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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710129897.1 (22)申请日 2017.03.07 (71)申请人 东北农业大学 地址 150030 黑龙江省哈尔滨市香坊区木 材街59号 (72)发明人 常缨 卜志刚陈玲玲陶文青 张常旭王琪 (74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211 代理人 邓宇 (51)Int.Cl. C12N 15/84(2006.01) A01H 9/00(2006.01) (54)发明名称 一种建立农杆菌介导香鳞毛蕨配子体遗传 转化体系的方法 (57)摘要。
2、 本发明公开了一种建立农杆菌介导香鳞毛 蕨配子体遗传转化体系的方法， 属于香鳞毛蕨遗 传转化技术领域。 本发明所提供的方法为是以香 鳞毛蕨配子体为受体， 用植物双元表达载体转化 农杆菌， 将经过预培养的香鳞毛蕨配子体浸泡于 转化后的农杆菌菌液中侵染， 除菌后进行延迟培 养， 最后对目标基因进行检测， 筛选后得到具有 可遗传目标基因的香鳞毛蕨植株。 该方法过程简 单， 操作方便， 成本低廉， 能在较短的时间内完成 香鳞毛蕨遗传转化体系的建立， 为今后进一步研 究相关基因合成和调控的特性， 转入抗性基因， 创新蕨类植物的种质资源和遗传转化奠定基础。 适用于香鳞毛蕨的遗传转化。 权利要求书1页 说明。
3、书7页 附图2页 CN 108570478 A 2018.09.25 CN 108570478 A 1.一种建立农杆菌介导香鳞毛蕨配子体遗传转化体系的方法， 其特征在于， 包括以下 步骤： 1)预培养： 将香鳞毛蕨配子体置于培养基上进行预培养； 2)农杆菌菌液的制备： 用植物双元表达载体转化农杆菌， 然后将含有植物双元表达载 体的农杆菌扩大培养后收集菌体， 重悬后获得农杆菌菌液； 3)农杆菌菌液的浸染； 将步骤1)中经过预培养的香鳞毛蕨配子体浸泡于步骤2)获得的 农杆菌菌液中进行侵染； 4)除菌和延迟培养： 除菌后进行延迟培养； 5)检测筛选： 最后对目标基因进行检测， 筛选后得到具有可遗传目。
4、标基因的香鳞毛蕨 植株。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤1)所述预培养的时间为0d-3d。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤2)所述植物双元表达载体上质粒携带 有GUS报告基因， CaMV启动子和筛选标记基因。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤2)所述植物双元表达载体为PBI 121。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤1)所述农杆菌菌液的OD6000.5-0.6。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤3)所述侵染， 时间为10min-15min。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤4)所述除。
5、菌是将经过农杆菌浸染后的 配子体用200mg/L-500mg/L的头孢霉素无菌水清洗后， 接种到含有200mg/L-300mg/L头孢霉 素的培养基上。 8.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤4)所述延迟培养的时间为7d-15d。 9.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤5)所述的筛选是在含有200mg/L- 300mg/L头孢霉素和150mg/L-200mg/L卡那霉素的培养基上进行的。 10.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)预培养： 将香鳞毛蕨配子体置于培养基上进行预培养2d； 2)农杆菌菌液的制备： 用载体PBI 121转化农杆菌LB4。
6、404， 然后将含有PBI 121载体的 农杆菌LB4404扩大培养后收集菌体， 重悬后使OD600为0.5， 获得农杆菌菌液； 3)农杆菌菌液的浸染； 将步骤1)中经过预培养的香鳞毛蕨配子体浸泡于步骤2)获得的 农杆菌菌液中进行侵染10min； 4)将经过农杆菌浸染后的配子体用200mg/L-500mg/L的头孢霉素无菌水清洗后， 接种 到含有300mg/L头孢霉素的培养基上， 然后进行延迟培养15d； 5)最后对GUS基因进行检测， 在含有300mg/L头孢霉素和200mg/L卡那霉素的培养基上 筛选30d， 得到具有可遗传目标基因的香鳞毛蕨植株。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108。
7、570478 A 2 一种建立农杆菌介导香鳞毛蕨配子体遗传转化体系的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种建立农杆菌介导香鳞毛蕨配子体遗传转化体系的方法， 属于香鳞 毛蕨遗传转化技术领域。 背景技术 0002 香鳞毛蕨(Dryopteris fragrans(L.)schoot.)是一种重要的药用植物， 由于其对 皮肤病有很好的疗效， 逐渐被人们重视。 目前国内外对香鳞毛蕨的研究主要集中在其药用 成分、 药理作用、 形态解剖学以及资源分布研究比较多， 而对于分子生物学方面的研究比较 少。 在蕨类植物中进行遗传转化却非常困难， 因为蕨类植物的生活史有明显的世代交替现 象， 生长周期较长， 目前。
8、， 在蕨类植物中只有水蕨建立了转化体系， 其他蕨类植物的转化体 系尚未研究， 且对于蕨类植物而言农杆菌介导的转基因还没有成功的例子， 目前在蕨类植 物中进行遗传转化可行的方法就是利用基因枪法， 但是到目前为止依然没有办法得到稳定 的转化效果。 韩静丹(2012)对铁线蕨的转基因的两种方法进行了研究， 结果表明， 农杆菌介 导的遗传转化由于再生过程中抑菌剂的影响致使材料褐化率高， 难以继续分化； 而基因枪 法由于在轰击过程中受到较大程度的污染， 致使材料在再生过程难以继续生长， 均未能建 立稳定的再生体系。 但近几年， 国外用水蕨的配子体和愈伤组织为受体材料， 利用基因枪和 农杆菌介导法成功的将。
9、外源基因导入到受体细胞内， 所以建立蕨类遗传转化体系成为可 能。 目前关于香鳞毛蕨转基因的研究尚未报道， 还没有建立一个高效、 稳定的遗传转化体 系， 更没有找到一种比较成熟的香鳞毛蕨遗传转化体系的建立方法。 发明内容 0003 为建立一种高效、 稳定的香鳞毛蕨遗传转化体系， 本发明提供了一种建立农杆菌 介导香鳞毛蕨配子体遗传转化体系的方法， 采用的技术方案如下： 0004 本发明的目的在于提供一种建立农杆菌介导香鳞毛蕨配子体遗传转化体系的方 法， 该方法包括以下步骤： 0005 1)预培养： 将香鳞毛蕨配子体置于培养基上进行预培养； 0006 2)农杆菌菌液的制备： 用植物双元表达载体转化农。
10、杆菌， 然后将含有植物双元表 达载体的农杆菌扩大培养后收集菌体， 重悬后获得农杆菌菌液； 0007 3)农杆菌菌液的浸染； 将步骤1)中经过预培养的香鳞毛蕨配子体浸泡于步骤2)获 得的农杆菌菌液中进行侵染； 0008 4)除菌和延迟培养： 除菌后进行延迟培养； 0009 5)检测筛选： 最后对目标基因进行检测， 筛选后得到具有可遗传目标基因的香鳞 毛蕨植株。 0010 优选地， 步骤1)所述预培养的时间为0d-3d。 0011 优选地， 步骤2)所述植物双元表达载体上质粒携带有GUS报告基因， CaMV启动子和 筛选标记基因。 说明书 1/7 页 3 CN 108570478 A 3 0012。
11、 更优选地， 步骤2)所述植物双元表达载体为PBI 121。 0013 优选地， 步骤1)所述农杆菌为LB4404。 0014 优选地， 步骤1)所述农杆菌菌液的OD6000.5-0.6。 最优为0.5。 0015 优选地， 步骤3)所述侵染， 时间为10min-15min。 最优选为10min。 0016 优选地， 步骤4)所述除菌是将经过农杆菌浸染后的配子体用200mg/L-500mg/L的 头孢霉素无菌水清洗后， 接种到含有200mg/L-300mg/L头孢霉素的培养基上。 0017 优选地， 步骤4)所述延迟培养的时间为7d-15d。 0018 优选地， 步骤5)所述的筛选是在含有20。
12、0mg/L-300mg/L头孢霉素和150mg/L- 200mg/L卡那霉素的培养基上进行的。 0019 优选地， 步骤5)所述的筛选时间为30d。 0020 优选地， 所述方法包括以下步骤： 0021 1)预培养： 将香鳞毛蕨配子体置于培养基上进行预培养2d； 0022 2)农杆菌菌液的制备： 用载体PBI 121转化农杆菌LB4404， 然后将含有PBI 121载 体的农杆菌LB4404扩大培养后收集菌体， 重悬后使OD600为0.5， 获得农杆菌菌液； 0023 3)农杆菌菌液的浸染； 将步骤1)中经过预培养的香鳞毛蕨配子体浸泡于步骤2)获 得的农杆菌菌液中进行侵染10min； 0024。
13、 4)将经过农杆菌浸染后的配子体用200mg/L-500mg/L的头孢霉素无菌水清洗后， 接种到含有300mg/L头孢霉素的培养基上， 然后进行延迟培养15d； 0025 5)最后对GUS基因进行检测， 在含有300mg/L头孢霉素和200mg/L卡那霉素的培养 基上筛选， 得到具有可遗传目标基因的香鳞毛蕨植株。 0026 本发明有益效果： 0027 1、 本发明方法成功建立了香鳞毛蕨的遗传转化体系， 该方法过程简单， 操作方便， 成本低廉， 能在较短的时间， 即30d内， 完成香鳞毛蕨遗传转化体系的建立。 为今后进一步研 究相关基因合成和调控的特性， 转入抗性基因， 创新蕨类植物的种质资源和。
14、遗传转化奠定 基础。 本发明方法可以提高香鳞毛蕨的抗性和适应性。 0028 2、 本发明是国内外首次公开香鳞毛蕨遗传转化的方法， 取得了较好的效果， 在转 化过程中配子体褐化率较低为40， 转化率为8.33， 为研究香鳞毛蕨基因功能奠定基础。 附图说明 0029 图1为预培养时间对配子体转化率的影响。 0030 图2为香鳞毛蕨配子体。 0031 图3为GUS染色前香鳞毛蕨配子体。 0032 图4为GUS染色后香鳞毛蕨配子体。 具体实施方式 0033 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明， 但本发明不受实施例的限制。 0034 实施例1 0035 一.试验材料的准备 0036 香鳞毛蕨全株采收。
15、于黑龙江省五大连池地区， 经中国科学院植物研究所张宪春研 究员鉴定为鳞毛蕨科， 鳞毛蕨属植物香鳞毛蕨。 收集的香鳞毛蕨孢子， 保存于4冰箱中， 备 说明书 2/7 页 4 CN 108570478 A 4 用。 0037 使用的根癌农杆菌菌株为LB4404,植物双元表达载体为PBI 121,该质粒携带有 GUS报告基因,CaMV启动子,筛选标记基因Npt。 由东北农业大学植物教研室保存。 0038 卡那霉素(Km)、 利福平(Rif)等抗生素试剂购自国药集团。 抗生素储备液： 配制所 用水均为无菌水。 头孢霉素为上海新先锋药业有限公司生产； 乙酰丁香酮为进口分析纯， 蔗 糖购于天津市科密欧化学。
16、试剂有限公司， 琼脂购自乘风牌， 福建泉州市泉港化工厂。 0039 二.实验方法 0040 本实施例建立了一种农杆菌介导香鳞毛蕨配子体的遗传转化体系， 是以香鳞毛蕨 配子体为受体， 用植物双元表达载体转化农杆菌， 将经过预培养的香鳞毛蕨配子体浸泡于 转化后的农杆菌菌液中侵染， 除菌后进行延迟培养， 最后对目标基因进行检测， 筛选后得到 具有可遗传目标基因的香鳞毛蕨植株。 具体实验方法如下： 0041 1、 香鳞毛蕨配子体的培养 0042 取成熟的孢子置于1.5mL离心管内， 滴入无菌水， 充分振荡使成悬浮液， 4 000r/ min离心1min， 使孢子全部沉淀， 弃去上清液。 离心管内再滴入。
17、约1.0mL的0.1HgCl2溶液, 灭菌1min， 无菌水冲洗45次， 用上述离心方法获得无菌的孢子悬浮液。 0043 接种于改良的Knop s培养基中先黑暗处理36h后进行培养， 待心脏形阶段原叶体 其接种于1/2MS+3.0蔗糖+0.70.8琼脂的培养基中进行培养15d-30d后得到转化的 受体材料。 改良的Knop s液体培养基： 该培养基中含有0.25g NaH2PO4， 0.25g KNO3， 0.25g MgSO4， 1.0g Ca(NO3)2和蒸馏水1000mL， pH为5.7-5.8。 0044 1/2MS+3.0蔗糖+0.70.8琼脂的培养基的pH值为5.7-5.8。 00。
18、45 培养条件为： 温度为252， 光照12h， 黑暗12h， 光强150 molm-2s-1-180 molm-2s-1。 0046 培养获得的香鳞毛蕨配子体见图2。 0047 2、 香鳞毛蕨配子体的预培养 0048 将香鳞毛蕨配子体置于1/2MS+3.0蔗糖+0.70.8琼脂的培养基上进行预 培养。 0049 3、 农杆菌菌液的制备 0050 将含有pBI121的农杆菌LB4404单菌落接种于YEB液体培养基中， 28、 200rpm振荡 培养12h， 然后以1:100比例扩大培养； 待菌液的浓度达到OD6000.8后， 4、 4000rpm离心 12min收集菌体， 并将菌体用1/2MS。
19、(1/2MS液体培养基中加入乙酰丁香酮(400 M/L)重悬于 液体浸染培养基中， 调整至合适的OD600值， 获得农杆菌菌液。 0051 4、 农杆菌菌液的侵染 0052 将经过预培养的香鳞毛蕨配子体浸泡于农杆菌菌液(上述3中获得的)中进行侵 染。 0053 5、 除菌 0054 是将经过农杆菌浸染后的配子体， 先用200mg/L-500mg/L(优选为400mg/L)的Cef 无菌水清洗4-5次， 然后用无菌滤纸吸干表面多余的菌液， 然后将外植体接种到1/2MS+ 3.0蔗糖+0.70.8琼脂+头孢霉素200mg/L-300mg/L的培养基上(还可以再添加卡那 霉素使其浓度为200mg/L。
20、)。 说明书 3/7 页 5 CN 108570478 A 5 0055 6、 延迟培养和筛选 0056 是先将材料在不含选择压的培养基中延迟培养7d-15d， 让其继续与农杆菌共生， 再进行筛选培养， 以提高转化率。 具体为： 是将被侵染的香鳞毛蕨配子体接种于1/2MS+ 3.0蔗糖+0.70.8琼脂+卡那霉素200mg/L+头孢霉素300mg/L的培养基中进行筛选 后在只含有Cef培养基中推迟筛选， 推迟筛选处理时间为0d、 7d、 15d、 30d。 0057 7、 GUS基因瞬时表达的检测 0058 将要检测的外植体洗净后放入离心管中,浸泡在X-gluc溶液中,于37下避光过 夜,注意。
21、密封。 次日用梯度酒精逐步脱去色素， 同时用未转化的外植体作为对照。 观察外植 体的颜色变化,有表达的部位显现稳定、 不溶于透明液的蓝色。 具体为： 0059 将要检测的外植体洗净后放入2mL的离心管中， 浸泡在X-gluc溶液中， 于37保温 箱中避光放置10h以上(一般过夜)， 注意密封。 次日将浸泡10-12h的外植体从离心管中取出 用清水冲洗后， 分别用50、 75、 90、 95的酒精进行梯度脱色处理， 直至对照外植体绿 色全部退掉。 统计外植体表达率外植体具有蓝色斑点的个数/总接种的外植体个数。 通过 统计数据发现转化率可达8.33。 0060 实施例2： 各影响因素实验 0061。
22、 1、 香鳞毛蕨最适卡那霉素抗性浓度的选择 0062 由于采用卡那霉素为筛选剂,首先需要掌握香鳞毛蕨自身的卡那霉素抗性指标， 具体实验过程和结果如下： 0063 实验所用载体pBI121的选择标记基因为NptII， 它编码的产物对卡那霉素具有抗 性。 因而可以设置添加0、 50mg/L、 100mg/L、 150mg/L、 200mg/L， 5个卡那浓度梯度在基本培养 基上置于培养室内光照培养， 30d后统计在培养基上不同处理的存活情况对比分析， 确定能 够使外植体死亡的最低浓度为合适的卡那浓度。 其中每个处理3个皿， 每皿接种10个外植 体， 重复3次。 将香鳞毛蕨配子体接种到含有卡那霉素的。
23、培养基中进行抗性浓度的筛选。 卡 那霉素对配子体分化率的影响见表1。 0064 表1卡那霉素对配子体分化率的影响 0065 0066 由表1可知将香鳞毛蕨配子体接种到含有不同浓度的分化培养基后， 随着浓度的 升高， 香鳞毛蕨配子体体的分化率逐渐降低， 当浓度达到200mg/L时， 香鳞毛蕨配子体全部 褐化死亡。 所以确定香鳞毛蕨配子体对卡那霉素抗性筛选最终浓度为(200mg/L),筛选时间 为30d。 2、 外植体预培养时间的选择 0067 将外植体置于培养基上预培养0d、 1d、 2d、 3d， 然后用制备好的菌液侵染10min。 共 说明书 4/7 页 6 CN 108570478 A 6。
24、 培养数天后进行筛选培养， 每个处理3皿， 每皿接种16个外植体， 重复3次。 30d后观察抗性外 植体的生长情况并计算表达率。 预培养时间对配子体转化率的影响见图1。 0068 由图1可以看出， 不同预培养时间对香鳞毛蕨配子体有一定的影响， 一般地， 在非 转基因状态,配子体预培养时间越长,对卡那霉素的抗性能力越强； 而在利用农杆菌介导法 对受体进行侵染时,要求受体材料也处于最容易接收外源大分子的状态。 0d、 1d、 3d处理对 配子体转化没有差异,预培养2d转化率为8.33。 说明预培养2d的配子体最容易接收外源 大分子,使得带有卡那霉素抗性基因的PBI121载体进入配子体伤口处的概率加。
25、大,2d处理 时间的配子体对卡那霉素抗性增强,因而确定预培养2d为最适预培养时间。 0069 3、 农杆菌最佳侵染时间的筛选 0070 用菌株培养阶段OD600为0.6、 侵染阶段OD400为0.5的农杆菌LB4404， 侵染预培养 后的配子体， 侵染时间设置5min、 10min、 15min， 共3个时间处理， 每个处理3皿， 每皿接种10 个外植体， 重复3次。 共培养4d后观察不同侵染时间的处理下外植体的生长情况与农杆菌的 侵染情况。 确定配子体的最佳侵染时间和菌液浓度。 筛选情况见表2。 0071 表2菌液浓度和侵染时间对转化率的影响 0072 0073 由表2可以看出， 不同侵染时。
26、间对配子体有一定影响。 当OD600值为0.6时， 无论侵染 时间为5min、 10min还是15min， 在共培养的过程中， 大片白色农杆菌清晰可见， 后期用含头 孢的无菌水进行清洗后仍无法阻止农杆菌的生长， 且极容易造成材料的污染。 因而采用的 OD600值为0.5。 当OD600值为0.5时， 侵染时间为10min， 感菌率为60， 而侵染时间为15min时， 感菌率达到了100， 后期配子体极容易污染， 褐化率也达到了23.33。 因而香鳞毛蕨配子 体转化采用菌液浓度为0.5， 侵染时间为10min最为合适。 0074 4、 延迟培养时间的筛选 0075 在培养过程中发现， 外植体在与。
27、农杆菌共生的状态下依然可以存活， 并且可以继 续分化。 因此在共培养4d后， 先将材料在不含选择压的培养基中延迟培养一段时间， 让其继 续与农杆菌共生， 再进行筛选培养， 以提高转化率。 根据外植体情况， 设置延迟培养时间分 别为0d、 7d、 15d、 30d。 之后进行GUS基因瞬时表达的检测， 比较延迟培养时间对转化率的影 响。 延迟培养筛选方式对配子体转化率的影响见表3。 0076 表3延迟培养筛选方式对配子体转化率的影响 说明书 5/7 页 7 CN 108570478 A 7 0077 0078 0079 由表3可知， 香鳞毛蕨配子体在延迟培养7d、 15d后的配子体转化率分别为6。
28、.25、 8.33， 显著高于没有进行延迟培养的处理， 但过长时间(30d)的延迟培养会导致配子体的 死亡； 上述结果表明， 在一定程度内， 延迟培养的时间越长， 外植体与农杆菌共生的时间也 越长， Ti质粒转入外植体的机率越高， 则转化率越高。 因此， 选择延迟培养7-15d效果较好， 其中延迟培养15d效果最好。 0080 5、 最适宜抑菌剂(头孢霉素)浓度的筛选 0081 头孢霉素是植物遗传转化过程中较常用的抑菌剂。 对于抑菌剂的选择， 要求既能 抑制农杆菌的大量生长， 又能使对外植体生长的影响最小。 由前人研究经验可知， 当头孢浓 度达到200mg/L时便可很好的抑制农杆菌的生长。 因。
29、而为了确定头孢霉素对外植体生长的 影响， 分别设置了0,100,200,300,400,500mg/L， 6个浓度梯度， 在基本培养基上置于培养室 内光照培养。 每个处理4个皿， 每皿接种10个外植体， 重复3次。 30d后统计外植体的分化率及 死亡率， 以此确定适宜的Cef浓度。 头孢霉素浓度对配子体生长的影响见表4。 0082 表4头孢霉素浓度对配子体生长的影响 0083 0084 由表4可知， 接种30d后， 香鳞毛蕨配子体分化率随Cef浓度的增加而下降， 死亡率 则逐渐升高。 当Cef浓度分别为200mg/L、 300mg/L时， 配子体的生长状况良好， 分化率较高， 分别为76.67。
30、、 76.33,当浓度达到400,500mg/L时， 配子体分化率明显降低分别为 33.33， 16.67， 褐化严重。 因此为了既能较好地抑制农杆菌的生长， 又不会影响配子体 的生长分化， 综合考虑确定香鳞毛蕨在共培养后抑制农杆菌的Cef浓度为300mg/L。 0085 实施例3 0086 本实施例提供了上述优化后得到的最优建立农杆菌介导香鳞毛蕨配子体的遗传 转化体系的方法， 具体包括以下步骤： 0087 1)预培养： 将香鳞毛蕨配子体置于培养基上进行预培养2d； 说明书 6/7 页 8 CN 108570478 A 8 0088 2)农杆菌菌液的制备： 用载体PBI 121转化农杆菌LB4。
31、404， 然后将含有PBI 121载 体的农杆菌LB4404扩大培养后收集菌体， 重悬后使OD600为0.5， 获得农杆菌菌液； 0089 3)农杆菌菌液的浸染； 将步骤1)中经过预培养的香鳞毛蕨配子体浸泡于步骤2)获 得的农杆菌菌液中进行侵染10min； 0090 4)将经过农杆菌浸染后的配子体用200mg/L-500mg/L的头孢霉素无菌水清洗后， 接种到含有300mg/L头孢霉素的培养基上， 然后进行延迟培养15d； 0091 5)最后对GUS基因进行检测， 在含有300mg/L头孢霉素和200mg/L卡那霉素的培养 基上筛选30d， 得到具有可遗传目标基因的香鳞毛蕨植株。 0092 通过GUS基因瞬时表达的检测， 香鳞毛蕨配子体转化率为8.33， 褐化率低达 40， 即本发明方法转化率可达8.33。 GUS染色前见图3染色后见图4。 0093 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上， 但其并非用以限定本发明， 任何熟悉此 技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内， 都可以做各种改动和修饰， 因此本发明的保护 范围应该以权利要求书所界定的为准。 说明书 7/7 页 9 CN 108570478 A 9 图1 图2 说明书附图 1/2 页 10 CN 108570478 A 10 图3 图4 说明书附图 2/2 页 11 CN 108570478 A 11 。