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1、(10)申请公布号 CN 102016027 A (43)申请公布日 2011.04.13 CN 102016027 A *CN102016027A* (21)申请号 200980106313.2 (22)申请日 2009.02.20 ECACC 08020602 2008.02.06 ECACC 08020603 2008.02.06 ECACC 08020604 2008.02.06 61/067,174 2008.02.25 US C12N 15/01(2006.01) C12N 15/85(2006.01) (71)申请人 巴克斯特国际公司 地址 美国伊利诺伊州 申请人 巴克斯特医疗保。
2、健股份有限公司 (72)发明人 曼弗雷德赖特尔 沃尔夫冈蒙特 西蒙费格尔 西蒙冯菲尔克斯 (74)专利代理机构 中原信达知识产权代理有限 责任公司 11219 代理人 张颖 樊卫民 (54) 发明名称 生产连续细胞系的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种用于生产连续细胞系的方 法， 所述方法包括提供动物或人类的活细胞， 用 UV 光辐照所述细胞， 增殖所述细胞， 以及筛选增 殖的细胞作为连续细胞系的细胞。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2010.08.25 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2009/034732 2009.02.20 (87)PCT申请的公布数。
3、据 WO2009/137146 EN 2009.11.12 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 13 页 附图 3 页 CN 102016037 A1/1 页 2 1.一种用于生产连续细胞系的方法，所述方法包括用有效剂量的UV光辐照动物或人 类的活细胞，以及选择在至少 20 次传代后能够增殖的细胞作为连续细胞系的细胞。 2. 权利要求 1 的方法，包括用波长在 10nm 到 400nm 之间的 UV 光辐照所述细胞。 3. 权利要求 2 的方法，其中波长在 200nm 到 300nm 之间。 4.。
4、 权利要求 1 的方法，其中 UV 光剂量为至少 50mJ/cm2。 5. 权利要求 1 的方法，其中 UV 光剂量高达 300mJ/cm2。 6. 权利要求 1 的方法，其中细胞是禽类或哺乳动物细胞。 7. 权利要求 1 的方法，其中选择所述细胞包含至少 40 次的传代。 8. 权利要求 1 的方法，其中细胞附着于表面或在悬液中。 9. 权利要求 1 的方法，其中细胞是胚胎的细胞。 10. 权利要求 1 的方法，其中细胞是一种以上类型组织的混合培养物。 11. 权利要求 1 的方法，其中细胞是内皮细胞。 12. 权利要求 1 的方法，其中细胞为单层细胞。 13. 一种生产病毒的方法，所述方法。
5、包括在允许病毒增殖的条件下用所述病毒感染权 利要求 1 的所述细胞，以及收集所述病毒。 14.权利要求13的方法，其中病毒选自杆状病毒、痘病毒、腺病毒、乳多空病毒、细 小病毒、嗜肝 DNA 病毒、冠状病毒、黄病毒、披膜病毒、星状病毒、小核糖核酸病毒、 反转录病毒、正粘病毒、线状病毒、副粘病毒、弹状病毒、沙粒病毒和布尼亚病毒。 15. 权利要求 13 的方法，其中病毒选自 MVA、 TBE 病毒、黄热病病毒、西尼罗病 毒、新加勒多尼亚病毒或流感病毒。 16. 一种生产重组基因产物的方法，所述方法包括在允许所述基因产物产生的条件下 用编码所述基因产物的核酸转染权利要求 1 的细胞，以及任选地收集所。
6、述基因产物。 17. 权利要求 1 的方法，其中细胞系的细胞适于在无血清培养基中生长。 18.权利要求17的方法，其中所述培养基选自DMEM/HAMs F12、RPMI、MEM、 BME、Waymouth 培养基、无寡肽培养基、化学成分确知培养基或其组合。 19. 权利要求 1 的方法，其中选择非致瘤和 / 或非致癌的所述细胞系的细胞。 20. 能通过下述方法获得的连续细胞系，所述方法为提供动物或人类的活细胞，用有 效剂量的 UV 光辐照所述细胞，增殖所述细胞，以及选择在至少 20 次传代后能够增殖的 细胞作为所述连续细胞系的细胞。 21. 权利要求 20 的细胞系，其中 UV 光的剂量为至少。
7、 50mJ/cm2。 22. 权利要求 20 的细胞系，其中 UV 光的剂量高达 300mJ/cm2。 23. 保藏在 ECACC 的细胞系，保藏登记号为 08020602、08020603 或 08020604。 24. 权利要求 20 的细胞系，其中细胞系的细胞是非致瘤和 / 或非致癌的。 25. 权利要求 20 的细胞系，其中细胞系的细胞能够在固体表面上或悬液中培养。 26. 权利要求 20 的细胞系，其中细胞系的细胞能够在无血清培养基中培养。 权 利 要 求 书 CN 102016027 A CN 102016037 A1/13 页 3 生产连续细胞系的方法 发明领域 0001 本发明。
8、涉及生产细胞系的方法。 0002 发明背景 0003 细胞系已成为用于疫苗制造的有价值的工具。 一些重要疫苗和病毒载体的生产 仍然在鸡胚或鸡胚原代成纤维细胞中进行。 用于病毒复制的禽类原代组织由 SPF( 无特 定病原体 ) 生产厂提供。 SPF 来源的组织昂贵，并且原料供应的质量通常难以控制。 因 此，供应的不一致性和短缺是基于 SPF 蛋技术的最主要缺点。 对于使用原代成纤维细胞 单层培养物的方法来说，同样也是这样。 为了无限地增殖细胞系，需要将细胞永生化。 目前使用的大多数永生化细胞系是癌细胞或融合的杂交瘤细胞的后裔。 但是，后一种技 术受到与骨髓瘤细胞融合的限制。 不存在能够产生不同类。
9、型的永生化细胞的通用技术。 0004 发明简述 0005 本发明的目的是从不连续的细胞材料生产连续细胞。 具体来说，目的是提供不 引入外来病毒基因的具有增殖潜力的连续细胞系。 0006 因此，本发明提供了一种用于生产连续细胞系的方法，所述方法包括提供动物 或人类的活细胞，用紫外光辐照所述细胞，增殖所述细胞，以及选择在至少 20 次传代后 能够增殖的细胞作为连续细胞系的细胞。 0007 这样的连续细胞系是能够增殖并用于生物分子例如蛋白质的重组表达，或用于 制造病毒产品例如病毒抗原或完整病毒群，特别是用于疫苗接种目的的细胞的培养物。 0008 因此，本发明还提供了一种生产病毒的方法，所述方法包括提。
10、供可通过本发明 的方法获得的连续细胞系的细胞，用所述病毒感染所述细胞，在所述细胞中增殖所述病 毒，以及收集所述病毒。 0009 另一方面，本发明提供了一种生产重组基因产物的方法，所述方法包括提供可 通过本发明的方法获得的连续细胞系的细胞，用编码所述基因产物的核酸转染细胞，表 达所述基因产物，以及任选地收集所述基因产物。 0010 另一方面，本发明提供了可以通过一种方法获得的连续细胞系，所述方法包括 提供动物或人类的活细胞，用有效剂量的紫外光辐照所述细胞，增殖所述细胞，以及选 择在至少 20 次传代后能够增殖的细胞作为所述连续细胞系的细胞。 附图说明 0011 图 1 显示了 UV 处理步骤的流。
11、程。 0012 图 2 显示了鹌鹑的连续细胞培养物。 0013 图 3 显示了生产鹌鹑连续细胞系的系统树以及处理路线。 0014 图 4 显示了采用用于生产连续细胞的设置，UV 剂量与辐照时间的相关性。 0015 发明详述 0016 本发明提供了通过细胞的 UV 处理来生产连续细胞系。 0017 细胞系是由原代细胞培养物的一个或多个传代培养物形成的细胞群。 每轮传 说 明 书 CN 102016027 A CN 102016037 A2/13 页 4 代培养被称为传代。 当细胞被传代培养时，它们被称为已被传代。 特定细胞群、或细 胞系，可以由它已被传代的次数来表征。 原代培养物是细胞从组织分离。
12、后的第一代培养 物。 在第一次传代培养后，细胞被描述为第二代培养物 ( 一次传代 )。 在第二次传代培 养后，细胞变成第三代培养物(两次传代)，依此类推。 本领域技术人员将会理解，在传 代期间可能存在多次群体加倍 ；因此，培养物群体加倍的数量大于传代次数。 传代之间 的时间中细胞的扩增(即群体加倍的数量)取决于许多因素，包括但不限于接种密度、基 底、培养基、生长条件和传代之间的时间。 培养可以通过接种细胞培养基，使细胞生长 至细胞形成汇合细胞培养物或连续的膜，并用一部分汇合细胞接种新的细胞培养基来进 行。 然而，传代是评估增殖能力的工具。 一般来说，从组织分离到的细胞、包括未辐照 细胞，在它们。
13、达到不发生进一步增殖或细胞加倍的状态之前，能够传代约 10-20 次。 然 后细胞进入衰老状态，不能从其获得进一步的传代培养。 与此相反，连续细胞系在 20 次 以上传代之后、例如在 22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、 50、55、60、65、70、75或80次以上传代之后能够增殖。 现在，本发明人已经发现，这 种在第 20 次传代后能够传代多次的连续细胞、特别是永生化细胞，可以通过用 UV 处理 改变细胞、即通过用有效剂量的 UV 光辐照这些细胞来获得。 本发明的术语 “有效剂量 的 UV 光” 是将非连续细胞系转化成连续细胞系所需的辐照的量。
14、。 有效剂量的 UV 光的 范围，从这种转化所必需的最小剂量直到这些细胞所耐受的对细胞培养物整体没有致死 结果的最大剂量。 显然，高于或低于有效剂量限度，不能获得连续细胞系。 本领域技术 人员在本文中获得的信息和指导的基础上，经常规的最适化过程就能容易地确定每个细 胞系的最适有效剂量。 细胞可以是原代细胞或几次传代后能够增殖的细胞。 细胞系的培 养可以使用标准的细胞培养技术来进行，例如在 T 型瓶系统或转瓶系统中，或在搅拌釜 或其他生物反应器形式中。 在本发明的几种实施方案中，培养物适合于并保持在无血清 条件下。 0018 在本申请中，术语“UV 光”是指波长从 10 到 400nm、特别是 。
15、100 到 400nm 的 紫外辐射。 UV 光可以选自 UV C(100 到 280nm)、UV B(280 到 320nm) 和 UV A(320 到 400nm)。 在本发明的某些实施方案中，波长在 200 到 300nm 之间。 可以使用光敏剂例 如嵌入到 DNA 中并被 UV 光活化的光敏剂来加速 UV 辐照的改变效应，尽管它们在本发 明的所有实施方案中不是必需的。 在本发明的一个实施方案中，UV光是波长为约100到 约 280nm 的 UV C。 在本发明的另一个实施方案中， UV 光具有约 240 到约 290nm 的波 长。 在本发明的另一个实施方案中，约 85或 85以上的 。
16、UV 光具有约 254nm 的波长。 0019 不受任何理论的束缚，据信 UV 光改变细胞的遗传物质，这引入了突变。 尽管 这样的改变一般能够被细胞的修复机制修复，但某些改变可能保留。 这些改变能够引入 致死突变以及导致细胞永生化的变化。 从 UV 辐照实验，可以选择导致显著部分的细胞 永生化并能够培养的最适剂量。 在传代后，据信只有能够增殖的活细胞被选择，预计它 们仅具有少量变化，其中至少一个变化导致了永生化。 显著部分的被辐照细胞将不被永 生化而是获得了不同的变化，产生凋亡或坏死的细胞。 但是，原则上说，对于获得连续 细胞培养物来说，仅仅一个具有诱导永生化的变化的细胞就已足够，因为该细胞将。
17、通过 本文描述的多轮传代继续增殖和存活。 0020 UV 光发射可以是连续形式的 UV 光发射例如汞灯技术，或脉冲式 UV 光例如单 说 明 书 CN 102016027 A CN 102016037 A3/13 页 5 色激光技术。 所需 UV 强度可以通过组合两个或以上灯来产生。 至少两个辐照步骤可以 组合，其间具有暂停。 本发明的主题包含任何有效剂量的 UV 光，即使细胞改变成连续 增殖的任何剂量的UV光。有效剂量可以依赖于各种不同的本技术领域所公知的因素，例 如 UV 辐照室的物理参数，例如灯和室的尺寸和直径、包含细胞的培养基与 UV 光源之间 的距离、室的材料的光吸收和反射性质。 在。
18、本发明的具体实施方案中，细胞以单层、表 面上的一个细胞层的形式被辐照。 同理，UV光的波长和强度以及细胞暴露于UV光的接 触时间对于有效剂量来说也是关键的。 此外，有效剂量还受细胞自身、含有病毒的培养 基及其光吸收性质的影响。 在本发明的各种不同实施方案中，有效剂量足以改变样品中 包含的至少 20、30、40、50、60、70、80、90或 100的细胞，在其 他实施方案中，有效剂量足以将细胞改变到其中至少 10的细胞被改变成连续生长的水 平。 10到90的细胞可以被辐照杀死。 在本发明的某些实施方案中，含有细胞的样品 被暴露于至少约 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、。
19、55、60、65 或 70mJ/cm2的 有效剂量。在某些实施方案中，有效剂量高达约500、450、400、350、300、250、200、 180、150、130 或 105mJ/cm2。 在本发明的具体实施方案中，UV 剂量在约 70 到 105mJ/ cm2之间。 在某些实施方案中，这些剂量被UV C光使用。 术语“约”是指通常的UV灯 不提供离散的单一波长 UV 光 ( 如同激光那样 )，而是具有也发射附近波长的光的高斯形 状的光谱的性质。 在利用了某些这样的灯的实施方案中，“约”是指波长值偏差 10。 0021 在辐照或传代之前或之后，能够对细胞系进行进一步选择，以满足质量控制标 准。
20、例如无菌性、不含支原体污染、不含外来病毒污染和 / 或通过用于检测反转录酶活性 存在的 F-Pert 测试，以及本技术领域中选择细胞系用于医学生物技术应用时使用的其他 质量控制标准。 在这种意义上，“不含” 应该被理解为污染被降低到低于当前质量测试 步骤的检测极限。 因为本发明的技术不使用病毒载体或导入反转录病毒就能够产生连续 细胞系，因此本发明的细胞系通常不具有任何反转录酶活性，正如可以通过用于反转录 酶活性的测定方法所测试的。 但是，出于例如在细胞系中生产病毒或蛋白质的目的，可 以通过分子工程技术将这种反转录病毒活性特异性地引入本发明的细胞系。 0022 细胞系可以是任何真核细胞的，特别是。
21、较高等生物体的，例如鱼类、禽类、爬 行类、两栖类或哺乳类细胞以及甚至昆虫和植物细胞的细胞系。 某些实施方案利用了哺 乳动物细胞例如仓鼠、小鼠、大鼠、狗、马、牛、灵长类或人类 ；其他实施方案利用了 禽类细胞例如鸡、鸭、金丝雀、鹦鹉、鹌鹑、驼鸟、鸸鹋、火鸡或鹅的细胞。 一般来 说，任何鸟类物种可以作为本发明中使用的禽类细胞的来源。 在某些实施方案中，利用 驯养得较少的物种 ( 例如鹌鹑或鸸鹋 ) 以避免原种组织被更常见驯养物种 ( 例如鸡 ) 中流 行的病毒的潜在污染，是有利的。 0023 被辐照细胞可以来自任何类型的组织。 在某些实施方案中，组织源自于胚胎。 在许多实施方案中，使用一种以上类型组。
22、织的混合培养物，正如可以通过分解组织或多 个组织所获得的。 在其他实施方案中，细胞来自胚胎的脐带。 被辐照细胞可以来自、或 组织可以来自或包括例如内皮细胞、上皮细胞、多能或全能干细胞、胚胎干细胞、神经 元细胞、肾细胞、肝细胞、肌肉细胞、结肠细胞、白细胞、肺细胞、卵巢细胞、皮肤细 胞、脾细胞、胃细胞、甲状腺细胞、血管细胞、胰腺细胞和 / 或它们的前体细胞及其组 合。 说 明 书 CN 102016027 A CN 102016037 A4/13 页 6 0024 在许多实施方案中，细胞在辐照过程或培养过程中附着于表面。 在表面上培养 特别适合于内皮细胞，细胞可以由此进一步选择以满足其他质量标准，。
23、例如它们形成单 层的能力，如果 UV 剂量引入了过多损伤性改变的话，这种能力可能受到妨碍。 在这种 表面上，细胞可以形成单层。 具体来说，细胞在微载体上培养或辐照。 或者，细胞可以 在悬液中辐照或培养或进行两者。 最初在表面上辐照或培养的细胞，后来可以适用于在 悬浮培养中生长。 0025 另一方面，本发明提供了一种生产病毒的方法，所述方法包括提供可通过本发 明的方法获得的连续细胞系的细胞，用所述病毒感染所述细胞，在所述细胞中增殖所述 病毒，以及收集所述病毒。 0026 在本发明中，将要生产的病毒选自具有正义或反义的，连续的或分段的单链或 双链 (DNA) 基因组的有包膜或无包膜的 DNA 或 。
24、RNA 病毒。 病毒可以选自杆状病毒、 痘病毒、腺病毒、乳多空病毒、细小病毒、嗜肝 DNA 病毒、冠状病毒、黄病毒、披膜病 毒、星状病毒、小核糖核酸病毒、反转录病毒、正粘病毒、线状病毒、副粘病毒、弹状 病毒、沙粒病毒和布尼亚病毒。 在本发明的某些实施方案中，病毒选自有包膜病毒，包 括黄病毒、披膜病毒、反转录病毒、冠状病毒、线状病毒、弹状病毒、布尼亚病毒、正 粘病毒、副粘病毒、沙粒病毒、嗜肝 DNA 病毒、疱疹病毒和痘病毒。 在其他实施方案 中，病毒是有包膜病毒例如流感病毒包括流感病毒 A、B 或 C、西尼罗病毒、痘苗病毒、 修饰的痘苗病毒或罗斯河病毒。 在本发明的其他实施方案中，病毒选自有包膜。
25、的RNA病 毒，包括黄病毒、披膜病毒、反转录病毒、冠状病毒、线状病毒、弹状病毒、布尼亚病 毒、正粘病毒、副粘病毒和沙粒病毒。 在具体实施方案中，病毒是 MVA( 修饰的痘苗病 毒安卡拉 )、 TBE( 蜱媒的脑炎 ) 病毒、黄热病病毒、西尼罗病毒、新加勒多尼亚病毒或 流感病毒。 0027 在收集步骤后，可以通过任何已知的用于病毒灭活的手段使病毒灭活，例如在 美国专利公开号2006/0270017A1中公开的，在此引为参考。具体来说，灭活可以通过单 独或组合的甲醛处理和 / 或 UV 辐照来进行。 0028 一般来说，血清或血清来源的物质例如白蛋白、转铁蛋白或胰岛素，可能包含 能够污染细胞培养物。
26、及其获得的生物产物的不想要的因子。 此外，源自人类血清的添加 物必须被测试所有已知病毒，包括能够经血清传播的肝炎病毒和 HIV。 因此，根据本 发明方法的某些实施方案，细胞系的细胞适合于生长在无血清培养基中，例如选择它们 在无血清培养基中生长的能力来。 培养基可以不含血清或血清级份，或一般来说也不 含血液成分。 用于本发明的这些实施方案的培养基选自 DMEM/HAM 的 F12、 RPMI、 MEM、 BME、 Waymouth 培养基，特别是如在 US 2007/0212770 中描述的不含寡肽或蛋 白的培养基，或其组合，所述 US 2007/0212770 在此以其全文引为参考。 所述不含。
27、寡肽 的培养基可以不含血液蛋白或尺寸大于15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或4个 氨基酸的寡肽，但是可以包含谷胱甘肽。 不含蛋白的培养基基本上不含蛋白，但是可以 包含由细胞系产生的蛋白或蛋白酶。 具体来说，培养基也可以包含聚酰胺作为生长促进 剂，和/或是如US2007/0212770中描述的化学成分确知培养基。 术语“化学上确定的” 是指培养基不含任何不明确的添加物，例如动物成分、器官、腺体、植物或酵母的提取 物。 因此，化学成分确知培养基的每种成分都是精确限定的。 化学成分确知培养基基 说 明 书 CN 102016027 A CN 102016037 A5/13 页 7。
28、 本上不含蛋白或细胞水解物，但是可以包含由细胞系产生的蛋白或蛋白酶。 这种培养基 的例子在 “无血清细胞培养指南” ( “A guide to Serum-Free Cell Culture”， GIBCO 细 胞培养 (2003) 中给出，可以在 SFMBrochure.pdf 网址处获得。 0029 这些培养基，包括无血清培养基、无寡肽培养基或化学成分确知培养基，在病 毒接种之前或之后也可以包含谷胱甘肽和 / 或蛋白酶，特别是胰蛋白酶例如猪胰蛋白酶 或重组胰蛋白酶 (Klenk 等，(1975)Virology，68 ：426-439)。 这样的蛋白酶在细胞系培 养过程中也可能需要，因为细。
29、胞通过表现出强到非常弱的粘附性而附着于表面。 强烈粘 附的细胞可以通过蛋白酶和/或螯合剂例如EDTA来剥离(Doyle等，细胞与组织培养 ： 实验室步骤中的“第四章 ：核心技术”(Chapter4 ：Core Techniques，in ：Cell & Tissue Culture ：Laboratory Procedures)， ECACC， John Wiley & Sons， Chichester(1996)。 此 外，培养基、特别是无蛋白培养基，在接种之前或之后可以包含植物或酵母水解物。 当 然，预计培养基也包含由本发明的细胞系产生的蛋白或代谢产物。 0030 一般来说，可通过本发明的。
30、方法获得的细胞系是非致瘤的和 / 或非致癌的。 在 某些实施方案中，对细胞系的细胞进行测试和筛选，以通过质量测试例如 F-pert 测试。 0031 另一方面，本发明提供了生产重组基因产物的方法，所述方法包括提供可通过 本发明的方法获得的连续细胞系的细胞，用编码所述基因产物的核酸转染细胞，表达所 述基因产物，以及任选地收集所述基因产物。 核酸可以是 DNA、RNA 或 PNA。 除了基 因组之外，核酸可以包含用于在细胞中表达的启动子和选择标记。 0032 另一方面，本发明提供了可以通过一种方法获得的连续细胞系，所述方法包括 提供动物或人类的活细胞，用有效剂量的紫外光辐照所述细胞，增殖所述细胞，。
31、以及筛 选在至少 20 次传代后能够增殖的细胞作为所述连续细胞系的细胞。 本发明的细胞系也包 括这样产生的细胞系的后代。 具体来说，细胞系被定义为可以通过本文描述的方法的实 施方案获得。 所获得的连续细胞系可以具有特征性特点，例如产生连续细胞系所必需的 与 UV 辐照相关的特定染色体组型的端粒酶活性。 在本发明的具体实施方案中，细胞系 的细胞是非致瘤和 / 或非致癌的，特别是也通过了质量测试例如 F-pert 测试。 0033 在具体实施方案中，细胞系是保藏在 ECACC、保藏登记号为 08020602、 08020603或08020604的细胞系，分别对应于提交参考号QOR/RE07-169。
32、，QOR1 CJ07和 CORECB/SF08-06。 此外，本发明的细胞系具有所述保藏细胞系以及当然也是连续细胞 系的特征性特点，例如增殖能力、细胞周期模式 (pattern)、端粒酶活性、染色体组型、 染色体型或端粒长度。 0034 下面的实施例对本发明进行了进一步说明，它们不对本发明构成限制。 实施例 0035 实施例 1 ：使用 UV 光对 Vero 细胞进行不同时间的辐照以产生突变体 0036 材料 ： 0037 TC-Vero 培养基 0038 N1 缓冲液 0039 胰蛋白酶 (1 10 稀释度 ) 说 明 书 CN 102016027 A CN 102016037 A6/13 。
33、页 8 0040 胰蛋白酶抑制剂 0041 6 孔板，Corning 目录号 3516 0042 25cm2T 型瓶，Nunc 目录号 ：163371 0043 UV 灯，VL 50C，240nm 栅极管，50W，Vilber-Lourmet 公司 0044 步骤 ： 0045 在 6 孔板中，使用 1106个细胞 / 孔和 5ml 培养基体积进行设置 ( 进行双份设 置 )。 总共设置 7 块板 ( 每次 2 个孔 / 板 )。 0046 24 小时后出现了良好的单层培养物。 0047 将 5ml 培养基排出至 1ml，将打开的板用 UV 光辐照 ( 板离 UV 灯的距离 9cm) 0048。
34、 A 板 ：15min 0049 B 板 ：30min 0050 C 板 ：45min 0051 D 板 ：60min 0052 E 板 ：90min 0053 F 板 ：120min 0054 G 板 ：对照，未辐照 0055 在辐照后，将两个孔的细胞用胰蛋白酶处理 (1ml 胰蛋白酶 +0.5ml 胰蛋白酶抑制 剂/孔)，其中第一个孔的细胞用于测定细胞数(CC)和存活率，第二个孔的细胞在25cm2 的 roux 瓶中使用 10ml 培养基传代。 0056 试验号 辐照时间 TCC/ 孔 x 106 Brker-Trk 存活率 A 15min 1.50 60.8 B 30min 1.25 2。
35、7.9 C 45min 1.15 5.6 D 60min 0.95 23.6 E 90min 0.55 未测定 F 120min 0.30 未测定 G 对照 1.25 94.2 0057 将 T 型瓶 25 的内含物进行胰蛋白酶处理，使用 Cedex 测定 TCC 和存活率 ： 0058 试验号 TCC/Rouxx 106 存活率 显微镜照片 说 明 书 CN 102016027 A CN 102016037 A7/13 页 9 A 0.80 23.2 球形细胞，无粘附性 B 0.60 18.8 细胞在上清液中，无粘附性 C 0.60 34.4 单个细胞在上清液中，无粘附性 D 0.50 25。
36、.0* 只剩细胞碎片 E 0.50 22.7* 只剩细胞碎片 F 0.40 11.1* 只剩细胞碎片 G 1.80 96.6 良好的单层，95-100 0059 * 实际值更低，因为 Cedex 中的细胞计数太低，不能校正细胞计数测定值！ ！ ！ 0060 实施例 2 ：禽类细胞的 UV 辐照 0061 本研究的目的是调查UV光处理作为适用于疫苗生产的连续细胞系的产生工具的 潜在应用。 0062 原代鸡和鹌鹑胚胎被用作起始材料生产最初的原代单层培养物。 从其获得的质 量受控的细胞培养物被用于基于 UV 光暴露的衍生步骤。 0063 将原代细胞暴露于 UV 光 (254nm)。 利用 UV 辐照。
37、从山齿鹌鹑 (bobwhite quail) 或鸡胚胎的原代细胞开发了连续细胞系。 0064 从鹌鹑胚胎的原代细胞衍生的细胞系的开发直到安全性库产生的详细过程，以 系统树的形式显示在图 3 中。 0065 作为 UV 辐照的起始材料，在每种情况下，将一安瓿源自于鸡胚、日本鹌鹑胚 胎和山齿鹌鹑胚胎的细胞制备物 ( 分解的完整胚胎的混合培养物 ) 的第一次评估细胞库 ( 鸡、日本鹌鹑和山齿鹌鹑 ) 解冻。 0066 用于UV辐照的设置在6孔板中使用1106个细胞/孔的细胞接种物和5ml培养 基体积进行。 培养基使用含有 5 FBS 和抗生素 ( 青霉素、链霉素和庆大霉素 ) 的 TBE 培养基 (。
38、FSME)。 总共设置了 7 块板，2 个孔 / 板。 24 小时后，可以在孔中观察到均匀 的单层培养物。为了对细胞辐照，将5ml培养基排出至1ml，将打开的板在层流工作台中 使用 UV 光如下进行辐照。 板与 UV 灯的距离是 9cm。 使用 Vilber-Lourmet 公司的 UV 灯 (VL 50C，240nm 栅极管，50W) 作为 UV 光源， 0067 A 板 ：0.5min 0068 B 板 ：1min 0069 C 板 ：2min 0070 D 板 ：3min 0071 E 板 ：4min 0072 F 板 ：5min 0073 G 板 ：对照，未辐照 说 明 书 CN 10。
39、2016027 A CN 102016037 A8/13 页 10 0074 在辐照后，将孔中的细胞用胰蛋白酶处理 (1ml 胰蛋白酶用 N1 缓冲液 1 10 稀 释 )，其中 1ml 细胞悬液 ( 总共 6ml) 用于测定 CC 和存活率，剩余细胞在 25cm2的 roux 瓶中使用 5ml 培养基传代。 结果归纳在本实施例的表中。 0075 在第一次培养期间 ( 约 25-35 天 )，只有培养基更换，细胞的形态学和粘附性在 每个试验中通过目测进行评估。 就当在T-25瓶中观察到粘附生长的细胞形成岛后，将试 验 A-E 的细胞用胰蛋白酶处理并转移到 6 孔板上 ( 表面比 T-25 瓶小。
40、 )，以便促进均匀、 粘附性的细胞定殖。 从该时间点、约为K40-K50开始，将已经达到80-100汇合的细胞 每 6-9 天在 T-25 和 T-75 瓶中进一步传代，并设置在 1-2 个安全性安瓿，用作产生评估 细胞库的起始材料 ( 约 10 个安瓿 )。 所述细胞群的胰蛋白酶处理和传代在实施例 3 中描 述。 0076 使用的制备物 0077 培养基 ：-TBE 培养基 (FSME)+5 FBS+ 抗生素混合物 ( 青霉素 / 链霉素 100mg/l 和 50mg/l 庆大霉素 ) 0078 -TBE 培养基 (FSME)+10 FBS 0079 -TC Vero 培养基 +10 FBS。
41、 0080 -N1 缓冲液 0081 - 胰蛋白酶 0082 -DMSO，Sigma 公司 0083 缩写 ：CC. 细胞数，T-25/75/175.25/75/175cm2T 型瓶， 0084 表 ：辐照后每个试验的细胞数和存活率 0085 试验号 辐照时间 CC/mlx 106 Brker-Trk 存活率 TCC/ 孔 x 106 A 30 秒 0.75 87.3 0.15 B 1 分钟 0.75 79.5 0.15 C 2 分钟 0.80 84.1 0.16 D 3 分钟 0.70 90.4 0.14 E 4 分钟 0.80 80.0 0.16 F 5 分钟 0.70 * 0.14 G 。
42、对照 0.75 84.1 0.15 0086 * 未测定 0087 由于每个试验设置 A-G 的细胞计数值和存活率相近，因此在细胞的 UV 辐照时 间方面不能显示处明显差异。 这就是几乎每天对被比较的培养物的形态学和粘附性进行 说 明 书 CN 102016027 A CN 102016037 A9/13 页 11 评估以识别特殊性的原因。 0088 在所有试验设置 A-F 中，来自设置 E 的细胞群显示出连续的、附着生长的细胞 系的最佳性质，例如均一的细胞结构、在不同 T 型瓶中培养、在几次传代后恒定的细胞 生长、低温保藏的能力和用于病毒增殖 ( 例如 MVA 病毒 ) 的适合性。 0089。
43、 在鹌鹑细胞的情况下，来自设置 F 的细胞群不能成功培养。 在对还没有用 UV 光辐照的细胞传代 6 次以上后 ( 试验 G)，可以观察到细胞生长减少带有不均一的细胞苔 的形成 ( 大整体 )。 从第 16 次传代起，细胞失去其分裂能力，不再能继续培养。 总的来 说，使用鹌鹑和鸡细胞试验能够达到类似的结果。 0090 实施例 3 ：细胞的胰蛋白酶处理和传代 0091 附着生长的鹌鹑细胞的胰蛋白酶处理和传代，以与通常用于 Vero 细胞的传代方 案相似的方案进行。 在倒掉培养基后，使用 N1 缓冲液进行洗涤步骤，然后，将培养物 用相应量的 1 10 稀释度的 胰蛋白酶的层覆盖，并在 37的温度下。
44、温育 ( 使用 6 孔 板和 T-25(T-25.25cm2T 型瓶 ) 时，室温就已足够 )，直到细胞从培养容器上脱离 ( 通过 轻敲 )。 由于培养基中包含 FBS，加入胰蛋白酶抑制剂以终止胰蛋白酶的效果不是必需 的。 随后，将细胞转移到新的培养基，并分配到与相应的分裂相一致的另外的培养容器 中，并再次使其生长。 0092 下表显示了在胰蛋白酶处理过程中使用的量。 0093 培养容器 N1 缓冲液 胰蛋白酶 ( 用 N1 缓冲液 1 10 稀释 ) 6 孔板 2ml 1ml 25cm2T 型瓶 5ml 1ml 75cm2T 型瓶 10ml 1ml 175cm2T 型瓶 20ml 2ml 0。
45、094 实施例 4 ：使用 UV 灯 VL 50C 进行细胞永生化的 UV-C 剂量测定 0095 测量了使用 UV 辐照获得连续细胞系的剂量。 剂量学设置与用于细胞处理的设 置相似。 使用 UV-C 光的辐照导致碘化钾的转化和碘酸钾溶解在缓冲溶液中成为棕黄色 的三碘化物。 三碘化物在352nm处具有其最大吸收，可以在分光光度计中定量测量。 该 原理允许测量细胞单层暴露过程中依赖于暴露时间的所施加的 UV 剂量。 因此，根据 6 孔板中的测量值，从 0.5 到 5 分钟的暴露时间对应于从 20 到 120mJ/cm2的 UV 剂量 ( 图 4)。 0096 剂量测定进行得尽可能精确，与细胞系试。
46、验一样的精确。在每种情况下，将1ml 吸收系数(367nm)为约2.5/cm、4.5/cm和7.5/cm的模型溶液在6孔板的一个孔中进行辐 照。 每种模型溶液被辐照 6 次。 辐照时间 30 秒、1 分钟、2 分钟、3 分钟、4 分钟和 5 分钟。 为了找出相应辐照时间的精确剂量，测定了使用的培养基的 OD(253.7nm)。 0097 使用的材料 ： 0098 - 便携式 UV 灯，VL50C，254nm，50W，Vilber-Lourmat 公司 说 明 书 CN 102016027 A CN 102016037 A10/13 页 12 0099 - 分光光度计，Therma 公司，装置编。
47、号 ：PA5007-012MM 0100 -6 孔板 0101 -99.9硼酸，Riedel-de Haen 公司，批号 ：60460 0102 -NaOH 粒，Baxter 公司，批号 ：318608 0103 -PVP K17PF( 聚乙烯吡咯烷酮 Collidon K17)，Basf 公司，批号 ：30408609T0 0104 - 碘化钾，Sigma Aldrich 公司，批号 ：P2963-500G 0105 - 碘酸钾，Merck 公司，批号 K32577451622 0106 -TC VERO 培养基 (VT)，Charge ：ORSFVTC0700401 0107 -WFI 水。
48、，Baxter 公司，PP2 0108 制备了足够量的三种模型溶液。 0109 表 1 ：模型溶液的组成 0110 0111 模型溶液可以储存在暗处直到使用，但是至少高达 47 天。 0112 从模型溶液 1、2 和 3 各取 60ml 以产生校正曲线。 为了防止入射光，将这些样 品送到 IBC 中，在 IBC 中建立校正曲线。 从模型溶液 1、2 和 3 各转移 100ml 到 Schott 瓶中，并防止入射光。 将便携式 UV 灯 VL 50C ist 放置在框架上。 桌面与便携式 UV 灯 的底面之间的距离是 9cm。 调整便携式 UV 灯以便滤光片指向桌面 ( 即朝下 )。 0113 。
49、在使用前将便携式 UV 灯打开 30 分钟。 0114 准备含有 100ml 模型溶液 1、2 和 3 的 3 个 Schott 瓶、移液管、电动移液器、空 的 Schott 瓶和三个 6 孔板。 将 1ml 模型溶液 1 转移到 6 孔板的左上孔中。 将该孔不盖盖 子放置在便携式 UV 灯下，使得它位于滤光片下方中央。 在辐照 30 秒后，将孔从它在便 携式 UV 灯下的位置快速取出。 从辐照过的 1ml 溶液中取 370l 转移到薄层石英比色杯 中，在5分钟内测定OD367nm。 进行三次同样的测量并记录。 确定这三个值的平均值。 如果测量到的值在光度计的校正范围之外，将使用相应地具有不同层厚度的比色杯。 吸 出孔中的上清液并丢弃。 0115 对于所有辐照时间重复这些步骤。 根据获得的曲线函数和 VT 培养基的 OD(253.7nm)，从远达 30 秒到 5 分钟计算相应的 UV 剂量 mJ/cm2。 结果显示在下面的 表中。 0116 表 ：根据相应的曲线函数计算 UV 剂量 ： 0117 说 明 书 CN 102016027 A CN 102016037 A11/13 页 13 0118 正如可以从该表中看到的，剂量曲线函数是 y 。