hRXRα，并对其给予DMSO、9cRA、13cRA16小时预处理后，细胞感染VSV(*PFU/μL)(感染复数＝0.01)。在上清液收集后，其病毒滴度由菌斑实验测定。数据表现为均数±标准差(n＝3)，上图作为其代表性实验。在三个独立的实验中得到相似的结果：*P＜0.05且**P＜0.01(t检验)。

图3显示为配体激活RXR抑制多个抗病毒基因：（A）RAW264.7细胞给予9cRA或给予DMSO，两组组均预处理16小时后转染polyΙ：C（1g/ml）2小时，提取其RNA，制作Affimetrix430.2芯片检测基因表达；（B）RAW264.7细胞给予9cRA或给予DMSO或给予HX531，三组均预处理16小时后转染polyΙ：C（1g/ml），转染后2小时，提取其RNA，并通过半定量PCR检测干扰素和Isg15mRNA的表达；（C）抗病毒激活干扰素诱导因子的表达，通过半定量PCR检测（B）中样本的Gbp1、Isg20、Oas2和Irf7的mRNA表达；（D）干扰素α敲除的骨髓源性巨噬细胞给予9cRA或给予DMSO或给予HX531，三组均预处理16小时后转染1g/mlpolyΙ：C，并通过半定量PCR检测干扰素和Isg15mRNA的表达。

(B)(C)(D)数据表现为均数±标准差(n＝3)，上图作为其代表性实验。在三个独立的实验中得到相似的结果：*P＜0.05且**P＜0.01(t检验)参见图9和图7

图9显示为RXR配体的活化抑制1型干扰素的表达。J2骨髓源性巨噬细胞经过DMSO、9cRA(100nM)或HX531(1μM)预处理16小时，紧接着转染1μg/mlpolyΙ：C4小时，4小时后QRT-PCR检测IfnβmRNA(A)和Ifnα4mRNA(B)表达；

图4显示为RXR过度表达通过下游RIG-1和TLR3信号通路抑制干扰素转录：(A)RAW264.7细胞转染干扰素启动子荧光素酶受体(IFNb-luc)给予DMSO或给予9顺式维甲酸预处理9小时后，对其进行polyΙ：C刺激。(5g/ml)polyΙ：C刺激20小时后收集其产物，根据发光分析实验对荧光素酶活力进行检测；(B-F)干扰素β荧光素酶受体共转染标记载体或人RXR，表明RIG-1以及TLR3信号通路作用元件转染293细胞24小时后，可以检测出裂解产物中荧光素酶活性；(G)标记载体或人RXR与产生Ι型干扰素信号通路作用原件共转染293T细胞24小时后，随后转染细胞感染VSV-GFP8小时(感染复数＝0.01)，应用流式细胞术来检测细胞中的VSV病毒。

GFP阳性的细胞比例表现为均数±标准差(n＝3)，代表了3个不同的实验P<0.01(t检验)参见图10。

图10显示为RXR过度表达抑制宿主细胞内I型干扰素基因生产通路的激活：(A)标记载体或人RXR转染HEK293T细胞24小时后，随后转染细胞感染VSV-GFP8小时(感染复数＝0.01)。应用流式细胞术来检测GFP阳性细胞。GFP阳性细胞为VSV感染细胞。(B-E)标记载体或人RXR与产生Ι型干扰素信号通路作用原件RIG-I(B)、IPS1(C).TBK1(D)或IRF1；(E)共转染HEK293T细胞24小时后，随后转染细胞感染VSV-GFP8小时(感染复数＝0.01)，应用流式细胞术来检测细胞中的VSV病毒。GFP阳性细胞为VSV感染细胞。数据代表三个实验。

图5显示为配体激活RXR诱导环氧合酶1产生但抑制环氧合酶2的产生：（A&B）RAW264.7细胞或J2骨髓源性巨噬细胞在特定的时间点给予DMSO或9cRA预处理后，转染1g/mlpolyΙ：C，2小时后提取其RNA并通过半定量PCR检测干扰素mRNA表达;（C）RAW264.7细胞给予DMSO或9cRA预处理16小时后提取其RNA，制作Affimetrix430.2基因芯片来检测基因表达;（D-E）J2骨髓源性巨噬细胞在特定的时间点给予DMSO或9cRA预处理后提取其RNA，并通过半定量PCR检测环氧合酶1、环氧合酶2mRNA表达;（F）J2骨髓源性巨噬细胞经过与（D-E）一致预处理后，通过免疫印迹实验检测环氧合酶1蛋白表达水平，GAPDH作为对照组。

数据代表了3个独立的实验。p<0.05(t检验)，在三个独立的实验中得到相似的结果：p<0.05并且P<0.01(t检验)参见图11图12。

图11显示为短时间预处理受体激动剂并没有改变I型干扰素及其下游基因的表达。

图12显示为RXR和RAR激动剂诱导环氧合酶1的表达。

图6显示为环氧合酶1调节RXR对干扰素产生的抑制作用：（A）环氧合酶1和环氧合酶2的标准化探针强度基因数据如图4A所示。根据430.2基因芯片的设计，标准化探针强度与基因的绝对复制呈正相关。基因表达数据表现为均数±标准差（**P＜0.01，t检验）；（B）J2骨髓源性巨噬细胞给予DMSO或9cRA预处理或者在9cRA中加入环氧合酶1/2泛抑制剂吲哚美辛/双氯芬酸（10nM）处理24小时后转染1ug/mlpolyΙ：C2小时或4小时后提取其RNA并通过半定量PCR检测干扰素1和干扰素4mRNA表达；（C）J2骨髓源性巨噬细胞转染对照组干扰RNA、干扰环氧合酶1、干扰环氧合酶2、干扰环氧合酶1&2，24小时后给予DMSO或9顺式维甲酸预处理16小时，转染1ug/mlpolyΙ：C2小时后提取其RNA并通过半定量PCR检测干扰素4mRNA表达；（D）J2骨髓源性巨噬细胞给予DMSO或9顺式维甲酸或者在9顺式维甲酸中加入环氧合酶1特异性抑制剂SC560（10nM）或加入环氧合酶2特异性抑制剂NS398（10nM）预处理24小时后，转染1ug/mlpolyΙ：C2小时或4小时后提取其RNA并通过半定量PCR检测干扰素4mRNA表达；（E）来自于野生型的原代骨髓源性巨噬细胞或环氧合酶1敲除的小鼠给予DMSO、9顺式维甲酸、HX531预处理72小时后（每24小时更换培养基并增加配方）转染1ug/mlpolyΙ：C4小时后提取其RNA并通过半定量PCR检测干扰素1和干扰素4mRNA表达；（F）病毒感染通过病原体识别受体下游信号来激活干扰素调节因子3，然后引起多个抗病毒基因的转录。同时干扰素调节因子3的激活抑制核受体RXR，通过诱导环氧合酶1抑制抗病毒基因的表达。

(B-F)数据表现为均数±标准差(n＝3)，上图作为其代表性实验。在三个独立的实验中得到相似的结果：*P＜0.05且**P＜0.01(t检验)

图13显示为在9顺式维甲酸预处理组以及PolyΙ：C激活巨噬细胞组，环氧合酶1在前列腺素(PGE2)生物合成中起主要作用：(A)将Cox1或Cox2进行梯度稀释，以其作为模板，分别进行qPCR。结果显示Cox1及Cox2标准曲线中扩增循环值(Ct值)及拷贝数可得出该细胞模型中环氧合酶1及环氧合酶2的绝对表达量；(B)J2骨髓源性巨噬细胞在9顺式维甲酸预处理16小时后，转染1ug/mlpolyΙ：C2小时后提取其RNA并通过半定量PCR检测环氧合酶1以及环氧合酶2的绝对表达量(标准曲线如图13A所示)，两个独立实验的实验数据已在图中显示；(C)J2骨髓源性巨噬细胞在转染空白对照(siRNA)，si-Cox1，si-Cox2或si-Cox1与si-Cox224小时后，随后用DMSO或9顺式维甲酸处理16小时后，再转染1ug/mlpolyΙ：C2小时后提取其RNA并通过半定量PCR检测环氧合酶1mRNA及环氧合酶2mRNA的绝对表达量(D)野生型细胞或Cox1缺失型J2骨髓源性巨噬细胞在DMSO，9cRA或HX531处理16小时后，转染1ug/mlpolyΙ：C2小时后提取其RNA并通过半定量PCR检测lfnβmRNA表达量。(E)J2骨髓源性巨噬细胞在DMSO或9cRA处理16h后，收集细胞上清液，ELISA检测PGE2表达量。(F)J2骨髓源性巨噬细胞用DMSO或9cRA预处理16h，收集上清作为对照组。随后，在指定时间转染1ug/mlpolyΙ：C，通过ELISA检测对照组与polyΙ：C转染组上清中PGE2表达量。

（C-F）数据表现为均数±标准差（n=3），上图作为其代表性实验。在三个独立的实验中得到相似的结果：*P＜0.05且**P＜0.01（t检验）

具体实施方式：

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。

核受体超家族(nuclearreceptorsuperfamily)是一组配体激活的转录因子家族，通过在信号分子与转录应答间建立联系，调控着细胞的生长和分化。RXR在抵御病毒感染的宿主防御中的作用仍然是未知的。我们发现RXR的过度表达以及其配体的刺激会导致宿主细胞的易感性的水泡口炎病毒VSV的功能缺失或RXR拮抗剂治疗使其病毒感染。与这些功能型研究相一致的是，配体刺激RXR在巨噬细胞显著抑制抗病毒基因的表达，其中包括一型干扰素以及多种干扰素刺激基因。我们的研究已经提供了进一步证据表明，COX1在RXR刺激巨噬细胞中显著诱导产生，介导RXR对一型干扰素的抑制作用，因此我们发现了一种新型的RXR-Cox-1依赖性途径，其在抑制一型干扰素-调节抗病毒免疫中起到重要作用。这说明，RXR在病毒感染的自身免疫反应中通过下调其表达来抑制抗病毒基因的表达，并在宿主抗病毒反应中起到优势作用。

各实施例中所使用的RAW264.7细胞系从ATCC公司购得，并给与DMEM加百分之十的FBS以及百分之一的青霉素或链霉素共同培养。RAW264.7细胞系从ATCC公司购得，并给与DMEM加百分之十的FBS以及百分之一的青霉素或链霉素共同培养。

本发明实施例中所使用的水泡型口炎病毒毒株（毒株编号）由UCLA的Lee博士提供。

将RAW264.7细胞植入6孔板中铺成6*105，给予DMSO或RXR激动剂或RXR拮抗剂处理16-24小时。病毒传播同之前描述的一致（Doyle等2002）。在培养基中细胞感染VSV（感染复数=0.01）1小时后，重新更换含有百分之一胎牛血清的DMEM。VSV-G假病毒包含reniila荧光素酶受体由UCLA的Lee博士提供。感染方式同前描述一致，并由荧光素酶检测试剂盒进行定量检测（Promega）。

稳定的细胞系的构建方法：人RXR克隆到pBABE–嘌呤霉素逆转录载体中，重组pBABE-人RXR，pBABE空载体，或pBABE-人RXR共转染载体psiA48小时。收集病毒上清液用来将人RXR转换为RAW264.7或F9胚胎癌细胞。感染细胞通过嘌呤霉素（2g/ml）形成转化株2周后，转化细胞即成为稳定的细胞系。

无限增值的骨髓源性巨噬细胞制备方法参见Palleroni等1991；zhou等2008。

polyΙ：C、polydA:dT和siRNA转染：

polyΙ：C与polydA:dT在六孔板转染，脂质体2000溶解于改良型DMEM培养基5分钟，2gpolyΙ：C或2gpolydA:dT溶解于改良型DMEM培养基,将以上脂质体2000溶液以及polyΙ：C或polydA:dT溶液混合，室温培养15分钟，随后，混合液加入含有1.6ml新鲜培养基的细胞中。酶联免疫吸附法中的转染试剂（polyplus制备公司）用做小干扰RNA的转染。根据厂家说明，将10nM对照组小干扰RNA或所示小干扰RNA转染J2骨髓源性巨噬细胞中。

统计方法：病毒滴度曲线使用对数秩检验进行比较。对于其他数据的统计显著性，通过2tailedunpairedttest，2-tailedMann-WhitneyUtest确定PFU数据，视情况使用1-wayANOVAcorrected多重比较法。P取值小于等于0.05，则被认为在统计学上是显著的。所有计算均使用GraphPadSoftwareInc.的Windows的Prism软件程序。PFU数据中的横条为各例的平均值，各图中的误差条表示结构方程模型（SEM）和重复数据。

实施例1

RXR的表达调控着宿主易感性的水泡型口炎病毒的感染：

我们以往的基因研究已经确立了一种新型的干扰素调节因子3依赖性但干扰素非依赖性的机制来下调RXR的表达（Chow等2006）。通过不同类型的病毒感染来确定RXR的表达水平，骨髓来源的巨噬细胞被水泡型口炎病毒感染。结果表明，感染以上病毒后引起RXR的表达下调（如图1A所示）。RXR基因的抑制并不是由于感染后细胞状态改变引起，因为L32控制基因没有变化（数据未显示）。给予RNA病毒类似物polyΙ：C和DNA病毒类似物polydA:dT，可以激活细胞内病毒，也显著抑制在骨髓巨噬细胞中RXR的表达。（如图1B所示）更重要的是，它证实了这种抑制是宿主反应抗病毒刺激产生而不是病毒直接抑制宿主基因产生的。为了确定RXR在宿主的免疫反应在病毒感染过程中是否起到作用，可以持续稳定的表达人类RXR，逆转录病毒感染产生pBABE控制载体。（如图1C所示）水泡型口炎病毒在人类RXR中感染引起过度表达的Raw264.7细胞系比对照组的细胞病毒载量更多。这个结果在不同的群体之间以及单细胞克隆持续表达人类RXR之间是一致的（数据未显示）。这些数据表明RXR的过度表达增加宿主细胞对病毒感染的易感性。

为了进一步明确RXR在宿主抗病毒感染中的作用，野生型RXR和缺乏F9胚胎癌细胞给予注射水泡型口炎病毒，通过噬菌斑测定RXR缺乏感染后细胞明显比野生型细胞对水泡型口炎病毒更具有抵抗性。（如图1E和1F所示）为了确定这种差异是否为RXR依赖性，RXR缺乏F9细胞通过逆转录病毒的感染重新建立人类RXR以及pBABE控制载体。给予三种不同的人类RXR注射水泡型口炎病毒比给予RXR缺乏F9细胞系重塑pBABE控制产生更高的病毒滴度。（如图1G-1H所示）这些结果表明RXR的缺乏降低了水泡型口炎病毒感染的宿主易感性。

综上所述，在RXR过度表达的细胞给予更多病毒感染以及RXR缺乏细胞给予较少的病毒感染，说明RXR表达水平可能调控水泡型口炎病毒感染的宿主易感性。

实施例2

RXR激动剂及其拮抗剂调节水泡型口炎病毒注射的巨噬细胞的宿主防御功能：

配体与RXR相结合可以激活其下游通路，且充分激活。为了探讨RXR配体激活是否能影响病毒感染，RAW264.7细胞给予RXR特异性激动剂Ig268和AGN194204进行过夜预处理，之后感染水泡型口炎病毒。通过菌斑实验分析，实验结果与RXR过度表达的实验结果相一致，配体激活组的RXR给予两种刺激剂之后显著增强其水泡型口炎病毒感染水平。(如图7A所示)与此相似的是，给予9-顺式维甲酸(RXR新型配体)治疗，也可以增加RAW264.7细胞系对水泡型口炎病毒感染的易感性，并且呈剂量依赖效应(维甲酸剂量范围16nM-20nM)(如图2B和7B所示)，相反，当给予特异性RXR拮抗剂HX531后，(如图2C所示)RAW264.7细胞系出现了对水泡型口炎病毒感染的抵抗增加。感染后我们采用GFP，是考虑到可以通过荧光显微镜来观察感染后细胞的形态。显然，与给予DMSO的对照组相比，给予维甲酸处理的细胞VSV感染更多、给予HX531处理的细胞VSV感染较少。(如图2C所示)F9细胞系，给予AGN194204后增加野生型细胞对病毒的易感性，对RXR缺乏的细胞没有影响，这一结果说明配体反应是RXR特异性的(如图2D所示)。为了进一步确定这一特异性配体反应，RXR缺乏F9细胞重新再造给予人类RXR，并选择单克隆细胞备用。给予AGN194204后，三种单克隆细胞中，RXR缺乏的细胞系通过人类RXR的再造，对病毒感染变得更具易感性。(如图2E所示)为了研究RXR是否可以调节VSV蛋白表达，人类RXR过度表达RAW264.7细胞给予9-顺式维甲酸和HX531，然后给予其中包含VSV-G荧光素酶受体无法复制的VSV假病毒感染。(Aguilar等2006)。HX531降低VSV荧光素酶受体活化，而9顺式维甲酸增加其活化。(如图2F所示)因为假病毒没有复制能力，受体表达增加意味着RXR激活病毒蛋白表达的活化。为了分别阐述这一数据，RAW264.7细胞预先给予DMSO处理，野生型VSV给予9顺式维甲酸处理，收集其产物，免疫印迹实验对VSV-G蛋白定量。VSV-G蛋白水平在人RXR过度表达的RAW264.7细胞中比对照组细胞中表达要高。给予9顺式维甲酸细胞组VSV-G蛋白水平显著上升。(如图2G所示)基因组的复制是病毒成功复制的另一个关键过程。为了检验RXR激活是否影响VSV基因组的复制，VSV感染的RAW264.7细胞经过9顺式维甲酸预处理提取其RNA,负链基因组RNA(VRNA)通过qPCR定量(Simon等2007)RAW264.7细胞给予9顺式维甲酸后其VRNA在感染后两小时内上升，差异在4小时候更加明显，这些结果表明RXR激活可以提高病毒基因组RNA产生以及病毒蛋白的产生。尽管这两种过程不是直接相关的，数据表明RXR可能影响病毒周期多种进程。考虑到RXR通过形成同二聚体或异二聚体来调节其靶基因，我们通过激动剂与不同的RXR潜在同伴结合，其中包括VDR、LXR、PPAR-α、PPAR-β以及RAR(类视黄醇受体)(Lefebvre等2010；Roszer等2013)。我们发现只有配体刺激RAR可以促进VSV感染，这也暗示RAR与RXR形成异二聚体，是它的潜在同伴。

实施例3

配体激活RXR抑制多种抗病毒基因的表达：

为了研究RXR是如何减弱宿主免疫反应并有利于病毒感染，本发明发明人对给予RXR激动剂预先处理组以及巨噬细胞PolyΙ：C转染组进行了基因芯片检测。结果表明9顺式维甲酸可以抑制多种PolyΙ：C诱导基因，其中包括Ι型干扰素基因(例如IFN1、IFN2、IFN4、IFN5)Isg15、Ifit3以及Gbp3(如图3A)考虑到Ι型干扰素以及其下游的干扰素刺激基因ISGs在抗病毒感染中对宿主的免疫反应发挥着重要的作用，RXR介导的对这些抗病毒基因的抑制可能是宿主对病毒感染的易感性引起的。为了验证基因数据以及证明RXR通过抑制抗病毒基因有利于病毒感染这一假说，本发明发明人给与RAW264.7细胞RXR激动剂预处理，或者给予其拮抗剂过夜处理，接着通过PolyΙ：C转染来模拟病毒感染刺激细胞。在转染后2小时，通过给予9顺式维甲酸，配体激活RXR对主要抗病毒基因IFN1以及Isg15显著抑制(如图3B所示)。通过抗病毒的刺激，次要干扰素诱导基因例如Gbp-1，Oas2，IRF7以及Isg20在该组表达水平也有所降低。(如图3C所示)给予RXR拮抗剂HX531，一部分但不是全部抗病毒的表达显著增加。(如图3B和3C所示)有趣的是，9顺式维甲酸以及HX531处理后给以调整部分基因的基础表达，这说明RXR的活化在正常生理状态下可能会抑制抗病毒基因激活(如图3B和3C所示)在J2病毒持续存在的骨髓巨噬细胞中，我们发现9顺式维甲酸抑制干扰素1以及干扰素4的表达，然而PolyΙ：C转染的巨噬细胞中，HX531对干扰素的表达增加。(如图9所示)。病毒感染可以直接触发主要抗病毒基因(例如干扰素1、Isg15)的表达，产生干扰素，并通过自分泌/旁分泌放大抗病毒效应。(Sadler和Williams2008)。为了验证RXR是否可以抑制主要抗病毒基因的产生从而抑制干扰素非依赖性下游通路信号，Ι型干扰素受体缺乏的骨髓源性巨噬细胞(IFNαr-/-)给予9顺式维甲酸以及HX531处理后，PolyΙ：C激活。在干扰素受体缺乏的骨髓源性巨噬细胞里，基因分析显示9顺式维甲酸处理组显著下调PolyΙ：C产生IFN1和Isg15的表达。(如图3D所示)而Oas2、Gbp1、Irf7以及Isg20没有显著。(数据未显示)。这说明其诱导方式为干扰素依赖型。这些结果表明给予PolyΙ：C刺激或，RXR的活化调节一组特定的包括干扰素在内的主要基因的表达。

实施例4

RXR通过靶向调节下游RIG-1以及TLR3信号通路来抑制干扰素的转录：

为了进一步研究RXR是如何抑制Ι型干扰素，本发明发明人应用了干扰素催化剂荧光素酶受体（IFN-luc）并发现由PolyΙ：C转染的9顺式维甲酸处理组显著降低干扰素启动子的激活。（如图4A所示）。这些数据表明RXR抑制干扰素转录。

转染的PolyΙ：C可以被TLR3以及RIG-1识别，TLR3和RIG-1分别募集下游接头分子IPS1和TRIF。IPS1和TRIF均可以促进TBK1激酶和干扰素调节因子3磷酸化，然后干扰素调节因子3的二聚体进入细胞核内促使干扰素转录(Newton和Dixit2012；Takeuchi和Akira2009，2010)。RXR的联合超表达显著抑制由RIG-1、IPS1、TBK1，IRF3和TRIF活化的干扰素启动子激活。(如图4B-4G所示)除干扰素启动子激活外，RXR的联合超表达减弱由RIG-1、IPS1、TBK1或IRF1调节的对水泡型口炎病毒的清除。(如图4G及图10A-4E所示)。考虑到RXR可以阻断干扰素启动子的活性，而干扰素启动子是由几乎所有Ι型干扰素通路的作用元件驱动激活，RXR很可能在RIG-1和TLR3调节的信号通路对下游干扰素调节因子3发挥其抑制功能。

实施例5

通过对9顺式维甲酸的前处理来抑制Ι型干扰素的表达：

在之前的实验中，本发明发明人已经注意到，RXR激动剂过夜处理显著抑制Ι型干扰素的表达。为了进一步确定RXR激动剂的功能动力学，在PolyΙ：C刺激前，根据不同的时间点给予RAW264.7细胞DMSO或9顺式维甲酸预处理，仅在给予9顺式维甲酸预处理超过12小时的细胞中观察到干扰素表达的显著降低，其中干扰素的表达是由PolyΙ：C引起的。(如图5A所示)与RAW264.7细胞相似的是，给予9顺式维甲酸和DMSO预处理6小时的骨髓源性巨噬细胞中，PolyΙ：C诱导的干扰素1和干扰素4mRNA水平变化无差异。给予9顺式维甲酸预处理4小时或8小时后，RIG-1，(一种干扰素刺激基因)也没有影响。(如图11C所示)然而，给予9顺式维甲酸预处理超过12小时候后，干扰素的表达显著被抑制。(如图5B所示)根据这些结果可以看出，我们假设9顺式维甲酸诱导型基因可以调节RXR对Ι型干扰素的表达的抑制作用。

实施例6

RXR配体激活诱导环氧合酶1和环氧合酶2的表达：

为了探讨9顺式维甲酸诱导型基因可能参与抑制Ι型干扰素的表达，本发明发明人对给予DMSO和9顺式维甲酸处理的巨噬细胞基因表达分析进行了比较，在这些9顺式维甲酸诱导型基因中(如图5C)，我们发现环氧合酶1是表达量最高的9顺式维甲酸诱导型基因。众所周知，炎症反应中，环氧合酶2是可以诱导的，而在以往的报道中环氧合酶1在多种细胞中作为本构表达基因起作用。(Vane等1998)有趣的是，在RXR激活的细胞中，环氧合酶1mRNA显著诱导，而环氧合酶2mRNA显著被抑制。在骨髓源性巨噬细胞中，在不同的时间点给予细胞9顺式维甲酸，4小时后，环氧合酶1表达显著增加，而环氧合酶2显著下降(如图5D和5E所示)，我们也发现，给予原发性骨髓源性巨噬细胞9顺式维甲酸过夜处理后，可以显著增加环氧合酶1的表达。(如图12A所示)PolyΙ：C活化可以显著诱导环氧合酶2的表达。然而，给予9顺式维甲酸处理后可以阻断环氧合酶2的表达。(如图12B所示)然而在给予9顺式维甲酸8小时后，环氧合酶1蛋白是检测不出来的。经过16小时后，环氧合酶1蛋白大量聚集。(如图5所示)这也解释了为什么给予9顺式维甲酸过夜处理可以抑制Ι型干扰素的表达。作为RXR的潜在合作伙伴，RAR可以促进病毒感染(如图7C所示)骨髓源性巨噬细胞给予RAR激动剂AM580处理，环氧合酶1在过夜处理后显著表达，而环氧合酶2并没有被显著抑制。

实施例7

环氧合酶1调节RXR对抗病毒基因的抑制作用：

考虑到环氧合酶1和环氧合酶2在催化花生四烯酸转化为多个前列腺素的功能非常相似，(Vane等1998)，我们在基因水平上检测了环氧合酶1和环氧合酶2的相对探针强度，发现在9顺式维甲酸预处理组以及PolyΙ：C激活巨噬细胞组，环氧合酶1的表达比环氧合酶2的表达更多(如图6A所示)。随后，环氧合酶1以及环氧合酶2的表达也可以用来对二者进行完全复制。(如图13A所示)与基因相对探针强度数据相一致的是，在9顺式维甲酸预处理组以及PolyΙ：C激活巨噬细胞组，环氧合酶1的完全复制产物的表达比环氧合酶2的完全复制产物的表达要高很多。(如图13B所示)这些结果表明，在RXR激活的细胞病毒感染期间，环氧合酶1在花生四烯酸转化为其终产物的过程中起到了关键作用。

为了明确环氧合酶1和环氧合酶2对Ι型干扰素的作用，非甾体类抗炎药(NSAID)双氯芬酸和吲哚美辛最初被用来阻断环氧合酶1和环氧合酶2酶活性。在PolyΙ：C激活巨噬细胞组，吲哚美辛和双氯芬酸可以明显逆转9顺式维甲酸对干扰素1和干扰素4表达的抑制作用。环氧合酶1和环氧合酶2特异性合成物以及干扰RNA用作后续应用。(如图13C所示)敲除环氧合酶1以及敲除环氧合酶1和2后能够明显逆转9顺式维甲酸对干扰素的表达的抑制效应，然而干扰环氧合酶2仅有轻微的影响(如图6C所示)。为了验证在病毒感染期间，环氧合酶1对9顺式维甲酸处理组特异性抑制Ι型干扰素的作用，我们对环氧合酶1特异性抑制剂SC-560和环氧合酶2特异性抑制剂NS398进行了测试。SC560可以显著逆转9顺式维甲酸对干扰素表达的抑制作用，而NS398没有对其起作用(如图6D所示)，最后，为了使结果更加合理，原发性骨髓源性巨噬细胞敲除环氧合酶1后给予RXR阻断剂和激动剂。在野生型细胞中，9顺式维甲酸显著抑制干扰素1和干扰素4的表达，而在环氧合酶1敲除的巨噬细胞中没有相同的变化(如图6F所示),在野生型以及环氧合酶1敲除的骨髓源性巨噬细胞中也可以得到同样的结果。以往的研究表明，前列腺素E2，是一种由环氧合酶1催化花生四烯酸的产物，它可以在TLR配体刺激时对巨噬细胞以及浆细胞样树突细胞中均抑制Ι型干扰素的表达。(Fabricius等2010；Xu等2008)，因此我们9顺式维甲酸处理组检测其细胞上清液中前列腺素E2的表达。9顺式维甲酸过夜处理的细胞提取其上清液，其前列腺素E2的表达显著提高(如图13E-F所示)。总而言之，这些结果表明，环氧合酶1调节RXR对抗病毒基因表达的抑制作用。我们的研究表明干扰素调节因子3除了可以直接诱导Ι型干扰素，也可以间接通过减轻RXR-COX1依赖性抑制通路来激活Ι型干扰素的转录。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。