技术领域
本发明涉及一种分离培养内皮克隆形成细胞的方法，具体涉及一 种从脐带中分离培养内皮克隆形成细胞的方法。
背景技术
内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管内皮细胞的 前体细胞，亦是具有向成熟血管内皮细胞分化能力的祖细胞。许多研究表 明EPCs参与胚胎血管和出生后血管发生过程，具有新生血管、修复血 管损伤、分泌多种促进新生血管生长因子的作用，在靶向治疗缺血性疾 病、炎症性疾病、恶性肿瘤、防止血管再狭窄、血管创伤愈合、促进造 血恢复等过程中有着重要临床应用前景。目前EPCs主要来源于外周血、 骨髓和脐带血，其获得主要存在以下问题：循环血中的EPCs数目非常 低，骨髓取材不便，脐带血取材及操作困难等。内皮祖细胞分离培养的 难度和数量的稀少成为未来临床应用的一个瓶颈，因此，如何有效获得 EPCs成了实验研究和临床应用急需解决的难题，从新的来源寻找 EPCs，以克服骨髓等来源的不足成为必要。
EPCs有早期EPCs及晚期EPCs两种亚型，晚期EPCs又称内皮克 隆形成细胞(endothelial colony forming cells，ECFCs)，或内皮外向生 长细胞，而ECFCs作为内皮祖细胞的一种亚群，具有较高的增殖能力 和较强的成血管活性。研究证实ECFCs更适用于心血管疾病等的治疗， 因此，获得ECFCs对内皮祖细胞实验研究和临床应用非常关键。
脐带由羊膜、华氏胶、两个脐动脉和两个脐静脉组成。2005年 Ingram和2006年Cherqui两位学者证实血管壁内存在EPCs。脐带来 源广泛，取材容易，对供者无不利影响，无道德伦理问题的限制，如果 能够从脐带中获得EPCs，将会成为骨髓等来源EPCs的理想替代来源。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脐带来源的ECFCs的制备方法，为 ECFCs的获得提供一种具有很大优越性的新来源。
本发明的一个方面涉及一种从脐带中分离培养内皮克隆形成细胞 的方法，其包括以下步骤：
(1)用消化酶消化离体脐带的脐静脉血管内膜；
(2)冲洗消化后的脐静脉，收集冲洗液；
(3)取冲洗液进行细胞培养，得到内皮克隆形成细胞。
在本发明中，所述脐带来源于人或哺乳动物；在本发明的一个实 施方案中，所述脐带来源于人。
在本发明中，所述消化酶可以为任何能够消化血管内膜的酶，例 如可为胶原酶、透明质酸酶或脱氧核糖核酸酶I型；在本发明的一个 实施方案中，所述消化酶为胶原酶。在本发明的一个具体实施方案中， 所述消化酶为II型胶原酶。
根据本发明第一方面任一项所述的方法，其中所述用消化酶消化 脐静脉血管内膜前还包括冲洗脐带外周及脐静脉腔内残留血液的步 骤。
根据本发明第一方面任一项所述的方法，其中所述用消化酶消化 脐静脉血管内膜的方法为将消化酶注入脐静脉腔内；任选地，在将消 化酶注入脐静脉腔内之前还包括结扎脐静脉一端的步骤。
在本发明的一个实施方案中，将消化酶注入脐静脉内后，将脐带 放入一定的缓冲液中以维持细胞的活性状态。
根据本发明第一方面任一项所述的方法，所述用消化酶消化的条 件根据不同的消化酶确定。在本发明的一个实施方案中，所述消化酶 为胶原酶，其反应条件为37℃温育。
根据本发明第一方面任一项所述的方法，其中所述取冲洗液进行 细胞培养之前还包括将冲洗液进行浓缩的步骤；所述浓缩的方法例如 为先离心，然后弃上清。
在本发明中，所述浓缩是指收集冲洗液中细胞的过程，例如可以 采用离心后弃上清或静止后弃上清方法进行浓缩；在本发明的一个实 施方案中，通过离心、弃上清的方式收集细胞。
在本发明的实施方案中，所述离心的条件为收集细胞的离心条件， 例如为1000-2000rpm，离心10-20min；在本发明的一个具体实施方案 中，为1500rpm，10min；离心温度一般为4℃。
根据本发明第一方面任一项所述的方法，其中所述胶原酶的浓度 为0.05-0.2％重量体积比，例如为0.075-0.15％重量体积比；在本发明 的一个实施方案中，所述浓度为0.1％重量体积比。
根据本发明第一方面任一项所述的方法，其中所述的用消化酶消 化的时间为30-120min，例如为45-90min，例如为60-80min；在本发 明的一个实施方案中，为60min。
根据本发明第一方面任一项所述的方法，其中所述细胞培养的培 养基为适合内皮克隆形成细胞生长的细胞培养基，例如可以为含VEGF 及bFGF的M199培养基或含添加多种生长因子的EGM-2培养基或DF-12 培养基；在本发明的一个实施方案中，为EGM-2培养基。
根据本发明第一方面任一项所述的方法，在细胞培养基中可以添 加5-20％体积胎牛血清，例如为7.5％-15％体积胎牛血清，例如为9％-12％ 体积胎牛血清；在本发明的一个实施方案中，添加了10％胎牛血清。
根据本发明第一方面任一项所述的方法，其中步骤(3)中所述的 细胞培养是指将细胞按1～2×104/cm2接种于培养瓶中进行培养；任选 地，3-5天后换液，弃去非贴壁细胞，以后每3-4天半量换液。
根据本发明第一方面任一项所述的方法，在所述进行细胞培养后， 得到的是原代内皮克隆形成细胞，可以通过传代，获得传代后的内皮 克隆形成细胞。所述传代方法为本领域常用的贴壁细胞的传代方法， 例如可以用胰酶消化细胞，然后按照一定比例传入新的培养瓶中；所 述胰酶的浓度例如可以为0.125％-0.25％，所述一定比例可以为1∶2-1∶ 4；在本发明的一个实施方案中，所述胰酶的浓度为0.25％，所述一定 的比例为1∶3。
在本发明的一个实施方案中，待细胞达80％以上融合时再进行消 化传代。
本发明的第二方面涉及根据本发明第一方面任一项所述方法获得 的内皮克隆形成细胞。
根据本发明第二方面任一项所述的内皮克隆形成细胞，其表达 CD34、CD73、CD90、CD105、CD31和VEGFR2，不表达CD45、CD31和 HLA-DR。
根据本发明第二方面任一项所述的内皮克隆形成细胞，其表达 vWF。
本发明还涉及脐带在制备内皮克隆形成细胞中的用途。
本发明还涉及血管内膜消化酶在制备内皮克隆形成细胞中的用 途。
在本发明中，按照本发明制备方法获得的内皮克隆形成细胞命名 为脐带源ECFCs。
在本发明中，所述脐带可以来源于人或哺乳动物；脐带是连接胚 胎和胎盘之间的索状结构，外被羊膜，内含脐静脉、脐动脉和体蒂分化 的粘液性结缔组织即华通氏胶(Wharton jelly)。
在本发明中，所述脐带源ECFCs来源于脐静脉，因此当脐静脉从所 述脐带剥离时，所述脐带也可以指脐静脉。
在本发明中，所述血管内膜是指脐静脉内皮和内皮下层。
在本发明中，所述消化酶是指能够消化血管内膜的酶。
在本发明中，所述消化血管内膜是指通过消化酶的作用分离血管 内皮细胞的过程。
在本发明中，所述胶原酶可以为II型胶原酶或I型胶原酶。
在本发明中，所述内皮克隆形成细胞是指具有高增殖潜能和成血 管能力的一类内皮祖细胞，其形态呈铺路石样，具有细胞克隆形成能 力，增殖能力强，能够连续传代，细胞周期具有干细胞特点，免疫表 型为表达CD34、VEGFR2、CD73、CD90、CD105，同时表达CD31及vWF成 熟内皮细胞标志，不表达HLA-DR，具有和内皮细胞吞噬及成血管能力 一样的功能。
附图说明
图1为脐带源ECFCs的细胞形态；
图2为脐带源ECFCs的细胞生长曲线；
图3为脐带源ECFCs的细胞周期分析；
图4为脐带源ECFCs的免疫表型流式细胞仪分析；
图5为脐带源ECFCs的细胞克隆形成实验；
图6为脐带源ECFCs成血管实验；
图7为脐带源ECFCs吞噬实验；
图8为免疫荧光检测脐带源ECFCs vWF表达；
其中C图为阴性对照组；D图为vWF阳性组；其中标尺为100μm。
图9为免疫组织化学法检测脐带源ECFCs vWF表达。
其中左图为阴性对照组；右图为vWF阳性组；其中标尺为100μm。
发明的有益效果
1.本发明的从脐带中分离培养内皮克隆形成细胞的方法，操作简 单易行，分离成功率100％，其形态、增殖能力、免疫表型、细胞周期、 克隆形成能力等指标符合内皮克隆形成细胞的特征，且在10代以内形 态和免疫表型不变，无衰老现象，为满足实验研究和临床应用提供了坚 实的保障。
2.本发明的脐带源ECFCs体外易扩增，增殖能力强，为ECFCs 的获得提供了新的来源。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领 域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限 定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造 商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通 过市购获得的常规产品。
实施例1脐带源ECFCs的分离和培养
(1)用磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.0)反复冲洗足月人脐带外周 及脐静脉腔残留血液，去除血液；
(2)用无菌手术线结扎脐带一末端，在脐静脉腔内注入5-10毫升 浓度为0.1％重量体积比的II型胶原酶，并在脐带另一端进行结扎，置入 盛有磷酸盐缓冲液(也可用生理盐水、Hank’s液代替)的平皿中，所 述缓冲液用于维持脐带中细胞的状态；
(3)放入37℃培养箱中孵育，II型胶原酶(GIBCO，美国)消化60 分钟；
(4)用磷酸盐缓冲液反复冲洗脐静脉腔5次，收集冲洗液， 1500rpm/min离心10min，弃上清，收集细胞沉淀；
(5)细胞按1～2×104/cm2接种于T75塑料培养瓶，用含10％胎牛 血清的完全EGM-2培养基(Lonza，瑞士)，置37℃，5％CO2培养箱培 养，3-5天后换液，弃去非贴壁细胞，以后每3-4天半量换液。
(6)待倒置显微镜下观察细胞达80％融合，0.25％胰酶消化，按 1∶3传代。
本方法短期内可获得大量的脐带源内皮克隆形成细胞(ECFCs)， 例如培养至第30天，约至P3代时可培养5.4×107个细胞。
实施例2脐带源ECFCs原代细胞培养及传代过程观察
采用实施例1方法分离的脐带源ECFCs原代细胞多于24-36小时 内贴壁，可见梭形、圆形贴壁细胞，培养3-7天，倒置显微镜观察到散 在分布的细胞克隆，细胞呈梭性、多角形、圆形，胞体大。7-10天后增 长速度较快，出现许多细胞克隆，10-14天左右可达80％细胞融合，呈 铺路石样排列。连续传10代，细胞形态无明显改变。(图1)
图1为脐带来源的ECFCs的细胞形态。(A)、原代细胞培养36h； (B)、原代细胞培养第5天；(C)、原代细胞培养第14天；(D)、 P1代细胞；(E)、P3代细胞；(F)、P10代细胞。
实施例3脐带源ECFCs生长曲线的测定
将按照实施例1方法获得的贴壁细胞达80％融合后用0.25％胰酶消 化后，按2×104细胞/孔接种在24孔板内，每隔24h消化3个孔，收集 细胞，并用0.4％的台盼兰计数活细胞，共观察7天，绘制生长曲线。
脐带源ECFCs生长曲线基本符合细胞生长曲线规律，分为潜伏期、 对数期、平台期，分别为1-2d、3-7d和7d后。提示脐带源ECFCs在 体外增殖相对稳定，生长状态无异常。细胞增殖较快，在对数生长期， 细胞倍增时间均约为(43.53±5.38)h(图2)。
实施例4脐带源ECFCs的细胞周期测定
在实施例1获得的脐带源ECFCs生长的对数期，消化细胞，冷冻 75％乙醇4℃固定1h，10μg/mL的RNase A 37℃孵育30min，加入50 μg/mL碘化丙啶4℃避光孵育5min，流式细胞仪(FACA Calibur型， 美国)检测，ModiFIT软件分析结果。
流式细胞仪分析细胞周期显示，G0/G1期占75.58％，S+G2+M期的 细胞仅占24.42％(图3)。
结果表明，脐带源ECFCs大多数细胞处于G0/G1期，少数处于S 期，具有典型干细胞增殖特点。
实施例5脐带源ECFCs的免疫表型分析
取按照实施例1方法制备的第3代处于对数生长期的脐带源ECFCs， 按每管1×105个细胞，依次加入10μlPE标记的鼠抗人单克隆抗体CD31， CD73，CD105，VEGFR2，FITC标记的CD34，CD45，CD90，HLA-DR抗 体(以上抗体均购自BD PharMingen，美国)及其相应同型对照标记 ECFCs细胞，室温避光30分钟；用PBS洗2-3次，流式细胞仪检测。
流式细胞仪检测第3代细胞免疫表型显示，贴壁细胞均表达CD34、 CD73、CD90和CD105、CD31、VEGFR2，不表达CD45和内皮细胞 的特征性表型CD31，不表达HLA-DR。CD34表达在传代过程中表达 逐渐下降，一般在5-7代以后表达消失，其余表达则不变(图4)。
结果表明，按照本发明方法制备得到的细胞是内皮克隆形成细胞， 而不是普通的血管内皮细胞。
实施例6脐带源ECFCs的细胞集落形成实验
按照实施例1方法制备得到的贴壁细胞常规消化，以1×103个细胞 接种于直径60cm培养皿中，37℃，5％CO2培养箱培养14天，甲醇固 定5分钟，弃培养基，0.5％结晶紫染色，以大于50个细胞为一个集落， 计算集落数。
细胞集落形成实验显示每103个细胞约有36个克隆形成(图5)。 结果表明，脐带源ECFCs具有细胞克隆形成能力，增殖能力强。
实施例7细胞表型特征实验
1.成血管实验
按每孔30μlMatrigel溶液(BD，美国)接种到预冷的48孔板中，置于 37℃、40min，使Matrigel凝固。按照实施例1方法制备得到的第三代 ECFCs调整为浓度1×104/1ml，按每孔1ml加入铺好Matrigel的48孔板 中，置于37℃、5％CO2的培养箱中孵育24h。设三个复孔，倒置显微 镜下观察血管形成。
细胞接种于Matrigel中孵育24小时拉长，成为芽式生长，形成管状 树枝状分叉结构(图6)。
成血管实验结果表明，脐带源ECFCs体外具有形成新生血管的能 力。
2.吞噬实验
按照实施例1方法制备得到的第三代ECFCs在玻片上培养5d后， PBS漂洗1次后加入乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL，10μg/ml)， 37℃、5％CO2的培养箱中孵育4h，PBS漂洗2次，1％多聚甲醛固定 20min，PBS漂洗后，加入DAPI(1.5μg/ml)，37℃、5％CO2的培养 箱中避光孵育1h，在倒置荧光显微镜下观察。
倒置荧光显微镜下观察红色细胞为吞噬Dil-acLDL的ECFCs(图 7)。
吞噬实验结果表明，脐带源ECFCs具有内皮细胞吞噬功能的特点。
实施例8免疫荧光方法检测细胞表面血管性血友病因子(vWF)的 表达
按照实施例1方法制备得到的第三代ECFCs在玻片上培养5d后， 用1％多聚甲醛固定10min；PBS洗2次，0.2％riton-100透膜20min， 依次加入1∶50稀释鼠抗人vWF单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology， 美国)100μl，37℃孵育1h，PBS洗2次，加入羊抗鼠IgG抗体，37℃ 孵育1h，PBS洗2次，DAPI(1.5ug/ml)染核30min，倒置荧光显微镜下 观察结果。
倒置荧光显微镜下观察红色细胞为表达vWF阳性的ECFCs(图8)。
结果表明，脐带源ECFCs表达内皮细胞标志vWF抗原。
实施例9vWF免疫组织化学检测
按照实施例1方法制备得到的第三代ECFCs在玻片上培养5d后，用 1％多聚甲醛固定10min，PBS洗2次，用3％H2O2灭活内源性过氧化物 酶10min，山羊血清阻断10min，然后分别加入1∶50稀释鼠抗人vWF单 克隆抗体100μl，37℃孵育60min，用PBS清洗后加入二抗37℃孵育30 min，DAB显色，显微镜下观察，细胞浆棕色为阳性反应细胞，根据棕色 深浅判断阳性强度。
免疫细胞化学染色显示，ECFCs表达vWF，阳性细胞呈棕褐色染色， 阴性对照未见染色(图9)。
结果表明，脐带源ECFCs表达内皮细胞标志vWF抗原。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人 员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修 改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围 由所附权利要求及其任何等同物给出。