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1、(10)申请公布号 CN 102618568 A (43)申请公布日 2012.08.01 CN 102618568 A *CN102618568A* (21)申请号 201210052690.6 (22)申请日 2012.03.02 C12N 15/70(2006.01) C12N 15/60(2006.01) C12N 1/21(2006.01) (71)申请人 浙江工商大学 地址 310018 浙江省杭州市下沙高教园区学 正街 18 号 (72)发明人 于平 (74)专利代理机构 浙江杭州金通专利事务所有 限公司 33100 代理人 徐关寿 (54) 发明名称 一种高产肝素酶的原核表达载。
2、体的构建方 法 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 高 产 肝 素 酶 的 原 核 表 达 载 体 的 构 建 方 法， 其 特 征 在 于， 包 括 以 下 步 骤 ：以 F1 和 R1 为 引 物， F1 ： 5 -TAGAATTCCAGCAAAAAAAATCCG-3 、 R1 ： 5 -GGC AAGCTTGTCTGGCAGTTTCGCTGTA-3 ； 利用 PCR 反应 扩增得到如 SEQIDNO.1 所示的编码肝素酶的基 因序列 ； 将上述编码肝素酶的基因序列连接至 pET-28a 载体上， 得重组表达载体 pET28a-HpaI ； 将重组表达载体 pET28a-Hpa。
3、 质粒转入大肠杆 菌 BL21 菌株。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 2 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种高产肝素酶的原核表达载体的构建方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： (a) 以 F1 和 R1 为引物， F1 ： 5 -TAGAATTCCAGCAAAAAAAATCCG -3 R1 ： 5 -GGCAAGCTTGTCTGGCAGTTTCGCTGTA -3 利用 PCR 反应扩增得到如 SEQ ID NO.1 所示。
4、的编码肝素酶的基因序列 ； (b) 将上述编码肝素酶的基因序列连接至 pET-28a 载体上， 得重组表达载体 pET28a-HpaI ； (c) 将重组表达载体 pET28a-Hpa 质粒转入大肠杆菌 BL21 菌株。 2. 如权利要求 1 所述的构建方法， 其特征在于， 步骤 a 中， PCR 反应体系为 ： 10Buffer 5l， MgCl2 3l， dNTP 1l， DNA 1l， Taq酶0.5l， 引物混合物2l， 双蒸水 37.5l ； 反应参数为 ： 97 5min， 97 50s、 55 50s、 72 1min 共 30 个循环， 最后在 72延伸 10min。 权 利 。
5、要 求 书 CN 102618568 A 2 1/3 页 3 一种高产肝素酶的原核表达载体的构建方法 技术领域 0001 本发明属于基因工程领域， 特别涉及一种高产肝素酶的原核表达载体的构建方 法。 背景技术 0002 肝素酶 (heparanase， Hpa) 是近年来研究较多的一类 D- 糖苷内切酶， 它不仅存在 于正常的组织中， 如胎盘和淋巴器官， 其对胚胎的形成， 新血管的生成， 神经系统的发育， 炎 症反应等都发挥着正常的生理功能 ； 同时也存在于多种恶性肿瘤细胞的表面， 能够促进细 胞的侵袭和转移， 诱导肿瘤血管生成， 从而降低肿瘤患者的生存率。目前， 研究的重点在于 如何抑制肿瘤。
6、细胞表面表达的肝素酶活性， 从而有效治疗肿瘤。 肝素酶的用途极其广泛， 其 在低分子量肝素及肝素寡糖的制备， 肝素及肝素类分子的结构测定， 控制肿瘤细胞的生长 和转移以及清除血液中残存肝素等方面都具有重要作用。自从 Payza 等在肝素黄杆菌中发 现肝素酶以来， 人们在许多微生物中都发现了肝素酶的存在， 是近期研究的热点。 肝素黄杆 菌来源的肝素酶可以分为肝素酶、 和三类， 其酶基因的克隆表达、 蛋白的纯化和性质 研究、 以及酶蛋白的改造等相关研究已经有所报道， 在作用机制和生物学活性等方面也都 有了一定的认识。但目前只有肝素黄杆菌和环状芽孢杆菌的肝素酶基因得到了克隆和表 达， 而商品化的肝素。
7、酶都来源于肝素黄杆菌。 0003 近期研究发现肝素作为长期以来用于治疗和预防血栓的药物对于人体具有一定 的副作用， 如影响血小板的稳定， 从而导致手术后大出血等。而分子量在 4000-8000 的低分 子量肝素 (LMWH) 则能够在不产生显著副作用的情况下有效地治疗血栓。截至目前为止， 低 分子量肝素已经逐步取代肝素成为了首选的治疗药物。 低分子量肝素的生产可以分为化学 降解法和酶解法。 酶解法相对于化学降解法而言具有其独特的优点， 例如作用条件温和， 酶 的专一性高， 环境相对友好等， 是较理想的工业生产肝素酶的方法。 但是利用酶解法生产低 分子量肝素的缺点在于 ： (1) 一方面肝素酶的。
8、来源有限， 其野生菌产量很低并且需要价格 昂贵的肝素进行诱导表达， 从而导致生产成本过高。另一方面也是由于肝素酶的重组表达 极易形成无活性的包涵体， 并且不容易复性。(2) 微生物来源的肝素酶是一种裂解酶， 在裂 解反应过程所产生的低分子量肝素的非还原末端的不饱和键严重影响肝素酶的药效， 必须 通过臭氧氧化法去除。我国是肝素原料的出口大国， 但一直未能对低分子量肝素生产技术 进行系统的研究。 目前低分子量肝素主要来自合资企业生产或者由国外进口， 因此， 利用酶 解法生产低分子量肝素的研究应用前景极为广泛。 而肝素酶作为低分子量肝素酶法生产的 原材料， 其高效生产技术的研究则是备受关注的课题。 。
9、发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种高产肝素酶的原核表达载体的构建方法。 0005 一种高产肝素酶的原核表达载体的构建方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： (a) 以 F1 和 R1 为引物， 说 明 书 CN 102618568 A 3 2/3 页 4 F1 ： 5 -TAGAATTCCAGCAAAAAAAATCCG -3 R1 ： 5 -GGCAAGCTTGTCTGGCAGTTTCGCTGTA -3 利用 PCR 反应扩增得到如 SEQ ID NO.1 所示的编码肝素酶的基因序列 ； (b) 将上述编码肝素酶的基因序列连接至 pET-28a 载体上， 得重组表达载体 pET28a。
10、-HpaI ； (c) 将重组表达载体 pET28a-Hpa 质粒转入大肠杆菌 BL21 菌株。 0006 进 一 步 地， ， 步 骤 a 中， PCR 反 应 体 系 为 ： 10Buffer 5l， MgCl2 3l， dNTP 1l， DNA 1l， Taq 酶 0.5l， 引物混合物 2l， 双蒸水 37.5l ； 反应参数为 ： 97 5min， 97 50s、 55 50s、 72 1min 共 30 个循环， 最后在 72延伸 10min。 0007 本发明构建了肝素黄杆菌肝素酶的原核表达载体。通过应用 PCR 技术合 成了肝素酶基因序列， 将该基因序列克隆至载体 pET-28。
11、a 中 , 得到重组表达载体 pET-28a-Hpa ， 再通过 CaCl2转化大肠杆菌， 根据生长情况快速筛选出肝素酶活性较高的 阳性克隆转化子 Hpa ， 该肝素酶目前可以通过大肠杆菌发酵生产， 具有良好的应用前景。 附图说明 0008 图 1 为本发明的构建流程图。 0009 图 2 是重组蛋白在E. coli BL21 中的表达产物电泳图。其中 ： M ： . 低分子量标准 蛋白 ； 条带1 ： pET-28a空载诱导 ； 条带2 ： 重组表达载体pET-28a- Hpa未诱导 ； 条带3 ： 重 组表达载体 pET-28a Hpa 诱导 3 h ； 条带 4 ： 重组表达载体 pET。
12、-28a- Hpa 诱导 4 h ； 条带 5 ： 重组表达载体 pET-28a- Hpa 诱导 5 h ； 条带 6 ： 重组表达载体 pET-28a- Hpa 诱导 6 h ； 条带 7 ： 超声裂解后的上清 ； 条带 8. ： 超声裂解后的沉淀。 具体实施方式 0010 实施例 1. 肝素黄杆菌肝素酶基因序列的获得 根据肝素酶的基因序列， 设计以下引物 ： F1 ： 5 -TAGAATTCCAGCAAAAAAAATCCG -3 R1 ： 5 -GGCAAGCTTGTCTGGCAGTTTCGCTGTA -3 利用 PCR 反应扩增编码肝素酶的基因序列， PCR 反应体系为 (50l) ： 。
13、10Buffer 5l， MgCl2 3l， dNTP 1l， DNA 1l， Taq 酶 0.5l， 引物混合物 2l， 双蒸水 37.5l。反应参数为 ： 97 5min， (97 50s， 55 50s， 72 1min) 共 30 个循环， 最后 在 72延伸 10min， 琼脂糖凝胶电泳回收 PCR 产物， 回收产物送上海生工生物工程有限公 司测序， 所得序列如 SEQ ID NO.1 所示。 0011 实施例 2. 重组大肠杆菌表达载体的构建 用EcoR 和Hind 分别双酶切 PCR 扩增产物和 pET-28a 质粒 DNA， 琼脂糖凝胶电泳 回收目的条带， 用 T4DNA 连接。
14、酶连接回收的目的条带， 得到原核表达载体 pET28a-HpaI， 用 CaCl2法 42热激 90 秒将其转化到大肠杆菌 BL21。利用 Kana 抗性筛选单菌落。所选转化 克隆经PCR、 酶切鉴定和DNA测序测定证明克隆正确后送上海生物工程有限公司测序。 具体 构建流程见图 1。 0012 实施例 3. 重组大肠杆菌表达载体的转化和筛选 说 明 书 CN 102618568 A 4 3/3 页 5 将鉴定正确的重组表达载体 pET28a-Hpa 质粒转入大肠杆菌 BL21 菌株， 加入 0.5mmol/L的IPTG诱导表达9h， 加入磷酸缓冲液重悬细胞， 超声波破碎得到肝素粗酶液。 利 用。
15、 Azure A 法测定肝素酶活性， 筛选出表达肝素酶活最高的菌株 Hpa （47） 。 0013 实施例 4. 肝素酶在大肠杆菌中的表达 在5 ml含50 mg/L Kan的LB液体培养基中， 按1 ： 50接种BL21-pET-28a- Hpa菌液， 37， 220 rpm 振荡培养过夜 ； 次日接种培养过夜的菌液至含 50 mg/L Kan 的新 LB 液体培 养基中， 37， 220 rpm 振荡培养至 OD600 0.5 左右 ； 每管分别加入 IPTG 至终浓度为 0.5 mmol/L， 28诱导表达 ； 分别在诱导 3 h、 4 h、 5 h、 6 h 后收集菌液， 4， 120。
16、00 rpm 高速离 心收集菌体 ； 加入 2 ml 0.025 M Na2HPO4-NaH2PO4（pH 6.8） 缓冲液重悬洗涤菌体， 4， 12000 rpm 离心 20 min， 弃上清。重复洗涤菌体一次。加入 1 ml 上述缓冲液重悬菌体。冰 浴中超声悬浮细胞 （工作 6 s， 间隔 6 s， 功率 200， 次数 100 次） 后， 12000 rpm 离心 10 min， 取上清即为粗酶液。SDS-PAGE 电泳检测， 如图 2 所示。在 44.3 kDa 位置附近出现一条高表 达量的特异性条带， 分子量大小约为 42.9 kDa， 与理论值相符。 0014 本技术领域中的普通技。
17、术人员应当认识到， 以上的实施例仅是用来说明本发明， 而并非作为对本发明的限定， 只要在本发明的实质范围内， 对以上所述实施例的变化、 变型 都将落在本发明权利要求书的范围内。 说 明 书 CN 102618568 A 5 1/2 页 6 SEQUENCE LISTING 浙江工商大学 一种高产肝素酶的原核表达载体的构建方法 3 PatentIn version 3.3 1 1214 DNA 肝素酶 1 gggacctcgc cttcctttcg ggctttgtta gcagccggat ctcagtggtg gtggtggtgg 60 tgctcgagtg cggccgcaag cttgt。
18、cgacg gagctcgaat tcggatccgc gacccatttg 120 ctgtccacca gtcatgctag ccatatggct gccgcgcggc accaggccgc tgctgtgatg 180 atgatgatga tggctgctgc ccatggtata tctccttctt aaagttaaac aaaattattt 240 ctagagggga attgttatcc gctcacaatt cccctatagt gagtcgtatt aatttcgcgg 300 gatcgagatc tcgatcctct acgccggacg catcgtggcc ggc。
19、atcaccg gcgccacagg 360 tgcggttgct ggcgcctata tcgccgacat cacgatgggg aagatcgggc tcgccacttc 420 gggctcatga gcgcttgttt cgcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc gggggactgt 480 tgggcgccat ctccttgcat gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac ggcctcaacc 540 tactactggg ctgcttccta atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga gatcccggac 6。
20、00 序 列 表 CN 102618568 A 6 2/2 页 7 accatcgaat ggcgcaaaac ctttcgcggt atggcatgat agcgcccgga agagagtcaa 660 ttcagggtgg tgaatgtgaa accagtaacg ttatacgatg tcgcagagta tgccggtgtc 720 tcttatcaga ccgtttcccg cgtggtgaac caggccagcc acgtttctgc gaaaacgcgg 780 gaaaaagtgg aagcggcgat ggcggagctg aattacattc ccaaccgcgt g。
21、gcacaacaa 840 ctggcgggca aacagtcgtt gctgattggc gttgccacct ccagtctggc cctgcacgcg 900 ccgtcgcaaa ttgtcgcggc gattaaatct cgcgccgatc aactgggtgc cagcgtggtg 960 gtgtcgatgg tagaacgaag cggcgtcgaa gcctgtaaag cggcggtgca caatcttctc 1020 gcgcaacgcg tcagtgggct gatcattact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg 1080 tgga。
22、gctgcc tgcactatgt ccggcgttat tttctgatgt ctctgaccag acacccatca 1140 cagtattatt ttctccatga agacgtacgc gactgggcgt ggagcatctg ggtcgcattg 1200 ggtccaccag ccaa 1214 2 24 DNA 人工序列 2 tagaattcca gcaaaaaaaa tccg 24 3 28 DNA 人工序列 3 ggcaagcttg tctggcagtt tcgctgta 28 序 列 表 CN 102618568 A 7 1/1 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102618568 A 8 。