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本申请依据美国法典第35篇第119条要求2009年3月15日提交的美国临时 申请第61/160,335号的优先权权益，所述美国临时申请的全部公开内容都以引用 的方式并入本文。
发明背景
癌症是由许多肿瘤抑制基因的表达来主动地避免，这些肿瘤抑制基因调节细胞分裂 周期并介导细胞间相互作用。对良性和恶性肿瘤的研究已显示，癌症经过多步过程而发 展，在所述多步过程中，随机累积的改变增强原癌基因的表达或减少肿瘤抑制基因和 DNA修复基因的表达或功能。体细胞突变是肿瘤抑制基因和DNA修复基因的这些改变中 某些改变的原因。然而，已愈加表明的是，诸如DNA过度甲基化和甲基化不足的表观遗 传改变也经由肿瘤抑制基因或原癌基因的失活作用或增强作用而在癌症的发展中起着 巨大作用。CpG启动子岛的过度甲基化发生于癌症发展的早期，且事实上这已在所有肿 瘤中被发现，使得所述过度甲基化潜在地成为极其适用的诊断标记物，使癌症在治疗最 有效时的早期就被非侵入性地检测到。举例来说，已报道了在诊断出鳞状细胞肺癌之前 至多3年，在吸烟者的痰液中检测出诸如DAP激酶、p16和MGMT的基因启动子区的过 度甲基化(Belinsky等人，(2006).Cancer Res.66：3338-44，Palmisano等人， 2000.Cancer Res.60：5954-8)。同样地，一小组基因的过度甲基化可能是非小细胞肺 癌的有价值的早期检测指示物。一小组基因的过度甲基化是在乳癌早期被检测到，但在 正常或良性乳房组织中检测不到(Krassenstein等人，(2004).Clin Cancer Res. 10：28-32)。
CpG岛中胞嘧啶的甲基化是大多数癌症的早期事件，它导致包括肿瘤抑制基因的许 多基因的表达减少。对肿瘤细胞DNA中CpG岛甲基化的调查暗示，这种表观遗传改变通 常足以对抗肿瘤进程中的突变影响。异常甲基化的早期检测可引出正规筛查和早期诊 断，早期的治疗最为有效。通常可在血清或其他体液(尿液、痰液、唾液)中而并非仅 仅在肿瘤组织本身中检测到早期的表观遗传改变，这就意谓着可使用这些液体来非侵入 性地进行表观遗传诊断测试。基于CpG岛甲基化的诊断测试也可用于药物开发、鉴别对 这些药物有反应的患者群体以及治疗后的监测。
近来对甲基化检测的灵敏度的改进和对用于特定癌症的甲基化标志的阐明已使得 通过从体液提取DNA样本来分析肿瘤成为可行的。在疾病的相对早期，肿瘤细胞将DNA 释放到血液中。已发现癌症患者血液中的3％至90％以上的DNA具有肿瘤起源(Kim等人， (2004)J.Clin.Oncol.22：2363-70)。基于PCR的甲基化试验的开发已使得从血液、 痰液和尿液中非侵入性地检测肿瘤的存在成为可能。在一项研究中，甲基化检测在检测 异常癌变前细胞中比尿液细胞学检查更灵敏。使用单一甲基化标记物调查血液样品时， 临床灵敏度(所检测病例的确认比例)通常较低。然而，血液样品的临床特异性(测试 为阴性的正常对照物的比例)达到100％。临床灵敏度应随评定多于单个CpG岛的甲基 化测试而增加。
体液自身出现的异常甲基化的DNA并不有助于精确定位受肿瘤影响的器官。令人意 外地，几乎不需要信息来确立肿瘤的组织起源。许多甲基化筛查研究都具有已确立的甲 基化标志；与特定器官的癌症强烈相关的甲基化CpG岛的集合。在一项调查中，3至4 种候选CpG岛的异常甲基化足以识别出15种癌症类型中的70-90％(Esteller等人， (2001)Cancer Res.61：3225-9)。开发用于原发性肿瘤的甲基化谱分析(methylation profile)可被用于肿瘤细胞系以精确地识别原发性肿瘤的亲本肿瘤的组织起源 (Graziano等人，(2004)Clin.Cancer Res.10：2784)。这个结果暗示，不同肿瘤 类型的甲基化标志并不明显地受与培养物中的生长相关的选择性压力的影响。甲基化谱 分析的可用性将大大增强通过简单血液测试来检测难以接近的器官中的癌症的能力。
对临床样品中的甲基化的检测使得癌症的早期检测能够实现。简单且灵敏的多重检 测试验的开发将允许对临床的小样品进行谱分析而获得多个CpG岛的状态。这种信息在 诊断和治疗中很有价值。
用于检测DNA甲基化的方法
已使用许多方法来检测靶DNA中的甲基化CpG(mCpG)。下文详细描述目前使用的 三种主要方法。
亚硫酸氢盐方法.最常用的甲基化检测方法是基于DNA的亚硫酸氢盐修饰，这种修 饰引起胞嘧啶残基脱氨基成为尿嘧啶，同时保留甲基化胞嘧啶不被改变。PCR扩增之后， 将甲基化胞嘧啶复制到胞嘧啶并将尿嘧啶复制到胸腺嘧啶。因此，在特定位置处胞嘧啶 的保留指示了甲基化。随后，例如通过序列分析、甲基化特异性PCR(MSP)(Herman 等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：9821-26)或杂交(例如与微阵列或印 迹杂交)来分析所修饰的DNA。在MSP中，将一对甲基化的特异性寡核苷酸引物添加到 经亚硫酸氢盐处理的DNA，并且进行PCR以扩增靶DNA。还可以对经亚硫酸氢盐修饰的 DNA进行基于荧光的定量实时PCR(Eads等人，(2000)Nucl.Acids Res.28：E32； Zeschnigk等人，(2004)Nucl.Acids Res.32：e125)。
MSP的经校准的基于荧光的变化方法拓展了实时PCR以提供对样品中的甲基化DNA 数量的定量分析。这些基于PCR的方法的重要基本假设在于：几乎没有被引物/探针识 别的CpG位点会反映靶CpG岛的整体状态。虽然这个假设通常对大量甲基化或完全未甲 基化的岛来说属实，但是部分甲基化的靶可能不易在甲基化或未甲基化特异性反应中被 计分记录(scored)。
亚硫酸氢盐修饰的优点在于，它将甲基化位点相对于未甲基化位点进行差异性标 记，从而允许测序方法检测甲基化模式。克隆的经亚硫酸氢盐处理的DNA的测序是用于 甲基化检测最常用的方法。除比基于MSP的方法提取到更大数量的CpG位点之外，它还 提供了有关亚硫酸氢盐处理成功的信息。然而，由于它的复杂性和费用，亚硫酸氢盐测 序比临床诊断更好地适于标记物探索。亚硫酸氢盐处理破坏了大比例的输入DNA，造成 有限的灵敏度和对大量DNA的需求。在进行检测试验之前，经亚硫酸氢盐处理的DNA 的质量控制评定是必要的，从而避免误导的结果。由于亚硫酸氢盐处理期间不完全的胞 嘧啶脱氨基，基于MSP的试验可能存在假阳性结果。经亚硫酸氢盐处理的DNA的扩增受 偏好未甲基化的DNA的PCR偏向性的影响。虽然这个问题通常可通过最佳化引物退火条 件来校正，但是可能使引物设计和测试变复杂。可使用数字亚硫酸氢盐PCR消除模板偏 向性。将DNA样品稀释到每次反应小于一个拷贝的平均值，从而消除模板间的竞争。可 在没有由克隆引入的偏向性条件下将各个分子测序。
用于分析mCpG的使用亚硫酸氢盐处理的商业试剂盒、试剂和系统是可获得的。表 观遗传学(Berlin)提供了MethyLight试验的两种变化方法，是称为定量的MethyLight (QM)和Heavy Methyl(HM)的定量实时PCR的改编方法。QM利用探针来产 生荧光信号。在扩增过程中，荧光剂从探针切割，产生可被实时检测的荧光 (Wojdacz & Dobrovic(2007)Nucl.Acids Res.35：e41)。HM是QM的改编方法， 其中将阻断剂寡核苷酸添加到反应中。这些阻断剂寡核苷酸能防止未甲基化DNA的扩 增，产生增大的试验灵敏度(Cottrell等人，(2004)Nucl.Acids Res.32：e10)。 也用于对经亚硫酸氢盐修饰的DNA的甲基化定量分析，如来自Biotage 的Pyro Q-CpG系统所例证(Uppsala，Sweden；Tost等人，(2003)Biotechniques 35：152-56)。
虽然亚硫酸氢盐修饰被广泛使用，但是其所引起的广泛DNA降解可在几乎没有分子 足够长而得以扩增时引入取样误差(Ehrich等人，(2007)Nucl.Acids Res.35：e29)。 此外，试验是耗时的，需要苛刻的碱基变性步骤并由于亚硫酸氢盐处理期间不完全的胞 嘧啶脱氨基而使假阳性结果的概率高。
甲基化灵敏性的限制性内切酶消化方法.用于检测DNA中的mCpG的第二类型的方 法依赖于通过限制性内切核酸酶的差异性切割。用MSRE(甲基化灵敏性限制性内切核 酸酶)或MDRE(甲基化依赖性限制性内切核酸酶)处理DNA，扩增并随后通过微阵列或 凝胶电泳进行分析。诸如HpaII和AciI的MSRE只是在它未甲基化时才切割DNA序列。 MDRE是为达切割而需要DNA序列甲基化的限制性内切核酸酶。通过用这些酶中的任一 酶来处理DNA样品并随后与对照样品相比较，可确定DNA样品的甲基化状态。如果特定 DNA样品的消化发生在用MDRE处理之后，那么可假设DNA被甲基化。相反地，如果DNA 在用MSRE处理时未经切割，那么可假设样品被甲基化。通过比较经切割DNA相对未经 切割DNA的数量，可估算出甲基化的水平。这种类型的甲基化分析的常见读出是所消化 的DNA的后续扩增和荧光标记。随后，可将片段与微阵列文库杂交并通过电泳来分析或 简单地解析。
市售的基于限制性内切核酸酶的系统包括Orion的利用微阵列读出的MethylScope (Lippman等人，(2004)Nature 430：471-76)和使用定量实时PCR的MethyScreen (Ordway等人，(2006)Carcinogenesis 27：2409-23)。
MSRE/MDRE消化的优点在于不必预处理DNA，尽管在称为COBRA的程序中所述预处 理经常连同DNA的亚硫酸氢盐处理一起进行(Xiong & Laird(1997)Nucl.Acids Res. 25：2532-34)。这个程序的一些缺点在于，它冗长且取决于靶DNA内部的MSRE/MDRE 识别序列的存在。此外，这种方法相对低效，从而可降低结果的可靠性。仅所评定的 CpG位点是处于少量限制性内切酶识别位点内部的那些CpG位点，且那些位点的状态可 能并不反映所述位点所属的整个CpG岛的状态。不完全消化导致频繁的假阳性，尤其在 裂解反应物会经历后续的扩增步骤时如此。与诸如MSP的亚硫酸氢盐方法相比，限制性 内切核酸酶的酶解试验的灵敏度较差，允许检测样品中不少于10％的甲基化DNA (Singer-Sam等人，Nucleic Acids Res，1990.18：687；Yegnasubramanian等人，Nucleic Acids Res.(2006)34：e19)。
染色质免疫沉淀方法.常用于检测mCpG的第三种方法是染色质免疫沉淀法 (ChIP)。通常，将细胞固定，并随后通过使用对甲基结合蛋白特异性的抗体而使甲基 化的DNA免疫沉淀。将所得DNA扩增、标记并通过在微阵列试验中的杂交来分析。这种 方法的优点在于，可对活细胞进行试验而几乎无需或无需DNA纯化。该试验也具有增大 的灵敏度，因为在分析之前除去了不需要的污染DNA。然而，ChIP程序是极其耗时的， 涉及若干步骤并需要昂贵的试剂。一些试验可能耗费长达5天来完成。
使用甲基结合蛋白的方法.将甲基化的DNA与未甲基化的DNA分离的替代的更灵敏 的方法涉及使用甲基-CpG结合域(MBD)蛋白或抗5-甲基-C的抗体。MBD蛋白对甲基化 的CpG位点具有高的亲和力而对未甲基化的DNA具有极低亲和力(Fraga等人，Nucleic Acids Res.(2003)31：1765-74)。将样品与固定化的MBD蛋白以各种格式(磁珠、柱、 PCR管壁)一起孵育。甲基化的DNA俘获通常后接所俘获DNA的扩增。基于MBD的DNA 检测具有的主要优点在于，所有甲基化位点都可有助于结合，从而允许对整个岛取样以 用于甲基-CpGs。这种特征使结合试验在部分甲基化岛中的未甲基化位点对应于引发位 点/探针位点时，不易倾向于影响基于MSP和基于限制性内切核酸酶的试验的假阴性 (Yegnasubramanian等人，Nucleic Acids Res.(2006)34：e19)。这种情况可能常 见于含有早期肿瘤细胞的临床样品中，所述肿瘤细胞含有部分甲基化CpG岛。基于MBD 的结合试验极为敏感，允许检测500个未甲基化分子中的少到160pg的甲基化DNA(相 当于约25个细胞)或1个甲基化分子(Gebhard等人，Nucleic Acids Res.(2006) 34：e8256)。这接近MSP的灵敏度(1个甲基化分子/1,000未甲基化分子)。COMPARE MBD 试验因在结合步骤之前包括了用HpaII(一种MSRE)的消化而可与实时MSP一样灵敏(1 个甲基化分子/10,000未甲基化分子)。未甲基化的DNA在PCR引发位点之间的位置处 的裂解产生了高灵敏度与DNA混合物，所述DNA混合物含有完全甲基化的人工甲基化 DNA(Yegnasubramanian等人，Nucleic Acids Res.(2006)34：e19)。然而，这个策 略可遭受与使用限制内切核酸酶相关的缺点，因为临床样品中的一些部分甲基化岛会被 计为未甲基化的(Yegnasubramanian等人，同上)。
考虑到CpG甲基化在癌症发展和进程中的重要性，用于甲基化CpG DNA的快速、可 靠和灵敏的测试将为癌症筛查提供重要和适用的工具。
发明概述
本发明提供用于检测样品中的靶多核苷酸的方法。所述方法通常涉及，使含有靶多 核苷酸的样品与引物对接触，所述引物对与所述多核苷酸的靶序列特异性地杂交并将所 述靶序列扩增。对这个步骤来说，引物对包括具有与侧接所述靶多核苷酸序列的第一序 列互补的3′序列和5′俘获标签(capture tag)的第一引物。所述对的第二引物具有在 相反链上与侧接所述多核苷酸靶序列的第二序列互补的3′序列和提供用于指导流产转 录(Abscription)的构件(means)的5′序列。在使用这种引物对的扩增(例如PCR) 之后，使扩增的靶序列与结合5′俘获标签的固定化分子接触，以俘获所扩增的靶序列。 随后，由用于指导流产转录的构件转录至少一个Abscript，并将所述Abscript作为靶 多核苷酸存在的检测指示。
俘获通常是经由亲和力试剂或与或能够与固体支持物结合的结合对来进行。举例来 说，5′俘获标签可为可容易掺入到寡核苷酸引物中的生物素，并且与5′俘获标签结合 的分子可为固定在固体支持物上的链霉亲和素(streptavidin)。诸如珠、管和微量滴 定板的多种固体支持物均适用于本发明的方法。适宜地，链霉亲和素和其他结合对分子 可与磁珠结合，从而允许固相与呈溶液的未结合试剂的快速分离。在本发明的某些实施 方案中，可在程序的后续步骤之前，将未结合试剂、引物和多核苷酸从固定和俘获的多 核苷酸中洗涤，从而可以提高方法的效率。然而，这并非必要的，因为整个方法可在单 个罐或管中进行而无需分离步骤。
使用例如热稳定DNA聚合酶或热稳定RNA聚合酶的PCR是通常用于扩增步骤。然而， 本领域中已知的各种靶扩增方法可适用于本发明的方法。
用于检测如本文所述的Abscript的各种方法均可利用，包括但不限于质谱分析法、 毛细管电泳或薄层色谱法。在某些方面中，可将可检测的经标记核苷酸或其他标记掺入 到由本发明的方法产生的Abscript信号中，以增大灵敏度或扩展可使用的检测技术。 例如，可检测的经标记核苷酸可为荧光核苷酸。
由本发明产生的Abscript通常较短，例如长度为3-20个核苷酸。长度少到3个核 苷酸的Abscript通常用于本文所述的方法。
在扩增期间使用的所述对的第二引物具有在相反链上与侧接所述多核苷酸靶序列 的第二序列互补的3′序列和提供用于指导流产转录的构件的5′序列。
在某些实施方案中，所述构件是由用于标记或识别靶的α-TAP(靶连接探针， Target Attachment Probe)序列来提供。α-TAP被设计成与TAP序列互补，并允许连 接APC(流产启动子盒，Abortive Promoter Cassette)。为将α-TAP维持为单链，进 而可用于与TAP序列杂交，可在5′α-TAP序列与3′序列之间包括非天然核苷酸，所 述3′序列与侧接引物中靶的序列互补。诸如亚乙烯基-脱氧腺苷的非天然核苷酸在扩增 期间不会被聚合酶识别。因此，引物中非天然核苷酸下游的序列不被复制，并且那些序 列仍为单链。
一旦APC经由所形成的TAP-α-TAP杂交体与扩增的靶结合，就由APC转录作为检 测靶存在的指示物或信号的Abscript。所结合的APC为双链区或因探针的杂交变成双 链。
在本发明的某些实施方案中，全双链体APC可在扩增反应期间由包括一个APC链的 引物序列产生。适宜地，可在扩增期间，通过在反应中包括热稳定RNA聚合酶和核苷酸 来进行流产转录。因此，在这些实施方案中，用于扩增反应的第二引物包括APC序列。 由于产生(例如通过PCR产生)双链体APC，所以从APC来转录Abscript，并可在Abscript 产生时来检测它们(例如实时检测)，或通过本文所述的Abscript检测方法在稍后的 时间进行分析。
本发明提供用于检测各种各样目标靶多核苷酸(包括DNA靶和RNA靶)的快速、灵 敏和特异的方法，并与PCR相比提供扩展全面能力的检测技术。与PCR不同，该方法也 适于检测诸如甲基化DNA靶的被修饰的多核苷酸靶。根据这类方法，首先通过切割含有 甲基化靶多核苷酸(诸如CpG岛)的基因组DNA样品来分离甲基化的基因组DNA片段， 同时限制性内切酶在切割期间不切割靶多核苷酸或产生靶的合适代表性片段。随后，使 经切割的基因组DNA与诸如本文所述的GST-MBD2融合蛋白的固定化甲基结合域接触。 这样，甲基化的基因组DNA片段被固定，且因此与样品中的非甲基化的DNA片段分离。 任选地，甲基化的基因组DNA片段可从固定化的MBD中洗脱并在分析之前回收。例如， 在GST-MBD2融合蛋白用于固定甲基化CpG岛靶的情况下，可将融合蛋白的GST部分与 谷胱甘肽树脂(在与DNA相互作用之前或之后)结合，并可用谷胱甘肽洗脱所结合的甲 基化DNA片段。
本发明的方法也适于多次复用。根据本发明的某些实施方案，通过在反应中包括多 个第一和第二引物对来同时处理多种不同的靶多核苷酸，各引物对被设计成与不同的靶 多核苷酸特异性地杂交。通过设计用于各种靶的不同的独特APC，可由所产生的APC信 号来识别多种靶的各种靶的存在，所述不同的独特APC是经由引物扩增(作为含有APC 的引物的组成部分或如本文所述经由TAP-α-TAP杂交体)与靶连接。例如，各APC可 根据分子量或核苷酸序列来设计以便可以区分。根据本发明的这些实施方案，可在单一 试验中检测到至少5、10、20、50、100个或更多的靶。
附图简述
图1示出流产转录(abortive transcription)的过程，本发明的方法拓展了此方法。当RNA聚合酶(RNAP)在启动子处俘获时，流产转录发生于大多数 启动子上，重复制得短的流产转录物(abortive transcript)(通常长2至12个nt)。 在流产转录期间，RNAP不会移位或离开启动子。在正常转录期间，RNAP最后经历构象 变化成为稳定的逐渐延伸的复合物(一种称为启动子逃离的过程)，随后持续转录直到 到达终止信号。已开发出人工启动子或流产启动子盒(APC)，它们俘获流产复合物中 的RNAP，每分钟反复合成出数千个相同的短寡核苷酸。各APC被设计成制造可分离和 定量的具有特定长度和特异序列的不同Abscript。
图2示出了使用检测蛋白质、RNA和DNA靶。将APC连接于特异性地 与分子靶结合的靶连接探针(TAP)(图2A)。对DNA和RNA的检测来说，TAP包括特 异性地与核酸靶杂交的寡核苷酸或特异性地与核酸靶结合的蛋白质(图2B)。对蛋白 质检测来说，APC可连接到与蛋白质靶结合的任何分子，诸如抗体或配体。图2C示出 本发明的一个实施方案，其中APC与抗体连接。与用于酶联免疫吸附试验(ELISA)的 策略相似，可将靶蛋白质“夹在”APC-抗体复合物与固定在固体支持物上的第二抗体之 间，以便俘获和检测蛋白质靶。
图3示出的二核苷酸起始以及添加一个NTP之后的终止。可通过包 括如所描绘的链终止NTP(R3处的3′-O-Me-NTP)或通过从反应中省略一个或多个NTP 来限制Abscript长度。R1＝亲和力标签，荧光标签；R2＝OH、OMe、H；R3＝OH、 OMe、H；R4＝OH、OMe、H。
图4A和图4B示出了通过质谱分析法检测Abscript。通过反相HPLC来分级分离包 括起始子GpA和GTP的反应。将柱的输出引入质谱仪中。图4A显示了基 于总离子计数与保留时间的函数变化的柱谱分析。图4B显示三核苷酸Abscript GAG 峰的离子光谱(保留时间5.4分钟)。单电荷和双电荷GAG物质的m/z值分别为956.1 和477.6。双电荷物质的钠加合物的m/z值为978.2。
图5是用于本发明的甲基化检测方法的GST-MBD蛋白的结构示意图。图5A显示MBD 域与GST域羧基末端的连接。连接所述域的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)含有由箭头指 示的凝血酶切割位点。图5B显示用于小鼠MBD2b的DNA结合域的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。划线的氨基酸对应于MBD蛋白的DNA结合域中的保守残基(Ohki等人，(1999) EMBO J.18：6653-61)。图5C显示使用固定化GST-MBD的甲基化DNA分级分离的结果。 S(上清液)分级分离物含有扩增的未甲基化的SNRPN CpG岛DNA。E1含有从固定蛋 白质洗脱的扩增的甲基化SNRPN CpG岛DNA。分级分离物E2和E3是来自 同一固定蛋白质的另外两个系列的洗脱液。图5D显示Hela细胞中的未甲基化 的PTGS2 DNA的分级分离。在未结合的上清液分级分离物S中回收到所有PTGS2 DNA。
图6是流程图，示出用于基于α-TAP的CpG甲基化检测的策略，包 括TAP-APC与靶CpG岛的扩增片段的结合。通过数字指示方法中的步骤。图6A示出含 有甲基化CpG的DNA的初始俘获。步骤1：用固定化GST-MBD蛋白使甲基化的DNA片段 与未甲基化的DNA片段分离。步骤2：通过热处理或对蛋白酶或谷胱甘肽的暴露释放甲 基化的DNA片段。图6B显示扩增标签和所标记DNA片段的俘获。步骤3：用亲和力标 记(诸如所示的生物素(B))来标记靶CpG岛，并且在PCR期间，经由掺入生物素化 引物和在引物序列与反TAP序列(α-TAP)之间含有非编码核苷酸的引物进行单链延伸。 步骤4：使生物素化扩增子与链霉亲和素磁珠结合。步骤5：通过TAP序列与α-TAP序 列之间的杂交将APC与扩增子结合。是通过使RNA聚合酶(RNAP)与含有 APC的珠粒固定复合物接触来进行。
图7A-7C示出示例性靶特异性扩增引物与反TAP(α-TAP)引物/探针之间的相互 作用。图7A示出用于CpG岛扩增的PCR引物和它们在扩增子中的相对位置。图7B和图 7C示出因设计较差的α-TAP引物/探针的不利试验结果。
图8显示出PCR相对图6中描绘的方法的DNA检测相 对灵敏度。从起始拷贝数/PCR为9000到30开始扩增来自未分级分离的甲基化HeLa DNA 的GSTP1 CpG岛的片段。图8A显示结果。引物是SEQ ID NO： 3和SEQ ID NO：4。检测9000个拷贝需要28次PCR循环。图8B显示29次PCR循环后 的检测结果。流产转录/PCR引物是SEQ ID NO：12和SEQ ID NO： 13。TAP-APC是通过退火SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：32来制得。APC编码Abscript GAG。 使用薄层色谱法(TLC)和UV造阴影法检测Abscript。面积指的是含有Abscript的色 谱峰的面积。
图9显示了对指定数量的输入DNA进行PCR扩增，接着进行2小时和8小时的 之后，使用TLC的CY5标记Abscript检测。
图10是流程图，显示在使用APC-引物的情况下，使用APC向扩增子中的直接掺入 时的用于甲基化DNA检测的策略。数字指示策略中的步骤。步骤1和2描绘使用如图 6A所示的固定化GST-MBD蛋白的甲基化DNA的分级分离。步骤3显示中靶序列与用于 将APC连接到扩增子的引物之间的关系。左侧的引物是常规PCR引物。右侧引物具有 3′引发序列和5′末端处的单链APC。步骤4和5表示靶标的PCR扩增。步骤6表示PCR 之后的步骤。PCR反应物补充有RNA聚合酶、起始子和一种或多种NTP。
图11示出用于GAPDH CpG岛的APC启动子对的证实。图11A显示了对归结于因APC 引物C443的自引发的背景信号和归结于C443(SEQ ID NO：33)与反向引物C446(SEQ ID NO：34)之间的引物-二聚体的形成的背景的评估。在56.4℃至68.5℃的退火温度范围 内进行了缺乏仅含有C443或含有C443和C446的组合的DNA的PCR反应，接着进行1 小时的通过TLC-UV造阴影法分析Abscript的产生。只有含有HeLa DNA 的阳性对照才产生Abscript GAG。图11B显示来自同一样品组的Abscript的LC-MS检 测结果。
发明详述
定义
应理解，上文一般描述和下文详细描述仅仅是示例性和解释性的，并非限制所要求 保护的本发明。如本文所使用，除非另外特别地说明，否则单数的使用包括复数。如本 文所使用，除非另外说明，否则“或”意思是“和/或”。如本文所使用，术语“包含” 和“包括”或其任何其他的变化形式都欲涵盖非排他性的包括，以使得包括要素清单的 方法、组合物、反应混合物、试剂盒或装置并不只是包括那些要素本身，而可以包括未 明确列出的或此种方法、组合物、反应混合物、试剂盒或装置固有的其他要素。本文使 用的章节标题仅出于编写目的，并不应解释为对所描述标的物的限制。
除非提供特定的定义，否则关联使用的命名法和本文所述的分子生物学、生物化学 和有机化学的实验程序和技术是本领域中已知的命名法和实验程序和技术。标准的化学 和生物学符号和缩写可与由这类符号和缩写表示的全名互换使用。因此，例如，术语“脱 氧核糖核酸”和“DNA”应理解为具有相同的含义。标准技术可用于例如化学合成、化 学分析、重组DNA方法和寡核苷酸合成。反应和纯化技术可例如使用试剂盒，根据制造 商的说明书、按本领域中通常所完成或如本文所述来实施。通常，可根据本领域中熟知 的常规方法和如遍及本说明书所引用和论述的各种一般的或更特定的参考文献中所述 的来实施前述技术和程序。参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y. (1989))；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons Inc.，N.Y.(2003))，其中的内容可因任何目的而以引用的方式全部并入本文中。
如本文所使用的“约”意思是被称为“约”的数字包含所述的数字加上或减去所述 数字的1-10％。例如，“约”50个核苷酸可意谓着45-55个核苷酸或视情况而定少达 49-51个核苷酸。无论何时在本文中出现时，数值范围(诸如“45-55”)指的是给定 范围内的各个整数；例如，“45-55个核苷酸”意思是核酸可含有45个核苷酸、46个 核苷酸，依此类推，直到并包括55个核苷酸。
如本文所使用的“转录”指的是通过RNA聚合酶(例如依赖DNA的RNA聚合酶)催 化的一条DNA链(即模板)的RNA拷贝的酶促合成。
“流产转录(abortive transcription)”是RNA聚合酶介导的过程，其反复合成 寡核苷酸和终止寡核苷酸的合成，所述寡核苷酸对应于互补核酸模板序列的至少一部 分。活体内合成的流产寡核苷酸在核苷酸长度上不同，并且与转录起始位点处或其附近 的序列互补。
是经最佳化用于活体外分析用途的一种流产转录形式，用以在活 体外以高频率从合成或天然存在的启动子序列反复产生短的均一RNA转录物或“流产转 录物(abscript)”。本文使用术语“Abscript”(首字母大写)来将反应或试验中产生的最佳化合成转录物与更一般的术语“流产转录物”相区别，所述更 一般的术语“流产转录物”也涵盖在与天然发生的转录一样的正常转录过程期间产生的 短的流产转录物。
“反复”指的是重复合成目标序列的多个相同或大体上相同的拷贝。
如本文所使用的“终止子”或“转录终止子”指的是使化合物、复合物或方法终止 的RNA链。本发明的终止子可例如为核苷酸类似物，其可在RNA合成期间掺入到RNA 链中，以防止额外的核苷酸添加到RNA链上。
如本文所使用的“扩增”指的是制造多核苷酸(诸如DNA片段或区域)的相同拷贝 的过程。扩增通常是通过聚合酶链式反应(PCR)来完成，但本领域中已知的其他方法 可适于扩增本发明的DNA片段。
“靶DNA序列”或“靶DNA”是需要进行检测、表征或定量分析的目标DNA序列。 靶DNA的实际核苷酸序列可为已知的或未知的。靶DNA通常是对其查询CpG甲基化状态 的DNA。“靶DNA片段”是含有靶DNA序列的DNA的区段。可通过包括例如剪切或超声 处理的任何方法来产生靶DNA片段，但其最通常是通过用一种或多种限制性内切核酸酶 消化来产生。
如本文所使用，“模板”是由其合成互补寡核苷酸或多核苷酸拷贝的多核苷酸。
“合成”通常指的是经由化学或酶促手段产生核酸的过程。化学合成通常是用于产 生可使用的核酸的单链和引物和探针。酶介导的“合成”涵盖从模板的转录和复制。合 成包括制造靶的单拷贝或多拷贝。“多拷贝”意思是至少2个拷贝。“拷贝”并不必意 谓与模板序列的理想的序列互补性或一致性。举例来说，拷贝可包括核苷酸类似物、在 合成期间发生的有意序列改变(诸如，经由包含可与模板杂交而不与模板互补的序列的 引物引入的序列改变)和/或序列误差。
术语“多核苷酸”和“核酸(分子)”可互换使用来指具有任何长度的核苷酸的多 聚体形式。多核苷酸可含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物。核苷酸 可被修饰或未被修饰，并具有任何三维结构，且可执行已知或未知的任何功能。术语“多 核苷酸”包括单链、双链和三链螺旋分子。下面是多核苷酸的非限制性实施方案：基因 或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支 多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。
“寡核苷酸”指的是具有介于2与约100个核苷酸的单链或双链核酸(通常为DNA) 的多核苷酸。寡核苷酸又称为寡聚物或寡聚体(oligo)，并可从基因和其他生物材料 分离或通过本领域中已知的方法化学合成。“引物”指的是通常为单链的含有至少6 个核苷酸的寡核苷酸，其提供用于启动酶介导的核酸合成的3′-羟基末端。“多核苷酸 探针”或“探针”是与互补多核苷酸序列特异性地杂交的多核苷酸。如本文所使用，“特 异性地结合”或“特异性地杂交”指的是一个分子与另一个分子在给定条件下的结合、 形成双链体或杂交。因此，探针或引物仅在给定结合条件下与它的预期靶多核苷酸“特 异性地杂交”，并且抗体仅在给定结合条件下与它的预期靶抗原“特异性地结合”。给 定条件是被指示用于结合或杂交的那些条件，且包括完全在本领域技术人员学识范围内 的缓冲液、离子强度、温度和其他因素。本领域技术人员也可学习获得有关破坏或解离 特异性结合，因而洗脱或熔融例如抗体-抗原、受体-配体和引物-靶多核苷酸组合的条 件。
“核酸序列”指的是具有寡核苷酸或多核苷酸(诸如DNA或RNA)中的核苷酸碱基 的序列。对双链分子来说，单链可用以表示两个链，互补链通过Watson-Crick碱基配 对来推定。
术语“互补的”或“互补性”是用于指第一多核苷酸(可为寡核苷酸)，其与第二 多核苷酸(也可为寡核苷酸)呈“反平行缔合(antiparallel association)”。如本 文所使用，术语“反平行缔合”指的是对准两个多核苷酸以使得两个缔合的多核苷酸的 个体核苷酸或碱基大体上按照Watson-Crick碱基配对法则来配对。互补性可能是“部 分的”，其中多核苷酸仅有一些碱基是根据碱基配对法则而匹配。或者，多核苷酸之间 可能有“完全”或“整体”的互补性。核酸技术领域的技术人员可通过考量许多变量而 经验性地确定双链体稳定性，所述变量包括例如可为寡核苷酸的第一多核苷酸的长度、 第一多核苷酸的碱基组成和序列，以及离子强度和错配碱基对的发生率。
如本文所使用，术语“杂交”用于指包括含有6个或更多核苷酸的多核苷酸和寡核 苷酸的互补核酸的碱基配对。杂交和杂交强度(即，核酸之间缔合的强度)受到诸如以 下的因素影响：核酸之间的互补程度、所涉及反应条件的严格性、所形成杂交物的解链 温度(Tm)以及双链体核酸内的G∶C比率。通常，“杂交”方法涉及将互补多核苷酸退 火至靶核酸(即，欲通过直接或间接手段检测的序列)。含有互补序列的两个多核苷酸 和/或寡核苷酸经由碱基配对相互作用而彼此定位并彼此退火的能力是已完全公认的现 象。
“复合物”是组分的组装体。复合物可能是或可能不是稳定的并可直接地或间接地 被检测。举例来说，如本文所述，给定反应的某些组分和反应的产物类型时，可推定复 合物的存在。举例来说，在本文所述的流产转录方法中，就最终的反复合成产物，诸如 最终的流产转录或复制产物而言，复合物通常是中间物。
“甲基化”指的是向分子、通常是向DNA或RNA中的核苷酸碱基中添加甲基(-CH3)。 “mCpG”指的是5′-CG-3′二核苷酸，其中位置5(5-甲基胞嘧啶或5-Me C)处的C被 甲基化。“CpG岛”是含有高频率的CpG二核苷酸的基因组区。CpG岛存在于哺乳动物 基因的40％或接近40％的启动子中，并且人类启动子的约70％具有高CpG含量。参见例 如Fatemi等人，(2005)Nucleic Acids Res.33：e176.doi：10.1093/nar/gni180.PMID 16314307。
如本文所使用的“启动子”指的是促进邻近基因的转录的DNA区。启动子通常是基 因中转录起始的开始位点的5′和其近端，并指导RNA聚合酶和相关联的转录因子到基 因转录的正确位置。
“微阵列”和“阵列”可互换使用来指化合物、样品或分子(诸如寡核苷酸或多核 苷酸)的集合的布置。阵列通常“可寻址”以使得集合的各个成员在布置的内部具有独 特的可识别的位置。阵列可形成在诸如载玻片的固体基底上，或诸如硝化纤维素膜的半 固体基底上，或诸如管或微量滴定板孔的容器中。阵列的典型布置是诸如使用微量滴定 板时的8行乘12列构造，然而适用于本发明的方法的其他布置完全在本领域技术人员 的学识范围内。
术语“固体支持物”指的是可用于固定的任何固相，例如俘获探针或其他寡核苷酸 或多核苷酸、多肽、抗体或其他所需的分子或复合物。合适的固体支持物是本领域中熟 知的且包括但不限于反应托盘(诸如微量滴定板)的孔壁、试管壁、聚苯乙烯珠、顺磁 性珠或非磁性珠、载玻片、硝化纤维素膜、尼龙薄膜和微颗粒(诸如乳胶颗粒)。用于 固体支持物的典型材料包括但不限于聚氯乙烯(PVC)、聚苯乙烯、纤维素、琼脂糖、 右旋糖苷、玻璃、尼龙、乳胶及其衍生物。另外，固体支持物可被涂覆、衍生化或另外 改性以促进所需分子的粘着力，和/或阻止非特异性结合或其他不需要的相互作用。特 定“固相”的选择通常不是关键的，而可由本领域技术人员根据所使用的方法和试验来 选择。适宜地，可选择固体支持物来适应各种检测方法。举例来说，96或384孔板可 用于(例如)通过机器人工作站自动进行的试验，和/或使用(例如)读板器来检测的 那些试验。对可涉及例如利用基于薄膜的显现方法的自动射线照相检测步骤的本发明方 法来说，固体支持物可为薄膜，诸如硝化纤维素或尼龙薄膜；凝胶或薄层色谱板。用于 将分子固定在固相上的合适方法包括离子、疏水性、共价相互作用及类似作用和其组合。 然而，固定方法通常不是重要的，而可能涉及尚未表征的吸附机理。如本文所使用的“固 体支持物”可因此涉及不溶解或可通过后续反应而变得不溶解的任何材料。可根据吸引 和固定俘获试剂的固有能力来选择固体支持物。或者，固体支持物可保留具有吸引和固 定例如“俘获”试剂的能力的额外分子。
如本文所使用的“抗体”包括：天然存在的物质，诸如多克隆抗体和单克隆抗体， 以及天然存在的分子的任何抗原结合部分、片段或亚基，诸如抗体的Fab、Fab′和F(ab)2等片段。还被涵盖用于本发明的方法的是重组抗体、截短抗体、单链抗体、嵌合抗体和 杂合抗体，包括但不限于人源化抗体和灵长类动物化抗体，和其他非天然存在的抗体形 式。
本发明是基于称为的分子检测技术，而是基于称为流 产转录的自然现象(图1)。是用于检测和定量包括蛋白质、核酸、SNP 和CpG甲基化的广泛范围靶的稳健等温方法(美国专利申请第10/602,045号、第 10/790,766号以及第10/488,971号；美国专利第7,045,319号和第7,226,738号)。 发生在转录的起始阶段期间，这个阶段中，RNA聚合酶(RNAP)反复产生 短的RNA或流产的转录物(Abscript)，同时仍与启动子紧紧地结合(Hsu，Biochim. Biophys.Acta(2002)1577：191-207；Hsu等人，Biochemistry(2003)42：3777-86； Vo等人，Biochemistry(2003)42：3798-811；Vo等人，Biochemistry(2003) 42：3787-97；Hsu等人，Biochemistry(2006)45：8841-54)。启动子和最初所转录区 段的序列对优势Abscript的长度以及它们的合成速率具有显著效应(Hsu等人， Biochemistry(2006)45：8841-54.28)。称为流产启动子盒(APC)的多个最佳高度流 产启动子已被开发和最佳化来以极高速率制得具有不同序列和长度(介于3与12个nt 之间)的Abscript。
短的Abscript的产生是极为高效的，因为RNAP并不会像它在产生各个全长转录物 之后那样在各轮次的截短RNA合成之间从启动子上解离，从而持续以高的周转速率产生 Abscript直到底物耗尽为止。这会引起每分钟每APC数千个Abscript的极为快速的产 生。是信号扩增方法，而不是靶扩增方法。
本发明提供由包括最佳化甲基结合域(MBD)多肽的mCpG靶位点探针检测DNA中的 CpG甲基化的简单灵敏方法。mCpG靶位点探针可直接或间接与信号产生器偶联，所述信 号产生器产生可作为CpG甲基化指示物来测量的可检测信号。
在本发明的某些实施方案中，信号产生是基于流产启动子盒(APC)信号产生器经 由mCpG靶特异性探针与靶mCpG位点结合的方法。RNA聚合酶从APC中的 合成或天然存在的流产启动子产生均一、短的RNA分子，以作为甲基化CpG存在的信号 (指示物)。在本发明的其他实施方案中，信号产生盒可经由PCR或其他复制和/或扩 增方法来产生可检测的RNA或DNA信号。
因为不需要亚硫酸氢盐处理，所以本发明的方法提供了超过当前CpG甲基化检测方 法的显著优点。因此，在本发明的某些实施方案中，可完全避免与靶DNA的化学处理相 关的广泛的DNA降解和序列复杂性的降低。本发明的方法是快速的并通常可在一天之内 完成。此外，本发明可适于多重和自动化应用。
本发明的某些基于的甲基化检测试验提供将线性稳健的信号扩增方 法与靶扩增方法(例如聚合酶链式反应或PCR)结合的独特能力。这 样提供了极高的灵敏度并允许测试仅使用少量的起始物料。另外，与诸如从样品的各个 靶产生相同信号分子的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的其他信号扩增方法不同，基于 的扩增可被格式化以从各个靶产生不同的信号。随后，可通过各种方法来 检测呈短寡核苷酸形式的这些信号。基于的试验需要的人工作时比其他 DNA甲基化检测试验更少，试剂成本极有竞争力并且仪器装备成本低。另外，这些试验 通过包括阳性对照和阴性对照模板来产生高度特异性的检测和比用于靶检测的其他方 法更少的假阳性。
技术
技术是基于以下观察结果：在启动全长RNA的转录之前，通过RNA 聚合酶在制得全长RNA转录物之前合成流产转录物。如下文所述，流产转录物是转录过 程的正常副产物，也可与全长RNA转录物(是转录过程的功能性信息产物)在大小和制 造它们的方式上予以区分。
转录过程.转录是真核生物和原核生物从DNA模板(即基因)选择性合成RNA转录 物时所利用的复杂和高度受控的过程(综述参见Record等人，(1996)Escherichia coli and Salmonella，(Neidhart编；ASM Press，Washington，DC)；deHaseth等 人，(1998)J.Bact.180：3019-25；Hsu(2002)Biochim.Biophys.Acta. 1577：191-207；Murakami & Darst(2003)Curr.Opin.Struct.Biol.13：31-39；Young 等人，(2002).Cell.109：417-120)。细胞环境中的转录包括5个阶段：1.预起始， 在此期间使转录机器(例如RNA聚合酶(RNAP)和转录因子)募集到启动子；2.起始， 在此期间开始合成RNA；3.启动子逃离，在此期间RNA聚合酶离开启动子且流产起始 停止(通常在近似12-mer RNA的合成之后)；4.延伸，在此期间RNAP沿模板DNA链 逐渐行进，从而合成全长RNA转录物；和5.终止，在此期间RNA合成停止且RNAP从 模板DNA上解离。
在全长RNA转录之前产生流产转录物.通常，RNAP在它第一次试图从启动子上逃 离时不能成功，取而代之的是，其卷入合成与释放被称为流产转录物的短RNA产物的多 次流产循环中。仅在RNAP成功合成具有临界长度的RNA产物时，RNAP才不可撤销地中 断它与启动子DNA的相互作用，并开始沿DNA模板移位，逐渐合成全长RNA转录物(参 见Hsu(2002)Biochim.Biophys.Acta.1577：191-207；Hsu等人，(2003) Biochemistry 42：3777-86；Vo等人，(2003)Biochemistry 42：3787-97；Vo等人， (2003)Biochemistry：42：3798-11)。在启动子逃离(第三阶段，上文)之前，RNAP 仍在启动子区域处或其附近与模板DNA结合，从而允许在短时间内的多轮次的流产合 成。
技术.技术拓展了流产RNA合成的自然现象，从而产生 大量可检测的流产转录物(Abscript)。是基于流产转录的等温、稳健、 线性信号产生系统。在方法中，流产启动子盒(APC)经由靶位点探针(TSP) 与靶分子结合。随后，诸如大肠杆菌RNA聚合酶(E.coli RNA polymerase)的RNA 聚合酶使用APC作为模板来针对每个靶产生大量呈短的、均一RNA分子或Abscript(流 产转录物)形式的信号。
检测方法具有三个基本步骤，可适于检测多种目标分子(即靶)。首 先，经由靶位点探针(TSP)将APC定位到目标靶分子。其次，由所定位的APC合成 Abscript。最后，检测Abscript以作为靶检测的手段，并可将其定量以作为存在的靶 分子数量的指示。该方法极为高效，因为RNAP并不会像它在产生各个全长转录物之后 那样在各轮次的流产RNA合成之间从启动子上移开或解离。此外，仅合成均一的、短 RNA信号，其可比较长的寡核苷酸和多核苷酸更快速产生并更不费力。
虽然启动子逃离(和因此，流产合成的结束)所需的因素和条件并未完全被了解， 但是可利用足够的知识来创造有利于流产转录物合成并排除全长RNA产生的合成环境。 在一个实施方案中，在合成阶段控制以产生Abscript，即，如图3中所 示的非限制性实施例所说明，以规定的二核苷酸起始子起始，并随后在添加一个或多个 NTP之后终止。可使用链终止NTP(例如，3′-O-Me-NTP)或通过从反应中省略一个或多 个NTP将Abscript长度限制到短达3个核苷酸(nt)。
在其他实施方案中，在启动子/模板阶段，通过在到达终止信号之前，提供可用于 转录的具有离散、有限数量的核苷酸的合成模板来控制Abscript长度。在单一 反应中从单一APC产生Abscript的均一性，产生与存在的靶数量成正比 的Abscript信号。因此，是用于测量诸如mCpG的靶的定性和定量系统。
流产启动子可经由靶扩增方法掺入到DNA靶中或通过第二条链的杂交而在单链DNA 靶上形成。然而更一般而言，可通过将APC结合到那些靶上而用于检测多 个靶分子(图2)。对蛋白质、RNA或DNA的检测来说，将APC连接到会与分子靶结合 的靶连接探针(图2A)。对DNA和RNA的检测来说，TAP包括与核酸靶特异性地结合的 寡核苷酸或蛋白质(图2B)。对蛋白质的检测来说，APC可连接到与蛋白质靶结合的任 何物上。已开发使用针对同一靶的两种抗体的若干试验，与ELISA相类似，一个抗体用 于靶的俘获而另一个用于APC的连接(图2C)。
三核苷酸合成
可在包括链终止子NTP时或通过省略一个或多个NTP来专门地制得三核苷酸 Abscript。可在期间，通过掺入经修饰的二核苷酸(Dissinger & Hanna， J.Biol.Chem(1990)265：7662-8；Dissinger & Hanna，J.Mol.Biol.(1991) 219：11-25；Hanna，Meth.Enzymol.，(1989)180：383-409；Hanna等人，Biochemistry (1989)28：5814-20；Hanna & Meares，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1983) 80：4238-42；Hanna & Meares，Biochemistry(1983)22：3546-51.29-34)或NTP(Hanna 等人，Nucleic Acids Res.(1999)27：1369-76；He等人，Nucleic Acids Res(1995) 23：1231-8)来标记Abscript以便用于检测或俘获。如本文所使用的“标记”指的是一 个部分，可直接或间接检测和辨别它在分子上的存在。检测标记通常比检测天然的未标 记物质更容易、效率更高和/或特异性更高。适用于本发明的方法的标记包括荧光基团、 亲和力标签(诸如生物素)和经电荷或团块(mass)修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，本文所述的试验涉及产生区别在于分子量或迁移率的不同三核 苷酸Abscript。三核苷酸是通过加入二核苷酸起始子和三磷酸核苷，由RNAP以每分钟 1000至2000个的速率在APC上制造。可在不标记的情况下，通过快速TLC和UV造阴 影法或质谱分析法来检测三核苷酸Abscript。或者，可经由掺入到二核苷酸起始子中 的标记(例如荧光部分)来检测Abscript。
本发明提供通过使含有多核苷酸的样品与引物对接触来检测样品中的多核苷酸的 方法，所述引物对与所述多核苷酸的靶序列特异性地杂交并将所述靶序列扩增。所述引 物对包括第一引物，其与多核苷酸互补，侧接靶序列并含有5′俘获标签。第二引物具 有三个区：与多核苷酸互补的3′序列，所述多核苷酸侧接来自第一引物的靶序列的相 反一侧上的靶序列；5′α-TAP序列，其用于连接APC，随后扩增；和3′序列与5′序列 之间的非天然核苷酸，其通常为亚乙烯基-脱氧腺苷。
随后，使用第一和第二引物将多核苷酸的靶序列扩增(例如通过聚合酶链式反应)， 并在含有结合5′俘获标签的分子的固体支持物上俘获所扩增的靶序列。这个步骤可使 用任何可用的PCR技术或合适的核酸扩增方法，诸如使用热稳定DNA聚合酶和/或RNA 聚合酶的PCR方法。例如，俘获标签可为生物素，且固体支持物可为链霉亲和素珠，诸 如磁珠。随后，可将所俘获的扩增子洗涤以除去未结合的引物，并在需要时，从固体支 持物中洗脱出来。
对靶多核苷酸序列的检测来说，使探针与扩增子杂交。这个探针包括与α-TAP序 列互补的5′TAP序列。由于在第二PCR引物中包括了非天然核苷酸，因此在PCR期间 α-TAP序列不被复制并且在扩增期间仍为单链，从而允许探针的TAP序列杂交而不需 要使所扩增的靶变性。亚乙烯基-脱氧腺苷可用作非天然核苷酸，但本领域技术人员知 道终止复制并可因此代替亚乙烯基-脱氧腺苷的额外的合适非天然核苷酸(例如核苷酸 类似物)。探针也包括APC，其为使用如上文所述的方法来合成Abscript 提供模板。最后，通过任何合适的方法，尤其本文所述用于Abscript检测的方法，诸 如质谱分析法、毛细管电泳或薄层色谱法来检测Abscript。通常，Abscript的长度为 3至20个核苷酸，并可通过在期间掺入可检测的经标记的(例如荧光的) 核苷酸来标记Abscript。
在本发明的其他实施方案中，可通过在第二扩增引物的5′末端处包括APC序列并 省略非天然存在的核苷酸来消除TAP/α-TAP步骤。在这类实施方案中，在扩增期间， 在扩增的靶序列附近产生双链APC，其在添加RNAP和核苷酸后指导如 果在扩增期间存在这些试剂，那么可在同一管中同时进行和扩增。
通过在反应中包括对各个多核苷酸具有特异性的引物对，本发明的这些方法可适于 多次复用(即，同时检测多个多核苷酸)。根据本发明的这个实施方案，设计各引物对 以与多核苷酸的独特靶序列特异性地杂交并将所述独特靶序列扩增。用于各引物对的α -TAP序列也是独特的，从而充当靶序列的标示符。通过杂交包括独特鉴别APC的互补 TAP序列随后PCR扩增，可基于多重反应中产生的Abscript来查询各多核苷酸的存在。 因此，独特的APC是连接到各扩增的靶多核苷酸，并且可检测和测量作为靶多核苷酸存 在的指示的由APC产生的可区分的Abscript信号。举例来说，各APC可根据分子量或 核苷酸序列设计来产生可区分的Abscript。在单一反应中，可检测到5、10、20个或 更多的独特靶序列。
本发明也提供在不使用亚硫酸氢盐的脱氨基作用情况下测定CpG岛甲基化状态的 方法。此类方法结合了靶扩增与线性信号扩增方法使其极为敏感。
在本发明的某些实施方案中，所述靶多核苷酸是甲基化CpG岛或多个(即，多次复 用的)CpG岛。在这些实施方案中，首先使用预定的限制性内切酶来切割含有甲基化CpG 岛的基因组DNA，所述预定限制性内切酶不会在多重试验中切割所述岛或所述多个岛中 的任何一个。随后，使用固定化的MBD试剂和用于查询目标特异性CpG序列的俘获片段 来从基因组DNA中俘获甲基化的DNA片段。根据本发明的一种方法，该方法以使用甲基 化的DNA富集方法使甲基化的DNA与片段化的基因组DNA分离开始。在本发明的一个方 面中，富集方法使用谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白，其含有来自小鼠MBD2的对甲基化的 DNA具有高度特异性的甲基结合域。与MBD2-融合蛋白结合的甲基化DNA被谷胱甘肽磁 珠快速俘获，并直接洗脱到缓冲液中以便通过聚合酶链式反应来扩增。目标CpG岛是使 用一对修饰的PCR引物来扩增。第一个含有生物素基团，用于后续将中靶的CpG岛俘获 到链霉亲和素磁珠上。第二引物含有岛特异性序列，其“标记”用于连接特定APC的扩 增子。一旦扩增，就将岛俘获到链霉亲和素珠上；独特的APC通过杂交相连接；并且启 动各CpG岛从而产生不同的Abscript；因此，可在各反应中查询到多 个CpG岛。
或者，可将APC序列掺入到第二扩增引物中，并且在扩增期间产生APC双链体。这 种方法通过在扩增反应中包括RNAP和核苷酸而允许同时进行扩增和因 为这种方法将靶扩增与信号扩增结合，所以需要的起始DNA比大多数甲基化DNA检测方 法的少，小于2ng的基因组DNA就足以用于分离甲基化DNA的最初步骤。整个试验极 为快速，需要的操作时间要比大多数竞争性试验的少。该试验可如所述使用磁珠，并且 还可被格式化以在微量滴定板格式下用于高流量筛查。
实施例
实施例1.方法
先前已有描述；参见例如美国专利申请第09/984,664号(2001年10 月30日提交)，现在的美国专利第7,045,319号；第10/425,037号(2003年4月29 日提交)；第10/600,581号(2003年6月23日提交)；第10/602,045号(2003年6 月24日提交)；第10/607,136号(2003年6月27日提交)，现在的美国专利第7,226,738 号；第10/686,713号(2003年10月17日)；第10/976,240号(2004年10月29日 提交)；第10/790,766号(2004年3月3日提交)；第10/488,971号(2004年10 月18日提交)；和第10/551,775号(2006年9月14日提交)，所述各专利申请的内 容都以引用的方式全部并入本文。
实施例2.Abscript的质谱分析检测
通过质谱分析法，随后通过HPLC从二核苷酸起始子将它们分级分离来检测三核苷 酸Abscript。如图4A所示，将分级分离的输出结果以总离子计数对色谱保留时间作图。 可将任何离子的色谱法谱分析以类似方式作图。具体的m/z物质在特定保留时间下的贡 献可以色谱峰下面积值来进行求和以便得出Abscript的量。图4B显示与Abscript GAG (保留时间为5.4分钟)相关的离子光谱。GAG的产率为m/z值为477.6、956.1和978.2 的物质的总和。这些物质分别对应双电荷物质、单电荷物质和钠加合物。
实施例3.GST-MBD蛋白的制备
如图5所示，构建含有来自小鼠MBD2的甲基结合域(MBD)的GST融合蛋白。将 MBD域的密码子最佳化以便在大肠杆菌中表达。该构建体含有介于GST与MBD域之间的 凝血酶切割位点。GST蛋白也含有4个用于连接APC或生物素的表面半胱氨酸残基。2008 年5月15日提交的美国专利申请第61/053,648号提供了GST-MBD蛋白的细节，所述美 国专利申请的内容以引用的方式并入本文，具体来说，描述MBD融合蛋白的制备和用途 的实施例2-11提供了GST-MBD蛋白的细节。
GST域允许融合蛋白或它与甲基化DNA的复合物在谷胱甘肽树脂或珠上进行分离并 用谷胱甘肽洗脱，或者用识别GST的抗体俘获或检测。
选择来自MBD2b蛋白的MBD用于最终的构建体，因为在已知的甲基CpG结合蛋白中， MBD2b具有对Me-CpG位点的最高亲和力和与未甲基化CpG的最低交叉反应性。它具有 比MeCP2高介于25至100倍之间的对Me-CpG位点的亲和力，并具有比MeCP2高介于 9.7至43之间的对甲基化DNA的偏好性(Fraga等人，(2003)Nucleic Acids Res.， 31：1765-74)。另外，像需要在CpG位点附近进行一轮4A-Ts的MeCP2一样，不存在 对MBD2 CpG识别的序列前后效应(sequence context effect)。因此，MDB2比MeCP2 识别更大数量的mCpG位点。
实施例4.即便在使用2ng或更小的输入DNA情况下，固定化的GST-MBD2仍保持 对甲基化DNA的高特异性
将GST-MBD蛋白连接于谷胱甘肽磁珠上并用于分离不同数量的甲基化DNA，从而测 定可以高特异性回收的最小起始DNA样品大小。在22℃下，以1000rpm下的水平旋转 混合方式，将HeLa基因组DNA或用SssI甲基酶人工甲基化的HeLa DNA与GST-MBD磁 珠一起孵育1小时。在除去含有未结合DNA的上清液之后，通过在80℃下，以1000rpm 下的水平旋转混合方式保温10分钟，从磁珠中洗脱所结合的DNA。使用引物对 5′-ggtacgaaaaggcggaaaga-3′(SEQ ID NO：6)和5′-tgtgggaaagctggaatatc-3′(SEQ ID NO：7)与用于检测的绿色染料，通过qPCR来测试所洗脱的DNA样品中PTGS2 (GenBank GL34576917)DNA的存在。HeLa中的PTGS2是未甲基化的，且预计其会保留 在结合反应的上清液中。在所洗脱的分级分离物中观察到人工甲基化的DNA的2ng基 因组DNA输入物的94％的回收率，同时如所预计，在上清液分级分离物中回收到来自HeLa 的未经修饰的PTGS2 DNA的100％。在1ng的甲基化HeLa DNA输入量下，73％的PTGS2 DNA 得以结合，并用热洗脱来回收。未检测到来自未经修饰的HeLa的未甲基化形式的结合。 可通过琼脂糖凝胶电泳染色显现的最低DNA量(2ng)相当于大约300个细胞。甚至可 分离更少的DNA，并使用用于扩增子检测的来检测。
实施例5.基于CpG甲基化试验的
图6示出用于测定多个CpG岛的甲基化状态的总方案。简单地说，从基因组DNA 样品中分离出片段化的甲基化DNA，然后扩增正在研究其甲基化状态的特异性CpG岛。 对扩增来说，一种引物含有诸如生物素的亲和力标签，其允许所述岛的挽回和固定。第 二引物含有用于连接流产启动子盒的序列。
这种方法允许扩增和分离样品中与可设计的相容PCR引物一样多的CpG岛。因为不 用造成“C”转化成“dU”的亚硫酸氢盐处理来使DNA脱氨基，所以避免了与由脱氨基 作用引起的序列异质性损失相关的高水平多次复用的问题。因为引物位点不会严格地限 于靶标中的特定序列，所以引物放置的足够灵活性允许设计多种相容的引物组 (Henegariu等人，Biotechniques(1997)23：504-11；Onishi等人，J.Agric.Food Chem.(2005)53：9713)。使不同的APC连接于各个靶CpG岛，从而产生各个靶CpG 岛的不同Abscript信号。因此，可实现从单一样品中同时检测多个CpG岛。
简单来说，将天然基因组DNA碎裂成片段，然后与含有谷胱甘肽-S-转移酶(GST) -甲基结合域(MBD)融合蛋白(如上文实施例3中所述制得)的谷胱甘肽珠结合。仅甲 基化的DNA才会结合(图6A，步骤1)。洗涤后，从珠粒中洗脱甲基化的DNA(图6A， 步骤2)并通过PCR扩增欲查询的岛(图6B，步骤3)。引物之一在5′末端处含有俘获 标签(例如生物素)(图7A)。第二引物含有2个区。第一个是与靶DNA互补的多核 苷酸序列。第二个区是与靶DNA或其他岛不同的任意序列(图7A)。这个第二序列是 与连接到流产启动子盒(APC)的靶连接探针(TAP)序列互补。TAP序列的互补序列称 为反TAP序列(α-TAP)。α-TAP序列在靶DNA的PCR扩增期间仍为单链，原因是： 在与靶标杂交的引物序列和α-TAP序列之间的衔接处包括有非天然核苷酸(图7A中的 εA核苷酸)。扩增后，将岛固定(例如)在链霉亲和素珠上(图6B，步骤4)，并洗 去剩余的基因组DNA和引物。随后，使TAP-APC多核苷酸与所扩增的靶DNA接触并与单 链反TAP序列杂交(图6C，步骤5)。将游离的TAP-APC洗去，再加入试剂以产生Abscript信号(图6C，步骤5)。下文给出了该方法的更多细节。
步骤1：基因组DNA的切割
设计初始的消化步骤以产生含有CpG岛或CpG岛的大部分的片段。选择落在欲分析 的区域之外的限制性位点，其既无甲基化依赖性又无甲基化敏感性。使用具有4个碱基 识别序列的限制性内切酶。表1列出了通过MseI或DdeI对6个被报道为差异甲基化的 CpG岛的样品所产生的片段大小。按照惯例，在供应商的限制性缓冲液(NEB缓冲液4) 中，用20个单位的MseI消化至多3μg的基因组DNA。在37℃下，将裂解反应物保温 至少8小时。通过在消化液样品上使用含有MseI序列的引物进行PCR来测量裂解的程 度。阳性对照是未用MseI处理的基因组DNA，和使用了不受MseI消化影响的引物的MseI 处理DNA的扩增反应。
消化的目的是解除靶岛与可被正常甲基化的相邻CpG序列的连接，从而使未甲基化 的岛转移到甲基化的DNA分级分离物中。在大多数情况下，MseI或DdeI产生的单一片 段占据了大部分的岛序列而不包括许多相邻的序列。例外是MGMT被DdeI过度切割的情 况。在这种情况下，替代的酶产生了令人满意的结果。在CpG岛被碎裂成若干片段的情 况下，各区段可用它自己的引物组来进行分析。
表1.CpG岛裂解模式
步骤2：甲基化DNA的分离和回收
将甲基化DNA的俘获步骤格式化以用于带有谷胱甘肽的磁珠。在除去过量的 GST-MBD蛋白后，将GST-MBD蛋白预装载到悬浮在DNA样品中的珠粒上。在室温下 (22-24℃)，以混合(Eppendorf Thermomixer，1000rpm)方式将DNA结合进行1 小时，以维持珠粒的悬浮状态。DNA样品通常是在50μl体积的结合缓冲液中含有介 于1ng至50ng之间的基因组DNA。完成结合步骤时，用稀土磁体使珠粒沉淀到管的 一侧，并除去含有未甲基化DNA的上清液。用400μl含有与结合缓冲液相同的NaCl 浓度(160mM)的洗涤缓冲液将珠粒洗涤两次。在室温下，以混合(1000rpm)方式使 各次洗涤液温育5分钟。最后一次洗涤用TE缓冲液(10mM Tris，pH 8，1mM EDTA) 来进行。使珠粒悬浮在400μl TE中并立即用磁铁使其沉淀。弃去TE洗涤缓冲液，将 珠粒悬浮在50μl的洗脱缓冲液(10mM Tris，pH 8，1mM EDTA)中。
用若干替代方法从珠粒中洗脱甲基化DNA。可在80℃下，以混合(1000rpm)方式 使TE缓冲液中的珠粒保温10分钟。用磁铁使珠粒沉淀，并回收所洗脱的DNA。在替代 方法中，将珠粒悬浮在含有0.1％SDS的洗脱缓冲液中。所结合的甲基化DNA的完全洗 脱是在50℃下用单次20分钟保温实现的。所洗脱的DNA无需进一步处理即可备用于 PCR，条件是：PCR缓冲液中包括诸如吐温-20的非离子型洗涤剂(参见Goldenberger 等人，PCR Methods Appl.(1995)4：368-70)。洗脱还可如下进行：使珠粒暴露于pH 8的含有最少量的20mM还原谷胱甘肽的洗脱缓冲液10分钟。图5C显示HeLa DNA的 SNRPN CpG岛的分级分离结果。用热处理来释放甲基化DNA。SNRPN是一种印迹基因。 一个拷贝是完全甲基化的，而另一个拷贝是正常未甲基化的。正如所料，上清液中发现 一半的SNRPN拷贝(图5C的分级分离物S，未甲基化的分级分离物)，而在第一次洗 脱时从珠粒中洗脱了一半的拷贝(图5C，分级分离物E1，甲基化的分级分离物)。在 第一次洗脱时，萃取所有甲基化的DNA。第一次洗脱后的两次连续洗脱(E2和E3)不 含有SNRPN DNA。使用PTGS2基因(HeLa中的未甲基化)的CpG岛作为阴性对照(图 5D)。所有PTGS2 DNA都出现在上清液分级分离物中。
步骤3：使用标记的引物的PCR扩增
使用生物素亲和力标签和用于连接流产启动子盒(APC)的单链寡核苷酸序列将CpG 岛区段扩增并标记。PCR反应物含有1x热启动Taq缓冲液(Fermentas)、0.8mM dNTP (各0.2mM)、2mM MgCl2和5％(v/v)的DMSO。生物素化引物和α-TAP引物各自以 1μM存在。用2个单位/20μl反应物的TrueStart热启动Taq DNA聚合酶 (Fermentas)来进行扩增。一个单位等于在74℃下在30分钟内掺入10nmol的dNTP。 循环条件是95℃1分钟，接着在95℃30秒、62℃30秒和72℃30秒下循环至多32次。 最后的延伸步骤是72℃5分钟。将完全的反应物保持在4℃下。图5C和图5D显示通过 琼脂糖凝胶电泳对分级分离的扩增DNA的检测。
α-TAP引物序列设计
通过最小化PCR反应物中存在的三寡核苷酸引物/α-TAP序列之间的相互作用来最 佳化引物以达高的信号强度。使用生物素化的PCR引物和α-TAP的3′末端来引发在扩 增期间的DNA合成，并且使用引物软件(Oligo Explorer 1.2)进行设计以最小化引物： 引物相互作用和引物发夹环的形成。第二引物的5′末端处的α-TAP被设计成掺入到扩 增子中，并且其由于非编码核苷酸亚乙烯基A(εA)的存在而仍为单链，所述非编码 核苷酸将引物序列与α-TAP分离。包括Taq聚合酶的大多数DNA聚合酶不能掺入对着 εA的dNTP(dNTP opposite εA)并终止合成(图7)(参见Patel等人，J.Biol.Chem. (2001)276：5044-51)。核苷酸类似物防止α-TAP序列在PCR期间被复制。使α-TAP 序列与任一的引物序列之间的潜在相互作用最小化，从而避免PCR的抑制和由于全单链 α-TAP的非特异性固定化的假阳性结果。
引物设计经历3个步骤。首先，根据以下标准来最佳化引发序列：1)引物长度在 16至20个nt之间；2)Tm接近60℃；3)消除带碱基配对的3′末端的引物-引物相互 作用；4)其他引物-引物相互作用必须具有＜16℃的Tm；和5)排除Tm＞8℃的发夹结 构。使用这些标准成功地开发出6个CpG岛的引物对。
引物最佳化中的第二个步骤是：消除α-TAP-引物寡核苷酸中的发夹结构，所述发 夹结构可能干扰PCR或TAP-APC的连接。基于RNA噬菌体MS2、fr和Qβ序列设计了6 个α-TAP候选序列的集合。对每个候选α-TAP进行电脑虚拟(in silico)测试，将在 我们的TAP退火条件下形成Tm＞26℃的发夹的那些候选α-TAP修饰，以便消除发夹并 再次测试(Zuker，Nucleic Acids Res.(2003)31：3406-15)。修饰α-TAP序列的唯 一限制在于，它们不会获得与引发序列的显著互补性。对α-TAP与所连接的引物序列 之间的潜在发夹相互作用进行电脑虚拟测试，并在必要时，将α-TAP序列改变以便最 小化发夹稳定性和/或防止引物从发夹的延伸。一种示例性的引物-α-TAP寡核苷酸 (SEQ ID NO：42)具有在所用PCR条件下Tm为41℃的发夹结构，但是扩增的CDKN2A DNA 与缺乏与反向引物SEQ ID NO：43的α-TAP延伸组合的引物一样有效。最后，在引物设 计软件中，使用α-TAP附在文件末尾的CpG岛序列文件并选择其与生物素化引物序列 一起作为引物来测试α-TAP与生物素化引物之间的相互作用。开发了用于CpG岛的α -TAP和反向引物对，所述CpG岛与附在文件末尾的α-TAP相关并选择其与生物素化引 物序列一起作为引物。开发了如以下表2中所列的用于CpG岛的α-TAP和反向引物对。
表2.α-TAP和反向引物对
TAP-APC设计
通过使TAP-APC非模板链与互补的APC模板链杂交来制得TAP-APC。APC部分是双 链的，而TAP区段是从非模板链延伸的单链。设计TAP-APC以便APC的集合编码用于单 式(single-plex)反应的相同Abscript，或TAP-APC的集合各自编码不同的Abscript 以允许多重检测。设计了用于α-TAP的单链的单式TAP-APC，如以下表3中所示。
表3.单式TAP APC
(表中文字Island：岛)
将单链的单式TAP-APC退火到编码相同Abscript的共同模板链(SEQ ID NO：32)。
多重相容的TAP-APC各自与它们自己的编码独特Abscript的模板链配对。多重 TAP-APC的集合(表4)可一起用以检测表4中列出的CpG岛。
表4.多重相容的TSP-APC
(表中文字Island：岛)
步骤4和5.扩增子与链霉亲和素珠的连接和TAP-APC的结合
使生物素化扩增子与链霉亲和素珠结合，以便在试验的后续步骤中除去游离的探针 和未结合的APC。
在最佳化实验中，在10pmol的生物素化引物存在下，观察到扩增子与链霉亲和素 磁珠的完全结合，总的结合容量为40pmol的生物素化寡核苷酸。将结合时间最佳化， 以便最小化使用琼脂糖凝胶电泳的试验时程，所述试验是测量扩增子从结合反应的缓冲 液相中除去。在将珠粒和DNA样品混合的5分钟内观察到生物素化扩增子的定量结合。
TAP-APC与扩增子的连接是成功地在添加链霉亲和素珠之前的溶液中自由进行，或 在扩增子与珠粒结合，接着进行洗涤步骤以除去游离的引物-αTAP寡核苷酸之后进行。 在所用退火条件下(150mM Na+)，TAP的Tm范围介于55.8-64℃之间。加入0.5μM 的TAP-APC，并在51℃下保温最少15分钟。不要求高的严格性来实现有效的结合。TAP 和α-TAP的分析表明，在这些退火条件下，发夹形成是可忽略的。即使制备经历了多 重PCR，反应的序列复杂性仍是低的。三重反应中最多存在3对α-TAP和TAP，且这些 序列可任意改变以防止交叉杂交。就梯度热循环器中的温度而言，将这个退火步骤最佳 化，并使用扩增子的电泳迁移率变动作为终点来测定最短的退火时间。
在DNA结合缓冲液中1∶1稀释PCR反应物，得到150mM的最终NaCl浓度。将适当 的TAP-APC加入到各DNA样品中达到0.5μM的最终浓度，接着在51℃下保温最少15 分钟。
将链霉亲和素磁珠等分装入PCR管中。用100μl的50％(v/v)结合缓冲液洗涤 各珠。将所洗涤的珠粒悬浮在DNA样品中，接着在51℃下保温最少5分钟。
通过用磁铁使珠粒沉淀来终止结合反应，并除去结合缓冲液。使珠粒在180μl 洗涤缓冲液中经历2次洗涤，所述洗涤缓冲液含有与50％(v/v)结合缓冲液(150mM) 相同的NaCl浓度。各次洗涤步骤包括在51℃下5分钟的保温以便复制结合反应的严格 性，并随后用磁铁使珠粒快速地沉淀。第三次洗涤是在pH 7.5的40mM HEPES、40mM KCl中进行。可将珠粒冷冻储存，或可立即进行
步骤6：
用磁铁使含有所结合扩增子：TAP-APC的珠粒沉淀以除去储存的缓冲液，并将其悬 浮在10μl的含有1mM二核苷酸起始子(GpA)、1mM NTP(GTP)和0.4个单位的 RNA聚合酶的缓冲液中。在65℃下，一个单位在60分钟内催化1nmol NTP 的掺入。在77℃下，将反应物保温1小时。
通过将1.5μl样品点样在含有荧光剂的硅胶TLC板上的UV造阴影法来检测 Abscript。在含有100ml溶剂(异丙醇∶氢氧化铵∶活化剂溶液，6∶3∶1)的气密腔室中 使TLC展开。如图8B所示，在短波UV光下检测到呈暗斑的Abscript(UV造阴影法)。
对LC-MS检测来说，在384孔板中，将10μl的反应物稀释到20μ l的HPLC级水中。如图8C所示，通过LC-MS处理并定量分析了10微升。
表5.和试验的灵敏度
图8显示滴定的HeLa的基于α-TAP的检测与Man PCR相比的结 果，两种方法都使用了相同的起始位点。使用5′-gcgggaccctccagaa-3′(SEQ ID NO：3) 和5′-actcactggtggcgaagact-3′(SEQ ID NO：4)进行qPCR扩增。 5′-FAM-accacccttataaggctcggaggcc-Iowa Black FQ猝灭剂-3′(SEQ ID NO：5)是 荧光探针。5′-actcactggt ggcgaagact-3′(SEQ ID NO：13)和5′-cctccatcccaaagta[ε A]gcgggaccctccagaa-3′(SEQ ID NO：12)是α-TAP引物对。图8B显示TLC检测的 结果。流产转录/PCR引物是SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13。TAP-APC是通过退火SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：32来制得。APC编码Abscript GAG。使用薄层色谱法(TLC) 和UV造阴影法检测Abscript。使用UV造阴影法时，在29次循环时的检出限(LOD) 是100个拷贝。图8C显示图8B中分析的相同样品的LC-MS检测结果。PCR反应的DNA 输入的变化范围是30至9000个基因组拷贝。在29次循环时LC-MS的LOD是30个拷贝。 面积指的是含有Abscript(GAG)的色谱峰的面积。
PCR需要35次循环来检测100个拷贝，并需要37次循环来检测30个拷 贝(图8A和表5)。即使使用TLC和UV造阴影法，基于的检测也比更灵敏。
如果用检测荧光Abscript来替换UV造阴影法，那么基于TLC的检测更灵敏。用含 有生物素基团(SEQ ID NO：43)和反TAP序列(SEQ ID NO：42)的引物扩增CDKN2A CpG 岛中被甲基化的基因组DNA。起始基因组DNA的数量是10ng、2.5ng、640pg和160pg。 这相当于基因组DNA的3000、750、188或47个拷贝。在添加编码AUC的TAP-APC后， 在45℃下，在Cy5标记的二核苷酸ApU和CTP存在下进行取出样品 (1μl)并通过快速TLC进行分析。如图9所示，在2小时的之后，可 以显现来自2.5ng起始DNA的Abscript，并在8小时的之后，可以容易 地检测到47个拷贝。
在这个实验中，产物是Cy5标记的三核苷酸AUC。事实上与若干其 他荧光染料相比，Cy5是相当差的引发剂，使三核苷酸合成的周转期缩短到使用未标 记二核苷酸的周转期的约8％。因此，Cy5可能不是选用于这些试验的染料，但是可用 诸如荧光素或DyLight(Pierce)的其他染料替换，荧光素或DyLight都使周转期更接 近用未标记引发剂所获得的周转期的35％。通过使用效率高近似4倍的染料，可相应地 缩短时间，允许在2小时内检测少于50拷贝的起始DNA。荧光素具有的额外优点是可 用低成本、长波长的UV光来检测。
实施例6.使用APC-引物的两步CpG岛甲基化检测
使用两步检测方法，与三步α-TAP方法(实施例5)中一样，从片段化的基因组 DNA样品中分离出甲基化的DNA。如上文所述，使甲基化的DNA片段与固定化的GST-MBD 蛋白结合(图10；步骤1)。在洗涤除去未甲基化的DNA之后，通过对热或谷胱甘肽的 暴露来释放甲基化的片段(图10；步骤2)。
使用在其5′末端含有APC序列的引物将中靶的CpG岛扩增并标记(图10；步骤3)。 APC的单链形式是无活性的，但是它在靶的扩增期间转化为双链形式时会变得活化(图 10；步骤4)。因此，如果包括了起始子NTP和RNAP，那么可在PCR反应期间进行 (图10；步骤6)。
实施例7.AJPC-引物的设计和验证.
设计APC-引物以避免自引发和与反向引物形成引物二聚体。这些事件中至少有一 些可能产生可创造高水平背景的有活性的双链体启动子。如实施例5中 所述来筛查潜在的引物序列形成引物二聚体和自引发的可能性。APC引物的APC部分长 是44个nt，其中的33个nt可被改变而不显著地影响活性。在大多数情 况下，可通过改变APC-引物的APC区段的序列来消除潜在的自引发或引物二聚体相互 作用。
通过在不存在DNA时，在退火温度的范围内进行PCR反应来测试被预测为没有潜在 相互作用的引物对，从而确定单独的引物是否可产生背景信号。首先，测试APC-引物 以确定自引发水平。其次，用APC引物和反向引物来进行无DNA的PCR反应，以便测试 引物二聚体效应。完全的PCR反应物补充有1mM二核苷酸起始子、1mM NTP、0.4个 单位的RNA聚合酶，并通过进行分析。图11显示精心设计的靶向GAPDH CpG 岛的引物对(SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34)的结果。图11A显示单独 的APC引物(SEQ ID NO：34)和引物对连同包括HeLa基因组DNA的阳性对照的TLC数 据。可仅在阳性对照中检测到编码的Abscript GAG。图11B显示相同样品的LC-MS数 据。仅阳性对照产生Abscript，而缺乏DNA的反应物在退火温度的宽范围内不产生显 著的信号。开发用于CpG岛的APC-引物/反向引物对在以下表6中给出。
表6.APC-引物/反向引物对
(表中文字Island：岛；Primer：引物；Reverse Primer：反向引物)
实施例8.用α-TAP和APC-引物方法检测来自肿瘤细胞系的甲基化DNA的比较
在供应商的含有2mM MgCl2、0.8mM dNTP(各0.2mM)和5％(v/v)DMSO的1X 缓冲液中，用0.4个单位的热启动Taq(Fermentas)来进行PCR反应。在74℃下，一 个单位的热启动Taq在30分钟内掺入10nmol的dNTP。APC-引物和反向引物各为1μ M。循环条件是95℃1分钟，接着在95℃30秒、62℃30秒和72℃30秒下循环至多32 次。最后的延伸步骤是72℃5分钟。将完全的反应物保持在4℃下。完全的PCR反应物 (10μl)补充有1mM二核苷酸起始子、1mM NTP、0.4个单位的RNA聚合酶。然后， 在77℃下进行至多1小时。
如果在PCR反应物中包括各为1mM的二核苷酸起始子和NTP，那么可在PCR期间 进行每20μl反应物加入0.4个单位的热稳定RNA聚合酶。在65℃下， 一个单位在60分钟内催化1nmol NTP的掺入。将反应物在77℃下保温 1小时。可如实施例2和5中所述检测Abscript。
表7.肿瘤细胞DNA的甲基化百分比
表7显示来自肿瘤细胞系的甲基化DNA的基于的检测结果。用来自 多次分级分离实验的测量过一次的样品进行大多数重复的测量。GAPDH CpG岛是未甲基 化的，这是预期在肿瘤维持这个岛的正常甲基化状态条件下的情况。SNRPN CpG岛符合 印迹基因的预测。除LNCaP中的DAPK1外，其他的岛与所公开的结果一致，但对DAPK1 的甲基化状态得出了有分歧的结论(Yegnasubramanian等人，(2004)Cancer Res. 64：1975-86；Lin等人，(2001)Am J.Pathol.159：1815-26；Paz等人，(2003)Cancer Res.63：1114-21；Toyota等人，(2000)Cancer Res.60-4044-48；Lodygin等人，(2005) Cancer Res.65：4218-27)。