基于流产转录的分子检测.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102421914 A (43)申请公布日 2012.04.18 CN 102421914 A *CN102421914A* (21)申请号 201080017620.6 (22)申请日 2010.03.15 61/160,335 2009.03.15 US C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 里伯米德生物技术公司 地址 美国加利福尼亚州卡尔斯巴德 (72)发明人 米歇尔M汉娜 大卫麦卡锡 (74)专利代理机构 深圳市博锐专利事务所 44275 代理人 张明 (54) 发明名称 基于流产转录的分子检测 (57)

2、 摘要 本发明提供基于流产转录技 术来检测生物标记物的方法。 具体来说， 本发明提 供从 DNA 的小样品中检测 CpG 岛甲基化的不含硫 酸氢盐的方法。所述方法适于多次复用并可用于 在短时间内分析来自单一样品中的多个 CpG 岛。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2011.10.24 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2010/027367 2010.03.15 (87)PCT申请的公布数据 WO2010/107716 EN 2010.09.23 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 26

3、 页 序列表 25 页 附图 6 页 CN 102421926 A1/2 页 2 1. 一种用于检测样品中的至少一个靶多核苷酸的方法， 其包括 ： a) 使含有所述至少一个多核苷酸的样品与引物对接触， 所述引物对与所述至少一个多 核苷酸的靶序列特异性地杂交并将所述靶序列扩增， 其中所述引物对由以下 i) 和 ii) 组 成 ： i) 第一引物， 其包含 (1)3序列， 其与侧接所述多核苷酸的所述靶序列的第一序列互补， 和 (2)5俘获标签 ； 和 ii) 第二引物， 其包含 ： (1)3序列， 其与侧接所述多核苷酸的所述靶序列的第二序列互补， 和 (2)5序列， 其提供用于指导流产转录 (Ab

4、scription) 的构件 ； b) 由所述第一引物和所述第二引物将所述靶序列扩增 ； c) 使所述扩增的靶序列与结合所述 5俘获标签的固定化分子接触， 从而俘获所述多 核苷酸的所述扩增的靶序列 ； d) 由所述用于指导流产转录的构件转录至少一个 Abscript ； 和 e) 检测步骤 d) 中转录的至少一个 Abscript。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中在进行随后步骤之前， 从固定和俘获的多核苷酸 中洗涤未结合的试剂、 引物和多核苷酸。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中扩增由进行聚合酶链式反应组成。 4. 根据权利要求 3 所述的方法， 其中所述聚合酶链式反应是

5、用热稳定 DNA 聚合酶和热 稳定 RNA 聚合酶中的至少一个来进行。 5.根据权利要求1所述的方法， 其中所述5俘获标签是生物素且与所述5俘获标签 结合的所述分子是链霉亲和素。 6. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中与所述 5俘获标签结合的所述分子是固定在选 自磁珠和微量滴定板的固体支持物上。 7.根据权利要求1所述的方法， 其中在步骤d)期间将可检测的经标记核苷酸掺入到至 少一个 Abscript 中。 8. 根据权利要求 7 所述的方法， 其中所述可检测的经标记核苷酸是荧光核苷酸。 9. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中检测所述至少一个 Abscript 包括质谱分析法、 毛 细

6、管电泳或薄层色谱法。 10. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中所述至少一个 Abscript 的长度是 3-20 个核苷 酸。 11. 根据权利要求 10 所述的方法， 其中所述至少一个 Abscript 的长度是 3 个核苷酸。 12. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中所述用于指导流产转录的构件包含 APC。 13. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中所述用于指导流产转录的构件包含 ： i)5 -TAP 序列， 其鉴别独特的 CpG 岛 ； 和 ii) 非天然核苷酸， 其介于 5 -TAP 序列和与侧接所述靶序列的所述第二序列互补 的所述 3序列之间 ； 权 利 要 求 书 CN

7、102421914 A CN 102421926 A2/2 页 3 且， 步骤 d) 包含 ： i) 使探针与所述扩增的靶序列杂交， 其中所述探针包含与所述 -TAP 序列互补的 5 TAP 序列和 3 APC ； 和 ii) 由所述 APC 转录至少一个 Abscript。 14.根据权利要求13所述的方法， 其中所述非天然核苷酸防止所述-TAP在扩增期间 的复制， 从而所述 -TAP 序列在步骤 a) 至 c) 期间仍为单链。 15. 根据权利要求 14 所述的方法， 其中所述非天然核苷酸是亚乙烯基 - 脱氧腺苷。 16. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中所述至少一个靶多核苷酸包含多个

8、不同的靶多 核苷酸， 并且同时用多个第一和第二引物对来进行步骤 a) 至 e)， 每个引物对都与不同的靶 特异性地杂交。 17. 根据权利要求 16 所述的方法， 其中所述用于指导流产转录的构件对多个靶中的每 一个靶都产生独特的 Abscript。 18. 根据权利要求 17 所述的方法， 其中所述独特的 APC 能根据分子量或核苷酸序列而 彼此区分。 19. 根据权利要求 16 所述的方法， 其中所述多个不同的靶包含至少 10 个不同的靶。 20.根据权利要求1所述的方法， 其中所述至少一个靶多核苷酸是甲基化的CpG岛且所 述样品包含分离的甲基化的基因组 DNA 片段。 21. 根据权利要求

9、 20 所述的方法， 其中所述甲基化的基因组 DNA 片段是通过以下步骤 分离的 ： a) 用不会切割所述靶多核苷酸 CpG 岛的限制性内切酶切割含有至少一个甲基化的靶 多核苷酸的基因组 DNA 样品 ； b) 使所述经切割的基因组 DNA 与固定化的 MBD 接触， 从而固定来自所述样品的甲基化 的基因组 DNA ； 和 c)任选地， 从所述固定化的MBD中回收所述甲基化的基因组DNA， 从而分离出甲基化的 基因组 DNA 片段。 22. 根据权利要求 21 所述的方法， 其中所述 MBD 是 GST-MBD2 融合蛋白。 23.根据权利要求22所述的方法， 其中将所述GST-MBD2融合蛋

10、白固定在含有谷胱甘肽 的固体支持物上。 权 利 要 求 书 CN 102421914 A CN 102421926 A1/26 页 4 基于流产转录的分子检测 0001 相关申请 0002 本申请依据美国法典第 35 篇第 119 条要求 2009 年 3 月 15 日提交的美国临时申 请第 61/160,335 号的优先权权益， 所述美国临时申请的全部公开内容都以引用的方式并 入本文。 0003 发明背景 0004 癌症是由许多肿瘤抑制基因的表达来主动地避免， 这些肿瘤抑制基因调节细胞分 裂周期并介导细胞间相互作用。对良性和恶性肿瘤的研究已显示， 癌症经过多步过程而发 展， 在所述多步过程中

11、， 随机累积的改变增强原癌基因的表达或减少肿瘤抑制基因和 DNA 修复基因的表达或功能。体细胞突变是肿瘤抑制基因和 DNA 修复基因的这些改变中某些 改变的原因。然而， 已愈加表明的是， 诸如 DNA 过度甲基化和甲基化不足的表观遗传改变 也经由肿瘤抑制基因或原癌基因的失活作用或增强作用而在癌症的发展中起着巨大作用。 CpG 启动子岛的过度甲基化发生于癌症发展的早期， 且事实上这已在所有肿瘤中被发现， 使 得所述过度甲基化潜在地成为极其适用的诊断标记物， 使癌症在治疗最有效时的早期就被 非侵入性地检测到。举例来说， 已报道了在诊断出鳞状细胞肺癌之前至多 3 年， 在吸烟者的 痰液中检测出诸如

12、DAP 激酶、 p16 和 MGMT 的基因启动子区的过度甲基化 (Belinsky 等人， (2006).Cancer Res.66 ： 3338-44， Palmisano等人， 2000.Cancer Res.60 ： 5954-8)。 同样地， 一小组基因的过度甲基化可能是非小细胞肺癌的有价值的早期检测指示物。 一小组基因的 过度甲基化是在乳癌早期被检测到， 但在正常或良性乳房组织中检测不到 (Krassenstein 等人， (2004).Clin Cancer Res.10 ： 28-32)。 0005 CpG 岛中胞嘧啶的甲基化是大多数癌症的早期事件， 它导致包括肿瘤抑制基因的

13、许多基因的表达减少。对肿瘤细胞 DNA 中 CpG 岛甲基化的调查暗示， 这种表观遗传改变通 常足以对抗肿瘤进程中的突变影响。异常甲基化的早期检测可引出正规筛查和早期诊断， 早期的治疗最为有效。通常可在血清或其他体液 ( 尿液、 痰液、 唾液 ) 中而并非仅仅在肿瘤 组织本身中检测到早期的表观遗传改变， 这就意谓着可使用这些液体来非侵入性地进行表 观遗传诊断测试。基于 CpG 岛甲基化的诊断测试也可用于药物开发、 鉴别对这些药物有反 应的患者群体以及治疗后的监测。 0006 近来对甲基化检测的灵敏度的改进和对用于特定癌症的甲基化标志的阐明已使 得通过从体液提取 DNA 样本来分析肿瘤成为可行的

14、。在疾病的相对早期， 肿瘤细胞将 DNA 释放到血液中。已发现癌症患者血液中的 3至 90以上的 DNA 具有肿瘤起源 (Kim 等人， (2004)J.Clin.Oncol.22 ： 2363-70)。基于 PCR 的甲基化试验的开发已使得从血液、 痰液和 尿液中非侵入性地检测肿瘤的存在成为可能。在一项研究中， 甲基化检测在检测异常癌变 前细胞中比尿液细胞学检查更灵敏。使用单一甲基化标记物调查血液样品时， 临床灵敏度 (所检测病例的确认比例)通常较低。 然而， 血液样品的临床特异性(测试为阴性的正常对 照物的比例 ) 达到 100。临床灵敏度应随评定多于单个 CpG 岛的甲基化测试而增加。

15、0007 体液自身出现的异常甲基化的 DNA 并不有助于精确定位受肿瘤影响的器官。令 人意外地， 几乎不需要信息来确立肿瘤的组织起源。许多甲基化筛查研究都具有已确立的 说 明 书 CN 102421914 A CN 102421926 A2/26 页 5 甲基化标志 ； 与特定器官的癌症强烈相关的甲基化 CpG 岛的集合。在一项调查中， 3 至 4 种 候选 CpG 岛的异常甲基化足以识别出 15 种癌症类型中的 70-90 (Esteller 等人， (2001) Cancer Res.61 ： 3225-9)。开发用于原发性肿瘤的甲基化谱分析 (methylation profile) 可

16、被用于肿瘤细胞系以精确地识别原发性肿瘤的亲本肿瘤的组织起源 (Graziano 等人， (2004)Clin.Cancer Res.10 ： 2784)。这个结果暗示， 不同肿瘤类型的甲基化标志并不明显 地受与培养物中的生长相关的选择性压力的影响。 甲基化谱分析的可用性将大大增强通过 简单血液测试来检测难以接近的器官中的癌症的能力。 0008 对临床样品中的甲基化的检测使得癌症的早期检测能够实现。 简单且灵敏的多重 检测试验的开发将允许对临床的小样品进行谱分析而获得多个 CpG 岛的状态。这种信息在 诊断和治疗中很有价值。 0009 用于检测 DNA 甲基化的方法 0010 已使用许多方法来检

17、测靶 DNA 中的甲基化 CpG(mCpG)。下文详细描述目前使用的 三种主要方法。 0011 亚硫酸氢盐方法 . 最常用的甲基化检测方法是基于 DNA 的亚硫酸氢盐修饰， 这 种修饰引起胞嘧啶残基脱氨基成为尿嘧啶， 同时保留甲基化胞嘧啶不被改变。PCR 扩增之 后， 将甲基化胞嘧啶复制到胞嘧啶并将尿嘧啶复制到胸腺嘧啶。因此， 在特定位置处胞嘧 啶的保留指示了甲基化。随后， 例如通过序列分析、 甲基化特异性 PCR(MSP)(Herman 等人， (1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93 ： 9821-26) 或杂交 ( 例如与微阵列或印迹杂交 ) 来分 析所修饰的 DN

18、A。在 MSP 中， 将一对甲基化的特异性寡核苷酸引物添加到经亚硫酸氢盐处 理的 DNA， 并且进行 PCR 以扩增靶 DNA。还可以对经亚硫酸氢盐修饰的 DNA 进行基于荧光的 定量实时 PCR(Eads 等人， (2000)Nucl.Acids Res.28 ： E32 ； Zeschnigk 等人， (2004)Nucl. Acids Res.32 ： e125)。 0012 MSP 的经校准的基于荧光的变化方法拓展了实时 PCR 以提供对样品中的甲基化 DNA 数量的定量分析。这些基于 PCR 的方法的重要基本假设在于 ： 几乎没有被引物 / 探针 识别的 CpG 位点会反映靶 CpG

19、 岛的整体状态。虽然这个假设通常对大量甲基化或完全未甲 基化的岛来说属实， 但是部分甲基化的靶可能不易在甲基化或未甲基化特异性反应中被计 分记录 (scored)。 0013 亚硫酸氢盐修饰的优点在于， 它将甲基化位点相对于未甲基化位点进行差异性标 记， 从而允许测序方法检测甲基化模式。克隆的经亚硫酸氢盐处理的 DNA 的测序是用于甲 基化检测最常用的方法。 除比基于MSP的方法提取到更大数量的CpG位点之外， 它还提供了 有关亚硫酸氢盐处理成功的信息。 然而， 由于它的复杂性和费用， 亚硫酸氢盐测序比临床诊 断更好地适于标记物探索。 亚硫酸氢盐处理破坏了大比例的输入DNA， 造成有限的灵敏度

20、和 对大量 DNA 的需求。在进行检测试验之前， 经亚硫酸氢盐处理的 DNA 的质量控制评定是必 要的， 从而避免误导的结果。由于亚硫酸氢盐处理期间不完全的胞嘧啶脱氨基， 基于 MSP 的 试验可能存在假阳性结果。经亚硫酸氢盐处理的 DNA 的扩增受偏好未甲基化的 DNA 的 PCR 偏向性的影响。虽然这个问题通常可通过最佳化引物退火条件来校正， 但是可能使引物设 计和测试变复杂。可使用数字亚硫酸氢盐 PCR 消除模板偏向性。将 DNA 样品稀释到每次反 应小于一个拷贝的平均值， 从而消除模板间的竞争。可在没有由克隆引入的偏向性条件下 将各个分子测序。 说 明 书 CN 102421914 A

21、 CN 102421926 A3/26 页 6 0014 用于分析 mCpG 的使用亚硫酸氢盐处理的商业试剂盒、 试剂和系统是可获得 的。表观遗传学 (Berlin) 提供了 MethyLight 试验的两种变化方法， 是称为定量的 MethyLight(QM) 和 Heavy Methyl(HM) 的定量实时 PCR 的改编方法。QM 利用探针 来产生荧光信号。在扩增过程中， 荧光剂从探针切割， 产生可被实时检测的荧光 (Wojdacz & Dobrovic(2007)Nucl.Acids Res.35 ： e41)。HM 是 QM 的改编方法， 其中将阻断 剂寡核苷酸添加到反应中。这些阻断

22、剂寡核苷酸能防止未甲基化 DNA 的扩增， 产生增大的 试验灵敏度 (Cottrell 等人， (2004)Nucl.Acids Res.32 ： e10)。也用于 对经亚硫酸氢盐修饰的 DNA 的甲基化定量分析， 如来自 Biotage 的 Pyro Q-CpG 系统所例证 (Uppsala， Sweden ； Tost 等人， (2003)Biotechniques 35 ： 152-56)。 0015 虽然亚硫酸氢盐修饰被广泛使用， 但是其所引起的广泛 DNA 降解可在几乎没有分 子足够长而得以扩增时引入取样误差 (Ehrich 等人， (2007)Nucl.Acids Res.35 ：

23、 e29)。此 外， 试验是耗时的， 需要苛刻的碱基变性步骤并由于亚硫酸氢盐处理期间不完全的胞嘧啶 脱氨基而使假阳性结果的概率高。 0016 甲基化灵敏性的限制性内切酶消化方法 . 用于检测 DNA 中的 mCpG 的第二类型的 方法依赖于通过限制性内切核酸酶的差异性切割。用 MSRE( 甲基化灵敏性限制性内切核酸 酶)或MDRE(甲基化依赖性限制性内切核酸酶)处理DNA， 扩增并随后通过微阵列或凝胶电 泳进行分析。诸如 HpaII 和 AciI 的 MSRE 只是在它未甲基化时才切割 DNA 序列。MDRE 是为 达切割而需要 DNA 序列甲基化的限制性内切核酸酶。通过用这些酶中的任一酶来处

24、理 DNA 样品并随后与对照样品相比较， 可确定 DNA 样品的甲基化状态。如果特定 DNA 样品的消化 发生在用 MDRE 处理之后， 那么可假设 DNA 被甲基化。相反地， 如果 DNA 在用 MSRE 处理时未 经切割， 那么可假设样品被甲基化。通过比较经切割 DNA 相对未经切割 DNA 的数量， 可估算 出甲基化的水平。这种类型的甲基化分析的常见读出是所消化的 DNA 的后续扩增和荧光标 记。随后， 可将片段与微阵列文库杂交并通过电泳来分析或简单地解析。 0017 市售的基于限制性内切核酸酶的系统包括 Orion 的利用微阵列读出的 MethylScope(Lippman 等 人，

25、(2004)Nature 430 ： 471-76) 和 使 用 定 量 实 时 PCR 的 MethyScreen(Ordway 等人， (2006)Carcinogenesis 27 ： 2409-23)。 0018 MSRE/MDRE消化的优点在于不必预处理DNA， 尽管在称为COBRA的程序中所述预处 理经常连同 DNA 的亚硫酸氢盐处理一起进行 (Xiong & Laird(1997)Nucl.Acids Res.25 ： 2532-34)。这个程序的一些缺点在于， 它冗长且取决于靶 DNA 内部的 MSRE/MDRE 识别序列 的存在。此外， 这种方法相对低效， 从而可降低结果的可

26、靠性。仅所评定的 CpG 位点是处于 少量限制性内切酶识别位点内部的那些 CpG 位点， 且那些位点的状态可能并不反映所述位 点所属的整个 CpG 岛的状态。不完全消化导致频繁的假阳性， 尤其在裂解反应物会经历后 续的扩增步骤时如此。与诸如 MSP 的亚硫酸氢盐方法相比， 限制性内切核酸酶的酶解试验 的灵敏度较差， 允许检测样品中不少于10的甲基化DNA(Singer-Sam等人， Nucleic Acids Res， 1990.18 ： 687 ； Yegnasubramanian 等人， Nucleic Acids Res.(2006)34 ： e19)。 0019 染色质免疫沉淀方法 .

27、 常用于检测 mCpG 的第三种方法是染色质免疫沉淀法 (ChIP)。通常， 将细胞固定， 并随后通过使用对甲基结合蛋白特异性的抗体而使甲基化的 DNA 免疫沉淀。将所得 DNA 扩增、 标记并通过在微阵列试验中的杂交来分析。这种方法的优 点在于， 可对活细胞进行试验而几乎无需或无需 DNA 纯化。该试验也具有增大的灵敏度， 因 说 明 书 CN 102421914 A CN 102421926 A4/26 页 7 为在分析之前除去了不需要的污染 DNA。然而， ChIP 程序是极其耗时的， 涉及若干步骤并需 要昂贵的试剂。一些试验可能耗费长达 5 天来完成。 0020 使用甲基结合蛋白的方法

28、 . 将甲基化的 DNA 与未甲基化的 DNA 分离的替代的更灵 敏的方法涉及使用甲基-CpG结合域(MBD)蛋白或抗5-甲基-C的抗体。 MBD蛋白对甲基化的 CpG位点具有高的亲和力而对未甲基化的DNA具有极低亲和力(Fraga等人， Nucleic Acids Res.(2003)31 ： 1765-74)。将样品与固定化的 MBD 蛋白以各种格式 ( 磁珠、 柱、 PCR 管壁 ) 一起孵育。甲基化的 DNA 俘获通常后接所俘获 DNA 的扩增。基于 MBD 的 DNA 检测具有的主 要优点在于， 所有甲基化位点都可有助于结合， 从而允许对整个岛取样以用于甲基 -CpGs。 这种特征使

29、结合试验在部分甲基化岛中的未甲基化位点对应于引发位点 / 探针位点时， 不 易倾向于影响基于 MSP 和基于限制性内切核酸酶的试验的假阴性 (Yegnasubramanian 等 人， Nucleic Acids Res.(2006)34 ： e19)。这种情况可能常见于含有早期肿瘤细胞的临床 样品中， 所述肿瘤细胞含有部分甲基化 CpG 岛。基于 MBD 的结合试验极为敏感， 允许检测 500 个未甲基化分子中的少到 160pg 的甲基化 DNA( 相当于约 25 个细胞 ) 或 1 个甲基化分 子 (Gebhard 等人， Nucleic Acids Res.(2006)34 ： e825

30、6)。这接近 MSP 的灵敏度 (1 个甲基 化分子 /1,000 未甲基化分子 )。COMPARE MBD 试验因在结合步骤之前包括了用 HpaII( 一 种 MSRE) 的消化而可与实时 MSP 一样灵敏 (1 个甲基化分子 /10,000 未甲基化分子 )。未甲 基化的 DNA 在 PCR 引发位点之间的位置处的裂解产生了高灵敏度与 DNA 混合物， 所述 DNA 混合物含有完全甲基化的人工甲基化 DNA(Yegnasubramanian 等人， Nucleic Acids Res. (2006)34 ： e19)。然而， 这个策略可遭受与使用限制内切核酸酶相关的缺点， 因为临床样品 中

31、的一些部分甲基化岛会被计为未甲基化的 (Yegnasubramanian 等人， 同上 )。 0021 考虑到CpG甲基化在癌症发展和进程中的重要性， 用于甲基化CpG DNA的快速、 可 靠和灵敏的测试将为癌症筛查提供重要和适用的工具。 0022 发明概述 0023 本发明提供用于检测样品中的靶多核苷酸的方法。所述方法通常涉及， 使含有靶 多核苷酸的样品与引物对接触， 所述引物对与所述多核苷酸的靶序列特异性地杂交并将所 述靶序列扩增。对这个步骤来说， 引物对包括具有与侧接所述靶多核苷酸序列的第一序列 互补的 3序列和 5俘获标签 (capture tag) 的第一引物。所述对的第二引物具有在

32、相 反链上与侧接所述多核苷酸靶序列的第二序列互补的 3序列和提供用于指导流产转录 (Abscription) 的构件 (means) 的 5序列。在使用这种引物对的扩增 ( 例如 PCR) 之后， 使扩增的靶序列与结合 5俘获标签的固定化分子接触， 以俘获所扩增的靶序列。随后， 由 用于指导流产转录的构件转录至少一个 Abscript， 并将所述 Abscript 作为靶多核苷酸存 在的检测指示。 0024 俘获通常是经由亲和力试剂或与或能够与固体支持物结合的结合对来进行。 举例 来说， 5俘获标签可为可容易掺入到寡核苷酸引物中的生物素， 并且与 5俘获标签结合 的分子可为固定在固体支持物上的

33、链霉亲和素 (streptavidin)。诸如珠、 管和微量滴定板 的多种固体支持物均适用于本发明的方法。适宜地， 链霉亲和素和其他结合对分子可与磁 珠结合， 从而允许固相与呈溶液的未结合试剂的快速分离。 在本发明的某些实施方案中， 可 在程序的后续步骤之前， 将未结合试剂、 引物和多核苷酸从固定和俘获的多核苷酸中洗涤， 从而可以提高方法的效率。 然而， 这并非必要的， 因为整个方法可在单个罐或管中进行而无 说 明 书 CN 102421914 A CN 102421926 A5/26 页 8 需分离步骤。 0025 使用例如热稳定 DNA 聚合酶或热稳定 RNA 聚合酶的 PCR 是通常用于

34、扩增步骤。然 而， 本领域中已知的各种靶扩增方法可适用于本发明的方法。 0026 用于检测如本文所述的 Abscript 的各种方法均可利用， 包括但不限于质谱分析 法、 毛细管电泳或薄层色谱法。 在某些方面中， 可将可检测的经标记核苷酸或其他标记掺入 到由本发明的方法产生的 Abscript 信号中， 以增大灵敏度或扩展可使用的检测技术。例 如， 可检测的经标记核苷酸可为荧光核苷酸。 0027 由本发明产生的 Abscript 通常较短， 例如长度为 3-20 个核苷酸。长度少到 3 个 核苷酸的 Abscript 通常用于本文所述的方法。 0028 在扩增期间使用的所述对的第二引物具有在相

35、反链上与侧接所述多核苷酸靶序 列的第二序列互补的 3序列和提供用于指导流产转录的构件的 5序列。 0029 在某些实施方案中， 所述构件是由用于标记或识别靶的 -TAP( 靶连接探针， Target Attachment Probe) 序列来提供。-TAP 被设计成与 TAP 序列互补， 并允许连接 APC( 流产启动子盒， Abortive Promoter Cassette)。为将 -TAP 维持为单链， 进而可用 于与 TAP 序列杂交， 可在 5 -TAP 序列与 3序列之间包括非天然核苷酸， 所述 3序列 与侧接引物中靶的序列互补。诸如亚乙烯基 - 脱氧腺苷的非天然核苷酸在扩增期间不

36、会被 聚合酶识别。因此， 引物中非天然核苷酸下游的序列不被复制， 并且那些序列仍为单链。 0030 一旦 APC 经由所形成的 TAP-TAP 杂交体与扩增的靶结合， 就由 APC 转录作为检 测靶存在的指示物或信号的 Abscript。所结合的 APC 为双链区或因探针的杂交变成双链。 0031 在本发明的某些实施方案中， 全双链体 APC 可在扩增反应期间由包括一个 APC 链 的引物序列产生。适宜地， 可在扩增期间， 通过在反应中包括热稳定 RNA 聚合酶和核苷酸来 进行流产转录。因此， 在这些实施方案中， 用于扩增反应的第二引物包括 APC 序列。由于产 生 ( 例如通过 PCR 产生

37、 ) 双链体 APC， 所以从 APC 来转录 Abscript， 并可在 Abscript 产生 时来检测它们 ( 例如实时检测 )， 或通过本文所述的 Abscript 检测方法在稍后的时间进行 分析。 0032 本发明提供用于检测各种各样目标靶多核苷酸 ( 包括 DNA 靶和 RNA 靶 ) 的快速、 灵敏和特异的方法， 并与 PCR 相比提供扩展全面能力的检测技术。与 PCR 不同， 该方法也适 于检测诸如甲基化 DNA 靶的被修饰的多核苷酸靶。根据这类方法， 首先通过切割含有甲基 化靶多核苷酸 ( 诸如 CpG 岛 ) 的基因组 DNA 样品来分离甲基化的基因组 DNA 片段， 同时

38、限 制性内切酶在切割期间不切割靶多核苷酸或产生靶的合适代表性片段。随后， 使经切割的 基因组 DNA 与诸如本文所述的 GST-MBD2 融合蛋白的固定化甲基结合域接触。这样， 甲基化 的基因组 DNA 片段被固定， 且因此与样品中的非甲基化的 DNA 片段分离。任选地， 甲基化的 基因组 DNA 片段可从固定化的 MBD 中洗脱并在分析之前回收。例如， 在 GST-MBD2 融合蛋白 用于固定甲基化 CpG 岛靶的情况下， 可将融合蛋白的 GST 部分与谷胱甘肽树脂 ( 在与 DNA 相互作用之前或之后 ) 结合， 并可用谷胱甘肽洗脱所结合的甲基化 DNA 片段。 0033 本发明的方法也适

39、于多次复用。根据本发明的某些实施方案， 通过在反应中包括 多个第一和第二引物对来同时处理多种不同的靶多核苷酸， 各引物对被设计成与不同的靶 多核苷酸特异性地杂交。 通过设计用于各种靶的不同的独特APC， 可由所产生的APC信号来 识别多种靶的各种靶的存在， 所述不同的独特 APC 是经由引物扩增 ( 作为含有 APC 的引物 说 明 书 CN 102421914 A CN 102421926 A6/26 页 9 的组成部分或如本文所述经由 TAP-TAP 杂交体 ) 与靶连接。例如， 各 APC 可根据分子量 或核苷酸序列来设计以便可以区分。根据本发明的这些实施方案， 可在单一试验中检测到 至

40、少 5、 10、 20、 50、 100 个或更多的靶。 0034 附图简述 0035 图1示出流产转录(abortive transcription)的过程， 本发明的方 法拓展了此方法。当 RNA 聚合酶 (RNAP) 在启动子处俘获时， 流产转录发生于大多数启动子 上， 重复制得短的流产转录物 (abortive transcript)( 通常长 2 至 12 个 nt)。在流产转录 期间， RNAP 不会移位或离开启动子。在正常转录期间， RNAP 最后经历构象变化成为稳定的 逐渐延伸的复合物(一种称为启动子逃离的过程)， 随后持续转录直到到达终止信号。 已开 发出人工启动子或流产启动

41、子盒 (APC)， 它们俘获流产复合物中的 RNAP， 每分钟反复合成 出数千个相同的短寡核苷酸。各 APC 被设计成制造可分离和定量的具有特定长度和特异序 列的不同 Abscript。 0036 图 2 示出了使用检测蛋白质、 RNA 和 DNA 靶。将 APC 连接于特异性 地与分子靶结合的靶连接探针 (TAP)( 图 2A)。对 DNA 和 RNA 的检测来说， TAP 包括特异性 地与核酸靶杂交的寡核苷酸或特异性地与核酸靶结合的蛋白质 ( 图 2B)。对蛋白质检测来 说， APC 可连接到与蛋白质靶结合的任何分子， 诸如抗体或配体。图 2C 示出本发明的一个 实施方案， 其中 APC

42、与抗体连接。与用于酶联免疫吸附试验 (ELISA) 的策略相似， 可将靶蛋 白质 “夹在” APC- 抗体复合物与固定在固体支持物上的第二抗体之间， 以便俘获和检测蛋白 质靶。 0037 图 3 示出的二核苷酸起始以及添加一个 NTP 之后的终止。可通过包 括如所描绘的链终止 NTP(R3 处的 3 -O-Me-NTP) 或通过从反应中省略一个或多个 NTP 来 限制 Abscript 长度。R1 亲和力标签， 荧光标签 ； R2 OH、 OMe、 H ； R3 OH、 OMe、 H ； R4 OH、 OMe、 H。 0038 图 4A 和图 4B 示出了通过质谱分析法检测 Abscript。

43、通过反相 HPLC 来分级分离 包括起始子GpA和GTP的反应。 将柱的输出引入质谱仪中。 图4A显示了基于 总离子计数与保留时间的函数变化的柱谱分析。图 4B 显示三核苷酸 Abscript GAG 峰的离 子光谱 ( 保留时间 5.4 分钟 )。单电荷和双电荷 GAG 物质的 m/z 值分别为 956.1 和 477.6。 双电荷物质的钠加合物的 m/z 值为 978.2。 0039 图 5 是用于本发明的甲基化检测方法的 GST-MBD 蛋白的结构示意图。图 5A 显示 MBD 域与 GST 域羧基末端的连接。连接所述域的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 1) 含有由箭头 指示的凝血

44、酶切割位点。图 5B 显示用于小鼠 MBD2b 的 DNA 结合域的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 2)。划线的氨基酸对应于 MBD 蛋白的 DNA 结合域中的保守残基 (Ohki 等人， (1999)EMBO J.18 ： 6653-61)。图 5C 显示使用固定化 GST-MBD 的甲基化 DNA 分级分离的结果。S( 上清 液 ) 分级分离物含有扩增的未甲基化的 SNRPN CpG 岛 DNA。E1 含有从固定蛋白质洗脱的扩 增的甲基化 SNRPN CpG 岛 DNA。分级分离物 E2 和 E3 是来自同一固定蛋白质的另外两个系 列的洗脱液。图 5D 显示 Hela 细胞中的未甲基

45、化的 PTGS2 DNA 的分级分离。在未结合的上 清液分级分离物 S 中回收到所有 PTGS2 DNA。 0040 图 6 是流程图， 示出用于基于 -TAP的 CpG 甲基化检测的策略， 包 括 TAP-APC 与靶 CpG 岛的扩增片段的结合。通过数字指示方法中的步骤。图 6A 示出含有 说 明 书 CN 102421914 A CN 102421926 A7/26 页 10 甲基化 CpG 的 DNA 的初始俘获。步骤 1 ： 用固定化 GST-MBD 蛋白使甲基化的 DNA 片段与未 甲基化的 DNA 片段分离。步骤 2 ： 通过热处理或对蛋白酶或谷胱甘肽的暴露释放甲基化的 DNA

46、片段。图 6B 显示扩增标签和所标记 DNA 片段的俘获。步骤 3 ： 用亲和力标记 ( 诸如所 示的生物素 (B) 来标记靶 CpG 岛， 并且在 PCR 期间， 经由掺入生物素化引物和在引物序列 与反 TAP 序列 (-TAP) 之间含有非编码核苷酸的引物进行单链延伸。步骤 4 ： 使生物素化 扩增子与链霉亲和素磁珠结合。步骤 5 ： 通过 TAP 序列与 -TAP 序列之间的杂交将 APC 与 扩增子结合。是通过使 RNA 聚合酶 (RNAP) 与含有 APC 的珠粒固定复合物接 触来进行。 0041 图 7A-7C 示出示例性靶特异性扩增引物与反 TAP(-TAP) 引物 / 探针之间

47、的相互 作用。图 7A 示出用于 CpG 岛扩增的 PCR 引物和它们在扩增子中的相对位置。图 7B 和图 7C 示出因设计较差的 -TAP 引物 / 探针的不利试验结果。 0042 图 8 显示出PCR 相对图 6 中描绘的方法的 DNA 检测 相对灵敏度。从起始拷贝数 /PCR 为 9000 到 30 开始扩增来自未分级分离的甲基化 HeLa DNA 的 GSTP1 CpG 岛的片段。图 8A 显示结果。引物是 SEQ ID NO ： 3 和 SEQ ID NO ： 4。检测 9000 个拷贝需要 28 次 PCR 循环。图 8B 显示 29 次 PCR 循环后 的检测结果。流产转录 /P

48、CR 引物是 SEQ ID NO ： 12 和 SEQ ID NO ： 13。 TAP-APC 是通过退火 SEQ ID NO ： 28 和 SEQ ID NO ： 32 来制得。APC 编码 Abscript GAG。使 用薄层色谱法 (TLC) 和 UV 造阴影法检测 Abscript。面积指的是含有 Abscript 的色谱峰的 面积。 0043 图 9 显示了对指定数量的输入 DNA 进行 PCR 扩增， 接着进行 2 小时和 8 小时的 之后， 使用 TLC 的 CY5 标记 Abscript 检测。 0044 图 10 是流程图， 显示在使用 APC- 引物的情况下， 使用 APC

49、 向扩增子中的直接掺入 时的用于甲基化 DNA 检测的策略。数字指示策略中的步骤。步骤 1 和 2 描绘使用如图 6A 所示的固定化 GST-MBD 蛋白的甲基化 DNA 的分级分离。步骤 3 显示中靶序列与用于将 APC 连接到扩增子的引物之间的关系。左侧的引物是常规 PCR 引物。右侧引物具有 3引发 序列和 5末端处的单链 APC。步骤 4 和 5 表示靶标的 PCR 扩增。步骤 6 表示 PCR 之后的 步骤。PCR 反应物补充有 RNA 聚合酶、 起始子和一种或多种 NTP。 0045 图 11 示出用于 GAPDH CpG 岛的 APC 启动子对的证实。图 11A 显示了对归结于因 APC引物C443的自引发的背景信号和归结于C443(SEQ ID NO ： 33)与反向引物C446(SEQ ID NO ： 34) 之间的引物 - 二聚体的形成的背景的评估。在 56.4至 68.5的退火温度范围内 进行了缺乏仅含有 C443 或含有 C443 和 C446 的组合的 DNA 的 PCR 反应， 接着进行 1 小时的 通过 TLC-UV 造阴影法分析 Abscript 的产生。只有含有 HeLa DNA 的阳性对 照才产生 Abscript GAG。图 11B 显示来自同一样品组的 Abscript 的 LC-MS 检测结果。