技术领域
本发明属于聚合物科学与技术领域，特别涉及一种大分子印迹聚乙烯基吡咯烷酮/海藻 酸钙聚合物微球及其制备方法。
背景技术
海藻酸钠是一种从褐藻中衍生出的阴离子多聚糖，它由D-manuronic and L-glucoside linkages组成。海藻酸盐的重要特征是在二价金属离子的存在下会产生凝胶，如钙离子，锌离 子等。海藻酸钠是一个可行且合适的蛋白质分子印迹基材，然而，海藻酸钙的机械强度不高， 它的溶胀常常使印迹位点变形从而降低蛋白质分子的印迹效率。为此很多研究者尝试改性海 藻酸钙或是将海藻酸盐与其它聚合物复合来提高应用性能。
张凤菊等报道了BSA印迹的海藻酸钙凝胶微球，羟乙基纤维素被用来与海藻酸钠(SA)形 成互穿网络以增加微球的机械强度，在一定程度上提高了印迹效果。【成国祥，张凤菊，英晓 光，双模板法羟乙基纤维素改性海藻酸盐微球及制备方法，中国发明专利，申请号 200510015832.1】。将聚乙烯醇(PVA)与海藻酸钙复合的研究也有报道【S.Hertzberg。E.Moen。 C.Vogelsang.Mixed photo-cross-linked polyvinyl alcohol and calcium-alginate gels for cell entrapment.Appl Microbiol Biotechnol。1995。43：10-17】。【Chao Liu，Xiujie Ji，Kongyin Zhao， et al.Preparation of Hydroxyapatite/Ca-Alginate Composite Microspheres via Inverse Suspension Crosslinked Method.Journal of Applied Polymer Science，104(2007)2034-2038】也阐述了聚磷 酸钙与海藻酸钙的复合。
PVP凝胶具有化学惰性和生物相容性，本身不会与蛋白质发生强的化学反应，也不使蛋 白质变性，使其具有良好的应用前景，而用交联pvp软湿凝胶进行蛋白质印迹也被研究过【G X cheng，C W Li，Study on the preparation of BSA-imprinted crosslinked PVP microsphers and the rebinding property via suspension polymerization，prepared】。
而本发明是将海藻酸钙与PVP两种成分复合，从而为大分子印迹提供一种新的基材。
发明内容
本发明提供了大分子蛋白质印迹聚乙烯基吡咯烷酮/海藻酸钙聚合物微球的制备方法及印 迹方法。
本发明的大分子印迹聚乙烯基吡咯烷酮/海藻酸钙聚合物微球，其组分和重量百分比如下：
海藻酸钠 10％-50％
聚乙烯基吡咯烷酮 0.1％-16％
氯化钙 20％-70％
蛋白质 0.1％-15％。
所述的蛋白 质包括牛血清白蛋白，卵白蛋白或溶菌酶。
所述的聚合物微球是蛋白质包埋印迹聚乙烯基吡咯烷酮/海藻酸钙聚合物微球粒径大小 为100-600μm.。
本发明的大分子印迹聚乙烯基吡咯烷酮/海藻酸钙聚合物微球的制备方法，其特征是所述 的蛋白质包埋印迹聚乙烯基吡咯烷酮/海藻酸钙聚合物微球的制备方法步骤如下：
a)取蛋白质BSA溶液，加入海藻酸钠，搅拌使其充分溶解，静置消去气泡成为实验中的 水相；
b)按水相体积的1∶1-4∶1量取有机相，倒入容器内，向其中加入1％-5％的乳化剂和 0.1％-15％的乙基纤维素，机械搅拌使其充分溶解；
c)将混合水溶液在磁力搅拌下加入到盛有机油相的容器中，常温搅拌使粘稠的混合溶液 分散成微球；在磁力搅拌下向体系中加入CaCl2溶液进行凝胶化反应；
d)静置使海藻酸钙凝胶微球沉降到容器底部，缓慢去掉上层液体，用去离子水冲洗微球， 洗脱模板处理后得到蛋白质大分子包埋印迹的聚乙烯基吡咯烷酮/海藻酸钙聚合物微球。
所述的有机相密度为0.75-0.95g/mL，由大豆油和乙酸丁酯复配而成，乳化剂为Tween80， 其质量占油相质量的1％-5％，乙基纤维素占海藻酸钠质量的0.1％-15％。
所述的大分子印迹聚乙烯基吡咯烷酮/海藻酸钙聚合物微球的制备方法，其特征是有机相 和水相的体积比为1∶1-4∶1。
本发明的大分子印迹聚乙烯基吡咯烷酮/海藻酸钙聚合物微球的制备方法中，所述的有机 相是通常采用的有机相，要求有机相的密度为0.75-0.95g/ml，其中溶解质量百分比为1％-5％ 的乳化剂或分散剂。但是为了环保需要，可采用如下有机相：
有机相1：大豆油与乙酸丁酯按照4∶1-1∶1的体积比混合，乳化剂为Tween80，其质 量占油相质量的1％-5％。
有机相2：色拉油与乙酸丁酯按照4∶1-1∶1的体积比混合，分散剂乙基纤维素占海藻酸 钠质量的0.1％-15％。
本发明所制备的聚乙烯基吡咯烷酮/海藻酸钙聚合物微球，经蛋白质重结合测试结果表 明，印迹微球的重结合量是非印迹微球，几不加蛋白质制备的微球的2-5倍。本发明制备方 法简单易行、反应过程易于控制等优点，解决了单一海藻酸钙微球的重结合量低，性能不稳 定的不足，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1：牛血清白蛋白印迹聚乙烯基吡咯烷酮/海藻酸钙聚合物微球照片；
图2：非印迹聚乙烯基吡咯烷酮/海藻酸钙聚合物微球照片；
图3：包埋印迹聚乙烯基吡咯烷酮/海藻酸钙聚合物微球对牛血清蛋白重结合曲线；
图4：包埋印迹聚乙烯基吡咯烷酮/海藻酸钙聚合物微球对牛血清蛋白印迹效率曲线。
具体实施方式
实施例1.
1.取20ml去离子水加入0.005gBSA配成溶液溶液，加入0.5g的海藻酸钠和0.005g的PVP， 搅拌使其充分溶解，静置消去气泡；
2.按4∶1的体积比量取大豆油和乙酸丁酯共计80ml，倒入250ml的烧杯内，向其中加入一定 量的0.1g tween80和0.06g乙基纤维素，常温搅拌10min使其充分溶解；
3.将混合水溶液在磁力搅拌下加入到盛有机油相的烧杯中，常温搅拌10min使粘稠的混合溶 液分散成微球；在磁力搅拌下向体系中加入4％的CaCl2溶液20ml进行凝胶化反应，继续搅 拌2小时。
4.静置30分钟，使海藻酸钙凝胶微球沉降到烧杯底部，缓慢倒去上层液体，用去离子水冲洗 微球3次。进行下一步的洗脱模板处理，得到牛血清白蛋白包埋印迹的聚乙烯基吡咯烷酮/海 藻酸钙聚合物微球。
包埋印迹的聚乙烯基吡咯烷酮/海藻酸钙聚合物微球的光学显微镜照片见图1，其对牛血清 白蛋白的重结合见图3.从图1中看到微球形貌较好，微球表面光滑。从图3中看出，表面印 迹微球对牛血清白蛋白的重结合容量明显大于非印迹微球对牛血清白蛋白的冲结合容量，平 衡时重结合容量为非印迹微球重结合容量的4.091倍，从图4也可以看出得出印迹微球的印 迹效率也较高。得到的聚合物微球粒径大小为100-600μm。
实施例2
1.取20ml去离子水加入0.5g的海藻酸钠和0.16gPVP，搅拌使其充分溶解，静置消去气泡；
2.按1∶1的体积比量取色拉油和乙酸丁酯共计80ml，倒入250ml的烧杯内，向其中加入一定 量的0.1gtween80和0.06g乙基纤维素，常温搅拌10min使其充分溶解；
3.将混合水溶液在磁力搅拌下加入到盛有机油相的烧杯中，常温搅拌10min使粘稠的混合溶 液分散成微球；在磁力搅拌下向体系中加入6％的CaCl2溶液20ml进行凝胶化反应，继续搅 拌2小时。
4.静置30分钟，使海藻酸钙凝胶微球沉降到烧杯底部，缓慢倒去上层液体，用去离子水冲洗 微球3次。进行下一步的洗脱模板处理，得到BSA包埋印迹的聚乙烯基吡咯烷酮/海藻酸钙 聚合物微球。
得出的非印迹微球如图2所示，与印迹微球相比在外形上没有太大区别。
实施例3
1.取20ml去离子水加入0.06g卵白蛋白配成溶液溶液，加入0.4g海藻酸钠和0.08gPVP，搅拌 使其充分溶解，静置消去气泡；
2.按3∶1的体积比量取色拉油和乙酸丁酯共计70ml，倒入250ml的烧杯内，向其中加入一定 量的0.05gtween80和0.04g乙基纤维素，常温搅拌10min使其充分溶解；
3.将混合水溶液在磁力搅拌下加入到盛有机油相的烧杯中，常温搅拌10min使粘稠的混合溶 液分散成微球；在磁力搅拌下向体系中加入3％的CaCl2溶液30ml进行凝胶化反应，继续搅 拌1小时。
4.静置30分钟，使海藻酸钙凝胶微球沉降到烧杯底部，缓慢倒去上层液体，用去离子水冲洗 微球3次。进行下一步的洗脱模板处理，得到BSA包埋印迹的聚乙烯基吡咯烷酮/海藻酸钙 聚合物微球。
实施例4
1.取20ml去离子水加入0.13g溶菌酶配成溶液溶液，加入0.5g的海藻酸钠和0.01gPVP，搅拌 使其充分溶解，静置消去气泡；
2.按2∶1的体积比量取大豆油和乙酸丁酯共计85ml，倒入250ml的烧杯内，向其中加入一定 量的0.2gtween80和0.03g乙基纤维素，常温搅拌10min使其充分溶解；
3.将混合水溶液在磁力搅拌下加入到盛有机油相的烧杯中，常温搅拌10min使粘稠的混合溶 液分散成微球；在磁力搅拌下向体系中加入5％的CaCl2溶液30ml进行凝胶化反应，继续搅 拌1小时。
4.静置30分钟，使海藻酸钙凝胶微球沉降到烧杯底部，缓慢倒去上层液体，用去离子水冲洗 微球3次。进行下一步的洗脱模板处理，得到BSA包埋印迹的聚乙烯基吡咯烷酮/海藻酸钙 聚合物微球。
本发明提出的大分子印迹聚乙烯基吡咯烷酮/海藻酸钙聚合物微球及其制备方法，已通过 实施例进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明的内容、精神和范围内对本文所述 的内容进行改动或适当变更与组合，来实现本发明。特别需要指出的是，所有相类似的替换 和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明的精神、范围和内 容中。