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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810288468.3 (22)申请日 2018.04.03 (71)申请人 郑州大学 地址 450001 河南省郑州市高新区科学大 道100号 (72)发明人 李朝辉耿欣孙远强屈凌波 (74)专利代理机构 郑州优盾知识产权代理有限 公司 41125 代理人 郑园王红培 (51)Int.Cl. C09K 11/06(2006.01) C09K 11/65(2006.01) B82Y 20/00(2011.01) B82Y 30/00(2011.01) B82Y 40/00(。
2、2011.01) G01N 21/64(2006.01) (54)发明名称 一种罗丹明杂化碳点的制备方法及在线粒 体靶向识别中的应用 (57)摘要 本发明涉及一种罗丹明杂化碳点的制备方 法及在线粒体靶向识别中的应用。 该方法利用微 波辅助法， 以柠檬酸和间氨基苯酚类化合物为原 料， 通过改变苯酚间位氨基形式， 可以有效调控 荧光发射波长， 生成罗丹明分子荧光团杂化的碳 点， 实现了可控的、 可预测的荧光发射波长碳点 的制备。 该方法操作简单、 原料易得、 绿色环保， 开创了一种合成分子荧光团杂化碳点的新策略。 本发明制备的碳点可用于细胞中线粒体靶向识 别， 在生物、 医疗等领域具有潜在的应用价。
3、值。 权利要求书1页 说明书4页 附图5页 CN 108504349 A 2018.09.07 CN 108504349 A 1.一种罗丹明杂化碳点的制备方法， 其特征在于步骤如下： （1） 将柠檬酸与间氨基苯酚类化合物混合溶于蒸馏水中， 配制成前体溶液， 放置于微波 反应管中； （2） 将步骤 （1） 中的微波反应管放置于微波反应器中， 将前体溶液加热到120-160 ， 反应0.5-6 h， 反应后的产品自然冷却至室温； （3） 将步骤 （2） 冷却后的产品用0.22 m滤膜处理， 去除大颗粒； 用截留量为3 KDa的超 滤管处理， 得到纯化后的Rho-CDs溶液； （4） 将步骤 （3）。
4、 得到的Rho-CDs溶液真空冷冻干燥， 得到Rho-CDs固体粉末。 2.根据权利要求1所述的罗丹明杂化碳点的制备方法， 其特征在于： 所述步骤 （1） 中间 氨基苯酚类化合物为间氨基苯酚、 间乙基氨基对甲苯酚、 间二乙氨基苯酚和8-羟基久洛里 定中的任意一种。 3.根据权利要求1所述的罗丹明杂化碳点的制备方法， 其特征在于： 所述步骤 （1） 中柠 檬酸与间氨基苯酚类化合物的摩尔比为 （1:2） - （2:1） 。 4.权利要求1-3任一项所述的罗丹明杂化碳点在线粒体靶向识别中的应用， 其特征在 于步骤如下： （1） 将细胞接种于共聚焦皿中， 在37、 5% CO2、 饱和湿度的细胞培养箱。
5、中培养12-24 h， 得到培养液A； （2） 将Rho-CDs加入到步骤 （1） 得到的培养液A中， 在37、 5% CO2、 饱和湿度的细胞培养 箱中培养4 h， 得到培养液B； （3） 将线粒体染色剂Rho123加入倒步骤 （2） 得到的培养液B中， 孵育10 min， 得到培养液 C； （4） 将核染试剂NucRedTM Live 647加入步骤 （3） 得到的培养液C中， 孵育10 min， 得到混 合液D； （5） 用磷酸盐缓冲液冲洗细胞， 之后加入新鲜的不含酚红的细胞培养液； 用激光共聚焦 显微镜进行拍摄成像。 5.根据权利要求4所述的罗丹明杂化碳点在线粒体靶向识别中的应用， 其。
6、特征在于： 所 述步骤 （1） 中细胞为Hela细胞、 A549细胞、 MCF7细胞和3T3细胞中的任意一种。 6. 根据权利要求4所述的罗丹明杂化碳点在线粒体靶向识别中的应用， 其特征在于： 所述步骤 （1） 中共聚焦皿中细胞培养液由DMEM高糖培养基、 10%体积百分数的胎牛血清、 100 g/mL青霉素和100 g/mL链霉素组成。 7. 根据权利要求4所述的罗丹明杂化碳点在线粒体靶向识别中的应用， 其特征在于： 所述步骤 （2） 中Rho-CDs加入后的浓度为50 g/mL。 8.根据权利要求4所述的罗丹明杂化碳点在线粒体靶向识别中的应用， 其特征在于： 所 述步骤 （3） 中线粒体染。
7、色剂Rho123加入后溶液的浓度为1 M。 9. 根据权利要求4所述的罗丹明杂化碳点在线粒体靶向识别中的应用， 其特征在于： 所述步骤 （5） 中核染试剂NucRedTM Live 647加入后溶液的浓度为2 drops/mL。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108504349 A 2 一种罗丹明杂化碳点的制备方法及在线粒体靶向识别中的 应用 技术领域 0001 本发明涉及纳米材料制造领域， 尤其涉及一种利用微波辅助法制备罗丹明杂化的 碳点的方法及应用该纳米材料进行细胞内线粒体靶向识别的方法。 背景技术 0002 经过十几年的发展， 碳点 （CDs） 作为一种新型的光致发光纳米材料， 以其。
8、独特的光 电性质， 在生物标记、 癌症诊断、 荧光传感、 太阳能电池等发面有了广泛的应用。 和传统的半 导体量子点 （CdTe， CdSe， PbS） 相比， 碳点以其毒性低、 环境友好、 光稳定性强、 制备方法简单 等优势在生物标记领域成为研究热点， 并被认为是一种最理想的荧光标记和检测材料。 0003 在碳点 “自下而上” 的合成方法中， 前体分子的选择尤为重要， 它们在一定程度上 决定了合成目标碳点的性质以及应用情况。 目前， 人们选用常见的有机小分子， 包括柠檬 酸、 糖类和胺类等作为碳源， 通过水热、 微波、 超声、 等离子体处理等方式合成了一系列荧光 性质良好的碳点 （参见： Zh。
9、u, S. J.; Meng, Q. N.; Wang, L.; Zhang, J. H.; Song, Y. B.; Jin, H.; Zhang, K.; Sun, H. C.; Wang, H. Y.； Yang, B. Angew. Chem. Int. Ed., 2013, 52, 3953; Pan, L. L.； Sun, S.; Zhang, A. D.； Jiang, K.; Zhang, L.; Dong, C. Q.; Huang, Q.; Wu, A. G.; Lin, H. W. Adv. Mater., 2015, 27, 7782. ） 。 但是， 这些碳点的发光。
10、性质在设计之初是无法准确预知的。 早期， 人们在研究碳点荧光发光 机理的时候， 将其归因于碳点表面的缺陷或氧化程度 （参见： Ding, H.; Yu, S. B.; Wei, J. S.; Xiong, H. M. ACS Nano, 2016, 10, 484. ） 。 2012年以后， 人们以柠檬酸和氨基乙 醇、 硫醇等反应为例开展了碳点的发光基团结构的初步探讨， 通过简单的有机反应确定了 发光基团的基本结构 （参见： Krysmann, M. J.;Kelarakis, A.; Dallas, P.;Giannelis, E. P. J. Am. Chem. Soc., 2012, 1。
11、34, 747; Song, Y. B.; Zhu, S. J.; Zhang, S. T.; Fu, Y.; Wang, L.; Zhao, X. H.； Yang. B. J. Mater. Chem. C, 2015, 3, 5976. ） 。 研究表明， 具有较高量子产率的碳点发光中心通常含有分子荧光团。 然而， 对于大 多数碳点来说， 它们普遍荧光发射波长较短， 大多在蓝光范围内， 在生物领域内应用易受背 景光干扰。 所以， 基于分子荧光团杂化碳点的方法， 开发出具有长波长荧光的碳点， 并应用 于生物识别是具有重要意义的。 0004 罗丹明染料以其摩尔消光系数大、 荧光量子产率高、 。
12、光稳定性强等优势在荧光标 记、 荧光探针等方面具有广泛的应用。 将罗丹明荧光团杂化到碳点的内部或表面， 可以可控 的得到产率高、 具有特定识别性质的罗丹明杂化碳点 （Rho-CDs） 。 0005 线粒体作为细胞生命活动的能量提供者， 其失调与人类的多种疾病相关， 如心血 管疾病、 帕金森氏症以及恶性肿瘤等。 带有正电荷的罗丹明分子易于富集到线粒体中。 因 此， Rho-CDs也同样具有富集到线粒体， 实现细胞内线粒体成像的作用。 发明内容 说明书 1/4 页 3 CN 108504349 A 3 0006 本发明提出一种制备罗丹明分子荧光团杂化碳点的方法， 该方法操作简单、 原料 易得、 绿。
13、色环保。 本发明还涉及该碳点的应用， 即可以应用于细胞中线粒体靶向识别。 0007 实现本发明的技术方案是： 一种罗丹明杂化碳点的制备方法， 步骤如下： （1） 将柠檬酸与间氨基苯酚类化合物混合溶于蒸馏水中， 配制成前体溶液， 放置于微波 反应管中； （2） 将步骤 （1） 中的微波反应管放置于微波反应器中， 将该前体溶液加热到120-160 ， 反应0.5-6 h， 得到的产品自然冷却至室温； （3） 将步骤 （2） 冷却后的产品用0.22 m滤膜处理， 去除大颗粒； 再用截留量为3 KDa的 超滤管处理， 得到纯化后的Rho-CDs溶液； （4） 将步骤 （3） 得到的Rho-CDs溶液真。
14、空冷冻干燥， 得到Rho-CDs固体粉末。 0008 所述步骤 （1） 中间氨基苯酚类化合物为间氨基苯酚， 间乙基氨基对甲苯酚， 间二乙 氨基苯酚和8-羟基久洛里定中的任意一种。 0009 所述步骤 （1） 中柠檬酸与间氨基苯酚类化合物的摩尔比为 （1:2） - （2:1） 。 0010 所述的罗丹明杂化碳点在线粒体靶向识别中的应用步骤如下： （1） 将细胞接种于共聚焦皿中， 在37 、 5% CO2、 饱和湿度的细胞培养箱中培养12-24 h， 得到培养液A； （2） 将Rho-CDs加入到步骤 （1） 得到的培养液A中， 在37 、 5% CO2、 饱和湿度的细胞培 养箱中培养4 h， 得。
15、到培养液B； （3） 将线粒体染色剂Rho123加入步骤 （2） 得到的培养液B中， 孵育10 min， 得到培养液C； （4） 将核染试剂NucRedTM Live 647加入步骤 （3） 得到的培养液C中， 孵育10 min， 得到 混合液D； （5） 用磷酸盐缓冲液冲洗细胞， 之后加入新鲜的不含酚红的细胞培养液； 用激光共聚焦 显微镜进行拍摄成像。 0011 所述步骤 （1） 中细胞为Hela细胞、 A549细胞、 MCF7细胞和3T3细胞中的任意一种。 0012 所述步骤 （1） 中共聚焦皿中细胞培养液由DMEM高糖培养基、 10%体积百分数的胎牛 血清、 100 g/mL青霉素和10。
16、0 g/mL链霉素组成。 0013 所述步骤 （2） 中Rho-CDs加入后的浓度为50 g/mL。 0014 所述步骤 （3） 中线粒体染色剂Rho123加入后溶液的浓度为1 M。 0015 所述步骤 （5） 中核染试剂NucRedTMLive 647加入后溶液的浓度为2 drops/mL。 0016 本发明的有益效果是： 本发明利用微波辅助法， 以常见的柠檬酸及间氨基苯酚类 物质为原料， 通过改变苯酚间位氨基形式， 有效的调控荧光发射波长， 成功将罗丹明分子荧 光团生成并杂化入碳点， 实现了可控的、 可预测的荧光发射波长碳点的制备。 该类Rho-CDs 荧光性质优异， 制备简单， 环境友好。
17、。 同时， 该类碳点可以对细胞线粒体进行靶向识别， 并具 有进一步应用于线粒体相关疾病的研究中的价值。 附图说明 0017 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案， 下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下， 还可以 说明书 2/4 页 4 CN 108504349 A 4 根据这些附图获得其他的附图。 0018 图1 罗丹明杂化碳点 （Rho-CDs） 制备原理图及实物荧光照片。 0019 图2为实施例1、 2、 3和4所制备Rho-CDs 。
18、580、 Rho-CDs 520、 Rho-CDs 540和Rho-CDs 600的紫外吸收光谱图。 0020 图3为实施例1、 2、 3和4所制备Rho-CDs 580、 Rho-CDs 520、 Rho-CDs 540和Rho-CDs 600激发光谱图。 0021 图4是实施例1、 2、 3和4所制备Rho-CDs 580、 Rho-CDs 520、 Rho-CDs 540和Rho-CDs 600荧光发射光谱图。 0022 图5是实施例1制备的Rho-CDs 580的透射电镜图。 0023 图6是实施例1制备的Rho-CDs 580的碳点粒径分布图。 0024 图7实施例1制备的Rho-C。
19、Ds 580在不同激发波长下碳点荧光发射图谱 （激发波长 为470 nm， 480 nm， 490 nm， 500 nm， 510 nm， 520 nm， 530 nm， 540 nm， 550 nm） 。 0025 图8 实施例1制备的Rho-CDs 580在细胞中线粒体靶向识别中的应用， 及Rho123、 NucRedTM Live 6470染色图和叠加图。 具体实施方式 0026 下面将结合本发明实施例， 对本发明的技术方案进行清楚、 完整地描述， 显然， 所 描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提。
20、下所获得的所有其他实施例， 都属于本发 明保护的范围。 0027 实施例1 Rho-CDs 580的制备方法， 包括以下步骤： 将30 mg柠檬酸与12.9 mg间二乙氨基苯酚 （摩尔比=2:1） 混合溶于2 mL蒸馏水中， 配制 成前体溶液， 放置于微波反应管中； 将微波反应管放置于微波反应器中， 将该前体溶液加热 到160 ， 反应2 h； 得到的产品自然冷却到室温； 用0.22 m滤膜处理， 去除大颗粒； 再用截 留量为3 KDa的超滤管处理， 去除未反应完的原料， 得到纯化后的Rho-CDs 580溶液； 将Rho- CDs 580溶液真空冷冻干燥， 得到Rho-CDs 580固体粉末。
21、。 Rho-CDs 580溶液的紫外-可见光 吸收光谱、 激发光谱和荧光发射光谱见附图2-4。 其电镜图及粒径分布图见附图5和6， 其在 不同激发下的荧光发射图见附图7， 图7曲线从下往上与标号相对应， 即470nm对应最下面曲 线， 其余类推。 0028 实施例2 Rho-CDs 520的制备方法： 将30 mg柠檬酸与8.5 mg间氨基苯酚 （摩尔比=2:1） 混合溶于2 mL蒸馏水中， 配制成前 体溶液。 其余步骤如实施例1。 Rho-CDs 520溶液的紫外-可见光吸收光谱、 激发光谱和荧光 发射光谱见附图2-4。 0029 实施例3 Rho-CDs 540的制备方法： 将30 mg柠。
22、檬酸与11.8 mg间乙基氨基对甲苯酚 （摩尔比=2:1） 混合溶于2 mL蒸馏水中， 配制成前体溶液。 其余步骤如实施例1。 Rho-CDs 540溶液的紫外-可见光吸收光谱、 激发光 说明书 3/4 页 5 CN 108504349 A 5 谱和荧光发射光谱见附图2-4。 0030 实施例4 Rho-CDs 600的制备方法： 将30 mg柠檬酸与14.8 mg 8-羟基久洛里定 （摩尔比=2:1） 混合溶于2 mL蒸馏水中， 配 制成前体溶液。 其余步骤如实施例1。 Rho-CDs 600溶液的紫外-可见光吸收光谱、 激发光谱 和荧光发射光谱见附图2-4。 0031 实施例5 Rho-C。
23、Ds 580的制备方法， 包括以下步骤： 将7.5 mg柠檬酸与12.9 mg间二乙氨基苯酚 （摩尔比=1:2） 混合溶于2 mL蒸馏水中， 配 制成前体溶液， 放置于微波反应管中； 将微波反应管放置于微波反应器中， 将该前体溶液加 热到120 ， 反应6 h； 得到的产品自然冷却到室温； 用0.22 m滤膜处理， 去除大颗粒； 再用 截留量为3 KDa的超滤管处理， 去除未反应完的原料， 得到纯化后的Rho-CDs 580溶液； 将 Rho-CDs 580溶液真空冷冻干燥， 得到Rho-CDs 580固体粉末。 0032 实施例6 Rho-CDs 580的制备方法， 包括以下步骤： 将15 。
24、mg柠檬酸与12.9 mg间二乙氨基苯酚 （摩尔比=1:1） 混合溶于2 mL蒸馏水中， 配制 成前体溶液， 放置于微波反应管中； 将微波反应管放置于微波反应器中， 将该前体溶液加热 到140 ， 反应0.5 h； 得到的产品自然冷却到室温； 用0.22 m滤膜处理， 去除大颗粒； 再用 截留量为3 KDa的超滤管处理， 去除未反应完的原料， 得到纯化后的Rho-CDs 580溶液； 将 Rho-CDs 580溶液真空冷冻干燥， 得到Rho-CDs 580固体粉末。 0033 应用于细胞中线粒体的靶向识别， 包括以下步骤： 将Hela细胞接种于共聚焦皿中， 在37 、 5% CO2， 饱和湿度。
25、的细胞培养箱中培养24 h （细胞培养液包含DMEM高糖培养基、 10%体积百分数的胎牛血清， 100 g/mL青霉素和100 g/mL链霉素） ； 将Rho-CDs 580配制成溶液加入共聚焦皿中， 使终浓度为50 g/mL ， 在37 ， 5% CO2， 饱和湿度的细胞培养箱中培养4 h； 为了考察Rho-CDs 580对线粒体靶向识别功 能的准确性， 在共聚焦培养皿中加入商业化线粒体染色剂Rho123， 终浓度为1 M， 孵育10 min； 并将核染试剂NucRedTM Live 647加入共聚焦皿中， 2 d/mL， 孵育10 min； 移去上述的混 合液， 用磷酸盐缓冲液冲洗细胞3遍。
26、， 加入新鲜的不含酚红的DMEM高糖细胞培养液。 用激光 共聚焦显微镜进行拍摄成像。 用波长为552 nm的激光器照射， 收取560-650 nm范围内的荧 光图像， 对应为Rho-CDs 580染色区域； 用波长为488 nm的激光器照射， 收取500-550 nm范 围内的荧光图像， 对应为商业化线粒体染色剂Rho123染色区域； 用波长为638 nm的激光器 照射， 收取650-750 nm范围内的荧光图像， 对应为核染试剂NucRedTM Live 6470染色区域。 结果图片见附图8。 0034 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 4/4 页 6 CN 108504349 A 6 图1 图2 说明书附图 1/5 页 7 CN 108504349 A 7 图3 图4 说明书附图 2/5 页 8 CN 108504349 A 8 图5 图6 说明书附图 3/5 页 9 CN 108504349 A 9 图7 说明书附图 4/5 页 10 CN 108504349 A 10 图8 说明书附图 5/5 页 11 CN 108504349 A 11 。