一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒及其检测方法.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201310199211.8

申请日:

20130527

公开号:

CN103255234B

公开日:

20150304

当前法律状态:

有效性:

有效

法律详情:

IPC分类号:

C12Q1/70,C12Q1/68,G01N21/64

主分类号:

C12Q1/70,C12Q1/68,G01N21/64

申请人:

中国农业科学院兰州兽医研究所

发明人:

刘湘涛,田宏,吴锦艳,陈妍,尚佑军,张克山,尹双辉,王光祥,杨顺利,刘永杰

地址:

730046 甘肃省兰州市城关区徐家坪1号

优先权:

CN201310199211A

专利代理机构:

深圳市中知专利商标代理有限公司

代理人:

吕晓蕾

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内容摘要

本发明提供了一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的检测方法,通过设计一对引物和一条探针对样品的DNA模板进行实时荧光定量PCR检测,本发明还提供了利用上述检测方法检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒。本发明针对ORFV的保守区域H2L基因建立的实时定量方法特异性高,稳定性好;本发明用来检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒,操作简便,用户只需将待检样品的DNA加入反应管中,根据扩增曲线即可得出检测结果,省时省力,成本较低,时间由原来的3-4小时缩短到1-2小时;并且比普通PCR的灵敏度高,可用于检测低微含量的羊传染性脓包皮炎病毒,可适用于我国各级防控单位,基层兽医站,大中型养殖场等,具有较好的应用前景。

权利要求书

1.一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒,其特征在于,包括Premix Ex Taq、阳性对照、阴性对照、扩增引物与探针的混合物以及50×ROX Reference Dye; 所述扩增引物与探针的混合物的序列如下: 上游引物:5’-TCCACGCTGCCGACGCCAAAGT-3’ 下游引物:5’-GCACCGCATCGAGAACGCCAAGAA-3’ 探针:5’-FAM-TCGAGGCTGCGCGCGGCCGAGACC-TAMRA-3’; 所述阴性对照为无RNA酶水; 所述阳性对照为含有羊传染性脓疱皮炎病毒H2L基因的质粒; 所述含有羊传染性脓疱皮炎病毒H2L基因的质粒的制备方法如下:从细胞分离的羊传染性脓疱皮炎病毒中扩增得到H2L基因,克隆至pMD-18T,转化大肠杆菌感受态细胞JM109感受态细胞,涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板上,37℃培养12~16小时,经蓝白斑筛选后,用质粒提取试剂盒提取质粒,将序列测定为阳性的质粒命名pMD-H2L,本发明的试剂盒所用阳性对照质粒浓度为2.81×10copies/μL; 试剂盒中上下游引物及探针的浓度均为10μM,体积配比为1:1:1。 

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的TaqMan Real-time 试剂盒及其检测方法,具体涉及用TaqMan实时荧光定量PCR检测 羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒及其检测方法。

背景技术

羊传染性脓疱皮炎病毒简称“羊口疮”病毒(Orf Virus,ORFV), 能引起羊属动物和人类接触性感染,甚至引发养羊业发展和环境安全 问题。ORFV污染的环境对于幼年羊只和泌乳母羊存在极高的感染风 险,它们主要侵害宿主皮肤或黏膜,并可导致其严重的持续性感染和 继发性感染。ORFV拥有鲜明的种属特性和丰富的功能性基因,其基 因组属于两端闭合的双股DNA,长约138kb,中央为核心区(88kb), 两端为反向重复序列(Inverted terminal repeat,ITR),冠以环状发夹结 构。中央核心区基因相对保守,主要调控病毒的复制、包装和输出。 其编码的主要蛋白有dUTPase、42KDa蛋白、20KDa蛋白、DNA聚 合酶、RNA螺旋酶、RNA聚合酶、RAP94、病毒粒子蛋白、后期基 因转录蛋白、拓扑异构酶、后期基因反式作用子、核心蛋白等。近年 该病在我国广泛流行,对养羊业及人类健康构成威胁。目前对ORFV 难以防控的原因是多方面的,感染早期的诊断技术薄弱是主要原因。 就目前ORFV的流行特点,要使其在流行病学方面得到控制,开展 一系列的防控和净化工作势在必行。从经济角度上讲,国外检测试剂 检测一份样品的价格往往是几十元甚至上百元人民币,成本过高导致 养羊业主无法接受。目前检测羊传染性脓包皮炎病毒仅有普通PCR 试剂盒,该试剂盒操作相对复杂,结果判定需靠电泳条带来确定,费 时费力,而且电泳时凝胶中加入的溴化乙锭危害人体健康,操作时需 格外小心。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种简便、准确、快速、特异性 和灵敏性好以及低成本的用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒 及其检测方法,本试剂盒及检测方法还适用于检测低微含量的羊传染 性脓疱皮炎病毒。

本发明提供了一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的检测方法, 其特征在于,通过针对羊传染性脓疱皮炎病毒保守区域H2L基因设计 一对引物和一条探针对样品的DNA模板进行实时荧光定量PCR检测, 所设计引物和和探针序列如下:

上游引物:5’-TCCACGCTGCCGACGCCAAAGT-3’

下游引物:5’-GCACCGCATCGAGAACGCCAAGAA-3’

探针:5’-FAM-TCGAGGCTGCGCGCGGCCGAGACC-TAMRA-3’。

所述样品的DNA模板使用宝生物工程有限公司的型号为D824A的 基因组DNA提取试剂盒进行提取。

所述实时荧光定量PCR的反应体系为:

1)Premix Ex Taq12.5μL;

2)上下游引物及探针,其浓度均为10μM,各取1μL;

3)样品的DNA模板3μL;

4)无RNA酶水6μL;

5)50×ROX Reference Dye0.5μL。

所述实时荧光定量PCR的反应条件如下:94℃预变性2min;94℃ 40s,54℃40s,72℃50s,40个循环。

本发明还提供了一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒, 包括Premix Ex Taq;阳性对照;阴性对照;扩增引物与探针的混合 物和50×ROX Reference Dye;

所述扩增引物与探针的混合物的序列如下:

上游引物:5’-TCCACGCTGCCGACGCCAAAGT-3’

下游引物:5’-GCACCGCATCGAGAACGCCAAGAA-3’

探针:5’-FAM-TCGAGGCTGCGCGCGGCCGAGACC-TAMRA-3’。

所述阴性对照为无RNA酶水。

所述阳性对照为含有羊传染性脓疱皮炎病毒H2L基因的质粒。

试剂盒中上下游引物及探针的浓度均为10μM,体积配比为 1:1:1。

本发明设计了针对ORFV的保守区域H2L设计扩增引物1对,探针 1条,用于羊传染性脓疱皮炎病毒Taqman实时定量PCR检测,H2L基 因高度保守,针对该基因建立的实时定量方法特异性高,稳定性好; 本发明用来检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒,操作简便,用户只 需将待检样品的DNA加入反应管中,根据扩增曲线即可得出检测结 果,省时省力,成本较低,时间由原来的3-4小时缩短到1-2小时;并 且比普通PCR的灵敏度高,可用于检测低微含量的羊传染性脓包皮炎 病毒,可适用于我国各级防控单位,基层兽医站,大中型养殖场等, 具有较好的应用前景。

附图说明

图1为3.1的分别以待检样品DNA、阴性对照和阳性对照为模板的 实时荧光定量PCR结果。

图2为3.2的分别以羊口疮原代牛睾丸细胞毒、羊口疮病毒田间 样品2份、羊痘牛睾丸细胞毒提取的DNA以及阴性对照无RNA酶水 为模板的实时荧光定量PCR结果。

图3为3.3的以阳性对照为模板进行6个重复实时荧光定量PCR 结果。

图4为3.4的以阳性对照构建的浓度为2.81×107copies/μL的 pMD-H2L质粒做10倍递减梯度稀释,以6个稀释度的质粒作为模板 的实时荧光定量PCR结果。

具体实施方式

本发明提供了一种用于羊传染性脓疱皮炎病毒的检测试剂盒,由 以下组分组成:

(1)Premix Ex Taq,购自宝生物工程(大连)有限公司,型号为 RR390Q。

(2)阳性对照

本试剂盒发明的阳性对照为含有羊传染性脓疱皮炎病毒H2L基 因的质粒,所述含有羊传染性脓疱皮炎病毒H2L基因的质粒的制备方 法如下:从细胞分离的羊传染性脓疱皮炎病毒中扩增得到H2L基因, 克隆至pMD-18T,转化大肠杆菌感受态细胞JM109感受态细胞,涂布 于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板上,37℃培养12~16小时。经蓝 白斑筛选后,用质粒(小量)提取试剂盒提取质粒,将序列测定为阳 性的质粒命名pMD-H2L,应用Nanodrop2000核酸蛋白分光光度计测 出该质粒的浓度为90ng/μL,计算出其拷贝数浓度为2.81× 107copies/μL(copies/μL即拷贝/微升,下同),本发明的试剂盒 所用阳性对照质粒浓度为2.81×104copies/μL。

(3)阴性对照:无RNA酶水。

(4)扩增引物与探针的混合物。上下游扩增引物及探针的浓度 均为10μM,体积配比为1:1:1。

(5)ROX Reference Dye(50×)。

使用上述试剂盒检测羊传染性脓疱皮炎病毒的方法:

1.引物设计与制备

参照GenBank查找多个毒株,进行序列比对,根据比对结果并参 照文献[徐洪庆,陈俊芳,陆则基.羊口疮病毒的病原特性及诊断.畜 禽业,2012,274:81]说明,针对ORFV的保守区域H2L基因设计了一 对特异引物和一条探针,引物和探针的信息如表1所示:

表1

上述引物和探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。

所扩增的靶序列如下:

tccacgctgccgacgccaaagtcgtcgaggctgcgcgcggccgagaccgaaagcg ggtccgcgttcttccactcggtaatgatcacgcgcacgcgcacgccgcggttgatggcc gcgcgcagcagcgcgtcaatgatctgcggccagtactccacggcgctggcgtgcttgat caccggcaccatcgagagcagcgagaggtcgatgctgttcttggcgttctcgatgcggt gc

2.待检样品DNA模板的提取

取2g采集的病料组织,按1:10(质量:体积)的比例加入20mlPBS, 加入灭菌的石英砂,充分研磨,浸毒(即浸泡)10-12小时,8000转 /分钟离心20分钟,吸取上清,使用基因组DNA提取试剂盒[宝生物 工程(大连)有限公司的TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA  Extraction Kit Ver.4.0(型号为D824A)],按照其试剂盒说明书对 DNA进行提取,经提取的DNA保存于-20℃保存备用,检测时只需在 反应液中加入3μL DNA即可。

3.TaqMan实时荧光定量PCR检测

3.1TaqMan实时荧光定量PCR检测羊传染性脓疱皮炎病毒

PCR反应总体系为25μL,向0.2mL扩增管中加入下列反应物配 备反应液:

1)Premix Ex Taq12.5μL

2)扩增引物与探针的混合物3μL:为上述浓度为10μM的上 下游引物及探针引物各1μL。

3)待检样品DNA模板3μL

4)无RNA酶水6.0μL

5)ROX Reference Dye(50×)0.5μL

反应液配好后9000转/分离心10秒后,将扩增管放入PCR扩增 仪中进行扩增,设定PCR扩增条件如下:94℃预变性2min;94℃40s, 54℃40s,72℃50s,40个循环。

阴性对照:以无RNA酶水取3μL代替上述待检样品DNA模板, 同样条件下进行扩增。

阳性对照:以制备的浓度为2.81×104copies/μL的pMD-H2L质 粒取3μL代替上述待检样品DNA模板,同样条件下进行扩增。

实验结果分析与判定:

根据扩增结果判定:在NTC(无模板对照,即本试剂盒的阴性对 照)没有Ct值的情况下,Ct值<35判为阳性;Ct值介于35-40为可 疑,需重复检测,再次测定时该样品Ct值<35为阳性,Ct值≥35为 阴性。

检测结果如图1显示,阴性对照即NTC没有Ct值,而阳性对照 的Ct值为18.36,待检样品的Ct值为22.69,其Ct值均小于35,故 待检样品判定为阳性,说明待检样品中有羊传染性脓包皮炎病毒。

3.2特异性检测

DNA模板的制备使用基因组DNA提取试剂盒[宝生物工程(大连) 有限公司的TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit  Ver.4.0(型号为D824A)],按照其试剂盒说明书分别提取羊口疮原代 牛睾丸细胞毒(图中简标为羊口疮细胞毒)(由中国农业科学院兰州 兽医研究所提供)、羊口疮病毒田间样品2份(图中简标为田间样品 1和田间样品2)(由中国农业科学院兰州兽医研究所提供)和羊痘牛 睾丸细胞毒(图中简标为羊痘病毒)(由中国农业科学院兰州兽医研 究所提供)的DNA,无RNA酶水做为阴性对照(图中标识为阴性对 照),各取3μL用于检测,反应条件同3.1进行的TaqMan实时荧光 定量PCR扩增,其结果如图2所示。

结果表明,羊口疮原代牛睾丸细胞毒、2份羊口疮病毒田间样品 提取的DNA模板均扩增出S形曲线,而羊痘病毒DNA及无核酶水 均未扩增出S形曲线。由此可见,本发明建立的TaqMan实时荧光定 量PCR具有较高的特异性。

3.3重复性检测

以3.1所用的阳性对照为模板,进行6个重复扩增,反应条件同 3.1.进行的TaqMan实时荧光定量PCR扩增,扩增结果如图3所示。 结果显示6个重复的变异系数小,说明试验稳定,重复性好。

3.4敏感性检测

将上述阳性对照构建的浓度为2.81×107copies/μL的pMD-H2L 质粒做10倍递减梯度稀释,将2.81×105~2.81×100copies/μL稀 释的样品各取3μL,反应条件同3.1进行的TaqMan实时荧光定量PCR 扩增,结果如图4所示。

结果显示,2.81×105copies/μL至2.81×101copies/μL稀释 度的重组质粒均扩增出了S形曲线,而2.81×100copies/μL稀释度 的重组质粒未扩增出任何峰线。

敏感性测定结果表明,本发明建立的TaqMan实时荧光定量PCR 检测羊传染性脓疱皮炎病毒的检测方法能检测出的最低拷贝数为 2.81×101copies/μL,比常规PCR要高10倍。

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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310199211.8 (22)申请日 2013.05.27 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (73)专利权人 中国农业科学院兰州兽医研究所 地址 730046 甘肃省兰州市城关区徐家坪 1 号 (72)发明人 刘湘涛 田宏 吴锦艳 陈妍 尚佑军 张克山 尹双辉 王光祥 杨顺利 刘永杰 (74)专利代理机构 深圳市中知专利商标代理有 限公司 44101 代理人 吕晓蕾 姚俊等 . 羊口疮病毒 TaqMan 实时荧光定 量 PCR 检测方法的建立及应用。

2、 .动物医学进 展 .2012, 第 33 卷 ( 第 11 期 ), 第 31-36 页 . 向智龙等 . 羊口疮病毒 PCR 检测方法的建立 与应用 .贵州农业科学 .2010, 第 38 卷 ( 第 7 期 ), 第 145-147 页 . (54) 发明名称 一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂 盒及其检测方法 (57) 摘要 本发明提供了一种用于检测羊传染性脓疱皮 炎病毒的检测方法, 通过设计一对引物和一条探 针对样品的DNA模板进行实时荧光定量PCR检测, 本发明还提供了利用上述检测方法检测羊传染性 脓疱皮炎病毒的试剂盒。 本发明针对ORFV的保守 区域 H2L 基因建立的实时定。

3、量方法特异性高, 稳 定性好 ; 本发明用来检测羊传染性脓疱皮炎病毒 的试剂盒, 操作简便, 用户只需将待检样品的 DNA 加入反应管中, 根据扩增曲线即可得出检测结果, 省时省力, 成本较低, 时间由原来的 3-4 小时缩短 到 1-2 小时 ; 并且比普通 PCR 的灵敏度高, 可用于 检测低微含量的羊传染性脓包皮炎病毒, 可适用 于我国各级防控单位, 基层兽医站, 大中型养殖场 等, 具有较好的应用前景。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李恩 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 (10)授权公告号 C。

4、N 103255234 B (45)授权公告日 2015.03.04 CN 103255234 B 1/1 页 2 1. 一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒, 其特征在于, 包括 Premix Ex Taq、 阳性对照、 阴性对照、 扩增引物与探针的混合物以及 50ROX Reference Dye ; 所述扩增引物与探针的混合物的序列如下 : 上游引物 : 5 -TCCACGCTGCCGACGCCAAAGT-3 下游引物 : 5 -GCACCGCATCGAGAACGCCAAGAA-3 探针 : 5 -FAM-TCGAGGCTGCGCGCGGCCGAGACC-TAMRA-3 ; 所述阴性。

5、对照为无 RNA 酶水 ; 所述阳性对照为含有羊传染性脓疱皮炎病毒 H2L 基因的质粒 ; 所述含有羊传染性脓疱皮炎病毒 H2L 基因的质粒的制备方法如下 : 从细胞分离的羊传 染性脓疱皮炎病毒中扩增得到 H2L 基因, 克隆至 pMD-18T, 转化大肠杆菌感受态细胞 JM109 感受态细胞, 涂布于含 100mg/L 氨苄青霉素的 LB 平板上, 37培养 12 16 小时, 经蓝白斑 筛选后, 用质粒提取试剂盒提取质粒, 将序列测定为阳性的质粒命名 pMD-H2L, 本发明的试 剂盒所用阳性对照质粒浓度为 2.81104copies/L ; 试剂盒中上下游引物及探针的浓度均为 10M, 。

6、体积配比为 1:1:1。 权 利 要 求 书 CN 103255234 B 2 1/5 页 3 一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒及其检测方 法 技术领域 0001 本发明涉及用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的 TaqMan Real-time 试剂盒及其检 测方法, 具体涉及用TaqMan实时荧光定量PCR检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒及其检 测方法。 背景技术 0002 羊传染性脓疱皮炎病毒简称 “羊口疮” 病毒 (Orf Virus,ORFV), 能引起羊属动物 和人类接触性感染, 甚至引发养羊业发展和环境安全问题。ORFV 污染的环境对于幼年羊 只和泌乳母羊存在极高的感染风险, 它。

7、们主要侵害宿主皮肤或黏膜, 并可导致其严重的持 续性感染和继发性感染。ORFV 拥有鲜明的种属特性和丰富的功能性基因, 其基因组属于 两端闭合的双股 DNA, 长约 138kb, 中央为核心区 (88kb), 两端为反向重复序列 (Inverted terminal repeat,ITR), 冠以环状发夹结构。 中央核心区基因相对保守, 主要调控病毒的复 制、 包装和输出。 其编码的主要蛋白有dUTPase、 42KDa蛋白、 20KDa蛋白、 DNA聚合酶、 RNA螺 旋酶、 RNA 聚合酶、 RAP94、 病毒粒子蛋白、 后期基因转录蛋白、 拓扑异构酶、 后期基因反式作 用子、 核心蛋白等。

8、。 近年该病在我国广泛流行, 对养羊业及人类健康构成威胁。 目前对ORFV 难以防控的原因是多方面的, 感染早期的诊断技术薄弱是主要原因。就目前 ORFV 的流行特 点, 要使其在流行病学方面得到控制, 开展一系列的防控和净化工作势在必行。 从经济角度 上讲, 国外检测试剂检测一份样品的价格往往是几十元甚至上百元人民币, 成本过高导致 养羊业主无法接受。目前检测羊传染性脓包皮炎病毒仅有普通 PCR 试剂盒, 该试剂盒操作 相对复杂, 结果判定需靠电泳条带来确定, 费时费力, 而且电泳时凝胶中加入的溴化乙锭危 害人体健康, 操作时需格外小心。 发明内容 0003 本发明要解决的技术问题是提供一种。

9、简便、 准确、 快速、 特异性和灵敏性好以及低 成本的用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒及其检测方法, 本试剂盒及检测方法还适 用于检测低微含量的羊传染性脓疱皮炎病毒。 0004 本发明提供了一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的检测方法, 其特征在于, 通 过针对羊传染性脓疱皮炎病毒保守区域H2L基因设计一对引物和一条探针对样品的DNA模 板进行实时荧光定量 PCR 检测, 所设计引物和和探针序列如下 : 0005 上游引物 : 5 -TCCACGCTGCCGACGCCAAAGT-3 0006 下游引物 : 5 -GCACCGCATCGAGAACGCCAAGAA-3 0007 探针 : 5 -。

10、FAM-TCGAGGCTGCGCGCGGCCGAGACC-TAMRA-3 。 0008 所述样品的 DNA 模板使用宝生物工程有限公司的型号为 D824A 的基因组 DNA 提取 试剂盒进行提取。 0009 所述实时荧光定量 PCR 的反应体系为 : 说 明 书 CN 103255234 B 3 2/5 页 4 0010 1)Premix Ex Taq12.5L ; 0011 2) 上下游引物及探针, 其浓度均为 10M, 各取 1L ; 0012 3) 样品的 DNA 模板 3L ; 0013 4) 无 RNA 酶水 6L ; 0014 5) 50ROX Reference Dye0.5L。。

11、 0015 所述实时荧光定量 PCR 的反应条件如下 : 94预变性 2min ; 94 40s, 54 40s, 72 50s, 40 个循环。 0016 本发明还提供了一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒, 包括 Premix Ex Taq ; 阳性对照 ; 阴性对照 ; 扩增引物与探针的混合物和 50ROX Reference Dye ; 0017 所述扩增引物与探针的混合物的序列如下 : 0018 上游引物 : 5 -TCCACGCTGCCGACGCCAAAGT-3 0019 下游引物 : 5 -GCACCGCATCGAGAACGCCAAGAA-3 0020 探针 : 5 -FAM。

12、-TCGAGGCTGCGCGCGGCCGAGACC-TAMRA-3 。 0021 所述阴性对照为无 RNA 酶水。 0022 所述阳性对照为含有羊传染性脓疱皮炎病毒 H2L 基因的质粒。 0023 试剂盒中上下游引物及探针的浓度均为 10M, 体积配比为 1:1:1。 0024 本发明设计了针对 ORFV 的保守区域 H2L 设计扩增引物 1 对, 探针 1 条, 用于羊传 染性脓疱皮炎病毒Taqman实时定量PCR检测, H2L基因高度保守, 针对该基因建立的实时定 量方法特异性高, 稳定性好 ; 本发明用来检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒, 操作简便, 用户只需将待检样品的 DNA 加入反。

13、应管中, 根据扩增曲线即可得出检测结果, 省时省力, 成 本较低, 时间由原来的 3-4 小时缩短到 1-2 小时 ; 并且比普通 PCR 的灵敏度高, 可用于检测 低微含量的羊传染性脓包皮炎病毒, 可适用于我国各级防控单位, 基层兽医站, 大中型养殖 场等, 具有较好的应用前景。 附图说明 0025 图 1 为 3.1 的分别以待检样品 DNA、 阴性对照和阳性对照为模板的实时荧光定量 PCR 结果。 0026 图 2 为 3.2 的分别以羊口疮原代牛睾丸细胞毒、 羊口疮病毒田间样品 2 份、 羊痘牛 睾丸细胞毒提取的 DNA 以及阴性对照无 RNA 酶水为模板的实时荧光定量 PCR 结果。。

14、 0027 图 3 为 3.3 的以阳性对照为模板进行 6 个重复实时荧光定量 PCR 结果。 0028 图 4 为 3.4 的以阳性对照构建的浓度为 2.81107copies/L 的 pMD-H2L 质粒做 10 倍递减梯度稀释, 以 6 个稀释度的质粒作为模板的实时荧光定量 PCR 结果。 具体实施方式 0029 本发明提供了一种用于羊传染性脓疱皮炎病毒的检测试剂盒, 由以下组分组成 : 0030 (1) Premix Ex Taq, 购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司, 型号为 RR390Q。 0031 (2) 阳性对照 0032 本试剂盒发明的阳性对照为含有羊传染性脓疱皮炎病毒 。

15、H2L 基因的质粒, 所述 含有羊传染性脓疱皮炎病毒 H2L 基因的质粒的制备方法如下 : 从细胞分离的羊传染性脓 说 明 书 CN 103255234 B 4 3/5 页 5 疱皮炎病毒中扩增得到 H2L 基因, 克隆至 pMD-18T, 转化大肠杆菌感受态细胞 JM109 感受 态细胞, 涂布于含 100mg/L 氨苄青霉素的 LB 平板上, 37培养 12 16 小时。经蓝白斑 筛选后, 用质粒 (小量) 提取试剂盒提取质粒, 将序列测定为阳性的质粒命名 pMD-H2L, 应用 Nanodrop2000 核酸蛋白分光光度计测出该质粒的浓度为 90ng/L, 计算出其拷贝数浓度 为 2.8。

16、1107copies/L (copies/L 即拷贝 / 微升, 下同) , 本发明的试剂盒所用阳性对照 质粒浓度为 2.81104copies/L。 0033 (3) 阴性对照 : 无 RNA 酶水。 0034 (4) 扩增引物与探针的混合物。上下游扩增引物及探针的浓度均为 10M, 体积配 比为 1:1:1。 0035 (5) ROX Reference Dye(50)。 0036 使用上述试剂盒检测羊传染性脓疱皮炎病毒的方法 : 0037 1. 引物设计与制备 0038 参照 GenBank 查找多个毒株, 进行序列比对, 根据比对结果并参照文献 徐洪庆, 陈俊芳, 陆则基.羊口疮病毒的。

17、病原特性及诊断.畜禽业, 2012,274:81说明, 针对ORFV的 保守区域 H2L 基因设计了一对特异引物和一条探针, 引物和探针的信息如表 1 所示 : 0039 表 1 0040 0041 上述引物和探针均由宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司合成。 0042 所扩增的靶序列如下 : 0043 tccacgctgccgacgccaaagtcgtcgaggctgcgcgcggccgagaccgaaagcgggtccgcgttcttc cactcggtaatgatcacgcgcacgcgcacgccgcggttgatggccgcgcgcagcagcgcgtcaatgatctgcggcca 。

18、gtactccacggcgctggcgtgcttgatcaccggcaccatcgagagcagcgagaggtcgatgctgttcttggcgttct cgatgcggtgc 0044 2. 待检样品 DNA 模板的提取 0045 取 2g 采集的病料组织, 按 1:10( 质量 : 体积 ) 的比例加入 20mlPBS, 加入灭菌的石 英砂, 充分研磨, 浸毒 (即浸泡) 10-12 小时, 8000 转 / 分钟离心 20 分钟, 吸取上清, 使用基因 组 DNA 提取试剂盒 宝生物工程 (大连) 有限公司的 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA 。

19、Extraction Kit Ver.4.0( 型号为 D824A), 按照其试剂盒说明书对 DNA 进行提取, 经 提取的 DNA 保存于 -20保存备用, 检测时只需在反应液中加入 3L DNA 即可。 0046 3TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测 0047 3.1TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测羊传染性脓疱皮炎病毒 说 明 书 CN 103255234 B 5 4/5 页 6 0048 PCR 反应总体系为 25L, 向 0.2mL 扩增管中加入下列反应物配备反应液 : 0049 1)Premix Ex Taq12.5L 0050 2)扩增引物与探针的混合物3L : 为上。

20、述浓度为10M的上下游引物及探针引物 各 1L。 0051 3) 待检样品 DNA 模板 3L 0052 4) 无 RNA 酶水 6.0L 0053 5) ROX Reference Dye(50)0.5L 0054 反应液配好后 9000 转 / 分离心 10 秒后, 将扩增管放入 PCR 扩增仪中进行扩增, 设 定 PCR 扩增条件如下 : 94预变性 2min ; 94 40s, 54 40s, 72 50s, 40 个循环。 0055 阴性对照 : 以无 RNA 酶水取 3L 代替上述待检样品 DNA 模板, 同样条件下进行扩 增。 0056 阳性对照 : 以制备的浓度为 2.8110。

21、4copies/L 的 pMD-H2L 质粒取 3L 代替上 述待检样品 DNA 模板, 同样条件下进行扩增。 0057 实验结果分析与判定 : 0058 根据扩增结果判定 : 在 NTC(无模板对照, 即本试剂盒的阴性对照) 没有 Ct 值的情 况下, Ct 值 35 判为阳性 ; Ct 值介于 35-40 为可疑, 需重复检测, 再次测定时该样品 Ct 值 35 为阳性, Ct 值 35 为阴性。 0059 检测结果如图1显示, 阴性对照即NTC没有Ct值, 而阳性对照的Ct值为18.36, 待 检样品的 Ct 值为 22.69, 其 Ct 值均小于 35, 故待检样品判定为阳性, 说明待。

22、检样品中有羊 传染性脓包皮炎病毒。 0060 3.2 特异性检测 0061 DNA 模板的制备使用基因组 DNA 提取试剂盒 宝生物工程 (大连)有限公司的 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.4.0(型号为D824A), 按 照其试剂盒说明书分别提取羊口疮原代牛睾丸细胞毒 (图中简标为羊口疮细胞毒) (由中国 农业科学院兰州兽医研究所提供) 、 羊口疮病毒田间样品 2 份 (图中简标为田间样品 1 和田 间样品 2)(由中国农业科学院兰州兽医研究所提供) 和羊痘牛睾丸细胞毒 (图中简标为羊痘 病毒) (由中国农业科。

23、学院兰州兽医研究所提供) 的 DNA, 无 RNA 酶水做为阴性对照 (图中标 识为阴性对照) , 各取 3L 用于检测, 反应条件同 3.1 进行的 TaqMan 实时荧光定量 PCR 扩 增, 其结果如图 2 所示。 0062 结果表明, 羊口疮原代牛睾丸细胞毒、 2 份羊口疮病毒田间样品提取的 DNA 模板均 扩增出 S 形曲线, 而羊痘病毒 DNA 及无核酶水均未扩增出 S 形曲线。由此可见, 本发明建立 的 TaqMan 实时荧光定量 PCR 具有较高的特异性。 0063 3.3 重复性检测 0064 以 3.1 所用的阳性对照为模板, 进行 6 个重复扩增, 反应条件同 3.1. 。

24、进行的 TaqMan 实时荧光定量 PCR 扩增, 扩增结果如图 3 所示。结果显示 6 个重复的变异系数小, 说 明试验稳定, 重复性好。 0065 3.4 敏感性检测 0066 将上述阳性对照构建的浓度为2.81107copies/L的pMD-H2L质粒做10倍递减 梯度稀释, 将 2.81105 2.81100copies/L 稀释的样品各取 3L, 反应条件同 3.1 进 说 明 书 CN 103255234 B 6 5/5 页 7 行的 TaqMan 实时荧光定量 PCR 扩增, 结果如图 4 所示。 0067 结果显示, 2.81105copies/L 至 2.81101copie。

25、s/L 稀释度的重组质粒均扩 增出了 S 形曲线, 而 2.81100copies/L 稀释度的重组质粒未扩增出任何峰线。 0068 敏感性测定结果表明, 本发明建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测羊传染性脓疱 皮炎病毒的检测方法能检测出的最低拷贝数为 2.81101copies/L, 比常规 PCR 要高 10 倍。 说 明 书 CN 103255234 B 7 1/2 页 8 0001 序 列 表 CN 103255234 B 8 2/2 页 9 0002 序 列 表 CN 103255234 B 9 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103255234 B 10 2/2 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103255234 B 11 。

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