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1、(10)申请公布号 CN 102586452 A (43)申请公布日 2012.07.18 CN 102586452 A *CN102586452A* (21)申请号 201210062791.1 (22)申请日 2012.03.12 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) (71)申请人 上海海洋大学 地址 201306 上海市浦东新区沪城环路 999 号 (72)发明人 孙晓红 苏晨曦 卢瑛 赵勇 潘迎捷 (74)专利代理机构 上海硕力知识产权代理事务 所 31251 代理人 王法男 (54) 发明名称 一种副溶血性弧菌检测试剂盒及其检测方法 (57) 。
2、摘要 本发明涉及的一种副溶血性弧菌的检测试剂 盒， 其特征在于 ： 它包括 (1) 免疫富集反应体系组 分 ： (2) 环介导等温核酸扩增体系组分 ： (3) 一套 基于副溶血性弧菌 tlh 基因的环介导等温扩增技 术的特异性引物 ： 两条外引物 F3、 B3， 、 两条内引 物 FIP、 BIP， 两条环引物 LF， LB。采用免疫富集和 环介导等温扩增技术相结合的方法检测副溶血性 弧菌。 采用副溶血性弧菌多克隆抗体， 制备免疫磁 珠， 采用免疫学方法进行实际样品中副溶血性弧 菌的初筛， 再根据其种属特异性基因 tlh 基因设 计 LAMP 特异性引物， 在核酸水平进行分子手段的 检测， 从。
3、而有效的避免了单纯的免疫学方法或者 分子方法检测假阳性或漏检情况， 是副溶血性弧 菌快速检测的新发展方向。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种副溶血性弧菌的检测试剂盒， 其特征在于它包括 ： (1) 免疫富集反应体系组分 ： 偶联了副溶血性弧菌多克隆抗体的直径 1.0-2.8m 免疫磁珠 ； 含 0.02 w/v 叠氮化 钠、 以及含0.1w/v牛血清白蛋白的pH为7.4的磷酸盐缓冲液组成的免疫磁珠保护液 ； 含 有 1。
4、 w/v 牛血清白蛋白的 pH 为 7.4 的磷酸盐缓冲液组成的免疫磁珠工作液 ； 0.05mol/L、 pH 为 6.4 的三羟甲基氨基甲烷 - 盐酸缓冲液作为免疫富集反应液 ； 含 0-0.1 Tween-20 的 pH 为 7.4 的磷酸盐缓冲液作为免疫富集洗脱液 ； (2) 环介导等温核酸扩增体系组分 ： 反应缓冲液由 20mM KCl ； 20mM(NH4)2SO4、 40mM Tris、 8mM MgSO4、 0.2 Tween-20 组成 的反应缓冲液 ； 含 10mM dNTP ； 20M FIP/BIP、 20MLF/LB ； 8000U/ml Bst DNA 聚合酶 ； 2。
5、00M 羟基萘酚蓝 ； (3) 一套基于副溶血性弧菌 tlh 基因的环介导等温扩增技术的特异性引物 ： 两条外引 物 F3 和 B3、 两条内引物 FIP 和 BIP、 两条环引物 LF 和 LB。 2. 如权利要求 1 所述的一种副溶血性弧菌的检测试剂盒， 其特征在于 ： 所述的两条外 引物 F3 和 B3、 两条内引物 FIP 和 BIP、 两条环引物 LF 和 LB， 其序列分别如下 ： F3 5 -GATACTCACGCCTTGTTCGA-3 B3 5 -TGCAACATAGCGGTGAGTTG-3 FIP 5 -CGACAGACGATGAGCGGTTGAT-CCGAAGAGCACGG。
6、TTTCG-3 BIP 5 -CCACGCATTGCGCTCTGAGT-TGTTGTTGGATGCGTGACAT-3 LF 5 -AGGATCGCTCGCGTTCA-3 LB 5 -CAGCGTCTGGTGCTGAGAAG-3 。 3. 如权利要求 1 所述的一种副溶血性弧菌的检测试剂盒， 其检测方法为 ： (1) 取免疫磁珠溶液不少于 0.75mg， 经磁力架富集分离去除免疫磁珠保护液， 等体积 加入免疫磁珠工作液， 备用 ； (2) 在反应管中加入免疫富集反应液和待检测样品共 50ml， 再加入备用的免疫磁珠， 洗脱管中加入免疫富集洗脱液 35ml， 采用仪器进行免疫富集， 反应结束后， 。
7、加入 100l PBS 重悬免疫磁珠， 备用 ； (3) 取免疫磁珠和菌体细胞的复合物 100l， 5000rpm/min， 离心 1min， 去除上清液， 加 入 50l 去离子水， 95， 煮沸 5min， 热裂解法提取 DNA 后置于 4冰箱备用。 (4) 按反应缓冲液， 12.5l ； 10mM dNTP， 1l ； 20M F3/B3， 0.5l ； 20M FIP/BIP， 2l ； 20M LF/LB， 1l ； 8000U/mL Bst DNA 聚 合 酶， 1l ； 200MHNB， 2l ； DNA 模 板， 2l 配置反应体系， 实现环介导等温核酸扩增 ； 反应体系反应温。
8、度为 64， 时间为 30min， 85灭活 5min ； 最后用肉眼观察反应后颜色变化， 并根据潘冬色卡判定结果。 权 利 要 求 书 CN 102586452 A 2 1/7 页 3 一种副溶血性弧菌检测试剂盒及其检测方法 技术领域 0001 本发明属于生物检测领域， 具体地说涉及一种副溶血性弧菌的检测试剂盒及其检 测方法， 可广泛应用于各级食品药品监督管理机构、 出入境检验检疫机构、 疾病预防控制机 构等对水产食品中的副溶血性弧菌的检测和监测。 背景技术 0002 副溶血性弧菌 (Vibrio parahaemolyticus， Vp) 是一种嗜盐性细菌， 隶属弧菌科 中的弧菌属， 19。
9、50 年在日本发生的一次食物中毒事件中发现并分离得到。它主要存在于海 水、 鱼、 虾、 贝类和腌醉制生食动物性海产品中。 其引起的食物中毒， 临床上以腹痛、 呕吐、 腹 泻等为主要症状。目前， 在我国沿海城市副溶血性弧菌引起的食物中毒在细菌性食物中毒 事件中所占比例已经超过沙门氏菌、 大肠杆菌 O157:H7、 金黄色葡萄球菌等， 位居首位。而 且副溶血性弧菌所致食物中毒也呈世界性分布， 发病呈上升趋势。美国和欧盟等国家对进 口养殖鱼类， 虾类以及其相关加工制品都要求副溶血性弧菌不得检出。因此， 检测水产品 中的副溶血弧菌对于食物中毒的预防、 水产食品的安全监测及市场健康有序运行具有重要 意义。
10、。目前， 针对副溶血性弧菌的检测大多都采用 PCR、 实时定量 PCR、 DNA 探针和 ELISA 等 方法， 不仅有成本高、 耗时长、 灵敏度低等缺点， 而且无法实现高通量处理样品， 不能满足诸 多食品安全监测机构的需要。 因此， 副溶血性弧菌的检测迫切需要发展快速、 简便、 可靠、 实 用、 高灵敏度和高特异性的高通量检测方法。 0003 环介导等温扩增 (Loop mediated isothermal amplification， LAMP) 技术是 Notomi于2000年报道的一种等温核酸扩增方法。 它利用6种特异性引物， 在链置换活性的 DNA 聚合酶的作用下完成 DNA 的体。
11、外扩增， 15min-1h 之内扩增效率就可达到 109-1010 个拷 贝， 其灵敏度是普通PCR方法的10-100倍。 LAMP法不需要昂贵的实验设备， 只需要60-65 的水浴即可完成， 且通过肉眼观察浊度或颜色变化就可判读结果。具有简便、 快速、 成本低 廉、 高灵敏度等特点。 该技术在临床疾病的诊断、 流行性细菌或病毒的定性定量检测以及动 物胚胎性别鉴定等方面得到广泛应用。目前， LAMP 技术应用于副溶血性弧菌的检测已有相 关报道， 检测基因涉及到 tlh， tdh， trh， toxR 基因。虽然该技术仅需 1h 内就可以完成检测， 但是应用在对实际样品中的副溶血性弧菌靶基因诊断。
12、时， 繁杂的样品前处理过程影响了该 技术的检测效率。 0004 免疫磁分离(Immonumagnetic Separation， IMS)技术是一种用来做细胞分离和微 生物富集捕获的样品前处理方法。 IMS可以有效的富集目的细胞， 并有效的去除食品样品或 临床样品中的抑制因子， 缩短增菌时间， 是有效的样品前处理方法。 0005 与单纯的 LAMP 检测技术相比， 采用 IMS 进行样品液前处理， 可以有效的富集目的 菌， 缩短增菌时间， 去除食品样品中的环境抑制因子， 为后续的检测提供便利、 节省时间、 提 高灵敏度。目前， 采用免疫富集和 LAMP 技术联合使用的报道多见于病毒类的研究， 。
13、如甲型 流感病毒。目前尚未有采用 IMS-LAMP 对副溶血性弧菌进行高通量检测的相关报道。 说 明 书 CN 102586452 A 3 2/7 页 4 发明内容 0006 本发明的目的在于 ： 提供一种副溶血性弧菌的检测试剂盒， 使其具有操作简单、 快 速、 特异性好、 灵敏度高等优势， 为各级食品安全检测机构实现对副溶血性弧菌的快速、 准 确检测和监测提供技术支持。 0007 本发明需要解决的技术问题在于 ： 提供一套副溶血性弧菌的检测方法， 该方法结 合免疫学方法和分子技术， 可直接从复杂样品中检测副溶血性弧菌。 0008 本发明需要解决的技术问题还在于， 提供一套基于副溶血性弧菌 t。
14、lh 基因的环介 导等温扩增技术的特异性引物， 为副溶血性弧菌检测试剂盒的高灵敏度和高特异性提供保 障。 0009 为了实现上述目的， 本发明采用以下技术措施 ： 0010 这种副溶血性弧菌的检测试剂盒， 其特征在于它包括 ： 0011 (1) 免疫富集反应体系组分 ： 0012 偶联了副溶血性弧菌多克隆抗体的直径 1.0-2.8m 免疫磁珠 ； 含 0.02 w/v 叠 氮化钠、 以及含 0.1 w/v 牛血清白蛋白的 pH 为 7.4 的磷酸盐缓冲液组成的免疫磁珠保护 液 ； 含有1w/v牛血清白蛋白的pH7.4为磷酸盐缓冲液的免疫磁珠工作液 ； 含三羟甲基氨 基甲烷 - 盐酸缓冲液 0.。
15、05mol/L、 pH 为 6.4 免疫富集反应液 ； 含 0-0.1 Tween-20 免疫富 集洗脱液。 0013 (2) 环介导等温核酸扩增体系组分 ： 0014 反应缓冲液由20mM KCl ； 20mM(NH4)2SO4、 40mM Tris、 8mM MgSO4、 0.2Tween-20组 成的反应缓冲液 ； 含 10mM dNTP ； 20M FIP/BIP、 20MLF/LB ； 8000U/ml Bst DNA 聚合酶 ； 200M 羟基萘酚蓝。 0015 (3) 一套基于副溶血性弧菌 tlh 基因的环介导等温扩增技术的特异性引物 ： 两条 外引物 F3、 B3， 、 两条内。
16、引物 FIP、 BIP， 两条环引物 LF， LB。 0016 所述的两条外引物 F3、 B3、 两条内引物 FIP、 BIP、 两条环引物 LF， LB 其序列分别如 下 ： 0017 F3 5 -GATACTCACGCCTTGTTCGA-3 0018 B3 5 -TGCAACATAGCGGTGAGTTG-3 0019 FIP 5 -CGACAGACGATGAGCGGTTGAT-CCGAAGAGCACGGTTTCG-3 0020 BIP 5 -CCACGCATTGCGCTCTGAGT-TGTTGTTGGATGCGTGACAT-3 0021 LF 5 -AGGATCGCTCGCGTTCA-3 。
17、0022 LB 5 -CAGCGTCTGGTGCTGAGAAG-3 。 0023 所述的一种副溶血性弧菌的检测试剂盒， 其检测方法为 ： 0024 (1) 取免疫磁珠溶液不少于 0.75mg， 经磁力架富集分离去除免疫磁珠保护液， 等 体积加入免疫磁珠工作液， 备用 ； 0025 (2) 在反应管中加入免疫富集反应液和待检测样品共 50ml， 再加入备用的免疫磁 珠， 洗脱管中加入免疫富集洗脱液 35ml， 采用仪器进行免疫富集， 反应结束后， 加入 100l PBS 重悬免疫磁珠， 备用 ； 0026 (3) 取免疫磁珠和菌体细胞的复合物 100l， 5000rpm/min， 离心 1min。
18、， 去除上清 液， 加入 50l 去离子水， 95， 煮沸 5min， 热裂解法提取 DNA 后置于 4冰箱备用。 说 明 书 CN 102586452 A 4 3/7 页 5 0027 (4) 按反应缓冲液， 12.5l ； 10mM dNTP， 1l ； 20M F3/B3， 0.5l ； 20M FIP/ BIP， 2l ； 20M LF/LB， 1l ； 8000U/ml Bst DNA 聚 合 酶， 1l ； 200MHNB， 2l ； DNA 模板， 2l 配置反应体系实现环介导等温核酸扩增 ； 反应体系反应温度为 64， 时间为 30min， 85灭活 5min ； 最后用肉眼观。
19、察反应后颜色变化， 并根据潘冬色卡判定结果。 0028 根据以上技术方案提出的这种副溶血性弧菌的检测试剂盒及其检测方法同现有 技术相比， 通过将免疫富集和环介导等温扩增技术相结合， 从样品液制备到判定结果耗时 70min， 检测灵敏度可达到3.79log CFU/25g。 具有操作过程简便、 耗时短、 特异性强、 灵敏度 高等特点。该方法能有效的分析样品带菌状态， 能实现高通量处理样品， 大大节省劳动力， 可广泛应用于各级食品药品监督管理机构、 疾病预防控制实验室等对水产品和临床病人胃 肠道呕吐物、 血液、 粪便等样品中副溶血性弧菌的富集捕获和后续检测。 附图说明 0029 图 1 为 IMB。
20、s-LAMP 反应检测副溶血性弧菌的浊度结果试管展示图 ； 0030 图 2 为 IMBs-LAMP 反应检测副溶血性弧菌的电泳结果示意图 ； 0031 图 3 为 IMBs-LAMP 灵敏度检测的电泳结果示意图。 0032 图 1 中 ： 1- 副溶血性弧菌阳性结果 2- 副溶血性弧菌阴性结果 3- 白色沉淀。 0033 图 2 中 ： M-Marker 1- 副溶血性弧菌阳性结果 2- 副溶血性弧菌阴性结果 3- 以 水作为空白对照的结果 0034 图 3 中 ： M-Marker ；“+” ： 阳性对照 ； 1 ： 起始接种量为 8.79log CFU/25g ； 2-7.79log C。
21、FU/25g ； 3 ： 6.79log CFU/25g ； 4 ： 5.79log CFU/25g ； 5 ： 4.79logCFU/25g ； 6 ： 3.79log CFU/25g ； 7 ： 2.79log CFU/25g ； C ： 空白对照 ； 9 ： 阴性对照 具体实施方式 0035 本发明提出的试剂盒工作原理是 ： 本试剂盒采用免疫富集和环介导等温扩增技术 相结合的方法检测副溶血性弧菌。 采用副溶血性弧菌多克隆抗体， 制备免疫磁珠， 采用免疫 学方法进行实际样品中副溶血性弧菌的初筛， 再根据其种属特异性基因 tlh 基因设计 LAMP 特异性引物， 在核酸水平进行分子手段的检测。
22、， 从而有效的避免了单纯的免疫学方法或者 分子方法检测假阳性或漏检情况， 是副溶血性弧菌快速检测的新发展方向。 0036 以下结合附图进一步阐述本发明， 并给出本发明的实施例。 0037 这种副溶血性弧菌的检测试剂盒， 其特征在于它包括 ： 0038 (1) 免疫富集反应体系组分 ： 0039 偶联了副溶血性弧菌多克隆抗体的直径 1.0-2.8m 免疫磁珠 ； 含 0.02 w/v 叠 氮化钠、 以及含 0.1 w/v 牛血清白蛋白的 pH 为 7.4 的磷酸盐缓冲液组成的免疫磁珠保护 液 ； 含有 1 w/v 牛血清白蛋白的 pH 为 7.4 的磷酸盐缓冲液的免疫磁珠工作液 ； 0.05mo。
23、l/ L、 pH为6.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液作为免疫富集反应液 ； 含0-0.1Tween-20 的 pH 为 7.4 的磷酸盐缓冲液组成的免疫富集洗脱液。 0040 (2) 环介导等温核酸扩增体系组分 ： 0041 反应缓冲液由 20mM KCl ； 20mM(NH4)2SO4、 40mM Tris、 8mM MgSO4、 0.2 Tween-20 组成 ； 10mM dNTP ； 20M F3/B3 ； 20M FIP/BIP ； 20MLF/LB ； 8000U/ml Bst DNA 聚合酶 ； 说 明 书 CN 102586452 A 5 4/7 页 6 200M 羟基萘酚蓝。
24、。 0042 (3) 一套基于副溶血性弧菌 tlh 基因的环介导等温扩增技术的特异性引物 ： 两条 外引物 F3 和 B3、 两条内引物 FIP 和 BIP、 两条环引物 LF 和 LB。 0043 所述的两条外引物 F3 和 B3、 两条内引物 FIP 和 BIP、 两条环引物 LF 和 LB 其序列 分别如下 ： 0044 F3 5 -GATACTCACGCCTTGTTCGA-3 0045 B3 5 -TGCAACATAGCGGTGAGTTG-3 0046 FIP 5 -CGACAGACGATGAGCGGTTGAT-CCGAAGAGCACGGTTTCG-3 0047 BIP 5 -CCAC。
25、GCATTGCGCTCTGAGT-TGTTGTTGGATGCGTGACAT-3 0048 LF 5 -AGGATCGCTCGCGTTCA-3 0049 LB 5 -CAGCGTCTGGTGCTGAGAAG-3 。 0050 所述的这种副溶血性弧菌的检测试剂盒， 其检测方法为 ： 0051 (1) 取免疫磁珠溶液不少于 0.75mg， 经磁力架富集分离去除免疫磁珠保护液， 等 体积加入免疫磁珠工作液， 备用。 0052 (2) 在反应管中加入免疫富集反应液和待检测样品共 50ml， 再加入备用的免疫磁 珠， 洗脱管中加入免疫富集洗脱液 35ml， 采用仪器进行免疫富集， 反应结束后， 加入 10。
26、0l PBS 重悬免疫磁珠， 备用。 0053 (3) 取免疫磁珠和菌体细胞的复合物 100l， 5000rpm/min， 离心 1min， 去除上清 液， 加入 50l 去离子水， 95， 煮沸 5min， 热裂解法提取 DNA 后置于 4冰箱备用。 0054 (4) 按反应缓冲液， 12.5l ； 10mM dNTP， 1l ； 20M F3/B3， 0.5l ； 20M FIP/ BIP， 2l ； 20M LF/LB， 1l ； 8000U/ml Bst DNA 聚 合 酶， 1l ； 200M HNB， 2l ； DNA 模板， 2l 配置反应体系实现环介导等温核酸扩增 ； 反应体系。
27、反应温度为 64， 时间为 30min， 85灭活 5min ； 最后用肉眼观察反应后颜色变化， 并根据潘冬色卡判定结果。 0055 实施例 1 0056 下面对本发明的具体内容作进一步的说明 ： 0057 一、 采用副溶血性弧菌的多克隆抗体， 利用 EDC/NHS 活化法将所述副溶血性弧菌 的多克隆抗体偶联在表面包被着羧基的磁珠上， 获得制备副溶血性弧菌的免疫磁珠。 0058 羧基磁珠偶联副溶血性弧菌多克隆抗体的具体操作如下 ： 0059 取 1ml 磁珠于 2ml 的离心管中， 用 25mM 的 2-(N- 吗啉代 ) 乙磺酸 MES(pH5) 洗涤 磁珠两次。再加入 500l EDC( 。
28、碳二亚胺， 50mg/ml) 和 500l NHS(N- 羟基琥珀酰亚胺， 50mg/ml)， 混合均匀， 室温反应30min。 将200l6.39mg/ml的多抗加入到经过活化的磁珠， 再加入 MES 补足 1ml， 混合均匀， 室温下培养 3h。加入 1ml 封闭液 ( 含有 1牛血清白蛋白 BSA 的 PBS)， 封闭未反应位点 30min。加入 1ml PBS 洗涤两次。加入保存液 ( 含 0.02叠 氮化钠 NaN3， 0.1牛血清白蛋白 BSA 的 PBS)1.5ml， 配置成终浓度为 15mg/ml 的免疫磁珠 溶液， 4冰箱保存备用。 0060 二、 重悬已偶联多抗的免疫磁珠，。
29、 将其加入到反应管中， 再加入反应液和样品液， 在洗脱管中加入洗涤液， 采用系统进行免疫富集。 0061 应用制备的免疫磁珠对副溶血性弧菌进行富集捕获， 步骤如下 ： 0062 (1) 取免疫磁珠溶液 100l 于灭菌的 2ml 离心管中， 置于磁力架上， 静置 2min， 待 说 明 书 CN 102586452 A 6 5/7 页 7 磁珠完全吸附在带磁场的一侧后， 去除上清液， 再加入同样体积的 PBS， 混合均匀， 于垂直混 合仪上洗涤 5min。 0063 (2) 取 Tris-HCl(pH 6.4)50ml 置于一次性样品管 (sample tube) 中， 加入 1ml 试验用菌。
30、液和 100l 磁珠， 在洗脱管 (elution tube) 中加入 35ml 的 PBST(PBS+0.05 Tween-20)， 将一次性套装 (consumable) 用无菌管路连接。 0064 (3)打开仪器， 待显示时， 即可取下反应槽(cartridge)， 将已安装好的一次性套装放置在反应槽中， 按下红色按钮， 15min 后， 待红绿灯交替显示时， 再按一次， 约 1min 后完成 IMS。 0065 (4) 取下整套装置， 取出洗脱管， 置于磁力管架上， 待磁珠被吸附在一侧时， 去除上 清液， 加入 200l PBS， 保存在 -20。 0066 三、 模板 DNA 制备 。
31、0067 取免疫磁珠和菌体细胞复合物 100l， 5000rpm/min， 离心 2min， 去除上清液。加 入 ddH2O 50l， 混合均匀， 95， 温浴 5min， 取出备用。 0068 四、 LAMP 反应 0069 (1) 配置 LAMP 反应缓冲液 ： 100mM 的 KCl 溶液 200l， 100mM 的 (NH4)2SO4溶液 200l， 100mM pH 8.8 的 Tris-base 溶液 400l， 1M 的 MgSO4溶液 18l， 加入 0.2的 Tween-20， 再加入 180l ddH2O， 混合均匀， 备用。 0070 (2) 配置 LAMP 反应体系 ：。
32、 反应缓冲液， 12.5l ； 10mM dNTP， 1l ； 20M F3/B3， 0.5l ； 20M FIP/BIP， 2l ； 20M LF/LB， 1l ； 8000U/mL BstDNA 聚合酶， 1l ； 200M HNB， 2l ； DNA 模板， 2l。 0071 (3) 设定反应温度为 64， 30min ； 85， 5min。 0072 五、 LAMP 反应产物的检测 0073 (1) 浊度变化观察法 ： 0074 采用 Mg2+终浓度为 9mM-10mM 进行 LAMP 反应。结束后， 直接采用肉眼观察浊度变 化， 或者将反应管采用 4000-6000rpm/min， 。
33、离心 1min， 观察离心管底部的白色沉淀。有白色 沉淀者即为副溶血性弧菌阳性， 否则为副溶血性弧菌阴性 ( 见图 1)。 0075 从图 1IMBs-LAMP 反应检测副溶血性弧菌的浊度结果可以看出 0076 左边的试管内产生白色沉淀， 即表示阳性 ； 右边的试管内不产生沉淀即为阴性。 0077 (2) 羟基萘酚蓝 (HNB) 预染色法 ： 0078 20mM 的 HNB 保存在 4冰箱内， 备用。将其稀释 100 倍， 成 200M， 取 2l 加入到 反应体系。反应后观察颜色变化。将 LAMP 的颜色反应结果与潘冬色卡进行对比， 副溶血性 弧菌阴性和阳性反应与潘冬色卡数字值的对应结果见表。
34、 1。 0079 表中所列的每个数值代表潘冬色卡上相应的颜色， 以此作为基准， 将 HNB 染色结 果可能出现的副溶血性弧菌阳性和阴性反应管的颜色与之比对， 大量实验数据表明 ： 0080 如表中所列编号的代号 ： 2718U， 2728U， 278U， 279U， 283U， 284U， 285U， 291U， 292U， 290U， 291U， 292U， 2905U， 2915U， 2925U， 297U， 298U， 299U， 2975U， 2985U， 2995U 均 为 副 溶 血 性弧菌 HNB 染色阳性结果 ； 编号代号为 ： 243U， 244U， 245U， 250U， 。
35、251U， 252U， 256U， 2562U， 2572U， 2562U， 2572U， 2563U， 2567U， 2577U， 2573U， 263U， 264U， 265U， 2635U， 2645U， 2655U， 2665U 均为副溶血性弧菌 HNB 染色阴性结果。 说 明 书 CN 102586452 A 7 6/7 页 8 0081 表 1 为 IMBs-LAMP 反应检测副溶血性弧菌的 HNB 染色结果与潘冬色卡对比结果比 对表 0082 0083 (3) 电泳检测 ： 0084 配置2琼脂糖凝胶， 取LAMP反应液加入Loading buffer进行上样， 选择100V电 。
36、压， 电泳 30min， EB 染色 10min， 照胶 ( 见图 2)。电泳结果呈现梯状条带即为副溶血性弧菌 阳性， 无条带则为副溶血性弧菌阴性。 0085 实施例 2 灵敏度检测 ： 0086 将 8.79log CFU/ml 的副溶血性弧菌培养液进行 10 倍的梯度稀释， 取各稀释度 (10-1-10-6) 菌液各 1ml 接种于煮沸的虾体表面。待干后加入 APW( 碱性蛋白胨水 )225ml， 低速拍打 90s。取均质液 25ml 加入到 50ml 离心管中， 4000rpm 离心 5min， 去除上清液， 加入 Tris-HCl(pH6.4)50ml， 加入免疫磁珠 100l， 洗脱。
37、管中加入 35ml PBS(+0.05 Tween-20)， 装好反应套装， 进行免疫富集。在反应结束后， 采用 LAMP 方法检测结果， 观察颜 色变化并采用电泳检测结果。电泳检测结果表明， LAMP 可以检测到人工污染虾样的灵敏度 为 3.79log CFU/25g( 见图 3)。采用 HNB 预染色法检测， 可以明显的观察到第 5 管开始呈现 阴性结果， 与电泳检测结果一致(见表2)。 因此， 人工模拟副溶血性弧菌污染南美白对虾的 样品时， IMBs-LAMP 的检测副溶血性弧菌的灵敏度可达到 3.39log CFU/25g。 0087 表 2.IMBs-LAMP 灵敏度检测的 HNB 。
38、染色与潘冬色卡对比结果 0088 说 明 书 CN 102586452 A 8 7/7 页 9 0089 实施例 3 特异性检测 ： 0090 应用实施例 1 的方法对 25 株副溶血性弧菌、 1 株霍乱弧菌、 1 株霍氏肠杆菌、 1 株 单增李斯特氏菌、 1 株金黄色葡萄球菌、 1 株肠炎沙门氏菌采用免疫磁珠高通量富集捕获副 溶血性弧菌， 然后应用 LAMP 方法， 检测副溶血性弧菌的种属特异性基因 tlh 基因。结果与 IMS-PCR 方法进行比较， 25 株副溶血性弧菌均出现特异性扩增条带， 5 株非副溶血性弧菌均 未出现特异性扩增条带， 表明该方法特异性强。 0091 表 3.IMS-LAMP 的特异性检测 0092 说 明 书 CN 102586452 A 9 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102586452 A 10 2/2 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 102586452 A 11 。