筛选可逆转基因沉寂药物的肿瘤工程细胞及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102234630 A (43)申请公布日 2011.11.09 CN 102234630 A *CN102234630A* (21)申请号 201010163858.1 (22)申请日 2010.05.04 CCTCC C201044 2010.04.30 CCTCC C201045 2010.04.30 C12N 5/10(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) C12R 1/91(2006.01) (71)申请人 武汉瀚湖细胞有限公司 地址 430074 湖北省武汉市东湖高新技术开 发区关山一路 369 号 35-1-202 (72)发明人 司佳。

2、丽 (74)专利代理机构 武汉凌达知识产权事务所 ( 特殊普通合伙 ) 42221 代理人 宋国荣 (54) 发明名称 筛选可逆转基因沉寂药物的肿瘤工程细胞及 其应用 (57) 摘要 本发明涉及筛选可逆转基因沉寂药物的肿瘤 工程细胞， 包含有一个报告基因， 该报告基因置于 一个被表观遗传学水平抑制的启动子控制下， 因 此该报告基因处于被沉寂的状态。本发明提供了 针对直结肠癌和乳腺癌的两种肿瘤工程细胞， 构 造该类肿瘤工程细胞的方法， 以及使用该类肿瘤 工程细胞进行药物筛选的方法。可以提高该类药 物的开发效率， 降低开发成本。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国。

3、国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 4 页 CN 102234632 A1/1 页 2 1. 筛选可逆转基因沉寂药物的肿瘤工程细胞， 包含有一个报告基因， 该报告基因置于 一个被表观遗传学水平抑制的启动子控制下， 因此该报告基因处于被沉寂的状态。 2. 根据权利要求 1 所述的肿瘤工程细胞， 其特征在于 ： 该报告基因为表达增强型绿色 荧光蛋白 EGFP 的报告基因， 该报告基因的启动子为 CMV 启动子， 且该启动子区域内的 CpG 岛被甲基化从而该启动子被抑制 ； 该肿瘤工程细胞还包含有一个新霉素抗性基因 neor 为 选择基因， 该选择基因的。

4、启动子为 SV40 启动子。 3. 根据权利要求 2 所述的肿瘤工程细胞， 其特征在于 ： 该肿瘤工程细胞源于 HCT-116 人直结肠癌细胞， 并经过基因工程改造以达到权利要求 2 所述特征 ； 该工程细胞被命名为 ECRC-1 人直结肠癌工程细胞， 保藏号为 CCTCC C201044。 4.根据权利要求3所述的肿瘤工程细胞， 其特征在于 ： 所述基因工程改造为在HCT-116 人直结肠癌细胞的基因组内稳定的整合进一段载体， 该载体包含有 CpG 岛被甲基化的 CMV 启动子及其所控制的增强型绿色荧光蛋白 EGFP 报告基因、 以及一个 SV40 启动子及其所控 制的新霉素抗性基因 neo。

5、r。 5. 根据权利要求 2 所述的肿瘤工程细胞， 其特征在于 ： 该肿瘤工程细胞源于 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞， 并经过基因工程改造以达到权利要求 2 所述特征 ； 该工程细胞 被命名为 EBTC-1 人乳腺癌肿瘤工程细胞， 保藏号为 CCTCC C201045。 6. 根据权利要求 5 所述的肿瘤工程细胞， 其特征在于 ： 所述基因工程改造为在 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞的基因组内稳定的整合进一段载体， 该载体包含有 CpG 岛被甲基 化的 CMV 启动子及其所控制的增强型绿色荧光蛋白 EGFP 报告基因、 以及一个 SV40 启动子 及其所控制的新霉素抗性基因 neor。

6、。 7. 一种根据权利要求 1-6 中任一项所述的肿瘤工程细胞在筛选用于逆转表观遗传水 平基因沉寂的药物上的应用。 权 利 要 求 书 CN 102234630 A CN 102234632 A1/10 页 3 筛选可逆转基因沉寂药物的肿瘤工程细胞及其应用 技术领域 0001 本发明涉及生物化学、 基因工程、 肿瘤学以及医学相关领域。更具体的， 本发明涉 及两种肿瘤工程细胞的构建。 通过在来源细胞基因组中稳定的整合一段启动子区域被过甲 基化的荧光基因， 该肿瘤工程细胞可以选择性的且灵敏的对可逆转基因沉寂的物质产生荧 光反应。 此外， 本发明还涉及使用该两种肿瘤工程细胞为模型， 筛选可逆转基因沉。

7、寂的药物 及疗法的方法。 背景技术 0002 在探索生命科学与人类疾病的关系中， 我们很早就了解并接受了这样一个发 现 - 遗传密码的变异普遍的存在于各种疾病中。而随着越来越多人类疾病建立起了与遗传 物质 (DNA， RNA) 核酸序列的增、 减、 替代、 重组的关联， 我们已经确立起这样一个概念和共 识 ： 大多数 ( 如果不能说是绝大多数的话 ) 疾病的起源， 就是一种或数种被改变 ( 变异 ) 的 遗传状态。特别是对于现代人类头号杀手之一的癌症更是如此。事实上， 癌症也一直都被 认为是一种基因变异所致的疾病 (Hanahan 和 Weinberg， Cell 2000， 100 ： 57。

8、-70)。然而， 随 着对癌症分子机理的深入研究以及对染色质变化的观测在技术上成为可能， 生物医学科学 家们在肿瘤细胞中发现了一种更为普遍的分子损伤 ( 既导致癌变的原因 )- 表观遗传学修 饰水平上的基因沉寂 - 它甚至比基因本身的变异导致了更多的肿瘤形成。 0003 表观遗传学研究的是基于非基因序列改变所致的基因表达水平变化， 其中两个最 为关键的分子因素是 DNA 甲基化以及组蛋白修饰引起的染色质构象变化。组蛋白是将 DNA 包裹进核小体(组成染色质的最小单元)的一组小蛋白。 每个核小体由8个组蛋白以及147 个DNA碱基对共同组成。 这些组蛋白的氨基端(N-端)从核小体内核中延伸出来，。

9、 形成了组 蛋白尾， 而组蛋白尾部上的氨基酸则可以被乙酰基化、 甲基化、 磷酸化、 泛素化等方式修饰。 这些修饰的组合构成了复杂的组蛋白密码。基于组蛋白密码， 激活或抑制蛋白被吸引到核 小体的 DNA 上， 决定这一段的染色质是以松散 ( 基因表达 ) 还是紧密 ( 基因沉寂 ) 的形式 存在。在组蛋白修饰中， 组蛋白乙酰基化是 DNA 激活状态的重要标志。 0004 与组蛋白令人眼花缭乱的复杂修饰相比， DNA 甲基化相对来说较为简单， 是将单个 甲基(CH3-)添加到胞嘧啶的5位上。 在哺乳动物中这样的修饰只发生在位于鸟嘌呤之前的 胞嘧啶上， 因此被称为 CpG( 既 cytosine p。

10、receding guanine)。在约半数的人类基因的启 动子区域存在着由几十至上百CpG组成的CpG岛， 其胞嘧啶在正常细胞中一般未被甲基化。 0005 在绝大多数的肿瘤细胞中， 大量抑癌基因启动子区域的 CpG 岛出现了过甲基化现 象。受影响的 ( 启动子被过甲基化 ) 基因将被永久的沉寂。由于 DNA 的甲基化可以随着有 丝分裂在甲基化转移酶 (DNMT) 的作用下维持和扩增， 又由于这些获得过甲基化从而抑制 某些抑癌基因表达的细胞群获得了相对正常细胞的生存优势， 这样的表观遗传学损伤将会 逐渐积累、 放大、 叠加， 最终导致癌变的发生。 在人类肿瘤中， 数以百计到千计的基因会因为 启。

11、动子过甲基化而被沉寂， 这种表现形在肿瘤学中被命名为 CpG 岛甲基化表现型 (CIMP)。 CIMP 最初在直结肠癌中被发现， 而其后的研究在几乎所有的肿瘤与白血病类型中发现与确 说 明 书 CN 102234630 A CN 102234632 A2/10 页 4 认了其存在 (Issa， Nature Review Cancer 2004， 4 ： 988-993)。表观遗传学水平上的 DNA 过甲基化在肿瘤中的发生率相比基因变异来说更为频繁得多。 在多种人类乳腺癌与直结肠 癌中进行的、 超过 20,000 个转录子的大规模测序研究发现， DNA 过甲基化引起的可致癌的 基因沉寂是可致癌。

12、的基因变异的 10-100 倍 (Wood 等， Science 2007， 318 ： 1108-13)。举例 来说， Wnt 细胞信号通路的过度活性长期被认为是癌症发生过程中重要的早期事件。实验 证明， Wnt 信号通路的过度活性与 SFRP 基因的沉寂相关。SFRP 蛋白可以抑制 Wnt 受体， 进 而抑制 Wnt 信号通路。而启动子区域的过甲基化是导致 SFRP 基因沉寂的直接原因。此外， 表观遗传学水平的启动子区域过甲基化导致的基因沉寂还会抑制那些修复或阻止 DNA 损 伤的基因， 从而导致癌变的发生。 比如， 抑癌基因p16NK4a的基因沉寂被发现普遍存在于上皮 癌症、 乳腺癌、 。

13、淋巴癌以及淋巴细胞贫血症中。类似的， GST-PI 基因的沉寂被发现存在于几 乎所有的前列腺癌。对于直结肠癌， 70-80的患者的 DNA 错配修复基因 MLH1 发生基因沉 寂。对于乳腺癌， BRCA1、 p161NK4a、 E-cadherin、 TIMP-3、 CDH1、 TWIST、 CCND2 等众多抑癌基因 因为启动子区域过甲基化而发生沉寂。 过甲基化导致的抑癌基因沉寂是肿瘤发生的主因之 一。 0006 调控组蛋白密码 ( 既组蛋白修饰 ) 也对肿瘤发生有极为关键的作用。在肿瘤细胞 中， 某些基因的变异会吸引组蛋白修饰酶， 从而改变重要基因的表达。 如组蛋白去乙酰基酶 HDAC 的。

14、异常活性会导致组蛋白失去乙酰基， 从而将染色质从激活的松散状态改变为导致基 因沉寂的紧密状态， 进而导致正常细胞向癌细胞的转化。一个实例是在急性前髓细胞白血 病中， PML-RAR 基因的移位会吸引并激活 HDAC， 导致正常细胞的白血病化。此外， 其他影响 组蛋白密码因子的抑制或激活， 如组蛋白乙酰化酶CBP与激活组蛋白3的甲基化转移酶MLL 的失活、 以及抑制组蛋白 3 的三甲基化转移酶 EZH2 的过度活性， 都会抑制抑癌基因的转录 表达， 在肿瘤发生中起到了相当关键的作用。 0007 由于表观遗传学在健康与疾病上的作用被生物医学界越来越牢固的认可， 美国以 及国际科学界已经联合起来建立。

15、表观遗传学组， 也就是在整个基因组的水平上确定表观遗 传学修饰在不同人群、 不同生理组织、 不同疾病中的变化。 美国的国立卫生研究院已经宣布 了表观遗传组学路线图项目， 而美国癌症研究协会也与欧盟科学顾问委员会联合建立了人 类表观遗传组与疾病联盟。随着表观遗传学及表观遗传组学研究的深入， 国际医学界已经 确认， 抑癌基因沉寂是致癌作用的原因， 而非结果 ； 抑癌基因沉寂发生在肿瘤发生发展过程 的非常早期， 既癌变前期 ； 启动子区域的过甲基化是比基因变异更为普遍的导致癌变的原 因。 0008 鉴于以上的事实， 一种可以便捷、 灵敏、 易于观测的筛选那些可以逆转基因沉寂的 物质的方法， 将会对开。

16、发针对抑癌基因沉寂为治疗靶标的药物与疗法产生极为重要的推动 作用 ； 提高该类药物的开发效率， 降低开发成本。 发明内容 0009 本发明所要解决的问题是， 提供一种筛选可逆转基因沉寂药物的肿瘤工程细胞， 该肿瘤工程细胞能够便捷、 灵敏地筛选那些可以逆转基因沉寂的物质。 0010 本发明提供的技术方案是 ： 筛选可逆转基因沉寂药物的肿瘤工程细胞， 包含有一 个报告基因， 该报告基因置于一个被表观遗传学水平抑制的启动子控制下， 因此该报告基 说 明 书 CN 102234630 A CN 102234632 A3/10 页 5 因处于被沉寂的状态。 0011 而且， 该报告基因为表达增强型绿色荧。

17、光蛋白 EGFP 的报告基因， 该报告基因的启 动子为CMV启动子， 且该启动子区域内的CpG岛被甲基化从而该启动子被抑制 ； 该肿瘤工程 细胞还包含有一个新霉素抗性基因neor为选择基因， 该选择基因的启动子为SV40启动子。 0012 而且， 该肿瘤工程细胞源于 HCT-116 人直结肠癌细胞， 并经过基因工程改造 以达到所述特征 ； 该工程细胞被命名为 ECRC-1 人直结肠癌工程细胞， 保藏号为 CCTCC C201044( 保藏日期 2010 年 4 月 30 日 ； 保藏单位中国典型培养物保藏中心 CCTCC)。 0013 所述基因工程改造为在 HCT-116 人直结肠癌细胞的基因。

18、组内稳定的整合进一段 载体， 该载体包含有 CpG 岛被甲基化的 CMV 启动子及其所控制的增强型绿色荧光蛋白 EGFP 报告基因、 以及一个 SV40 启动子及其所控制的新霉素抗性基因 neor。 0014 或者， 该肿瘤工程细胞源于 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞， 并经过基因工程改造 以达到所述特征 ； 该工程细胞被命名为 EBTC-1 人乳腺癌肿瘤工程细胞， 保藏号为 CCTCC C201045( 保藏日期 2010 年 4 月 30 日 ； 保藏单位中国典型培养物保藏中心 CCTCC)。 0015 所述基因工程改造为在 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞的基因组内稳定的整合进一段。

19、 载体， 该载体包含有 CpG 岛被甲基化的 CMV 启动子及其所控制的增强型绿色荧光蛋白 EGFP 报告基因、 以及一个 SV40 启动子及其所控制的新霉素抗性基因 neor。 0016 本发明所述的肿瘤工程细胞在筛选用于逆转表观遗传水平基因沉寂的药物上的 应用。 0017 本发明涉及到两种肿瘤工程细胞， 该两种肿瘤工程细胞均包含有一个被表观遗传 学水平失活的启动子所控制的报告基因。因此， 该报告基因在该两种肿瘤工程细胞中是被 沉寂的。所述表观遗传学水平的失活由 DNA 甲基化形成。DNA 甲基化由位于 CpG 岛的胞嘧 啶的甲基化形成。该被甲基化的启动子是 pCMV。该报告基因为增强绿色荧。

20、光蛋白 (EGFP) 基因。该肿瘤工程细胞均包含有一个选择基因。该选择基因为新霉素抗性基因 (neor)。该 新霉素抗性基因为一个 SV40 启动子所控制。该两种肿瘤工程细胞来源于两种人类癌症细 胞系 ： 一种肿瘤工程细胞的源细胞是 HCT-116 人直结肠癌细胞， 该细胞包含有一个表达增 强型绿色荧光蛋白的报告基因， 该报告基因的启动子为 CMV 启动子， 该 CMV 启动子被甲基 化， 甲基化发生在启动子区域的 CpG 岛中 ； 该工程细胞包含有一个选择基因， 该选择基因为 新霉素抗性基因， 该新霉素抗性基因为一个SV40启动子所控制。 该工程细胞为ECRC-1人直 结肠癌肿瘤工程细胞， 。

21、保藏于中国典型培养物保藏中心 ( 地址 ： 武汉大学 )。另一种肿瘤工 程细胞的源细胞是 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞， 该细胞包含有一个表达增强型绿色荧光蛋 白的报告基因， 该报告基因的启动子为 CMV 启动子， 该 CMV 启动子被甲基化， 甲基化发生在 启动子区域的 CpG 岛中 ； 该工程细胞包含有一个选择基因， 该选择基因为新霉素抗性基因， 该新霉素抗性基因为一个 SV40 启动子所控制。该工程细胞为 EBTC-1 人乳腺癌肿瘤工程细 胞， 保藏于中国典型培养物保藏中心 ( 地址 ： 武汉大学 )。 0018 本发明还提供将候选物质 ( 药物或疗法 ) 与如上描述的肿瘤工程细胞。

22、接触， 其后 检测报告基因是否在该肿瘤工程细胞中表达的方法。 0019 而且， 检测报告基因是否在该肿瘤工程细胞中表达使用的是荧光激活细胞分拣 术， 也称为流式细胞术。 0020 而且， 当细胞与候选物质相接触时， 该肿瘤工程细胞处于活跃的复制状态中。 说 明 书 CN 102234630 A CN 102234632 A4/10 页 6 0021 而且， 在细胞与候选物质接触前， 该肿瘤工程细胞在平面培养皿中应该生长至较 为密集。 0022 而且， 在细胞与候选物质接触前， 该肿瘤工程细胞在三维培养条件下应该生长为 球状细胞团。 0023 本发明提供了针对直结肠癌和乳腺癌的两种肿瘤工程细胞，。

23、 构造该类肿瘤工程细 胞的方法， 以及使用该类肿瘤工程细胞进行药物筛选的方法。可以提高该类药物的开发效 率， 降低开发成本。 0024 保藏说明 0025 ECRC-1人直结肠癌工程细胞， 保藏号CCTCC C201044 ； 保藏日期2010年4月30日 ； 保藏单位中国典型培养物保藏中心 CCTCC ； 0026 EBTC-1 人乳腺癌肿瘤工程细胞， 保藏号 CCTCC C201045 ； 保藏日期 2010 年 4 月 30 日 ； 保藏单位中国典型培养物保藏中心 CCTCC。 附图说明 0027 图 1 为本发明报告基因载体示意图。 0028 图 2 为本发明实施例的 pEGFP-N1。

24、 载体示意图。 0029 图 3 为本发明实施例的在 ECRC-1 细胞及 EBTC-1 细胞中基因载体插入实时定量 PCR 实验结果示意图。显示的是针对 CMV 启动子、 EGFP 基因、 neor 基因及内部参照物 HBB 基因的每一个实时定量 PCR 探针 ( 即引物 ) 在 (a)ECRC-1 肿瘤工程细胞及 (b)EBTC-1 肿瘤 工程细胞的基因组DNA中产生的标准曲线。 横坐标代表的是DNA浓度的Log10， 纵坐标显示 的是Ct value， 即实时定量PCR循环数。 根据Applied Biosystems公司提供的实验手册计 算确定， CMV 启动子、 EGFP 及 neo。

25、r 基因在 (a)ECRC-1 肿瘤工程细胞及 (b)EBTC-1 肿瘤工程 细胞的基因组中的拷贝数均为 1 个。 0030 图 4 为本发明实施例的 ECRC-1 人直结肠癌肿瘤工程细胞在 SAHA 及 DAC 处理下的 反应示意图， 其中 ： 0031 (a) 在没有药物处理的情况下， ECRC-1 的源细胞 HCT-116 人直结肠癌细胞中没有 表现绿色荧光信号 ； 0032 (b) 在没有药物处理的情况下， ECRC-1 肿瘤工程细胞中没有表现绿色荧光信号 ； 0033 (c) 在低剂量组蛋白去乙酰基酶抑制剂 SAHA 处理的情况下， 12.76的 ECRC-1 肿 瘤工程细胞表现出绿。

26、色荧光信号 ； 0034 (d)在低剂量DNA甲基化转移酶抑制剂DAC处理的情况下， 25.91的ECRC-1肿瘤 工程细胞表现出绿色荧光信号。 0035 图 5 为本发明实施例的 EBTC-1 人乳腺癌肿瘤工程细胞在 SAHA 及 DAC 处理下的反 应示意图， 其中 ： 0036 (a)在没有药物处理的情况下， EBTC-1的源细胞MDA-MB-231人乳腺癌细胞中没有 表现绿色荧光信号 ； 0037 (b) 在没有药物处理的情况下， EBTC-1 肿瘤工程细胞中没有表现绿色荧光信号 ； 0038 (c) 在低剂量组蛋白去乙酰基酶抑制剂 SAHA 处理的情况下， 16.37的 EBTC-1。

27、 肿 瘤工程细胞表现出绿色荧光信号 ； 说 明 书 CN 102234630 A CN 102234632 A5/10 页 7 0039 (d)在低剂量DNA甲基化转移酶抑制剂DAC处理的情况下， 17.51的EBTC-1肿瘤 工程细胞表现出绿色荧光信号。 具体实施方式 0040 实施例 1. 构建筛选逆转基因沉寂药物的肿瘤工程细胞的原理 0041 在此处用到的 “肿瘤工程细胞” ， 指的是其基因组被稳定的插入一段外源 DNA 的肿 瘤细胞。稳定的插入的意思是， 这段外源 DNA 随着细胞的分裂而复制， 并被分配到其子代细 胞中。具体来说， 这段外源 DNA 片段包含有一个被甲基化的启动子， 。

28、一个被该甲基化启动子 控制的 ( 因此是沉寂的 ) 报告基因， 以及一个选择基因。 0042 在此处用到的 “启动子” ， 指的是一段可以启动基因转录的 DNA 序列。基因转录这 一过程的结果是基因表达产物(通常是蛋白质)的合成。 在真核细胞中， 启动子的调控序列 通常被称为转录因子的蛋白所附着， 从而导致转录复合物的形成， 以及基因的转录与表达。 0043 如果与某基因相连的启动子序列被在遗传学水平或表观遗传学水平上所抑制， 相 应的该基因被沉寂 ； 也就是说， 该基因不可以被转录， 其基因产物也不可以被表达出来。“遗 传学水平的抑制” 指的是通过改变核苷酸序列的方法， 既增加、 减少、 替。

29、代、 重组构成启动子 序列的碱基对。而另一方面，“表观遗传学水平的抑制” 指的是一种可遗传的 ( 既可以被稳 定的传递到下一次代的)， 不涉及核苷酸序列本身改变的基因表达的改变。 表观遗传学水平 抑制的一个主要例子就是启动子区域 CpG 岛甲基化， 其结果是与该启动子区域相连的基因 被沉寂。 0044 CpG 指的是 16 种可能的 DNA 碱基双核苷序列 ( 即 AA、 AT、 AC、 AG、 TT、 TA、 TC、 TG、 CC、 CA、 CT、 CG、 GA、 GT、 GG 和 GC) 中的一种。此处的 “p” 指的是连接胞嘧啶 (C) 和鸟嘌呤 (G) 的磷酸二酯键。因此， CpG 是。

30、一个 “胞嘧啶 - 磷酸二酯键 - 鸟嘌呤” 序列。从概率统计上来 说， 这 16 种双核苷序列在一段随机的 DNA 序列中出现的几率都是 1/16， 既约 6.2。然而， 在人类基因组中， CpG 出现的几率却远低于 6.2。这一现象被认为与脱氨基作用有关。 0045 然而， 在基因组中存在着 CpG 双核苷序列出现几率很高 ( 接近其统计学概率 ) 的 区域， 这种区域被称为 CpG 岛。目前被广泛接受的 CpG 岛的定义是 ： 一段长于 200 个碱基对 的DNA序列， 其胞嘧啶加鸟嘌呤含量超过50且CpG出现几率不少于其统计概率的0.6倍。 0046 CpG 岛在其正常状态下表现出比整。

31、个基因组中零散的 CpG 双核苷序列低得多的甲 基化。 0047 DNA甲基化转移酶(DNMT)家族包含有4种DNMT。 DNA甲基化转移酶通过使用S-腺 苷甲硫氨酸作为甲基供体来甲基化 CpG 双核苷的胞嘧啶的第五位。 0048 CpG 岛以非常显著的高频率发生在基因的启动子区域 ； 据估算， 高达 70的基因 启动子区域包含有 CpG 岛。如上面所述的， 正常的细胞状态下， 启动子区域的 CpG 岛是未被 甲基化的， 而包含有未被甲基化 CpG 岛的启动子处于激活状态。另一方面， 启动子区域的 CpG 岛的甲基化是启动子失活以及基因沉寂的指示。 0049 尽管表观遗传学水平 DNA 甲基化。

32、所导致启动子失活是导致基因沉寂的主要因素， 但可以预料的是， DNA 甲基化不会是单独作用的。事实上， 一系列极为复杂的组蛋白尾部氨 基酸的修饰与 DNA 甲基化一同作用于基因沉寂中。这些修饰包括组蛋白尾部某些氨基酸的 甲基化、 乙酰基化以及去乙酰基化， 其复杂的组合形成了被称为 “组蛋白密码” 的一套编码， 说 明 书 CN 102234630 A CN 102234632 A6/10 页 8 调控着基因的转录活性状态。事实上， 在人类基因组中的大多数 DNA 都以过甲基化的染色 质形式存在， 并与去乙酰基化的组蛋白一起形成紧密核小体。这种紧密的核小体结构会阻 止转录因子与DNA结合 ； 因。

33、此， 这些被包裹进紧密核小体的染色质区域被沉寂了。 这种基因 沉寂被一组组蛋白去乙酰基酶 (HDACs) 所维持。 0050 以上的论述建议了两种有效的恢复基因活性 ( 既逆转基因沉寂 ) 的方法， 既逆转 基因启动子区域的甲基化， 以及抑制组蛋白去乙酰基酶的活性。这样的推论被显示出至少 是部分正确的。 例如， DNA甲基化转移酶抑制剂阿扎胞苷Azacitidine(简称AZA)及脱氧阿 扎胞苷 Decitabine(2 -deoxy-5 -Azacitidine 简称 DAC) 可以重新激活被沉寂的基因启 动子以及随后的基因表达。组蛋白去乙酰基酶抑制剂 SAHA 可以有效的抑制组蛋白去乙酰 。

34、基酶， 从而恢复基因表达。而另一方面， 用阿扎胞苷 AZA 处理细胞除了通过抑制 DNA 甲基化 转移酶进而有效的逆转了启动子区域 CpG 岛的甲基化， 还明显的影响了包裹该基因 DNA 的 组蛋白赖氨酸 9 及赖氨酸 4 的乙酰基化的恢复 ； 这些作用共同导致了被沉寂基因的激活与 表达。 0051 随着快速积累的证据压倒性的表明表观遗传学水平上的基因沉寂不单伴随着多 种疾病(特别是癌症)的发展， 更是伴随在这些疾病发生的最初阶段， 医学界与医药开发界 显然亟需一种可以灵敏快捷的筛选那些可逆转启动子区域甲基化以及组蛋白去乙酰基化 的物质的方法。这些被筛选到的可以逆转基因沉寂的物质将会是用来治疗。

35、及阻止疾病， 特 别是癌症， 的非常有效的药物。本发明正是提供了这样一种方法， 以及使用这一方法的工 具。 0052 实施例 2. 载体与工程细胞的构建 0053 在此处， 此方法涉及到构建肿瘤工程细胞系。该肿瘤工程细胞均包含一个在甲基 化 ( 因此是被抑制的 ) 启动子控制下的可以稳定遗传的报告基因。在使用候选物质处理的 情况下， 检测报告基因产物的在该工程细胞中的表达 ； 如果报告基因表达， 表明该候选物质 可以逆转报告基因表观遗传学水平上的沉寂。 0054 尽管有很多种的细胞系可以被选择作为构建该肿瘤工程细胞的源细胞， 我们最初 成功构建的两种肿瘤工程细胞来源于 HCT-116 人直结肠。

36、癌细胞以及 MDA-MB-231 人乳腺癌 细胞。该两种源细胞均来自 NCI-60 细胞组 ( 美国国立癌症研究所维持的被医药界普遍接 受用于筛选抗癌药物的一组 60 种肿瘤细胞 )。可以理解的是， 本发明提供的方法可构建的 肿瘤工程细胞并不是局限于某几种特定的细胞系 ； 也就是说， 任何可以稳定转录插入的外 源报告基因的细胞系， 当然在目前阶段特指肿瘤细胞系， 均可以成为本发明所提供的工程 细胞构建方法的源细胞系。 0055 对于将被工程化改造的细胞系来说， 本发明提供的方法可以适用于多种报告基 因。在目前阶段， 我们倾向于选择一种报告基因， 其基因产物的表现型可以被容易、 便捷的 监测到。。

37、 其中特别倾向于那些基因产物可以发出冷光、 荧光、 或者吸收某个波长光的报告基 因。 同时， 一个非常关键的考虑因素是这种报告基因不可以原本就存在于源细胞中 ； 另外一 个关键的考虑因素是该报告基因的激活不需要任何其他的底物或者共同作用因子。 基于这 些原则， 绿色荧光蛋白基因 GFP 被选择作为报告基因。更具体的， 我们选择的增强型绿色荧 光蛋白基因 EGFP。增强型绿色荧光蛋白是绿色荧光蛋白的变种， 可以在荧光激活细胞分拣 术实验中激发出比绿色荧光蛋白更强的荧光信号。值得说明的是， 本发明提供的构建肿瘤 说 明 书 CN 102234630 A CN 102234632 A7/10 页 9。

38、 工程细胞的方法不局限于某一种特定的报告基因， 凡是符合上述标准的基因， 如萤光素酶 基因、 beta- 半乳糖苷酶基因、 beta- 葡萄糖苷酸酶基因等， 均可以依据实际需要被选择成 为报告基因。 0056 在本发明中， 报告基因被置于一段启动子的控制之下。被选择成为报告基因启动 子的标准是 ： 该启动子可以诱导 EGFP 增强型绿色荧光蛋白基因的转录与表达， 启动子区域 内包含有一个或更多的 CpG 岛， 其 CpG 岛的甲基化可以使该启动子失去活性。所有符合上 述要求的启动子均在本发明的范畴内。在本发明已经构建的两种肿瘤工程细胞 ( 既来源于 HCT-116细胞的ECRC-1人直结肠癌肿。

39、瘤工程细胞和来源于MDA-MB-231细胞的EBTC-1人乳 腺癌肿瘤工程细胞 ) 中， 我们使用了人类细胞巨化病毒 CMV 启动子。该启动子已知可以在 极为广泛的细胞系中， 稳定且连续的支持被克隆基因的表达。 0057 为了提高稳定的细胞克隆的效率， 一个选择基因被整合到源细胞的基因组中。选 择基因会表达一个基因产物， 该基因产物可以保护细胞不受到人为添加到细胞培养液中的 毒素的伤害。用这种方法， 被稳定克隆的带有该选择基因的工程细胞可以在有毒素的培养 液中存活， 而没有被稳定克隆的细胞则会死亡。在本发明已经构建的 ECRC-1 人直结肠癌肿 瘤工程细胞和EBTC-1人乳腺癌肿瘤工程细胞中，。

40、 我们使用的是新霉素抗性基因neor。 该抗 性基因被包括到携带报告基因的质粒载体中， 并被置于 SV40 启动子的控制下。在添加有新 霉素 ( 或其类似物 ) 的细胞培养液中， 该选择基因的表达提供了对被克隆的哺乳动物细胞 稳定的保护和选择作用。 0058 值得说明的是， HCT-116细胞及ECRC-1工程细胞的细胞培养液为含有10胎牛血 清的改进型 McCoy s 5A 培养液， 而 MDA-MB-231 细胞及 EBTC-1 工程细胞的培养液为含有 10胎牛血清的 Leibovitz s L-15 培养液。这些培养液在细胞生长、 新霉素选择、 质粒转 染、 药物筛选及其他所有需要培养细。

41、胞的条件下均适用。 0059 根据我们构建肿瘤工程细胞的要求， 我们所需的报告基因载体依次包含有 pCMV 启动子、 EGFP 基因、 SV40 启动子以及 neor 基因组成。该报告基因载体的线性示意图见图 1。 0060 将该报告基因质粒载体转染进入源细胞 ( 既 HCT-116 细胞及 MDA-MB-231 细胞 )， 我们使用了本领域的工作人员熟知的标准的质粒转移技术。在转染前， pCMV 启动子区域的 CpG 岛必须被甲基化， 以使该启动子失去启动 EGFP 基因转录及表达的活性。为了达到这一 目的， 我们选择了pEGFP-N1质粒(Clontech公司)。 需要再一次指出的是， 任。

42、何符合下述克 隆操作要求的质粒载体均可以被用于此处， 且均包含在本发明的范畴中。pEGFP-N1 载体的 示意图见图 2。 0061 制备 EGFP 报告基因启动子区域被单独甲基化质粒的具体步骤为 ： 0062 1)一部分pEGFP-N1质粒被使用SssI(CpG)甲基化酶(新英格兰生物实验室公司) 处理。该酶可以特异性的甲基化双链 CpG 双核苷酸序列 ； 使用 SssI 酶处理质粒的方法依据 新英格兰生物实验室公司提供的标准方法， 在此不予详述。 0063 2) 由于 SssI 甲基化酶的非选择性， 它可以甲基化被克隆过的载体中所有的 CpG。 因此， 我们使用两种限制性内切酶 Pci I。

43、 和 Bgl ( 新英格兰生物实验室公司 ) 将 CMV 启 动子序列完全从被SssI甲基化过的质粒中切除出来 ； Pci I和Bgl 双酶切的方法依据新 英格兰生物实验室公司提供的标准方法， 在此不予详述。被切除的甲基化 CMV 启动子片段 说 明 书 CN 102234630 A CN 102234632 A8/10 页 10 在 DNA 琼脂糖胶中被与质粒分离， 并被 DNA 胶提取试剂盒 (Qiagen 公司 ) 所提纯出来 ； 提纯 方法依据 Qiagen 公司提供的标准方法， 在此不详述。 0064 3) 同时， 未被 SssI 处理的 pEGFP-N1 也被限制性内切酶 Pci 。

44、I 和 Bgl 双酶切， 被切除 CMV 启动子区域的未被甲基化的质粒被分离并提纯出来。方法同上。 0065 4)步骤2中被甲基化的CMV启动子片段与步骤3中未被甲基化的切除了CMV的质 粒， 被 DNA 连接酶连接起来， 使用的是 DNA 快速连接试剂盒 (Roche 公司 ) 及其提供的标准 方法。于是就获得了仅有报告基因启动子被特异性甲基化的质粒。 0066 pCMV 启动子的甲基化水平可以被亚硫酸氢盐测序法以及亚硫酸氢盐焦硫酸测序 法来检测。前者 ( 亚硫酸氢盐测序法 ) 可以检测 pCMV 中总的 CpG 甲基化水平。而后者 ( 亚 硫酸氢盐焦硫酸测序法)可以定量测量多个连续的CpG。

45、位点各自的甲基化程度， 非常精确， 且实验结果可重复性极佳 ( 高于 95的可重复性 )。 0067 将 该 改 造 过 的 质 粒 转 染 进 HCT-116 细 胞 或 MDA-MB-231 细 胞 使 用 的 是 Lipofectamine 2000(Invitrogen 公司 ) 转染试剂。转染细胞的条件可以依据 Invitrogen 公司提供的守则及对不同细胞转染条件的数据库来确定。因此， 转染的具体操作程序在此 不详述。 0068 在转染之后， 被整合进报告基因载体的细胞在含有新霉素的培养液 ( 终浓度 400g/mL)中进行选择。 如前所述， 稳定整合了neor新霉素抗性基因的细。

46、胞将会在含有新 霉素 ( 或其类似物 ) 的培养液中存活下来。在存活的细胞被转入不含有新霉素的培养液中 培养以后， 细胞被胰蛋白酶消化下来， 并被荧光激活细胞分拣术筛选出没有绿色荧光蛋白 表达的细胞， 既其 pCMV 启动子区域的 CpG 岛被甲基化的细胞。 0069 为了确定在获得的肿瘤工程细胞中整合的 EGFP 基因确实处于沉寂状态， 源细胞 (HCT-116 细胞和 MDA-MB-231 细胞 ) 及获得的肿瘤工程细胞 (ECRC-1 人直结肠癌肿瘤工 程细胞和 EBTC-1 人乳腺癌肿瘤工程细胞 ) 均被荧光激活细胞分拣术测试其绿色荧光状 态。从图 4a 和 4b 以及图 5a 和 5。

47、b 可以看到， 不出预料， 所有的源细胞， 既 HCT-116 细胞和 MDA-MB-231 细胞， 均没有绿色荧光信号 ； 同时， 两种肿瘤工程细胞 ECRC-1 及 EBTC-1 也没有 被检测到绿色荧光信号。可见， 两种肿瘤工程细胞的 EGFP 基因启动子 pCMV 处于被甲基化 的状态。 0070 为确认包含有 pCMV 启动子、 EGFP 基因、 SV40 启动子以及 neor 基因的载体是否被 成功整合进工程细胞的基因组， 我们进行了下述实验， 具体步骤为 ： 0071 1)CMV 启动子的正向引物与反向引物被用于实时定量 PCR 扩增工程细胞内可 能的 CMV 启动子 DNA 序。

48、列。如检测到该对引物 PCR 产物， 可证明 CMV 启动子序列在工 程细胞基因组内的存在。该对引物为 ： 正向 CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA， 反向 GAAATCCCCGTGAGTCAAACC。其实时定量 PCR 荧光 MGB 探针为 CAATGGGCGTGGATAG。 0072 2)EGFP 基因的正向引物与反向引物被用于实时定量 PCR 扩增工程细胞内可能的 EGFP 基因 DNA 序列。如检测到该对引物 PCR 产物， 可证明 EGFP 序列在工程细胞基因组内 的存在。该对引物为 ： 正向 GTCCGCCCTGAGCAAAGA， 反向 TCCAGCAGGA。

49、CCATGTGA。其实时定量 PCR 荧光 MGB 探针为 CCCAACGAGAAGCG。 0073 3)Neor 基因的正向引物与反向引物被用于实时定量 PCR 扩增工程细胞内可 能的 neor 基因 DNA 序列。如检测到该对引物 PCR 产物， 可证明 neor 基因序列在工 说 明 书 CN 102234630 A CN 102234632 A9/10 页 11 程细胞基因组内的存在。该对引物为 ： 正向 CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA， 反向 GAAATCCCCGTGAGTCAAACC。其实时定量 PCR 荧光 MGB 探针为 TGGCCGCTTTTCT。 0074 4) 人 beta- 血球蛋白 HBB 基因被用作内部参照物， 以此来进行定量分析。该对引 物为 ： 正向 TGAAGGCTCATGGCAAGAAA， 反向 GGTGAGCCAAGGCCATCAC。其实时定量 PCR 荧光 MGB 探针为 TGCTCGGTGCCTTT。 0075 图 3a 和 3b 显示， ECRC-1 工程细胞及 EBTC-1 工程细胞的基因组内均整合有 CMV 启动子、 EGFP 基因及 neor 基因的 DNA 序列， 且其在工程细胞内的基因拷贝数均为 1， 证明了 ECRC-1 及 EBTC-1 细胞均为成功构建的符合我们要求的肿瘤工。