细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光探针底物及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410699522.5 (22)申请日 2014.11.27 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105219374 A (43)申请公布日 2016.01.06 (66)本国优先权数据 201410239782.4 2014.05.30 CN (73)专利权人 中国科学院大连化学物理研究所 地址 116023 辽宁省大连市中山路457号 (72)发明人 杨凌戴子茹崔京南葛广波 冯磊宁静 (74)专利代理机构 沈阳晨创科技专利代理有限 责任公司 21001 代理。

2、人 张晨 (51)Int.Cl. C09K 11/06(2006.01) C07D 221/14(2006.01) C12Q 1/26(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (56)对比文件 JP S4418955 B,1969.08.18,说明书第6页. CS 185273 B1,1978.09.15,权利要求1， 说 明书第4栏. CN 104342488 A,2015.02.11,实施例1,图 10. Pavel A. Panchenko等.Spectroscopical study of bacteriopurpurinimide naphthalimide con。

3、jugates for fluorescent diagnostics and photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology .2014,第133卷140- 144. M. DANNY BURKE 等.CYTOCHROME P450 SPECIFICITIES OF ALKOXYRESORUFIN O- DEALKYLATION IN HUMAN AND RAT LIVER. Biochemical Pharmacology .1994,第48卷 923-936. MARY L. HAAS。

4、CH 等.USE OF 7- ALKOXYPHENOXAZONES,7-ALKOXYCOUMARINS AND 7-ALKOXYQUINOLINES AS FLUORESCENT SUBSTRATES FOR RAINBOW TROUT HEPATIC MICROSOMES AFTER TREATMENT WITH VARIOUS INDUCERS. Biochemical Pharmacology .1994, 第47卷893-903. 审查员 陈雅清 (54)发明名称 细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光探针底 物及其应用 (57)摘要 一种细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光探 针底物及。

5、其应用， 该特异性探针底物具有羟基萘 二甲酰亚胺烷酸结构， 其可用于测定生物体系中 CYP1A的酶活。 CYP1A酶活测定的流程如下： 选择 羟基萘二甲酰亚胺烷酸类去甲基化反应为探针 反应， 通过定量检测单位时间内其去甲基化代谢 产物的生成量来测定各类生物样品中CYP1A酶的 活性。 本发明可用于不同种属、 不同个体来源生 物样本中CYP1A酶活的定量评估， 以及不同来源 的动物组织细胞培养液及细胞制备物中CYP1A酶 活的定量测定， 以期实现对重要药物代谢酶 CYP1A处置药物能力的评估。 此外， 借助该探针反 应还可用于体外快速筛选CYP1A的抑制剂并评估 其抑制能力。 权利要求书1页 说。

6、明书6页 附图4页 CN 105219374 B 2017.08.04 CN 105219374 B 1.一种细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光探针底物的应用， 其特征在于： 采用CYP1A 亚酶的特异性底物， 与含CYP1A的生物样品混合后进行酶促反应， 通过定量检测单位时间内 的底物消除率或其去甲基化产物的生成率来定量测定不同生物体系中CYP1A的活性， 该底物具有1,8-萘酰亚胺类结构， 其结构式如下： 其中， R为-COOH、 苯甲酸、 -SO3H中的任意一种， n为210； 具体测定方法及条件如下： A.体系中以1,8-萘酰亚胺类化合物作为比率型探针底物； 底物浓度选择1/1010。

7、Km； B.在PBS缓冲液中， 反应温度为2060之间， 孵育体系pH介于5.510.5之间， ； C.反应时间为5120分钟， 确保以上底物相应的O-去甲基化产物达到定量限且底物转 化率不超过20时终止反应； D.测定单位时间内底物减少量或O-去甲基化产物生成量作为CYP1A活性的评价指标。 2.按照权利要求1所述的细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光探针底物应用， 其特征在 于步骤A中单点测定时底物浓度优选Km； 步骤B中优选37为最优反应时间； 优选pH7.4为最 优反应pH值。 3.按照权利要求1所述的细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光探针底物的应用， 其特征 还在于所述的生物体系为。

8、重组表达CYP1A单酶、 人或动物组织制备液、 各类哺乳动物组织细 胞及其制备物中的任意一种。 4.按照权利要求1所述的细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光探针底物的应用， 其特征 还在于： 该探针底物及其去甲基化产物的荧光信号需采用不同检测波长去检测， 去甲基化 产物及底物的荧光检测条件分别为： 激发波长450， 372nm， 最大发射波长分别为564， 452nm。 5.一种如权利要求1所述的细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光探针底物的应用， 其特 征在于： 该探针底物还可用于CYP1A抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。 6.一种如权利要求1所述的细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光。

9、探针底物的应用， 其特 征在于： 该探针底物也可作为实验动物在体及整体CYP1A的探针底物， 评估代谢酶CYP1A的 个体及种属差异。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105219374 B 2 细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光探针底物及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及一种细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧 光探针反应及其应用。 背景技术 0002 细胞色素P450酶系(cytochrome P450,P450酶)超家族是机体内最重要的药物代 谢酶， 大约60的药物(包括绝大部分临床药物和杀虫剂)的主要清除是由CYP介导的。 细胞 色素P450酶系是一个。

10、蛋白质超家族， 是一大类含血红素的蛋白质， 在还原态时与CO形成的 复合物于450nm处有最大吸收峰。 因其催化的I相反应是化合物在体内代谢的关键步骤， 因 为这一步反应通常是药物从体内清除的限速步骤， 可影响化合物的半衰期、 清除率等动力 学特征， 且P450酶活性常随遗传因素、 年龄、 疾病状态或其它药物相互作用的影响而发生改 变。 药物对机体P450酶的影响， 能造成临床上显著的药物相互作用。 0003 CYP1A是重要的I相代谢酶， 主要包括两种亚型： CYP1A1和CYP1A2， 其中CYP1A1主要 在人肺中表达， 而CYP1A2则主要在人肝中表达， 且占人肝中CYP总量的13。 。

11、CYP1A也参与多 种药物例如茶碱、 咖啡因、 安替比林等， 以及环境毒素和内源性底物的代谢， 并在多种前致 癌物被激活成具有遗传毒性中间体或最终致癌物的过程中起到了重要作用,例如在一定程 度上激活咖啡因诱使肝硬化的发生(MOL ASPECTS MED.1999.20： 1-137)。 除此之外， CYP1A 的活性在不同人种中也有很大的个体差异， 人口研究发现CYP1A在不同人种中可能会呈现 单峰、 双峰甚至三峰的分布(Eur J Clin Pharmacol.1995.47:423-430)。 因此， 开展CYP1A 酶活的个体差异研究对于临床个性化安全用药有着重要意义。 目前国内外制药巨。

12、头在药物 开发过程中， 需要在体外评估各候选新药抑制CYP1A的能力。 因此， 开发高效、 灵敏的特异性 CYP1A探针底物对于高效筛选CYP1A抑制剂， 及定量测定生物体系内CYP1A的活性至关重要。 0004 由于CYP1A亚家族中的各亚型具有相似的氨基酸序列， 其底物通常相互交叠， 因此 各亚型酶鲜有特异性的底物。 目前， 已报道的CYP1A的荧光探针底物有3个， 分别是3-氰基- 7-乙氧基香豆素， 乙氧基试卤灵和荧光素-ME-EGE。 这些已知的荧光底物均属于off-on型探 针， 单酶选择性并不高且易受生物基质的干扰， 定量误差较大。 而比率型探针发射光谱的蓝 移/红移则可用于比率。

13、检测， 且此时探针分子原型可作为内部校准来减小光照强度、 探针浓 度、 样品不均匀、 仪器参数等对定量分析的影响。 因此， 开发高选择性的CYP1A比率型荧光探 针反应及其配套的高通量检测方法具有重要的实用价值。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光探针底物及其应 用， 该比率型荧光探针底物和去甲基化产物的荧光发射波长具有明显差异， 且产物的荧光 量子产率更高更易检测。 利用该探针反应可对多种生物体系中CYP1A的分布和功能进行定 量评价。 0006 本发明提供了一种细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光探针底物， 该探针底物可 说明书 1/6 页 3。

14、 CN 105219374 B 3 被CYP1A特异性催化生成相应的O-去甲基化产物， 该底物具有1,8-萘酰亚胺类结构， 其结构 式如下： 0007 0008 其中， R为-COOH、 苯甲酸、 -SO3H中的任意一种， n为210。 0009 本发明还提供一种细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光探针底物的应用， 采用该 CYP1A亚酶的特异性底物， 与含CYP1A的生物样品混合后进行酶促反应， 通过定量检测单位 时间内的底物消除率或其去甲基化产物的生成率来定量测定不同生物体系中CYP1A的活 性， 具体测定方法及条件如下： 0010 A.体系中以1,8-萘酰亚胺类化合物作为比率型探针底物；。

15、 底物浓度选择1/10 10Km； 单点测定时底物浓度优选Km； 0011 B.在PBS缓冲液中， 反应温度为20至60之间， 优选37为最优反应时间； 孵育 体系pH介于5.510.5之间， 优选pH7.4为最优反应pH值； 0012 C.反应时间为5120分钟， 确保以上底物相应的O-去甲基化产物达到定量限且底 物转化率不超过20时终止反应； 0013 D.测定单位时间内底物减少量或O-去甲基化产物生成量作为CYP1A活性的评价指 标。 0014 所述的细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光探针底物应用， 其特征还在于所述的 生物体系为重组表达CYP1A单酶、 人或动物组织制备液、 各类哺乳。

16、动物组织细胞及其制备物 中的任意一种。 0015 该探针底物及其去甲基化产物的荧光信号需采用不同检测波长去检测， 去甲基化 产物及底物的荧光检测条件分别为： 激发波长450， 372nm， 最大发射波长分别为564， 452nm。 0016 该探针底物还可用于CYP1A抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。 0017 该探针底物也可作为实验动物在体及整体CYP1A的探针底物， 评估代谢酶CYP1A的 个体及种属差异。 0018 本发明提供的细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光探针反应的应用， 该探针底物 及其O-去甲基化产物均具有荧光属性， 且两者具有不同的光学属性， 可采用荧光检测器同 时实。

17、现底物及产物的快速、 灵敏检测； O-去甲基化产物及底物荧光检测条件分别为： 激发波 长372， 450nm， 最大发射波长为450， 564nm如图3所示。 说明书 2/6 页 4 CN 105219374 B 4 0019 该特异性探针底物为比率型荧光探针， 其在CYP1A活性检测过程不易受生物体系 基质及杂质的干扰， 可用于各种重组CYP1A、 人及动物组织制备液及各类组织细胞中CYP1A 酶活的定量测定； 同时也可作为在体及动物整体CYP1A的探针底物， 评估代谢酶CYP1A的个 体及种属差异。 该探针底物及O-去甲基化代谢产物的荧光检测方法还可用于CYP1A抑制剂 的快速筛选及抑制能。

18、力的定量评价。 0020 采用重组细胞色素氧化酶CYP1A单酶， 肝微粒体孵育体系进行考察， 通过相关性分 析(如图5所示)， 重组单酶代谢反应(如图6所示)， 特异性抑制实验(如图7所示)， 以及酶反 应动力学几方面的证据， 证明1,8-萘酰亚胺类化合物可特异性的经细胞色素氧化酶CYP1A 代谢(如图8所示)， 生成O-去甲基化氧化产物。 进一步采用各种哺乳动物的新鲜提取的肝细 胞 原代培养肝细胞、 肝切片 肝灌流等代谢评价体系进行考察， 发现该代谢反应具有非常 良好的特异性。 0021 作为高特异性的细胞色素氧化酶CYP1A单酶的荧光探针底物， 该化合物可以用来 检测CYP1A的活性， 尤。

19、其适合用于对细菌、 昆虫细胞、 哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体 系生产的CYP1A的酶活测定， 以及多种哺乳动物组织器官来源的微粒体、 S-9等制备物中 CYP1A的活性标定。 0022 选用本发明所述细胞色素氧化酶CYP1A单酶的比率型荧光探针反应检细胞色素氧 化酶CYP1A单酶体外活性具有以下突出优势： 0023 (1)高特异性： 1,8-萘酰亚胺类化合物可被细胞色素氧化酶CYP1A单酶高特异性地 代谢成一个代谢产物， 即O-去甲基化产物。 0024 (2)廉价易得： 1,8-萘酰亚胺类化合物可经化学合成获得， 合成工艺简单易行， 荧 光方法检测成本低。 0025 (3)高灵敏度： 具有。

20、1,8-萘酰亚胺母核结构的化合物均具有良好的荧光发射光谱 特性(450700nm)， 且该底物及其O-去甲基化代谢产物具有不同的荧光发射光谱特征， 能 较好的进行区分检测， 同时可通过比率型标准曲线的建立进行定量测定CYP1A单酶的检测 下限为0.2nM/ml。 附图说明 0026 图1.1,8-萘酰亚胺类化合物的结构通式； 0027 图2.N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺的1H-NMR谱图； 0028 图3.N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺及其O-去甲基化代谢产物的紫外吸 收光谱图(分别在372nm和450nm有最大吸收)； 0029 图4.14例HLM对N-。

21、(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺的代谢图； 0030 图5.N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺及其O-去甲基化代谢速率与非那西 汀的O-脱乙基代谢速率的相关性分析实验； 0031 图6.N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺的人CYP重组单酶筛选试验结果； 0032 图7.N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺在人肝中的化学抑制实验结果； 0033 图8.CYP1A介导N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺的代谢通路； 0034 图9.N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺的合成路线。 说明书 3/6 页 5 CN 105219。

22、374 B 5 具体实施方式 0035 下面的实施例将对本发明予以进一步的说明， 但并不因此而限制本发明。 0036 本发明所采用的设备及其型号为： 荧光发射/激发光谱是由SynergyH1全功能微孔 板检测仪检测完成； 1H-NMR谱图是由核磁共振波谱仪(Avance II 400MHz)检测完成。 0037 实施例1 0038 N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺的合成路线 0039 (1)化合物1的合成 0040 将4.2mmol 4-氨基丁酸加入到含有1g(3.61mmol)4-溴-1， 8萘酐的50ml乙醇溶液 中， 70-80反应过夜后， 加入200ml水， 析出大量固。

23、体， 过滤， 真空干燥得到米黄色固体N- (3-羧丙基)-4-溴-1， 8-萘酰亚胺， 产率80-90。 0041 (2)化合物2的合成 0042 将800mg化合物1与2.54g碳酸钾置于100ml单口瓶中， 加入30ml甲醇， 60-70反应 过夜后， 冷却， 用1M的盐酸将pH调至酸性， 析出大量黄色固体， 过滤， 大量水洗， 真空干燥得 到黄色固体N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1， 8-萘酰亚胺， 产率80-90。 0043 化合物1、 2的结构如图9所示， N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺及其O-去甲 基化代谢产物的紫外吸收光谱图如图3所示， 分别在372nm和45。

24、0nm有最大吸收； 制备的化合 物2的核磁共振波谱分析图2所示， 具体如下： 0044 1H NMR(400MHz,DMSO) 12.05(s,1H),8.49(ddd,J8.4,7.8,1.1,2H),8.43(d, J8.3,1H),7.80(dd,J8.3,7.4,1H),7.31(d,J8.4,1H),4.13(s,3H),4.06(t,J7.0, 2H),2.30(t,J7.4,2H),1.88(p,J7.2,2H). 13C NMR(100MHz,DMSO)23.59,31.82,39.33, 56.99,116.36,114.39,122.01,122.86,126.45,131。

25、.15,133.39,160.48,163.27,163.93, 174.45.HRMSM+H+313.0950,found 314.1025. 0045 实施例2 0046 N-(羧戊基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺的合成 0047 (1)化合物N-(3-羧戊基)-4-溴-1， 8-萘酰亚胺的合成 0048 将4.2mmol 6-氨基己酸加入到含有1g(3.61mmol)4-溴-1， 8萘酐的50ml乙醇溶液 中， 70-80反应过夜后， 加入200ml水， 析出大量固体， 过滤， 真空干燥得到米黄色固体N- (3-羧戊基)-4-溴-1， 8-萘酰亚胺， 产率80-90。 0049 (2)。

26、化合物N-(3-羧戊基)-4-甲氧基-1， 8-萘酰亚胺的合成 0050 将800mg化合物N-(3-羧戊基)-4-溴-1， 8-萘酰亚胺与2.54g碳酸钾置于100ml单口 瓶中， 加入30ml甲醇， 60-70反应过夜后， 冷却， 用1M的盐酸将pH调至酸性， 析出大量黄色 固体， 过滤， 大量水洗， 真空干燥得到黄色固体N-(3-羧戊基)-4-甲氧基-1， 8-萘酰亚胺， 产 率80-90。 0051 制备的产物的核磁共振波谱具体如下： 0052 1H NMR(400MHz,DMSO) 11.99(s,1H),8.558.38(m,3H),7.837.74(m,1H),7.30 (d,J。

27、8.4Hz,1H),4.12(s,3H),4.053.94(m,2H),2.22(t,J7.3Hz,2H),1.671.48(m, 4H),1.401.25(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO) 174.87,163.63,162.96,160.34,133.18, 130.97,128.47,128.17,126.25,122.72,121.84,114.27,106.17,56.80,33.96,27.70, 说明书 4/6 页 6 CN 105219374 B 6 26.54,24.68.HRMSM+H+341.1236,found 342.1335. 0053 实施例3。

28、 0054 N-(4-羧基苯基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺的合成 0055 (1)化合物N-(4-羧基苯基)-4-溴-1， 8-萘酰亚胺的合成 0056 将4.2mmol 4-氨基苯甲酸加入到含有1g(3.61mmol)4-溴-1， 8萘酐的50ml乙酸溶 液中， 100-110反应过夜后， 趁热过滤， 用乙酸洗涤滤饼， 真空干燥得到米黄色固体N-(4- 羧基苯基)-4-溴-1， 8-萘酰亚胺， 产率30-40。 0057 (2)化合物N-(4-羧基苯基)-4-甲氧基-1， 8-萘酰亚胺的合成 0058 将800毫克化合物N-(4-羧基苯基)-4-溴-1， 8-萘酰亚胺与2.54g碳酸钾置。

29、于100ml 单口瓶中， 加入30ml甲醇， 60-70反应过夜后， 冷却， 用1M的盐酸将pH调至酸性， 析出大量 黄色固体， 过滤， 大量水洗， 真空干燥得到黄色固体N-(4-羧基苯基)-4-甲氧基-1， 8-萘酰亚 胺， 产率60-70。 0059 制备的产物的核磁共振波谱具体如下： 0060 1H NMR(400MHz,DMSO) 13.05(s,1H),8.62(d,J7.9Hz,1H),8.51(dd,J12.4, 7.5Hz,2H),8.128.03(m,2H),7.87(t,J7.9Hz,1H),7.52(d,J8.3Hz,2H),7.38(d,J 8.4Hz,1H),4.16。

30、(s,3H). 0061 实施例4 0062 体外测定人重组CYP单酶的选择性 0063 (1)预先准备90 l CYP代谢反应体系， 包括pH 7.4的PBS缓冲液(100mM)、 重组人 CYP各单酶(0.75nm/ml)， N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺终浓度为10 M， 于37条 件下震荡预孵3分钟； 0064 (2)向反应体系中加入10 l浓度为10mM的NADP+起始反应； 0065 (3)40分钟后， 加入50 l冰乙腈， 剧烈震荡后， 终止反应； 0066 (4)用高速冷冻离心机在4， 20,000g的条件下， 高速离心20分钟后， 取上清， 进 行荧光检测(。

31、Ex372nm， Em450nm)； 重组人CYP1A(1A1和1A2)酶的选择性最高约是其它单 酶的10倍左右(图6)。 0067 实施例5 0068 不同个体来源肝微粒体中CYP1A2的活性定量评估 0069 (1)选取14例人肝微粒体(HLM)稀释至2.5mg/ml， 准备CYP1A代谢反应体系， 包括pH 7.4的PBS缓冲液(100mM)、 人肝微粒体(0.25mg/ml)、 NADP+10mM， 6-磷酸葡萄糖100mM， 葡萄 糖-6-磷酸脱氢酶1unit/ml， MgCl2 40mM， N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺终浓度为 10 M， 于37条件下震荡预孵3。

32、分钟； 0070 (2)向反应体系中加入10 l浓度为10mM的NADP+起始反应； 0071 (3)30分钟后， 加入10 l冰乙腈， 剧烈震荡后， 终止反应； 0072 (4)用高速冷冻离心机在4， 20,000g的条件下， 高速离心20分钟后， 取上清， 进 行荧光检测(Ex372nm， Em450nm)， 将所获荧光强度代入标准曲线后得到14例人肝微粒 体(HLM)对N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺的代谢速率(图4)。 0073 实施例6 0074 体外测定CYP1A的检测下限测定 说明书 5/6 页 7 CN 105219374 B 7 0075 实验在酶标仪上使用9。

33、6孔板进行测定， N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺10 M， NADP+10mM， 6-磷酸葡萄糖100mM， 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1unit/ml， MgCl240mM， CYP1A2单 酶0.1nM/ml2nM/ml， pH 7.4的PBS缓冲液50mM， 总体积为100 L， 37下孵育1h后通过酶标 仪分析， 每组的平均值与不加CYP1A的对照组比较， 结果表明0.2nM/ml的CYP1A具有统计学 意义(P0.05)， 因此确定CYP1A的检测下限为0.2nM/ml。 0076 实施例7 0077 CYP1A时间标准曲线测定 0078 实验在酶标仪上使用96孔板进行。

34、测定， N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺10 M， NADP+10mM， 6-磷酸葡萄糖100mM， 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1unit/ml， MgCl2 40mM， CYP1A2单 酶0.1nM/ml2nM/ml， pH 7.4的PBS缓冲液50mM， 总体积为100 L， 37下孵育60min， 每隔5 分钟酶标仪分析， 产物的荧光强度比底物的荧光强度的比值与孵育时间做标准曲线， 每条 标准曲线的R20.99， 表明标准曲线线性范围宽广， 可准确定量CYP1A的含量。 说明书 6/6 页 8 CN 105219374 B 8 图1 图2 说明书附图 1/4 页 9 CN 105219374 B 9 图3 图4 说明书附图 2/4 页 10 CN 105219374 B 10 图5 图6 说明书附图 3/4 页 11 CN 105219374 B 11 图7 图8 图9 说明书附图 4/4 页 12 CN 105219374 B 12 。